DE3486356T2

DE3486356T2 - Von polypeptiden induzierte monoklonale antikörper gegen oncoproteine.

Info

Publication number: DE3486356T2
Application number: DE3486356T
Authority: DE
Inventors: Richard Alan La Jolla Ca 92037 Lerner; Henry L. Carlsbad Ca 92008 Niman
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1983-08-17
Filing date: 1984-08-17
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2004-08-18
Also published as: WO1985000807A1; DE3486356D1; EP0152477B1; JPH07284398A; ZA846439B; EP0152477A4; AU3395084A; AU633253B2; EP0592026A1; IT8448736A0; JP2592581B2; ATE113962T1; AU3386089A; JPS61500068A; AU580738B2; IT1177968B; CA1219232A; IT8448736A1; EP0152477A1

Description

Technisches Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf immunologische Rezeptoren und Liganden und sie bezieht sich insbesondere auf monoklonale Rezeptoren, die gebildet (induziert) worden sind init (gegenüber) Polypeptiden, deren Aminosäurerest-Sequenzen Sequenzen von Retroviren-Onkoprotein-Liganden entsprechen.

Technischer Hintergrund

Retroviren sind Viren, die einen einzelnen RNA-Strang als genomisches Material anstelle einer DNA enthalten. Das Einzelstrang-RNA-Genom jedes dieser Viren erzeugt ein Doppelstrang-DNA-Molekül, nachdem das Virus einen empfänglichen Wirt infiziert hat. Diese DNA-Replika des Virus-Genoms führt sich dann selbst dauerhaft in ein Chromosom der erfolgreich infizierten Zelle ein und repliziert sich in diesem Wirts-Chromosom.
Die nachstehend und in den Patentansprüchen diskutierten Retroviren können ferner definiert werden als replikationsdefekte Retroviren. Diese Viren enthalten somit selbst kein Gen, das die Reverse Transkriptase codiert, die üblicherweise erforderlich ist, um eine Translation des viralen RNA-Genoms in eine DNA zu ermöglichen, die in ein Chromosom des infizierten Wirts eingeführt werden kann. Vielmehr müssen die nachstehend diskutierten Retroviren in der Regel in ihrer Infektion durch ein sogenanntes Helfer- Virus, das replikations-kompetent ist, koinplementiert werden. Dieses zweite Virus enthält das Gen, welches das Reverse Transkriptase-Enzyin codiert, welches die genomischen Materialien aus beiden Viren in die erfolgreich infizierten Wirtszellen einführt, um diese Zellen zu transformieren.
Zur Erleichterung des Verständnisses werden die nachstehend und in den Patentansprüchen diskutierten replikations-defekten Retroviren lediglich als Retroviren bezeichnet, unter denen solche zu verstehen sind, die replikations-defekt sind und die Unterstützung durch ein Helfer-Virus für die erfolgreiche Infektion und Transformation von Wirts-Zellen benötigen. Diese Verwendung des Ausdrucks Retrovirus ist auf diesem Gebiet bekannt und dieser Ausdruck wird daher als solcher ohne nähere Erläuterung verwendet.
Einige Vertreter der Retroviren-Familie sind stark onkogen, beurteilt anhand ihrer Fähigkeit, die Bildung von festen (soliden) Tumoren innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach dem Inokulieren in den Wirt hervorzurufen. Diese Viren können auch "krebsartige" Veränderungen in Zellen hervorrufen, die im Labor gezüchtet und kultiviert worden sind; diese Änderungen werden als "Transformationen" bezeichnet und stellen einen zuverlässigen biologischen in vitro-Assay für onkogene Viren dar. Mehrere dieser Viren wurden bereits aus Hühnchen, Truthähnen, Mäusen, Ratten, Katzen und Affen isoliert.
Ein einzelnes Gen, das Onkogen, das auf dem Genom dieser stark onkogenen Viren angeordnet ist, ist für das tumorbildende Potential des Virus verantwortlich. Im Falle mehrere Viren wurden die Proteinprodukte ihrer Onkogene, hier als Onkoproteine bezeichnet, immunologisch identifziert durch Ausnutzung der Tatsache, daß das Serum aus einem Tier, das einen Virus-induzierten Tumor trägt, Antikörper enthält, die gegen diese Onkoproteine gerichtet sind.
Ein schnell wachsender Nachweiskörper zeigt an, daß die onkogene von Retroviren eng verwandt sind mit und stammen aus verschiedenen spezifischen Orten der normalen genetischen Zell-Information aller Wirbeltiere. Molekulare Hybridisierungsstudien, in denen spezifische Nucleinsäure-Sonden verwendet wurden, die in der Mitte der Siebziger Jahre durchgeführt wurden, und die nachfolgende genetische Klonierung von viralen Onkogenen und ihren Zellabkömmlingen durch rekombinante DNA-Technologie haben gezeigt, daß eine Verwandtschaft zwischen retroviralen Onkogenen (v- onc) und zellulären Onkogenen (c-onc) besteht, die bei a1len normalen Wirbeltierzellen zu finden ist.
Die molekulare Analyse von nahezu zwei Dutzend Retroviren, die bisher isoliert worden sind, hat mehr als ein Dutzend unterschiedliche Onkogene gezeigt, die sich durch ihre Nucleotid-Sequenz jeweils voneinander unterscheiden und jeweils mit einem entsprechenden zellulären onkogenen Homologen vorkommen. So wurde beispielsweise das Human EJ oder T24-Blasen-Carcinom-Onkogen identifiziert als Homologon des Transformationsgens des Harvey Maus-Sarcom-Virus (rasHa) und auch des BALB Sarcom-Virus (bas) [Parada et al., "Nature", 297, 474-478 (1982); Der et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 79, 3627-3634 (1982); und Santos et al., "Nature", 298, 343-347 (1982)]. Außerdem wurde gefunden, daß das Onkogen der Human-Carcinom-Zellinie LX-1 homolog ist zu dem Transformations-Gen des Maus-Sarcom-Virus vom Kirsten-Stamm (rasKi) [Der et al., s. oben]. Außerdem ist das gleiche v-onc für ein c-onc, bezeichnet als fps eines Voge1-Ursprungs mindestens zweimal vertreten unter einer begrenzten Anzahl von Voge1-Retrovirus-Isolaten; sein Säugetier-Artverwandtes, bei den Katzen-Species als fes bezeichnet, ist in zwei unterschiedlichen Stämmen von Katzen-Sarcom-Viren zu finden. Darüber hinaus wurde in einer jüngeren Arbeit eine Sequenz-Homologie zwischen dem von Human-Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem durch das Simian-Sarcom-Onkogen codierten Onkoprotein v-sis gefunden und als p28sis bezeichnet [Antoniades et al., "Science", 220, 963-965 (1983) und Devare et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 731-735 (1983)].
Die strukturelle und immunologische Verwandtschaft zwischen dem transformierenden sis-Gen-Produkt (p28sis) des Simian-Sarcom-Virus und dem aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) stellt das solideste Verbindungsglied zwischen den Transformationseigenschaften von Onkogenen und der mitogenen Wirkung von Wachstumsfaktoren dar. Das sis-Gen ist eines von vielen Onkogenen, die durch Retroviren transduziert worden sind. Diese eingefangenen Gene wurden durch die Evolution in hohem Maße konserviert, was verinuten läßt, daß sie wichtige physiologische Funktionen haben. PDGF ist ein sehr starkes Mitogen für viele Typen von Bindegewebszellen in einer Kultur. Er wird in den α-Kernen von Blutplättchen gespeichert und an den Stellen einer Gefäßschädigung freigesetzt. Der PDGF bindet sich an spezifische Zelloberflächen-Rezeptoren, wobei er eine Tyrosin-spezifische Proteinkinase-Aktivität auslöst. Dieses Ereignis zeigt einen gemeinsamen Mechanismus, wie er von einer großen Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Onkogenen angewendet wird.
Insulin, Gastrin, der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und Transformations-Wachstumsfaktoren binden sich alle an Rezeptoren, die mit der Tyrosin-Proteinkinase-Aktivität in Verbindung stehen. Die Onkogene src, yes, fes, fps, ros, abl, fgr weisen eine Tyrosin-Kinase-Aktivität auf, während die Onkogene mos, raf, mht und erb B eine Sequenzhomologie zu der Region aufweisen, welche die Kinaseaktivität codiert. Außerdem zeigt eine Sequenzanalyse von Fragmenten des EGF-Rezeptors eine sehr enge Homologie mit der obengenannten Sequenz von erb B. Die Bindung eines Wachstumsfaktors an einen Rezeptor mit einer Tyrosin-Kinase-Aktivität scheint somit ein gemeinsames Ereignis bei der Mitogenese und Transformation zu sein.
Die genauen Molekularmechanismen dieser Wechselwirkung sind nicht bekannt. Der aus Blutplättchen isolierte PDGF enthält zwei Polypeptid-Ketten, die Disulfid-gebundene Komplexe bilden, die sich bei der Denaturierung von Polyacrylamid-Gelen zwischen 20 000 und 35 000 Dalton bewegen. Die Reduktion zerstört die biologische Aktivität dieser Komplexe und bildet Proteine, die sich zwischen 14 000 und 18 000 Dalton bewegen. Die Sequenzanalyse des bei 18 000 Dalton sich bewegenden Materials identifiziert zwei Homologe, jedoch verschiedene Sequenzen.
Wie oben diskutiert, ist eine dieser Sequenzen (PDGF-2) stark homolog zu dem Protein (p28sis), das durch die Nucleotid-Sequenz des Simian-Sarcom-Virus-Onkogens (sis) vorhergesagt wurde. Die Homologie beginnt bei dem Rest 67 und erstreckt sich mindestens bis zu dem Rest 171. Vor kurzem wurde durch Isolierung und Sequenzierung eines Human c-sis-Klons diese Homologie bis zu dem vorhergesagten Carboxy-Terminus erweitert. Der offene Leseraster, der die sequenzierte PDGF-2-Region codiert, setzt sich stromaufwärts fort, was anzeigt, daß der PDGF, der aus Blutplättchen isoliert wurde, von einem größeren Vorläufer abgeleitet ist, was übereinstimmt mit der 4,2 kb sis-verwandeten mRNA, die in verschiedenen Zellinien nachgewiesen wurde.
Das Protein, das durch das virale Onkogen codiert wird und ein entsprechendes homologes Protein innerhalb der Wirts- Zelle aufweist, werden hier beide als Onkoproteine bezeichnet, obgleich das zelluläre Onkoprotein in der Regel in geringen Mengen in normalen Zellen vorliegt und somit nicht nur mit neoplastischen Zuständen assoziiert sein muß. Außerdem können Onkoproteine, die durch verwandte Onkogene codiert werden, unterschiedliche Molekulargewichte aufweisen, z.B. die p85 und p108 Onkoproteine, die durch v-fesST bzw. v-fesGA codiert werden, und das 100-105k Da1ton-Protein von normalen Nerz-Zellen, von denen angenommen wird, daß sie durch das c-fes-Gen codiert werden [Sen et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 1246-1250 (1983)). Der Ausdruck Onkoprotein wird somit hier allgemein für Proteine verwendet, deren Gene und Aminosäurerest-Sequenzen mindestens zum Teil homolog sind.
Das Onkoprotein ist im allgemeinen in dem Virus-Teilchen, das die Zelle infiziert, nicht vorhanden, sondern wird erst nach der Infektion und Transformation exprimiert. Das entsprechende zelluläre Onkoprotein wird höchstens in minimalem Umfang in normalen Zellen exprimiert und es wird in einem größeren Umfang in neoplastischen Zellen exprimiert. Das Onkoprotein kann daher in der Regel nicht aus dem Virus erhalten werden. Außerdem wird die Isolierung von Onkoproteinen aus Zellen erschwert durch die vorhandene geringe Menge, durch die komplexe Mischung der Proteine, die in normalen Zellen zu finden ist, und die verhältnismäßig geringe Menge dieser Proteine, die selbst in transformierten Zellen vorhanden ist.
Die durch v-onc und c-onc-Gene codierten Onkoproteine enthalten somit in der Regel große Sequenzen von Aminosäureresten, die homolog, aber dennoch in der Regel nicht identisch sind. Außerdem wurde gefunden, daß Onkoproteine, die durch Gene verschiedener Viren-Stämme codiert werden, von denen jeder anscheinend das gleiche Onkogen enthält, geringfügige Variationen im Hinblick aufihre Aminosäurerest-Sequenzen aufweisen, wie oben beispielhaft und durch die vier publizierten Sequenzen des ras-Gens angegeben, die sich in der Position des zwölften Aminosäurerestes voneinander unterscheiden. Somit kann es selbst dann, wenn Onkoproteine verfügbar sind, schwierig sein, sie voneinander zu unterscheiden.
Immunologisch induzierte Rezeptormoleküle, wie monoklonale und polyklonale Antikörper oder die ein Idiotyp entha1tenden Abschnitte dieser Antikörper sind nützlich bei der Reinigung von Protein-Liganden, an die sie sich binden, als diagnostische Reagentien zur Bestimmung der Anwesenheit und Menge der Protein-Liganden sowie zur Unterscheidung zwischen homologenen Protein-Liganden.
Die Schwierigkeiten, die mit der Herstellung von Mengen von Onkoproteinen verbunden sind, sprechen in der Regel jgegen die Herstellung von Rezeptoren für diese Onkoproteine, obgleich durch ganze Zellen induzierte monoklonale Antikörper gegen ein durch v-fes und v-fps codiertes Onkoprotein von Veronese et al. in "J. Virol.", 43, 896-904 (1982), beschrieben worden sind. Außerdem führt selbst dann, wenn ganze Proteine für die Verwendung als Immunogene zur Induktion der Bildung solcher Rezeptoren zur Verfügung stehen, die Verwendung von großen Protein-Molekülen als Immunogene zur Bildung von Antiseren, die polyklonale Antikörper gegenüber den zahlreichen Epitopen der großen Protein-Moleküle enthalten.
Hybridom- und monoklonale Antikörper-Verfahren, in denen ganze Proteine oder große Protein-Fragmente als Immunogene verwendet werden, haben sich als nützlich erwiesen bei der Einengung der immunologischen Antwort auf solche Immunogene. Diese Technologie, wie sie bisher praktisch angewendet wird, ist jedoch extrem zeitraubend und liefert nur eine verhältnismäßig geringe Anzahl von Hybridomen, die nützliche Antikörper sekretieren (abscheiden) können, die das Immunogen erkennen. Darüber hinaus können diese Verfahren, selbst wenn sie erfolgreich sind, keine Voraussage für die chemische Identität des Epitops liefern, gegenüber dem die Rezeptormoleküle gebildet werden. Demzufolge ist selbst nach der Bildung von das Immunogen erkennenden Rezeptoren die Erzielung von Rezeptoren für spezifische, chemisch identifizierte Epitop-Abschnitte des Protein-Liganden ein Erfolg oder Mißerfolg, der die Anzahl der nützlichen Hybridome, die letztlich gebildet werden, noch weiter herabsetzt.
Arnheiter et al. berichteten in "Nature", 294, 278-280 (1981), über die Bildung von monoklonalen Antikörpern, die gegenüber einem Polypeptid gebildet (erregt) wurden, das 56 Aminosäurereste enthielt und in der Aminosäurerest-Sequenz dem Carboxy-terminalen Abschnitt eines intakten Interferon-Moleküls entsprach. Dieses 56-Mer-Polypeptid entsprach somit etwa einem Drittel der Sequenz des intakten Moleküls.
Arnheiter et al. berichteten über die Bildung von 11 monoklonalen Antikörpern. Jedoch nur einer dieser 11 monoklonalen Antikörper band sich sowohl an das Polypeptid-Immunogen als auch an das intakte Interferon-Molekül. Außerdem war die Bindung nicht sehr stark, wie anhand des 3000-fachen Überschusses an intaktem Interferon, das erforderlich war, um den Antikörper aus dem synthetsichen Polypeptid zu verdrängen, gezeigt wurde. Keiner der anderen monoklonalen Antikörper wurde an das intakte Molekül gebunden.
Außerdem waren zur Bildung der Hybridome, welche diese monoklonalen Antikörper sekretieren, die Milzen aus drei immunisierten Mäusen erforderlich. Die geringe Ausbeute an den erwünschten Interferon-bindenden monoklonalen Antikörpern und die Tatsache, daß drei Maus-Milzen erforderlich waren für die Herstellung dieser Hybridom-Zellinien zeigt, daß diese Autoren in bezug aufihre Bemühungen verhältnismäßig wenig erfolgreich waren.
Lerner et al. waren erfolgreich bei der Erzielung eines Schutzes von Tieren durch die Verwendung von Impfstoffen gegen Pathogene unter Verwendung von synthetischen Aminosäurerest-Sequenzen einer kurzen bis mittleren Länge als Immunogene (vgl. Sutcliffe et al., "Science", 219, 495-497 (1983).
Es ist jedoch klar, daß bis zu der vorliegenden Erfindung die erfolgreiche Herstellung von Hybridomen und ihrer sekretierten monoklonalen Rezeptoren sich unterscheidet von der erfolgreichen Herstellung eines Impfstoffes, der oligoklonale Rezeptoren enthält. Zur Erzielung einer hohen Ausbeute bei der monoklonalen Antikörper-Herstellung ist es daher erforderlich, B-Zellen zu stimulieren, große Mengen von aviden Antikörpern zu sekretieren. Andererseits kann für einen synthetischen Impfstoff ein breiteres Spektrum von oligoklonalen Antikörpern in geringeren Mengen und mit geringeren Aviditäten gebildet werden. Außerdem erfordert der Schutz eines Tiers gegen ein Pathogen die Aktivierung sowohl von T-Zellen als auch von B-Zellen, so daß eine zelluläre Antwort bzw. eine humorale Antwort an dem Tier induziert werden kann.
Eine populäre Erklärung des Erfolgs von ein synthetisches Polypeptid enthaltenden Impfstoffen bei der Erzeugung von Antikörpern, die intakte Proteine erkennen und Tier-Wirte schützen, umfaßt ein stochastisches Modell, bei dem die Verschiedenartigkeit der Immun-Antwort die Beobachtung eines seltenen Ereignisses erlaubt; d.h., des Polypeptids, das die Bestätigung seiner entsprechenden Sequenz in dem nativen Molekül ermöglicht. Das Konzept, daß Polypeptide mit mittlerer Länge häufig konform zu nativen Strukturen sein können, steht im Gegensatz zu theoretischen und experimentellen Studien. Es wird vielmehr angenommen, daß so1che Polypeptide als Gesamtheit einer großen Anzahl von Konformations-Übergangszuständen vorliegen, die im dynamischen Gleichgewicht stehen. Die T-Zellen-Aktivierung durch und die B-Zellen-Bildung von Antikörpern, die gebildet wurden gegen einen Teil dieser Konformations-Einheit ergeben, wie angenommen wird, einen ausreichenden Schutz bei der Impfung.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein monoklonales Rezeptor-Molekül, das sich bindet sowohl (a) an einen Protein- Liganden, der durch ein Retrovirus-Gen codiert worden ist, als auch (b) an ein Polypeptid mittlerer Länge von etwa 7 bis etwa 40, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 30 Aminosäureresten, das eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die eine Aminosäurerest-Sequenz eines Teils des Proteins entspricht, das durch ein Retrovirus-Gen codiert wird. Das Rezeptor-Molekül wird gebildet von (induziert durch) einem (ein) Immmunogen, welches das Polypeptid enthält. Am meisten bevorzugt ist es, daß das Rezeptormolekül ein monoklonaler Rezeptor, beispielsweise der IgG- oder IgM-Klasse von Immunoglobulinen ist.
Spezifische bevorzugte erfindungsgemäße monoklonale Rezeptormoleküle binden sich an die Proteine, die durch die nachstehend aufgezählten Gene codiert werden, als auch an die Polypeptide, die neben diesen Genen gegenüberstehend aufgezählt sind: Gene Polypeptide
worin die in Klammern angegebenen Aminosäurereste jeweils eine Alternative zu dem in der Formel unmitte1bar vorhergehenden Aminosäurerest darstellen;
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Rezeptormolekülen für einen Proteinmolekü1-Liganden, der durch ein Retrovirus-Gen codiert wird. Bei diesem Verfahren wird ein immunogenes Polypeptid mittlerer Länge (von etwa 7 bis etwa 40 Resten), das vorzugsweise synthetisch hergestellt worden ist, oder ein Konjugat dieses Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, bereitgestellt. Die Aminosäurerest-Sequenz dieses Polypeptids entspricht einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz eines Protein-Liganden. Dieses immunogene Polypeptid ist, wenn es als Konjugat an einen Träger von Keyhole-Limpet-Hämocyanin gebunden ist und zum Immunisieren einer Maus verwendet wird, ausreichend immunogen und antigen, um einen 50 %-Bindungs-Titer des immunisierten Maus-Serums an das Polypeptid in einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 nach drei Immunisierungen zu ergeben, von denen jede mindestens 10 ug Polypeptid in dem Konjugat enthält, und unter Verwendung eines vollständigen Freund-Adjuvans für die erste Immunisierung und von Alaun als Adjuvans bei der zweiten und bei der dritten Immunisierung.
Ein Säugetier wird mit dem immunogenen Polypeptid oder einem Konjugat dieses Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, hyperimmunisiert unter Bildung eines Hyperimmun-Serums, das einen 50 %-Bindungstiter an das Polypeptid in einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 aufweist. Die Rezeptormoleküle dieses Serums binden sich auch an den Proteinmolekü1-Liganden, dem das Polypeptid in bezug auf die Aminosäurerest-Sequenz entspricht.
Das hyperimmunisierte Säugetier wird nach der Verabreichung der Immunisierung, die einen 50 %-Bindungstiter einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 ergibt, mindestens etwa 30 Tage lang gehalten. Eine Booster-Immunisierung, beispielsweise durch intravenöse Injektion, wird danach dem Tier verabreicht.
Antikörper-bildende Zellen, beispielsweise Milzzellen (Splenozyten), des einer Booster-Immunisierung unterworfenen Säugetiers werden mit Myelom-Zellen innerhalb eines Zeitraums von etwa 3 bis etwa 5 Tagen ab dem Tag der Booster-Verabreichung fusioniert zur Herstellung von Hybridom-Zellen. Die so hergestellten Hybridom-Zellen werden analysiert (untersucht) auf die Bildung von monoklonalen Rezeptormolekülen, die sich binden an einen Proteinmolekü1-Liganden, wobei das immunogene Polypeptid in bezug auf seine Aminosäurerest-Sequenz einem Teil desselben entspricht. Vorzugsweise werden die Hybridom-Zellen auch untersucht (analysiert) in bezug auf die Bildung von monoklonalen Rezeptormolekülen, die sich an das Polypeptid binden.
Die Hybridom-Zellen, die monoklonale Rezeptormoleküle bi1den, die sich an den Proteinmolekü1-Liganden binden, werden dann kultiviert (gezüchtet) zur Herstellung einer zusätzlichen Menge an diesen Zellen. Bei der bevorzugten Praxis sind diejenigen Hybridom-Zellen, die kultiviert (gezüchtet) werden, auch solche, die monoklonale Rezeptoren bilden, die sich an das Polypeptid binden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein diagnostisches System, beispielsweise ein Kit für die Bestimmung (Messung) der Anwesenheit eines Onkoprotein-Liganden. Dieses System umfaßt mindestens eine erste Packung, die erfindungsgemäße monoklonale Rezeptormoleküle enthält. Durch Vermischen einer vorgegebenen Menge dieser Rezeptoren mit einer vorgegebenen Menge einer wäßrigen Zusammensetzung, die auf die Anwesenheit eines Onkoprotein-Liganden untersucht werden soll, entsteht ein Rezeptor-Ligand-Komplex durch eine immunologische Reaktion, wenn der Onkoprotein-Ligand eine Aminosäurerest-Sequenz enthält, die der Aminosäurerest-Sequenz des durch das Rezeptormolekül gebundenen Polypeptids entspricht. Die Anwesenheit des Komplexes kann durch eine Markierung identifiziert werden, die vorzugsweise in einer zweiten Packung des Systems enthalten ist. Eine bevorzugte, einen Onkoprotein-Liganden enthaltende wäßrige Zusammensetzung ist die Amnion-Flüssigkeit (Fruchtwasser) oder konzentrierter Urin. Das Urinkonzentrat wird leicht erhalten auf nichtinvasivem Wege und leicht eingeengt, um die Implementierung des hier beschriebenen diagnostischen Test-Sets zu erlauben. Zellen-Extrakte und Medien, die durch transformierte Zellen konditioniert worden sind, sind ebenfalls geeignete wäßrige Zusammensetzungen, die Onkoprotein-Liganden enthalten.
Ein ELISA-Assay ist eine andere in Betracht kommende Ausführungsform dieser Erfindung. Hier wird eine wäßrige Zusammensetzung, die auf die Anwesenheit eines Onkoprotein- Liganden untersucht werden soll, beispielsweise konzentrierter Urin, gebunden oder anderweitig fixiert an einer festen Matrix, wie z.B. eine Mikrotiter-Test-Vertiefung unter Bildung eines festen Trägers. Eine flüssige Lösung, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptor enthält, wird mit dem festen Träger gemischt unter Bildung einer Fest-Flüssig-Phasen-Mischung. Die Fest-Flüssig-Phasen-Mischung wird für eine Zeitspanne aufrechterhalten, die ausreicht, um den monoklonalen Rezeptor an den Onkoprotein- Liganden des festen Trägers, d.h. der an der festen Matrix fixiert ist, zu binden (damit eine Immunreaktion einzugehen). Die festen und flüssigen Phasen werden danach voneinander getrennt und die Menge des an den festen Träger gebundenen monoklonalen Rezeptors und damit die Menge des in der untersuchten Probe enthaltenen Onkoprotein-Liganden werden bestimmt. Diese Bestimmungen werden in der Regel durchgeführt unter Verwendung eines mit einem Radioisotop oder mit einem Enzym markierten Antikörpers oder mit Staphylococcus aureus-Protein A, das sich spezifisch an einen erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptor bindet.
Bei einer noch anderen Ausführungsform dieser Erfindung bilden monoklonale Rezeptormoleküle die aktiven, bindenden Abschnitte eines Affinitäts-Sorbens, das zum Binden und Reinigen von Onkoprotein-Liganden nützlich ist. Hier werden die Rezeptoren an einen festen Träger gebunden, der gegenüber dem Onkoprotein chemisch inert ist, wie z.B. Agarose oder vernetzte Agarose. Das so hergestellte Affinitäts-Sorbens kann dann mit einer wäßrigen Zusammensetzung gemischt werden, die einen Protein-Liganden enthält, unter Bildung eines reversiblen Rezeptor-Ligand-Komplexes, wenn der Protein-Ligand eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die der Aminosäurerest-Sequenz des durch den Rezeptor gebundenen Polypeptids entspricht. Der so gebildete Komplex kann danach dissoziiert werden unter Bildung des Protein-Liganden in einer gereinigten Form.
Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Nutzen und Vorteile.
Ein Nutzen der vorliegenden Erfindung besteht in monoklonalen Rezeptormolekülen, die sich an Epitope binden, die in Polypeptiden mit einer bekannten Aminosäurerest-Sequenz enthalten sind.
Ein anderer Nutzen der Erfindung besteht darin, daß monoklonale Rezeptormoleküle erzeugt (induziert) werden können, die sich an Epitope binden, die in den bekannten Aminosäurerest-Sequenzen von Protein-Liganden enthalten sind, die durch Retroviren codiert werden, wobei diese Protein-Liganden nicht benötigt werden zur Induktion der Bildung der Rezeptormoleküle.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung von monoklonalen Rezeptoren in hoher Ausbeute, die sich sowohl an ein immunogenes Polypeptid mittlerer Länge als auch an ein Proteinliganden-Molekül binden, dessen Aminosäurerest-Sequenz das Polypeptid teilweise entspricht.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist die Bereitste1lung eines diagnostischen Systems, wie z.B. eines Kits, das (der) monoklonale Rezeptormoleküle enthält, die in der Lage sind, die Anwesenheit eines Onkoproteins zu bestimmen.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist die Bereitste1lung eines diagnostischen Verfahrens, das durchgeführt werden kann unter Verwendung von Körperproben, die auf nicht-invasivem Wege erhalten wurden.
Ein anderer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, daß Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten nachgewiesen werden können, was eine differentielle und sehr genaue Bestimmung der genauen Onkogene, die innerhalb des Organismus exprimiert werden, erlaubt.
Noch weitere Nutzen und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den nachfolgenden Patentansprüchen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen, die einen Teil dieser Offenbarung darstellen, zeigen:
Die Fig. 1 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zur Bestimmung der Anwesenheit des ST-FeSV-v-fes-Onkoproteins erläutert. Zellextrakte von etwa 10&sup5; MSTF-Zellen, eine produktiv transformierte Nerz-Zellinie, die mit dem Snyder-Theilen-Stamm des Katzen-Sarcom-Virus (ST-FeSV) und dem Katzen-Leukämie-Virus-B (FeLV-B) infiziert worden sind [Sen et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80, 1246-1250 (1983)] wurden auf einem 5-17 % Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und dann auf Nitrocellulose-Platten übertragen. Die übertragenen Proteine wurden dann mit den überstehenden Flüssigkeiten aus Hybridom-Gewebe-Kulturen, als S10F03 (Streifen 1) oder S22C06 (Streifen 2) bezeichnet, oder mit einem Antiinfluenza-Hämagglutinin-Hybridom, das als negative Kontrolle verwendet wurde, umgesetzt. Dieses Verfahren aus Polyacrylamidge1-Trennung und nachfolgende Übertragung auf Nitrocellulose und Sichtbarmachung wird nachstehend als Western-Transfer(Western-Blot)-Verfahren bezeichnet. Die Sichtbarmachung des Proteins wurde wie in dem weiter unten folgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben durchgeführt.
Die Fig. 2 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zum Nachweis der Anwesenheit des FeSV-Fusionsproteins, als p85 (85 Kilodalton; 85 K-Dalton) bezeichnet, durch Western-Transfer-Verfahren ähnlich wie diejenigen der Fig. 1 erläutert. Zellextrakte von etwa 2 x 10&sup6; MSTF-Zellen wurden in einem 5 - 17 % Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Streifen übertragen. Die Streifen aus Nitrocellulose wurden mit 5 ml jeder überstehenden Hybridom-Kulturflüssigkeit, verdünnt im Verhältnis 1:50, aus Hybridomen, bezeichnet als S10F03 (Streifen A); P43D09 (Streifen B); P42C10 (Streifen C); P44E11 (Streifen D) oder mit R&sub2;06B08, einem einen Anti- Rauscher gp70 Protein-Rezeptor-bildenden Hybridom [Niman und Elder, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 77, 4524-4528 (1980)] als negative Kontrolle (Streifen E) inkubiert.
Die Bindung wurde sichtbar gemacht durch Zugabe von mit Peroxidase markiertem Kaninchen-Antimaus-IgG, wie in dem nachstehenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" erläutert. Der Hinweis "p85-" auf der linken Seite der Fig. 2 erläutert die Wanderungsposition des 85k Dalton ST-FeSV- Polyproteins, das durch das fes-Gen codiert wurde.
Wie aus den Proteinen in dem Streifen E ersichtlich, erlaubt dieses Verfahren die Sichtbarmachung von Proteinmolekülen, die durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren nicht spezifisch gebunden sind. Die Subtraktion der nicht-spezifisch gebundenen Proteine, die in dem Streifen E sichtbar gemacht worden sind, von den in den Streifen A bis D sichtbar gemachten Proteinen zeigt, daß das einzige spezifisch gebundene Protein das durch v-fes codierte P85-Onkoproteins ist.
Die Fig. 3 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen Immunpräzipitations-Assay zur Bestimmung der Anwesenheit des mit ³²P-markierten FeSV-Fusionsproteins, als p85 bezeichnet, erläutert. CCL64 Nerz-Zellen (MSTF-Zellen; Streifen B und D) oder diejenigen, die mit FeLV-B und FeSV (MSTF-Zellen; Streifen A und C) infiziert worden sind, wurden jeweils 2 h lang mit 1 Mikrocurie ³²P markiert. Die markierten Zellextrakte wurden dann mit 5 ul Ziegen-Anti- FeLV p15-Antikörpern (Streifen A und B) oder mit 50 ul der überstehenden Flüssigkeit des kultivierten Hybridoms S10F03 (Streifen C und D) inkubiert. Die so hergestellten Immunkomplexe Wurden gesammelt unter Verwendung von Staphylococcus aureus-Bakterien, die Protein A exprimieren. Die so gesammelten ausgefällten Komplexe wurden gewaschen und dann in ihre Komponententeile dissoziiert. Die Proteine wurden anschließend unter Anwendung einer reduzierenden denaturierenden Elektrophorese analysiert unter Verwendung eines 5 - 17 % Polyacrylamid-Gels. Die Hinweise "p85-" und "pr65-" auf der linken Seite der Fig. 3 zeigen die Wanderungspositionen des 85K Dalton ST-FeSV-Fusionsproteins, das durch das fes-Gen codiert wird, und das 65K Dalton FeLV gag-Vorläufer-Protein.
Die Fig. 4 zeigt ein Diagramm, das die Immunreaktivitäten von oligoklonalen Antikörpern, die von synthetischen Polypeptiden gebildet (induziert) worden sind, die in ihrer Aminosäurerest-Sequenz entsprechen (i) den Positionen 139 bis 155 der vorhergesagten Sequenz des Simian-Sarcom-Virus-Transformations-Proteins, als p28sis bezeichnet [Devare et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 731-735 (1983)], nachstehend als Polypeptid (c) und als PDGF-2(73- 89) identifiziert, und (ii) den Resten 2 bis 18 der vorhergesagten Aminosäurerest-Sequenz des Voge1-Myeloblastose-Virus-Onkoproteins [Rushlow et al. "Science", 216, 1421-1423 (1982)], nachstehend als Polypeptid (d) identifiziert, erläutert. Die mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) konjugierten synthetischen Polypeptide wurden zum Immunisieren von Mäusen, wie allgemein in dem weiter unten folgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" erläutert, verwendet.
Um die Spezifität der so hergestellten, oligoklonale Antikörper enthaltenden Seren zu untersuchen, wurden 250 ng nicht-konjugiertes Polypeptid oder 500 ng KLH auf dem Boden von Mikrotiter-Vertiefungen getrocknet und mit Methanol fixiert, wie von Niman und Elder in "Monoklonal Antibodies and T Cell Products", Auflage Katz, CRC Press, Boca Raton, Florida, S. 23-51 (1982), beschrieben. Die übrigen Abschnitte der Vertiefungen wurden gegen nicht-spezifische Protein-Adsorption blockiert unter Verwendung eines 3 %igen Rinderserumalbumins (BSA) und Anwendung einer 4- stündigen Inkubationsperiode bei 37ºC.
In jede Vertiefung der Mikrotiter-Platte wurden 25 ul jeder der Zweifach-Verdünnungen von immunisierten Maus-Seren, beginnend mit einer Verdünnung von 1:400, unter Verwendung eines Gewebekultur-Mediums, ergänzt mit einem 10 % Föta1-Kalbs-Serum, beträufelt und 16 h lang bei 25ºC mit dem BSA-blockierten Polypeptid oder KLH inkubiert. Nach 10 maligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 25 ul Kaninchen-Antimaus-Kappa-Antikörper (Litton Bionics Inc., Kensington, Maryland, USA), verdünnt im Verhältnis 1:500 mit 1 % BSA in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) zugegeben und 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Nach weiterem 10-maligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 25 ul Ziegen-Antikaninchen-IgG, konjugiert an Glucose-Oxidase, und verdünnt im Verhältnis 1:500 mit 1 % BSA in PBS zugegeben und 1 h lang bei 37ºC inkubiert.
Die so gebundene Menge an Glucose-Oxidase wurde bestimmt durch Zugabe von 50 ul einer Lösung, die 100 ug/ml ABTS- Farbstoff (Boehringer-Mannheim) enthielt, in Gegenwart von 1,2 % Glucose und 10 ug/ml Meerrettich-Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0. Die optischen Dichten der so hergestellten Lösungen wurden bei 414 nm abgelesen unter Verwendung eines Titertech-Mikroscanners (Flow Laboratories Inc., Inglewood, Californien, USA).
Die Bindungen, welche die oligoklonalen Antikörper in Seren aufwiesen gegenüber den sis-verwandten und myb-verwandten Polypeptiden sind durch leere bzw. ausgefüllte Symbole dargestellt. Die Antikörper-Antigene sind:
sis-verwandtes Polypeptid (c) (O, );
myb-verwandtes Polypeptid (d) ( , ); und
KLH ( , ).
Die Fig. 5 zeigt eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zur Bestimmung der Anwesenheit des nicht-reduzierten u nd reduzierten, aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktors (PDEF) unter Verwendung von Maus-Antiseren, die oligoklonale Antikörper (Rezeptoren) enthalten, die durch die synthetischen Polypeptide (c) und (d) als Sonden induziert worden sind, erläutert. Der PDGF-Extrakt wurde von gealterten (outdated) Blutplättchen gereinigt, wie in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben.
Der gereinigte PDGF-Extrakt aus etwa 2,5 Einheiten Blutplättchen wurde mit einem minimalen Volumen einer Lösung gemischt, die 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 % 2- Mercaptoethanol enthielt. Die resultierende Mischung wurde 2 min lang zum Sieden erhitzt und dann in einem 5 - 17 % Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Das Protein wurde danach elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen [Niman und Elder, "Virology", 123, 187-205 (1982)], die danach in Streifen geschnitten wurde, unter Anwendung des Western Transfer-Verfahrens.
Die so hergestellten Nitrocellulose-Streifen wurden dann mit einer Lösung, enthaltend 3 % BSA, 0,1 % Polyoxyethylen-(9)-octylphenyläther (Triton X-100, Rohm und Haas Company, Philadelphia, PA, USA) in PBS, behandelt, um eine nicht spezifische Protein-Bindung zu inhibieren. Dann wurden 4 ml Maus-Antiserum, verdünnt im Verhältnis 1:200, mit den Nitrocellulose-Streifen inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit einer Lösung von 0,1 % Triton X-100 in PBS wurden die Nitrocellulose-Streifen entweder mit 10&sup6; Zählern pro Minute von ¹²&sup5;J-markiertem Staphylococcus aureus-Protein A (Streifen 2 und 3) oder einer 1:1000-Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Antimaus-Serum (Tago, Inc., Burlingame, Californien, USA) inkubiert und erneut mit 0,1 % Triton X-100 in PBS gewaschen. Das Peroxidase-Konjugat wurde mit einer Lösung, enthaltend 0,0009 % H&sub2;O&sub2;, 0,0025 % 3,3'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid (Eastman-Kodak Co., Rochester, New York, USA) in einem 10 mmolaren Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 entwickelt. Die mit ¹²&sup5;J-markierten Streifen wurden entwickelt durch Auflegen auf einen XRP-1-Film (Eastman-Kodak Co., Rochester, New York, USA) unter Verwendung von Cronex Hi-Plus-Verstärkerschirmen (E.I. DuPont de Nemours & Co., Wilmington, Delaware) USA) bei -70ºC für 48 h.
Der Streifen 1 enthält das mit Amido-Ruß verfärbte Gesamt- Protein. Der gereinigte Blutplättchen-Extrakt ist dargestellt nach dem Versetzen mit Antiseren, die gegenüber dem sis-verwandten Polypeptid (c) (Streifen 2 und 4) oder gegenüber dem myb-verwandten Polypeptid (d) (Streifen 3 und 5) als Negativkontrolle gebildet (induziert) wurden. Die äußeren Molekulargewichts-Standards auf der Basis von BSA, Ovalbumin, Chymotrypsinogen und β-Lactoglobulin sind auf der linken Seite angegeben.
Die Fig. 6 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von PDGF unter Anwendung eines Western-Transfer- Verfahrens erläutert ähnlich demjenigen, wie es weiter oben beschrieben wurde. Der PDGF wurde in Gegenwart (Streifen A - F) oder Abwesenheit (Streifen G - L) von 10 % 2-Mercaptoethanol zum Sieden erhitzt vor Durchführung der elektrophoretischen Protein-Trennung nach Verfahren, wie sie in Niman, "Nature", 307, 180-183 (1984), beschrieben sind. In den Streifen A und G und in den Streifen B und H wurden zwei oligoklonale Antikörper entha1tende Antiseren verwendet, die durch die Amino-terminalen 12 Aminosäurereste von PDGF-1 [(als PDGF-1 (1-12) bezeichnet] induziert wurden. In den Streifen D und J und in den Streifen E und K wurden zwei oligoklonale Antikörper enthaltende Antiseren verwendet, die durch ein Polypeptid aus einem zentralen Abschnitt von PDGF-2 [als PDGF-2(73- 89) und Polypeptid (c) bezeichnet], welcher der Aminosäurerest-Sequenz in den Positionen 139 bis 155 von p28sis entspricht, induziert worden waren. In den Streifen C und I bzw. in den Streifen F und L wurden oligoklonale Antikörper enthaltende Antiseren verwendet, die induziert worden waren durch die Amino-terminalen 17 Reste von PDGF-2 [als PDGF-2(1-17) bezeichnet] und durch die 20 Reste von PDGF-2, die bei den 36-16-Resten ab dem Carboxy-Terminus angeordnet waren [als PDGF-2(126-145) bezeichnet], die der Sequenz in den Positionen 192 bis 211 von p28sis entsprachen. Die Antikörper-Bindung an die Proteine wurde sichtbar gemacht unter Verwendung von Kaninchen-Antimaus-IgG&sub1;, gefolgt von 10&sup6; cpm ¹²&sup5;J-markiertem Staphylococcus aureus- Protein A, wie von Niman, supra, und in dem nachfolgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben.
Auf ähnliche Weise wie in Fig. 6 beschrieben wurde ein immunologischer Assay durchgeführt zur Bestimmung der Anwesenheit eines 70 000 Dalton Proteins in drei Zellinien unter Anwendung eines Western-Transfer-Verfahrens (Daten nicht dargestellt). Ein Extrakt aus etwa 10&sup6; Zellen pro Streifen jeweils aus SSV-transformierten NIH 3T3-Zellen, TRD1-Zellen (einer spontan transformierten Balb/3T3-Zellinie) und MSTF-Zellen [einer Nerz-Lungen-Zellinie (CCL64), die produktiv mit FeLV-B und dem Snyder-Theilen Stamm von FeSV infiziert worden waren] wurde auf Nitrocellulose- Platten unter Anwendung eines Western-Transfer-Verfahrens übertragen. Es wurden oligoklonale Antikörper enthaltende Antiseren, induziert durch PDGF-1(1-12) und PDGF-2(73-89) verwendet. Die Antiseren wurden mit 100 ug der Polypeptide PDGF-1(1-12), PDGF-2(1-17) und PDGF-2(73 - 89) inkubiert, bevor eine Immunreaktion mit den transferierten Zellextrakten durchgeführt wurde. Die Proteine wurden wie für Fig. 6 beschrieben sichtbar gemacht.
Die Fig. 7 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von p20sis in Kulturmedien erläutert, die getrennt konditioniert wurden durch SSV-transformierte normale Ratten-Nieren-Zellen und normale Ratten-Nieren (NRK)-Zellen.
Die Proteine aus den konzentrierten Medien, die äquivalent waren zu 25 ul der nicht-konzentrierten Medien, konditioniert durch SSV-transformierte Zellen (Streifen A, C, E und G) oder durch NRK-Zellen (Streifen B, D, F und H) wurden voneinander getrennt und auf Nitrocellulose übertragen unter Anwendung des Western-Transfer-Verfahrens. Die übertragenen Proteine wurden dann mit oligoklonale Antikörper enthaltenden Antiseren, induziert durch PDGF-2(1-17) (Streifen A-D) und PDGF-2(73-89) (Streifen E-H), gemischt. Die Seren wurden mit 100 ug Polypeptiden PDGF-2(73-89) (Streifen A, B, G und H) und PDGF-2(1-17) (Streifen C, D, E und F) inkubiert, bevor eine Immunreaktion mit den übertragenen Proteinen durchgeführt wurde. Die Immunreaktionen wurden wie für Fig. 6 beschrieben sichtbar gemacht. Die Bezeichnung "p20sis" auf der linken Seite der Fig. 8 zeigt die Position von p20sis an.
Die Fig. 8 ist eine Photographie eines Autoradiogramms, das einen immunologischen Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von Proteinen erläutert, die codiert werden durch oder verwandt sind mit sis- und fes-Antiseren in Urin aus Human-Krebspatienten. Die Körperflüssigkeitsprobe in diesem Assay war ein Urinkonzentrat, das wie in dem nachfolgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben erhalten wurde. Der konzentrierte Urin wurde in einem 5 - 17 % Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen.
Der Urin von drei Spendern wurde 200-fach eingeengt, dialysiert und 20 ul jedes Konzentrats wurden elektrophoretisch behandelt und die Proteine darin wurden auf Nitrocellulose übertragen, wie oben beschrieben. Diese drei Spender wiesen einen rektalen Tumor (Streifen A, D, G und J), einen Lebertumor (Streifen B, E, H und K) und ein Cholongiocarcinom (Streifen C, F, I und L) auf. In den Streifen D-F wurde ein einen oligoklonalen Rezeptor enthaltendes Antiserum, induziert durch das sis-verwandte Polypeptid PDGF-2(73-89), das mit dem immunisierten Polypeptid vorinkubiert worden war, verwendet, während in den Streifen A-C das gleiche Antiserum verwendet wurde, das mit dem fes-verwandten Polypeptid, entsprechend der Sequenz, die in den Positionen 744-759 des v-fesST-Onkoproteins angeordnet ist, vorinkubiert worden war. In entsprechender Weise wurde ein oligoklonale Rezeptoren enthaltendes Antiserum, induziert durch das obengenannte fesverwandte Polypeptid, das mit dem immunisierenden Polypeptid vorinkubiert worden war, in den Streifen G-I verwendet, während das gleiche Antiserum, das mit dem obengenannten sis-verwandten Polypeptid vorinkubiert worden war, in den Streifen J-L verwendet wurde. Die Immunreaktion (Bindung) zwischen den oligoklonalen Rezeptoren und den Proteinen wurde wie für Fig. 6 beschrieben sichtbar gemacht. Die Positionen der in den Urinkonzentraten nachgewiesenen sis- und fes-verwandten Proteine sind auf den linken und rechten Rändern jeweils durch die Bezeichnungen "sis" bzw. "fes" angegeben.
Die Fig. 9, 10 und 11 zeigen Tabellen, die Aminosäure-Sequenzen von drei konservierten Regionen von Onkoproteinen, die eine Proteinkinase-Aktivität aufweisen, enthalten. Diese Regionen werden in den Figuren 9, 10 und 11 jeweils als "konservierte Kinase-Region" 1, 2 bzw. 3 bezeichnet. Das ein Onkoprotein mit einer Proteinkinase-Aktivität codierende Onkogen wird durch sein übliches Symbol in der linken Spalte angegeben. Die mittlere Spalte zeigt die Anordnung in der Onkoprotein-Sequenz ab dem Amino-Terminus der konservierten Aminosäurerest-Sequenz. Die rechte Spalte zeigt die Aminosäurerest-Sequenzen von links nach rechts und in Richtung ab dem Amino-Terminus bis zu dem Carboxy-Terminus dieser konservierten Regionen. Die Aminosäurerest-Sequenzen sind auch die Sequenzen der Polypeptide, die als Immunogene für die induzierende Bildung der erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren geeignet sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale Rezeptormoleküle für Onkoprotein-Liganden, auf ein generelles Verfahren zur Induktion oder Bildung solcher Rezeptoren und auf Produkte und Verfahren, in denen diese Rezeptoren verwendet werden. Die hier häufig verwendeten Ausdrücke werden nachstehend definiert.
Rezeptor - ein "Rezeptor" ist ein biologisch aktives Molekül, das sich an einen Liganden bindet. Die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle sind intakte oder im wesentlichen intakte Antikörper oder Idiotyp-enthaltende Polyamid-Abschnitte von Antikörpern. Die biologische Aktivität eines Rezeptormoleküls wird nachgewiesen durch die Bindung des Rezeptors an seinen antigenen Liganden bei ihrem Mischen in einem wäßrigen Medium, mindestens bei physiologischen pH-Werten und Ionenkonzentrationen. Vorzugsweise binden sich die Rezeptoren auch an den Antigen-Liganden innerhalb eines pH-Wertbereiches von etwa 5 bis etwa 9 und bei Ionenkonzentrationen, wie z.B. denjenigen von destilliertem Wasser bis zu denjenigen von etwa 1 molarem Natriumchlorid.
Idiotyp-enthaltende Polypeptid-Abschnitte (Antikörper- Verbindungs-Stellen) von Antikörpern sind solche Abschnitte von Antikörpermolekülen, die den Idiotyp enthalten und sich an den Liganden binden und sie umfassen die Fab- und F(ab')&sub2;-Abschnitte der Antikörper. Die Fab- und F(ab')&sub2;-Abschnitte der Antikörper sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und sie werden hergestellt durch Reagierenlassen von Papain bzw. Pepsin mit im wesentlichen intakten Antikörpern unter Anwendung an sich bekannter Verfahren (vgl. z.B. das US-Patent Nr. 4 342 566 (Theofilopolous und Dixon)). Intakte Antikörper sind bevorzugt und werden für die Erläuterung der erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle verwendet.
Monoklonaler Rezeptor - ein "monoklonaler Rezeptor" (Mab) ist ein Rezeptor, der durch Klone einer Einzelzelle, als Hybridom bezeichnet, gebildet wird, das nur eine Art eines Rezeptormoleküls sekretiert. Die Hybridom-Zelle wird fusioniert aus einer einen Antikörper bildenden Zelle und einer Myelom-Zelle oder einer anderen sich selbst fortsetzenden Zellinie. Solche Rezeptoren wurden zuerst beschrieben von Kohler und Milstein, "Nature", 256, 495-497 (1985), auf deren Beschreibung hier Bezug genommen wird.
Oligoklonaler Rezeptor - ein "oligoklonaler Rezeptor" ist ein Rezeptor, der induziert wird durch und sich bindet an mehr als ein Epitop an einem Polypeptid mittlerer Länge von beispielsweise einer Länge von etwa 7 bis etwa 40 oder vorzugsweise etwa 10 bis etwa 30 Aminosäureresten. Oligoklonale Rezeptoren sind in der Regel ein Gemisch von Rezeptoren, die durch mehr als eine Zelle gebildet werden. Die so gebildeten oligoklonalen Rezeptoren sind in der Regel mehr Epitop-spezifisch in Ihrer Bindung als die polyklonalen Rezeptoren, die durch Geamtproteinmoleküle gebildet (induziert) wurden, die über die gesamte Länge der Proteinkette oder -ketten Epitop-Regionen aufweisen können. Tiere, die mit den erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptiden immunisiert worden sind, bilden Seren, die oligoklonale Rezeptoren (Antikörper) enthalten.
Ligand - ein "Ligand" ist das Protein oder Polypeptid, an das sich ein erfindungsgemäßer Rezeptor bindet.
Entsprechend - der Ausdruck "entsprechend", wie er hier in Verbindung mit Aminosäurerest-Sequenzen verwendet wird, bedeutet, daß die Aminosäurerest-Sequenz eines ersten Polypeptids oder Proteins ausreichend ähnlich ist der Aminosäurerest-Sequenz, die in einem zweiten Polypeptid oder Protein enthalten ist, so daß Rezeptoren, die durch das erstgenannte gebildet (induziert) werden (beispielsweise auf einem anitgenen synthetischen Polypeptid) sich immunologisch an das letztgenannte (beispielsweise ein Onkoprotein) binden, wenn die zwei in einer wäßrigen Zusammensetzung miteinander gemischt werden.
Die ein Epitop enthaltenden Aminosäurerest-Sequenzen der entsprechenden ersten und zweiten Polypeptide oder Proteine sind am meisten bevorzugt identisch. Es können aber auch Änderungen, vorzugsweise konservative, in Aminosäureresten und Deletionen oder Additionen von Resten innerhalb des Epitops vorgenommen werden und sie erlauben noch die Überkreuzreaktion eines Rezeptors mit dem ersten Polypeptid oder eines Proteins mit dem zweiten, wie an sich bekannt. Konservative Änderungen in Aminosäureresten sind allgemein bekannt und sie umfassen den Austausch von Resten zwischen Lysin (Lys; K) und Arginin (Arg; R) zwischen Asparaginsäure (Asp; D) und Glutaminsäure (Glu; E), zwischen Leucin (Leu; L) und Isoleucin (Ile; I) und dgl.
Die hier verwendbaren Polypeptide werden häufig als solche beschrieben, die eine Aminosäurerest-Sequenz aufweisen, die einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz eines Proteins entspricht. Solche Polypeptide enthalten vorzugsweise nur Aminosäurereste, die diesem identisch entsprechen, zusätzlich zu terminalen Resten, wie Cys-Resten, die zum Binden oder Verbinden des Polypeptids mit einem Träger verwendet werden. Zusätzliche Aminosäurereste, die den Resten in dem Protein nicht entsprechen, können an den Polypeptid-Enden ebenfalls vorhanden sein, die Verwendung solcher Reste, obgleich sie hier in Betracht gezogen wird, ist in der Regel jedoch überflüssig und nicht bevorzugt.
In entsprechender Weise werden Proteine beschrieben als solche, die eine Aminosäurerest-Sequenz aufweisen, wobei ein Teil derselben der Aminosäurerest-Sequenz eines Polypeptids entspricht. Diese Terminologie dient dazu, die gleiche Beziehung zwischen dem Polypeptid und dem Protein, wie weiter oben diskutiert, zu implizieren.
Manchmal werden hier die vollständigen Namen für die einzelnen Aminosäurereste verwendet ebenso wie die bekannten 3-Buchstaben-Abkürzungen. Die 1-Buchstaben-Symbole für die Aminosäurereste werden am häufigsten verwendet. Die nachfolgende Korrespondenz-Tabelle gibt für jeden der hier genannten Aminosäurereste den vollständigen Namen sowie die Abkürzungen und Symbole an. Korrespondenz-Tabelle Aminosäure 3-Buchstaben-Abkürzung 1-Buchstaben-Symbol Alanin Arginin Asparagin Asparaginsäure Asparagine + Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glutamin + Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin
(A.L. Lehninger, "Biochemistry", Worth Publishers Inc., N.Y., N.Y., 1970).

1. Bildung von monoklonalen Rezeptoren

Wie oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung monoklonale Rezeptormoleküle, die sich an ein immunogenes Polypeptid mittlerer Länge von beispielsweise etwa 7 bis etwa 40, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 30 Resten, sowie an einen Proteinmolekül-Liganden, von dem ein Teil seiner Aminosäurerest-Sequenz der Aminosäurerest-Sequenz dieses Polypeptids entspricht, binden. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren werden gebildet oder induziert durch Verwendung eines immunogenen Polypeptides oder Konjugats dieses Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist; das immunogene Polypeptid enthält eine Aminosäurerest-Sequenz mittlerer Länge, die einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz des Proteininolekül-Liganden entspricht.
Die epitope Lokalisierung von monoklonalen Antikörpern bringt technische Probleme mit sich. Monoklonale Antikörper zu den ganzen Bakterien-Gen-Produkten können mit zwei unterschiedlichen Typen von Immunogenen, nativen oder denaturierten, gebildet werden. Die Verwendung eines nativen Proteins bringt die schwerwiegendsten technischen Probleme in bezug auf die Reinigung und die nachfolgende Epitop- Kartierung mit sich. Der Hauptvorteil der Verwendung eines nativen Proteins ist die Bildung von monoklonalen Antikörpern, welche die biologische Funktion des Target-Proteins blockieren.
Das in Bakterien gebildete onkogene Produkt ist in der Regel strukturell nicht das gleiche wie das in höheren Organismen synthetisierte Gen-Produkt. Ein direkter Nachweis für diesen Unterschied liefert die Analyse des sis-Gen- Produkts. In Säugetierzellen wird das p28sis schnell zerlegt (gespalten) in p20sis. Im Gegensatz dazu wird bakterielles p28sis nicht zerlegt (gespalten), noch bildet es ein Dimer. Der indirekte Nachweis für die Unterschiede zwischen anderen onkogenen Produkten, die in Bakterien- oder Vogel-Zellen gebildet werden, liefert die Beobachtung, daß monoklonale Antikörper, die gebildet wurden gegenüber dem von E. coli gebildeten Protein-Produkt sich viel wirksamer an das Immunogen binden als an das Protein, das in transformierten Hühner-Zellen synthetisiert wurde, obgleich das Immunogen denaturiert wurde.
Obgleich die Reinigung von denaturiertem Protein technisch einfacher ist, können somit die resultierenden Antiseren einzelne Konformationen an dem bakteriellen Gen-Produkt erkennen. Diese Beobachtung bringt schwerwiegende technische Schwierigkeiten für Epitop-Kartierungs-Studien mit sich.
In Versuchen, das Epitop der Antikörper zu definieren, werden Protein-Fragmente verwendet, die durch partielle Proteolyse oder Expression von subgenomischen Fragmenten gebildet werden. Obgleich die Kartierung von Epitopen unter Verwendung von Protein-Fragmenten zuerst gezeigt wurde von Niman und Elder, 1980, konnte nur eine Annäherung an die Bindungsstellen vorgenommen werden, selbst wenn mehrere Digests mit einer großen Gruppe von monoklonalen Antikörpern untersucht (getestet) wurden. Die Immunisierung selbst mit Protein-Fragmenten beschränkt somit die Definition der Bindungsstelle. Außerdem besteht keine Garantie, daß die interessierenden Regionen monoklonale Antikörper induzieren.
Im Gegensatz dazu gewährleistet die Immunisierung mit geeigneten Polypeptiden mit einer bekannten Aminosäurerest- Sequenz, wie sie hier durchgeführt wird, die Bildung von Antikörpern (Rezeptoren), die eine Immunreaktion mit gut definierten Regionen, d.h. mit Regionen, die den Sequenzen der immunisierenden Polypeptide entsprechen, eingehen.
Die Kartierung von Epitopen läßt vermuten, daß eine Änderung des Epitops durch eine Aminosäure deutlich verschiedene Reaktivitäten erzeugen kann, während andere Studien zeigen, daß Überkreuz-Reaktivitäten erhalten werden, wenn ein oder mehr Aminosäurereste innerhalb des Epitops verschieden sind. Außerdem können durch Immunisierung des gleichen Mäuse-Stammes mit dem gleichen synthetischen Polypeptid unterschiedliche Reaktivitäten, die in dem Serum nachgewiesen werden, erzeugt werden.
Hybridome, die mit synthetischen Polypeptiden gebildet werden, bilden ebenfalls monoklonale Rezeptoren, die mit dem intakten Protein unter einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen reagieren, weil die Erkennung weitgehend Konformations-unabhängig ist. Deshalb können ein Western-Transfer, ein Punkt-Blot, fixierte Zellen und fixierte Gewebe und Körperflüssigkeiten, wie die Amnion-Flüssigkeit und Urin, entweder konzentriert oder so wie erhalten nachgewiesen (bestimmt) werden ebenso wie native Proteine. Ferner erlauben die bekannten, genau definierten Aminosäurereste in dem Epitop die Isolierung von Antikörpern, die einzelne Aminosäureänderungen unterscheiden können, weshalb sie ein Mittel zur Bestimmung der Signifikanz von beschränkten Änderungen in konservierten Regionen von verwandten Proteinen darstellen.
Monoklonale Antikörper gegen synthetische Polypeptide ergeben ebenfalls ein Mittel für Kartierungsstellen der Protein-Wechselwirkung. Es wurde über differentielle Kopräzipitationen von Molekülen, assoziiert mit dem pp60src berichtet, was eine Identifizierung der Regionen von src- Proteinen vermuten läßt, die an diesen Wechselwirkungen beteiligt sind.
Die Bildung von monoklonalen Antikörpern (Rezeptoren) mit einem immunogenen synthetischen Polypeptid gewährleistet somit die Isolierung von Antikörpern, die eine Immunreaktion mit Domänen eingehen, die durch die Sequenz des immunisierenden Polypeptids definiert sind, erfordert keine komplexen Verfahren zur Isolierung des entsprechenden immunogenen Onkoproteins oder zur Identifizierung der Epitop-Stelle dieses Onkoproteins und bildet Rezeptoren, die das onkogene Produkt in einer Konformations-unabhängigien Weise erkennen, wobei alle diese Merkmale die Anwendung dieser Rezeptoren für eine Vielzahl von Studien erweitern.
Es wurde weiter oben darauf hingewiesen, daß, obgleich das Schützen eines Tier-Wirts durch die Verwendung von immunogenen Polypeptiden als aktive Agentien in Impfstoffen als möglich dargestellt wurde, die Möglichkeit der Verwendung solcher immunogener Polypeptide zur Bildung von Hybridom- Gewebekulturen in hohen Ausbeuten, die avide monoklonale Antikörper (Mabs) sekretieren, bisher nicht als wahrscheinliche Möglichkeit angesehen wurde. Da jeder Mab von einer einzelnen Zelle stammt, entsteht nur eine Spezifität, wobei das Verhältnis zwischen der Anzahl der Klone, die Antipolypeptid-Antikörper bilden, die auch das intakte Protein-Molekül erkennen, und der Gesamtanzahl der das Polypeptid erkennenden Klone eine vernünftige Abschätzung der wahren Konformations-Häufigkeit des Polypeptids ergeben kann.
Die hier beschriebenen Ergebnisse stehen im Gegensatz zu dem obengenannten stochastischen Modell und die Häufigkeit, mit der die hier verwendeten Polypeptide mittlerer Länge eine Konformation annehmen ähnlich derjenigen des nativen Proteins, ist viel höher als früher erwartet. Die Häufigkeit der Bildung von Hybridomen, deren Mabs sowohl das synthetische Polypeptid, durch das sie gebildet (induziert) wurden, als auch das intakte Molekül erkennen, ist um etwa 4 Größenordnungen (etwa 10 000 mal) höher als durch die stochastische Theorie vorausgesagt.
Es sei auch darauf hingewiesen, daß verschiedene Arbeiter immunogene Polypeptide verwendet haben zur Bildung (Induzierung) von Antikörpern, die diese Polypeptide über mehrere Dekaden erkennen. Außerdem wurde der obengenannte Artikel von Kohler und Milstein bezüglich der Bildung von monoklonalen Antikörpern 1975 publiziert. Seit diesem Zeitpunkt, 1975, haben Arnheimer et al, supra, einen Versuch beschrieben zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung eines Polypeptid-Immunogens. Wie oben angegeben, müssen die Ergebnisse von Arnheimer et al als Fehlschlag insofern angesehen werden, als bei diesen Autoren die Verwendung der Milzen von drei immunisierten Mäusen erforderlich war und sie nur einen IgG-Typ eines monoklonalen Antikörpers erhielten, der ihr großes 56-Mer- Polypeptid sowie das Protein, dessen Sequenz das Polypeptid entsprach, erkannte.
Es wird angenommen, daß die relative Seltenheit von publizierten Berichten, die sich auf die Herstellung von monoklonalen Rezeptoren beziehen, die aus immunogenen Polypeptiden hergestellt wurden, die sowohl das Immunogen als auch einen Protein-Liganden erkennen, dessen Aminosäure- Sequenz dem immunogenen Polypeptid teilweise entspricht, auf mindestens zwei Faktoren zurückzuführen ist. Erstens, die vorherrschende Meinung nach dein stochastischen Modell, daß nur wenige, wenn überhaupt derartige monoklonale Antikörper hergestellt werden können. Zweitens, die Tatsache, daß Arbeiter, wie Arnheiter et al, s. oben, über kein Verfahren verfügten, das für die Herstellung der monoklonalen Rezeptoren geeignet war, insofern als die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren, die von Polypeptiden gebildet (induziert) werden, anders hergestellt werden als monoklonale Antikörper, die von Gesamtproteinen hergestellt werden.
Um erfolgreich monoklonale Rezeptoren der Ig-Klasse herzustellen, die sowohl das immunogene Polypeptid als auch den Protein-Liganden erkennen, dessen Aminosäurerest-Sequenz das Polypeptid teilweise entspricht, sollten die nachstehend angegebenen Stufen durchgeführt werden.
Es wird ein immunogenes Polypeptid allein oder ein Konjugat dieses Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, bereitgestellt. Dieses Polypeptid weist eine Aminosäurerest-Sequenz mittlerer Länge, beispielsweise von etwa 7 bis etwa 40 Aminosäurereste, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 30 Aminosäurereste, auf. Die Aminosäurerest-Sequenz des immunogenen Polypeptids entspricht einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz eines Proteinmolekül-Liganden, wie z.B. eines Onkoproteins. Obgleich das immunogene Polypeptid selbst als Ligand verwendet werden kann, ist es bevorzugt, das Polypeptid-Immunogen in Form eines Konjugats, gebunden an einen Träger, wie z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Albumine, wie Rinderserumalbumin (BSA), Human- Serumalbumin (HSA), rote Blutkörperchen, wie Schaf-Erythrozyten, Tetanus-Toxoid und Edestin sowie Polyaminosäuren, wie Poly(D-Lysin: D-Glutaminsäure) und dgl., zu verwenden.
Die Immunogenizität und Antigenizität des Polypeptids kann getestet werden durch Binden des Polypeptids an einen Keyhole-Limpet-Hämocyanin-Träger in Form eines Konjugats und anschließende Verwendung des so hergestellten Konjugats zum Immunisieren einer Maus. Das immunisierende Polypeptid oder Konjugat wird in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel, wie einer normalen Salzlösung, einer Phosphat-gepufferten Salzlösung oder dgl., wie sie an sich bekannt sind, gelöst oder dispergiert. Ein Adjuvans, wie nachstehend erläutert, ist in dem Inokulum, das für die Immunisierungen verwendet wird, ebenfalls enthalten.
Ein verwendbares Polypeptid ist ausreichend immunogen und antigen für die Bildung eines 50 %-Bindungstiters des oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiserums einer immunisierten Maus an das Polypeptid, der nach drei Immunisierungen innerhalb eines Zeitraums von 1 Monat in einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 vorliegt, wobei jede der Immunisierungen mindestens etwa 10 ug, vorzugsweise mindestens etwa 50 4g des Polypeptids in dem Konjugat enthält, und wobei ein vollständiges Freund-Adjuvans für die erste Immunisierung und Alaun als Adjuvans danach verwendet werden.
Dieses Testverfahren braucht nicht vor der Verwendung eines gegebenen Polypeptids als Iminunogen durchgeführt zu werden, es ist jedoch bevorzugt, dies zu tun als ein Vor- Screening-Verfahren, um die Polypeptide zu bestimmen, die für die Herstellung der gewünschten monoklonalen Rezeptoren geeignet sind. Unabhängig davon, ob sie in Form eines Vor-Screening verwendet werden oder nicht, ergeben die hier als Immunogene verwendbaren Polypeptide den obengenannten Titer bei Anwendung des obengenannten Immunisierungsverfahrens.
Nach der Bereitstellung des immunogenen Polypeptids wird ein Säugetier, beispielsweise eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Pferd oder dgl., mit dem immunogenen Polypeptid oder einem Konjugat dieses Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, hyperimmunisiert zur Erzeugung eines Hyperimmun-Serums, dessen Rezeptormoleküle einen 50 %-Bindungstiter an das Polypeptid in einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 aufweisen. Somit kann das gleiche Tier, beispielsweise eine Maus, in dem man die Immunogenizität des Polypeptids vorzutesten wünscht, zur Bildung (Induktion) der Mabs verwendet werden.
Es ist insbesondere bevorzugt, daß das gleiche Tier, das für einen Vortest verwendet wird, zur Bildung (Induktion) der Mabs verwendet wird. Diese Bevorzugung ergibt sich aus der Tatsache, daß dann, wenn einmal der obengenannte 50 %- Bindungstiter erzielt ist, die Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifität sekretieren bei Verwendung der Milz dieses Tieres als Quelle für die Antikörper-bildenden Zellen, im wesentlichen gewährleistet ist, abgesehen von dem Auftreten von zufälligen Labor-Pannen, wie z.B. einer Kontamination der Zellkulturen oder einer sonstigen Zerstörung dieser Kulturen.
Es sei darauf hingewiesen, daß das zur Erzielung eines hyperimmunen Zustandes erforderliche Immunisierungsverfahren unter anderem eine Funktion des Tier-Typs, des Gewichtes des Tieres, der Immunogenizität und der Mengen an Polypeptid und Träger, falls verwendet, des Adjuvans, falls verwendet, und der Anzahl der innerhalb einer gegebenen Zeitspanne verabreichten Immunisierungen ist, wie allgemein bekannt. Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Erzielung einer 50 %-Bindungstiter-Verdünnung von mindestens etwa 1:400 ergibt einen hyperimmunen Zustand in der Testmaus und er kann als proportionalisierbare Basis zur Induktion von hyperimmunen Zuständen in anderen Tieren verwendet werden. Es sei ferner darauf hingewiesen, daß drei Immunisierungen nicht notwendigerweise erforderlich sind, um den hyperimmunisierten Zustand zu erzielen, daß jedoch für ein verwendbares Polypeptid drei derartige Immunisierungen innerhalb eines Zeitraums von 1 Monat ausreichend sind, um diesen Zustand zu erzeugen, oder das Polypeptid ist nicht ausreichend immunogen für die Bildung von Hybridomen und ihrer erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in hoher Ausbeute.
Die auf diese Weise in dem hyperimmunisierten Tier gebildeten oligoklonalen Serum-Rezeptormoleküle binden sich auch an den Proteinmolekül-Liganden, wobei das immunogene Polypeptid einem Teil desselben in bezug auf die Aminosäurerest-Sequenz entspricht. Bindungs-Assays sind in dem nachfolgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben. Es sei darauf hingewiesen, daß in diesen Assays eine reine Probe des Proteinmolekül-Liganden nicht verwendet zu werden braucht, daß vielmehr ein Zellextrakt oder ein Gewebepräparat, beispielsweise ein Objektträger, der den Protein-Liganden enthält, verwendet werden kann.
Das hyperimmunisierte Tier wird aufrechterhalten, d.h. am Leben erhalten ohne Verabreichung weiterer Immunisierungen, für einen Zeitraum von mindestens etwa 30 Tage nach Verabreichung der Immunisierung, die einen 50 % -Bindungstiter mindestens einer Verdünnung von 1:400 ergibt. Das heißt mit anderen Worten, das Tier wird zuerst immunisiert, um einen hyperimmunisierten Zustand zu erzeugen, und dann läßt man die Hyperimmunisierung allmählich abnehmen.
Die Abnahme der Bindungsaktivität erfolgt in der Regel bei Mäusen innerhalb von 1 bis etwa 5 Monaten. Diese Abnahme des Bindungs-Titers entspricht, wie angenommen wird, einem Zeitraum, in dem die vorbehandelten Keimzellen in die Lage versetzt werden, eine stakre Antwort zu erzeugen, wenn das Immunogen erneut eingeführt wird.
Eine Booster-Immunisierung, beispielsweise durch intravenöse Injektion, bei der das immunogene Polypeptid oder sein Konjugat verwendet wird, wird dem Tier nach Beendigung der Aufrechterhaltungs-Zeitspanne, beispielsweise mindestens 30 Tage nach der letzten Immunisierung, verabreicht.
Antikörper bildende Zellen, z.B. Milzzellen oder Lymphzellen des einer Booster-Behandlung unterworfenen Tieres werden dann mit einer Myelom-Zellinie aus dem gleichen Tier- Typ (Species) innerhalb eines Zeitraums von etwa 3 bis etwa 5 Tagen ab dem Tage der Booster-Verabreichung fusioniert zur Herstellung von Hybridom-Zellen. Die Booster-Behandlung stimuliert, wie angenommen wird, die Reifung der Keimzellen bis zu dem Punkt, an dem diese Zellen nahezu optimale Mengen von oligoklonalen Antikörpern für das Polypeptid sekretieren.
Für die Verwendung bei der Fusion mit Maus-Milzzellen ist die Verwendung der SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581), Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT)-empfindlichen Myelom-Zellinie bevorzugt, obgleich auch andere Zellinien verwendet werden können. Einzelheiten der Verwendung dieser HAT-Linie für die Fusion werden nachstehend in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" angegeben. Die Hybridom-Zellen werden danach bei einer begrenzenden Verdünnung geklont, die frei von der Anwesenheit oder der Notwendigkeit von Feeder-Schichten oder Makrophogen ist, um ein übermäßiges Wachstum durch nicht-produzierende Zellen zu vermindern und eine Selektionsmethode für Zellen, die unter in vitro- Bedingungen leicht wachsen, zu schaffen. Solche Feeder- Schichten können jedoch verwendet werden.
Die so hergestellten Hybridom-Zellen werden dann untersucht in bezug auf die Bildung (Sekretion) von monoklonalen Rezeptormolekülen, die sich an den Proteinmolekül-Liganden binden. Dieser Ligand ist ein Teil des Proteins, dem das immunogene Polypeptid in bezug auf die Aminosäurerest-Sequenz entspricht. Danach werden die Hybridom-Zellen, die monoklonale Rezeptormoleküle bilden, die sich an den Protein-Liganden binden, weiter kultiviert (gezüchtet) zur Herstellung zusätzlicher Mengen an solchen Hybridom- Zellen und der monoklonalen Rezeptoren, die von diesen Zellen sekretiert werden, die sich an den Proteinmolekül- Liganden binden. In der Regel erfolgt eine solche Kultivierung nach einer begrenzenden Verdünnung, beispielsweise bei durchschnittlich etwa einer Zelle pro Vertiefung mit darin wachsender Kultur.
Bei einer bevorzugten Praxis werden die Mybridom-Zellen, die hergestellt werden, auch untersucht in bezug auf die Bildung von monoklonalen Rezeptormolekülen, die sich sowohl an das Polypeptid-Immunogen als auch an den Protein-Liganden binden. Danach sind die Hybridom-Zellen, die monoklonale Rezeptormoleküle bilden, die sich sowohl an das immunogene Polypeptid als auch an den Protein-Liganden binden, solche Zellen, die bevorzugt kultiviert (gezüchtet) werden.
Wenn die Proben des Proteinmolekül-Liganden beschränkt sind, ist es zweckmäßig, zuerst die Hybridome für die Sekretion von monoklonalen Rezeptoren, die sich an das immunogene Polypeptid binden, auszusuchen. Dann werden die Hybridom-Klone, die eine positive Bindung gegenüber diesem Polypeptid aufweisen, in der Regel eingefroren für die Lagerung. Anschließend werden sie wieder aufgetaut und subkloniert durch begrenzende Verdünnung, um sicherzustellen, daß echte monoklonale Antikörper gebildet werden, anstatt daß eine Vielzahl von monoklonalen Rezeptoren aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Hybridom-Zellen gebildet wird. Diese Subklonierungs-Kulturen mit begrenzender Verdünnung werden in der Regel erneut durchgeführt frei von Feeder-Schichten oder Makrophagen, da solche nicht erforderlich sind.
Die Hybridom-Zellen, die schließlich gebildet werden, können unter Anwendung der üblichen in vitro-Gewebekultur- Verfahren für solche Zellen, wie sie allgemein bekannt sind, kultiviert (gezüchtet) werden. Die Hybridom-Zellen werden insbesondere in Tieren kultiviert (gezüchtet) unter Anwendung ähnlicher an sich bekannter Verfahren, wobei die monoklonalen Rezeptoren aus der dabei gebildeten Ascites-Flüssigkeit erhalten werden. Die für die Erzeugung der Ascites-Flüssigkeit verwendeten Tiere sind in der Regel 129 x BALB/c-Mäuse, die in der Maus-Kolonie der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, Kalifornien, USA, gezüchtet worden sind. Wenn jedoch andere Tiere als Mäuse zur Herstellung der Hybridome verwendet wurden, wird dieser Tier-Typ für die Bildung der Ascites-Flüssigkeit verwendet.
Wie weiter oben angegeben, ist es bevorzugt, daß die Myelom-Zellinie aus der gleichen Species wie der Rezeptor stammt. Deshalb werden in der Regel fusionierte Hybride, wie Maus-Maus-Hybride [Shulman et al., "Nature", 276, 269 (1978)] oder Ratten-Ratten-Hybride [Galfre et al, "Nature", 277, 131 (1979)] verwendet. Zur Bildung von Hybridomen wurden aber auch bereits einige Ratten-Maus-Hybride erfolgreich verwendet [Goding, "Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion" in "Antibody as a Tool", Marchalonis et al., eds., John Wiley & Sons Ltd., S. 273 (1982)]. Zu geeigneten Myelom-Linien für die erfindungsgemäße Verwendung gehören MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63- Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp2/O-Ag14 (ATCC CRL 1581), P3X 63 Ag8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Ag1.2.3. (hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Paris, Frankreich, unter der Nummer I-078) und P3X63Ag8 (ATCC TIB 9). Die Myelom-Linie Sp2/O-Ag14 wird erfindungsgemäß bevorzugt verwendet.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren, die von den Hybridomen S22C06 und S10F03 sekretiert werden, sind besonders bevorzugte monoklonale Rezeptoren. Beide bevorzugten monoklonalen Rezeptoren sind monoklonale IgG&sub1;-Rezeptoren mit leichten Kappa-Ketten, die eine Immunreaktion eingehen mit dem immunisierenden Polypeptid und mit dem fes- verwandten Onkoprotein mit einer Aminosäurerest-Sequenz, die der Sequenz des immunisierenden Polypeptids entspricht.
Das folgende erfindungsgemäße Verfahren ist somit möglich zur Herstellung von verhältnismäßig hohen Ausbeuten an monoklonalen Rezeptoren, die sich binden an oder eine Immunreaktion eingehen mit bekannten, vorgegebenen Epitopen von Proteinmolekülen, wie Onkoproteinen. Außerdem kann dann, wenn der geschickte Arbeiter einmal Hyperimmun-Serum hergestellt hat, das oligoklonale Antikörper enthält, die einen 50 %-Bindungstiter von mindestens etwa 1:400 gegenüber dem immunisierenden Polypeptid aufweisen, dieser die obengenannten Stufen durchführen, die Milz aus dem hyperimmunisierten Tier entnehmen, ihre Antikörper-bildenden Zellen mit Zellen einer Myelom-Linie aus dem gleichen Tier-Typ oder dem gleichen Stamm fusionieren und er kann im wesentlichen sicher sein, daß ein oder mehr Hybridome aus dieser Fusion monoklonale Rezeptoren sekretieren, die sich an das immunisierende Polypeptid und an das entsprechende Protein, beispielsweise ein Onkoprotein, binden. Solche Ergebnisse waren bisher nicht möglich.
Das vorgenannte Verfahren ist nützlich zur Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Rezeptoren für im wesentlichen jeden beliebigen Proteinmolekül-Liganden sekretieren. Beispiele für solche Hybridome und bhre monoklonalen Rezeptoren sind solche, die durch immunogene Polypeptide mittlerer Länge gebildet (erzeugt) werden, deren Aminosäurerest-Sequenzen den Aminosäurerest-Sequenzen der durch Onkogene codierten Onkoproteine entsprechen. Beispielhafte Onkogene und nützliche immunogene Polypeptide sind nachstehend angegeben durch die in Klammer angegebene numerische Position ab dem Amino-Terminus in der Onkoprotein-Sequenz, der das Polypeptid entspricht, wobei die Aminosäurerest-Sequenzen dieser Polypeptide von links nach rechts und in der Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus angegeben sind und durch eine Formel dargestellt sind, die ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Formeln, wie sie in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben sind. Tabelle 1 Onkogen Polypeptid-Sequenz
* v-fes ST = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das fes-Onkogen des Snyder-Theilen-Stammes des Katzen-Leukämie-Virus codiert werden (Hampe et al. "Cell", 30, 775-785 (1982)).
v-myb = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das myb-Gen des Vogel-Myeloblastose-Virus codiert werden (Rushlow et al., "Science", 216, 1421- 1423 (1982)).
v-sis Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das sis-Gen des Simian-Sarcom-Virus codiert werden. (Devare et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 79, 3179-3182 (1982)).
v-rasHa = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das ras-Onkogen des Harvey-Maus-Sarcom-Virus codiert werden (Dhar et al., "Science", 217, 934- 937 (1982)).
v-rasKi = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das ras-Onkogen des Kirsten-Maus-Sarcom-Virus codiert werden (Tsuchida et al., "Science", 217, 937-939 (1982)).
T24-rasHu = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das ras-Onkogen des Human-Blasen-Carcinoms codiert werden (Reddy et al., "Nature", 300, 149-152 (1982)).
c-rasHu = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das ras-Onkogen von normalen Human-Zellen codiert werden (Reddy et al., "Nature", 300, 149-152 (1982)).
c-mycHu = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das myc-Onkogen von normalen Human-Zellen codiert werden (Colby et al., "Nature", 301, 722-725 (1983)).
v-mos = Polypeptide aus vorhergesagten Sequenzen, die durch das mos-Onkogen von normalen Human-Zellen codiert werden (Van Beveren et al., "Nature", 298, 258- 262 (1981)).
PDGF-2 = Polypeptid aus einer Sequenz, das durch das Gen für den aus Blutplättchen stammenden Human-Wachstumsfaktor, Kette 2, codiert wird (Doolittle et al., "Science", 220, 275-277 (1983)).
PDGF-1 = Polypeptid aus einer Sequenz, das durch das Gen für den aus dem Blutplättchen stammenden Human- Wachstumsfaktor, Kette 1, codiert wird (Doolittle et al., "Science", 220, 275-277 (1983)).
Die durch die obengenannten vier ras-Gene codierten homologen Polypeptide können zweckmäßig geschrieben werden als eine Aminosäurerest-Sequenz von links nach rechts und in der Richtung ab dem Amino-Terminus zu dem Carboxy-Terminus, dargestellt durch die folgende Formel
KLVVVGAR(S,V,G)GVGK
worin die Aminosäurereste in Klammern jeweils eine Alternative zu dem in der Formel unmittelbar vorhergehenden Aminosäurerest "R" darstellen.
Weitere immunogene Polypeptide, die für die Induktion der Bildung von erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren geeignet sind, sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben, in der die Onkogen-Abkürzungen und die Positionen in den Klammern wie für die Tabelle 1 beschrieben definiert sind. Tabelle 2 Onkogen Sequenz
Noch weitere Polypeptide, die für die Induktion der Bildung von erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren geeignet sind, sind die Polypeptide, deren Onkogen, deren Position in der Onkoprotein-Sequenz und deren Polypeptid- Aminosäurerest-Sequenzen in den Figuren 9, 10 und 11 dargestellt sind. Diese Polypeptide entsprechen den Sequenzkonservierten Regionen in der allgemein bekannten Familie der Proteinkinase-Onkoproteine, von denen einige Onkogene bereits weiter oben genannt worden sind.

II. Monoklonale Rezeptoren

Obgleich die vorliegende Erfindung eine große Anzahl von monoklonalen Rezeptoren betrifft, werden nachstehend als Beispiel für die Gruppe fünf derartige Rezeptoren, intakte monoklonale Antikörper (Mabs) im Detail diskutiert. Der oben diskutierte Test für die Immunogenizität und Antigenizität des Polypeptids wird nachstehend für die Polypeptide diskutiert, die zusätzlichen monoklonalen Rezeptoren entsprechen, die sich an verschiedene Onkoproteine binden.

A. Beispielhafte Rezeptoren

Jeder der fünf bespielhaften monoklonalen Rezeptoren wurde gebildet gegenüber dem v-fes-verwandten, immunogenen synthetischen 30-Mer-Polypeptid, wie es nachstehend angegeben ist (Polypeptid a) und jeder bindet sich auch an das nachstehend angegebene Carboxy-terminale 12-Mer-Polypeptid (Polypeptid b) sowie an das Onkoprotein p85 (85K Dalton, das durch das v-fes-Gen von ST-FeSV codiert wird. Die Aminosäurerest-Sequenzen der synthetischen Polypeptide (a) und (b) von links nach rechts und in der Richtung von dem Amino-Terminus zu dem Carboxy-Terminus werden durch die folgenden Formeln dargestellt
Polypeptid a SDVWSFGILLWETFSLGASPYPNLSNQQTR;
Polypeptid b SPYPNLSNQQTR.
Die Hybridome, die diese Mabs sekretieren, werden bezeichnet als S10F03, D22C06, P43D09, P42C10 und P44E11. Vier der obengenannten Hybridome wurden hinterlegt am 2. August 1984 bei der American Type Culture Collection of Rockville, MD, und sie erhielten die Bezeichnungen ATCC HB 8596 (S10F03), ATCC HB 8595 (S22C06), ATCC HB 8594 (P43D09) und ATCC HB 8593 (P44E11).
Die Hybridome mit der Bezeichnung S10F03, S22C06, P43D09 und P44E11 sekretieren kurzkettige monoklonale Kappa-IgG&sub1;- Rezeptoren ebenso wie das Hybridom mit der Beziehnung P42C10.
Die obengenannten Hybridome werden aus zwei getrennten Zellfusionen hergestellt. Der Wirkungsgrad der Bildung der Hybridome, deren Mbas das immunogene Polypeptid sowie den entsprechenden Onkoprotein-Molekül-Liganden erkennen, betruf für das erste Präparat 100 %; d.h. es wurden 2 Mbas (aus S10F03 und S22C06) gebildet, die das Polypeptid erkennen, und diese beiden Mbas erkennen auch das Onkoprotein. Für das zweite Präparat betrug der Wirkungsgrad, der in ähnlicher Weise berechnet wurde, etwa 20 %.
Die Fig. 1 erläutert den immunologischen Nachweis des p85 Onkoprotein-Liganden durch die monoklonalen Rezeptoren, die durch die Hybridome S10F03 (ATCC HB 8596) und S22C06 (ATCC HB 8595) sekretiert werden unter Verwendung eines externen Standards für den p85 Onkoprotein-Liganden und eines Influenza-Hämagglutinin-erkennenden Mab als negative Kontrolle. Die Fig.2 erläutert ähnliche Ergebnisse die erhalten wurden wiederum unter Verwendung der Mabs aus dem Hybridom S10F03 sowie der Mabs aus den Hybridomen P43D09 (ATCC HB 8594) und P44E11 (ATCC HB 8593) sowie auch des Hybridoms P42C10. Als Negativkontrolle wurde ein monoklonaler Antikörper gegen das Rouscher-Virus-Protein mit der Bezeichnung gp70 verwendet [Niman und Eider, "Monoclonal Antibodies and T Cell Products", s. oben].
Die Fig. 3 erläutert außerdem die Spezifität der erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren. CCL64-Nerz-Zellen (Streifen B und D) oder MSTF-Zellen, die mit FeLV-B und FeSV infiziert waren (Streifen A und B), wurden mit ³²P radioaktiv markiert. Extrakte aus den markierten Zellen wurden dann entweder mit einem Ziegen-Antiserum gegen das p15-Protein, das durch den gag-Abschnitt des v-fes-Gens codiert und exprimiert wurde als Protein-Vorläufer mit der Bezeichnung pr65 (Streifen A und B), oder mit der überstehenden Flüssigkeit einer Gewebekultur des Hybridoms S10F03 (Streifen C und D) inkubiert.
Wie ersichtlich, band sich der erfindungsgemäße Mab aus dem Hybridom S10F03 nur an den p85 Onkoprotein-Lig anden (Streifen C), während das Ziegen-Anti-p15-Serum sich an beide pr65- und p85-Fusions-Onkoproteine aus den infizierten Zellen band (Streifen A). Es wurden keine Proteine aus den nicht-infizierten Zellen gebunden (Streifen B und D). Diese Ergebnisse bestätigen, daß die erfindungsgemäßen Mabs sich nur an den Onkoprotein-Liganden (p85) binden, von dem ein Teil seiner Aminosäurerest-Sequenz der Sequenz des immunogenen Polypeptids entspricht, das zur Herstellung des jeden Mab sekretierenden Hybridoms verwendet wurde.
Bei ähnlichen, nicht dargestellten Ergebnissen banden sich die Mabs aus den obengeanannten fünf Hybridomen auch an den 108K Dalton Onkoprotein-Liganden, der in durch Ga-FeSV transformierten Zellen exprimiert wurde. Der Onkoprotein- Ligand, der durch den Ga-FeSV-Stamm codiert wird, ist im wesentlichen identisch in bezug auf die Aminosäurerest-Sequenz mit dem Onkoprotein-Liganden, der durch den ST-FeSV- Stamm codiert wird, in der Region des immunogen nützlichen Polypeptids (vgl. Hampe et al., "Cell", 30, 777-785 (1982)).
Keiner der obengenannten fünf Mabs band sich an das Onkoprotein, das durch das v-fps-Gen des Fujinami-Stammes des Vogel-Sarcom-Virus codiert wurde. Das vorhergesagte v-fps Onkoprotein enthält auch weitgehende Homologien zu dem vorhergesagten v-fes Onkoprotein und unterscheidet sich in der Region, die dem obengenannten 12-Mer (Polypeptid b) entspricht, nur durch die Substitution des ersten und vierten Restes ab dem Amino-Terminus dieses 12-Mer- Polypeptids, d.h. das Amino-terminale Serin (S) des v-fes- verwandten Polypeptids und des Onkoproteins ist ersetzt durch ein Valin (V) in dem v-fps-verwandten Onkoprotein und der zweite Prolin(P)-Rest) ab dem Amino-Terminus ist ersetzt durch einen Alanin(A)-Rest.
Die Nicht-Bindung der obengenannten Mabs an das v-fps-verwandte (stammende) Onkoprotein stellt eine Basis für die Unterscheidung zwischen den exprimierten Onkoproteinen in transformierten Zellen und für die Bestimmung der Anwesenheit des v-fes-verwandten Onkoprotein-Liganden in Gegenwart des v-fps-verwandten Onkoproteins dar. Dieser Unterschied in bezug auf die Bindung kann auch nützlich sein zur Reinigung einer Mischung beider Proteine durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Mab als Teil eines Affinitäts-Sorbens, wie weiter unten erläutert.
Die obengenannte Nicht-Bindung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an das von v-fps abgeleitete Onkoprotein zeigt auch die Verbesserung in bezug auf die Spezifität der monoklonalen Rezeptoren gegenüber den früher erhaltenen oligoklonalen Rezeptoren. So verwendeten Sen et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80 1246-1250 (1983), das obengenannte Polypeptid (b), konjugiert an KLH, zur Herstellung von oligoklonalen Kaninchen-Antikörpern. Diese oligoklonalen Antikörper banden sich an Onkoproteine, die in Zellen exprimiert wurden, die durch ST-FeSV, GA-FeSV und FSV (Fuginami-Sarcom-Virus) transformiert worden waren, welche die v-fesST, v-fesGa bzw. v-fps Onkogene enthalten. Deshalb ist daraus zu ersehen, daß die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren erzielte Spezifität stark verbessert ist gegenüber derjenigen, die mit oligoklonalen Rezeptoren erhalten wird, selbst wenn beide gegenüber dem gleichen immunogenen Polypeptid gebildet (induziert) werden.
Auf ähnliche Weise werden Hybridome hergestellt, die monoklonale Rezeptoren sekretieren, die sich binden sowohl an Onkoproteinmolekül-Liganden, z.B. PDGF, an immunogene Polypeptide, die durch die retroviralen Onkogene mit der Be-Zeichnung fes, myb, sis, ras, myc und mos codiert werden, sowie an immunogene Polypeptide, deren Sequenzen den Sequenzen der Onkoproteine entsprechen, die durch Onkogene mit der Bezeichnung fps, src, yes, fgr, fms, erb B, mht, raf, abl und rel codiert werden, und auch an Onkoproteine, die in Zellen exprimiert werden, die durch diese Gene enthaltende Retroviren transformiert worden sind. Spezifische erfindungsgemäße monoklonale Rezeptoren binden sich an ein immunogenes Polypeptid, da durch die obengenannten Onkogene codiert wird.
Einige dieser Onkogene sind nachstehend aufgezählt und erläutert neben den Formeln für die Polypeptide, die durch diejenigen Sequenzen codiert werden, an die sich die bevorzugten erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren binden. Die rechte Spalte erläutert die Fälle, für die gezeigt wurde, daß die oligoklonalen Antiseren, die gegenüber dem aufgezählten Polypeptid gebildet (induziert) wurden, Antikörper (Rezeptoren) enthalten, die sich an das onkoprotein binden, das eine Aminosäurerest-Sequenz enthält, die der Sequenz des Polypeptids entspricht, unter Verwendung einer Western-Transfer-Analyse. Die Bindung ist durch ein Plus-Zeichen (+) dargestellt und die einen oligoklonalen Rezeptor enthaltenden Antiseren, für die ein Plus-Zeichen angegeben ist, wiesen einen 50 % -Bindungstiter, wie vorstehend beschrieben, auf. Die Bezeichnung "NT" gibt an, daß eine strenge Bindungsuntersuchung nicht durchgeführt wurde. Die Polypeptid-Formeln enthalten die angegebenen Aminosäurerest-Sequenzen, die von links nach rechts und in der Richtung vorn Amino-Terminus zum Carboxy- Terminus angegeben sind. Onkogen Polypeptid-Sequenz Bindung der Antiseren an Onkoproteine
Die für die Induktion der Bildung von oligoklonalen Rezeptoren und schließlich für die Bildung von monoklonalen Rezeptoren verwendbaren Polypeptide sind vorzugsweise an ein Trägermolekül gebunden, wie hier diskutiert, wobei durchgehend Polypeptide, die an KLH gebunden sind, als beispielhafte Polypeptid-Träger-Konjugate verwendet wurden. Für Polypeptide, die weniger als etwa 35 Aminosäurereste enthalten, wird vorzugsweise ein Träger verwendet zum Zwecke der Induktion der Bildung von oligoklonalen und monoklonalen Rezeptoren. Polypeptide, die etwa 35 bis etwa 40 Aminosäurereste enthalten, können ohne Bindung an einen Träger allein verwendet werden, um die Rezeptor-Bildung zu induzieren, obgleich es dennoch bevorzugt ist, einen Träger für die Bildung dieser Rezeptoren zu verwenden. Die Rezeptoren können somit induziert werden durch oder gebildet werden durch ein Polypeptid allein oder gebunden an einen Träger.

B. Immunisierungs-Bindungs-Untersuchungen

Wie bereits mehrmals angegeben, sind die Polypeptide, die zur Bildung von oligoklonalen Antikörpern verwendet werden, und die Hybridome, die monoklonale Antikörper sekretieren, selbst immunogen und antigen, und diese Eigenschaften liefern Kriterien für die Identifizierung von Polypeptiden, die für die Hybridom-Herstellung verwendbar sind. Die nachfolgende Diskussion bezieht sich auf Untersuchungen mit oligoklonale Antikörper (Rezeptoren) enthaltende Antiseren, die induziert werden durch oder gebildet werden mit Polypeptiden, die bei der Herstellung von Hybridomen verwendet werden, die monoklonale Rezeptoren (Antikörper) sekretieren für Onkoproteine, die durch die sis- und myb-Onkogene codiert werden. Wie nachstehend beschrieben, induziert das von sis abstammende (damit verwandte) Polypeptid die Bildung von oligoklonalen Rezeptoren, die sich nicht nur an das Polypeptid, sondern auch an ein entsprechendes Onkoprotein, den aus Blutplättchen stammenden Human-Wachstumsfaktor (PDGF), binden. Die so hergestellten oligoklonalen Antikörper wiesen den obengenannten 50 %-Bindungstiter an das immunisierende Polypeptid auf, wodurch angezeigt wird, daß erfindungsgemäße monoklonale Antikörper (Rezeptoren) auch durch Fusion der Antikörper bildenden Splenocyten mit Zellen einer geeigneten Myelom-Linie hergestellt werden können.
Der aus Blutplättchen isolierte PDGF besteht aus zwei Ketten, die zu etwa 60 % an dem Amino-terminalen Ende homolog sind. Eine dieser Ketten (PDGF-2) ist praktisch identisch mit einem Teil des Simian-Sarcom-Virus (v-sis)-Genprodukts (p28sis). Die Sequenzierung des Human c-sis und v-sis endet in der gleichen Position und das PDGF-2-Molekül stammt aus einem größeren Vorläufer, der eine weitgehende Homologie mit p28sis hat. Die Homologie zwischen p28sis und PDGF-2 beginnt an dem Aminosäurerest 67 von p28sis und dem Amino-Terminus von PDGF-2 und wurde vor kurzem verlängert bis zu dem vorhergesagten Carboxy-Terminus von p28sis über die Isolierung und Sequenzierung eines Human c-sis-Klons. (Josephs eta al., "Science", 223, 487-491 (1984)). p28sis wird schnell gespalten (zerlegt) unter Bildung von p20sis, das vermutlich den gleichen Amino-Terminus hat wie PDGF-2. Innerhalb der Region, die für p20sis und PDGF-2 codiert, gibt es 8 Aminosäure-Veränderungen, die in drei Regionen angeordnet sein können. Die beiden Veränderungen in der Nähe des Amino-Terminus sind konservativ, fünf Änderungen konzentrieren sich in der Nähe des Zentrums des Moleküls und eine Änderung ist in dem Carboxyl-terminalen Abschnitt angeordnet.
Es wurden zwei beispielhafte Polypeptide hergestellt. Das erste mit der Bezeichnung Polypeptid (c) entspricht in der Aminosäurerest-Sequenz den Resten 139 bis 155 der vorhergesagten Sequenz des Simian-Sarcom-Virus, welches das Protein mit der Bezeichnung p28sis transformiert (Devare et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 731-735 (1983)). Die Sequenz des Polypeptids (c) entspricht ebenfalls der Sequenz der Positionen 73 bis 89 ab dem Amino-Terminus der Protein-Kette mit der Bezeichnung PDGF-2 des von Blutplättchen abgeleiteten Human-Wachstumsfaktors, wie oben angegeben. Das zweite mit der Bezeichnung Polypeptid (d) entspricht in der Aminosäurerest-Sequenz den Resten 2 bis 18 der vorhergesagten Sequenz des transformierenden Proteins des Vogel-Myeloblastose-Virus (v-myb)-Onkoproteins (Rushlow et al., "Science", 216, 1421-1423 (1982)). Die Aminosäurerest-Sequenz der Polypeptide (c) und (d) sind nachstehend angegeben von links nach rechts und in der Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus:
Polypeptid (c) RKIEIVRKKPIFKKATV;
Polypeptid (d) RRKVEQEGYPQESSKAG.
Jedes der Polypeptide wurde synthetisiert und an KLH gebunden unter Verwendung eines Cys-Restes ihrer Carboxy- Termini (in den obigen Formeln nicht dargestellt) und jedes resultierende Konjugat wurde dann zum Immunisieren von Mäusen verwendet, wie in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" allgemein erläutert. Wie aus einer Überprüfung der Figur ersichtlich, enthielten Seren, die mit dem Polypeptid (c) gebildet wurden, oligoklonale Rezeptoren, die sich sowohl an das Polypeptid (c) als auch an KLH binden, und Seren, die gegenüber dem Polypeptid (d) gebildet wurden, enthielten oligoklonale Rezeptoren, die sich sowohl an das Polypeptid (d) als auch an KLH binden. Kein Serum enthielt Rezeptoren, die eine Überkreuzreaktion eingehen und sich an das Polypeptid binden, das nicht zur Bildung (Induktion) derselben verwendet wurde.
Extrakte aus gealterten (outdated) Human-Blutplättchen wurden verwendet zur Erzielung von teilweise gereinigten Proben von PDGF. Wie bereits angegeben, ist PDGF ein Onkoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 K Dalton, das reduktiv gespalten (zerlegt) werden kann in zwei Polypeptide mit einem hohen Molekulargewicht, die ähnliche scheinbare Molekulargewichte haben, mit den Bezeichnungen PDGF-1 und -2.
Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Western-Transfer-Analyse von PDGF unter Verwendung der oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiseren, die mit den Polypeptiden (c) und (d) gebildet (induziert) wurden, wie in der Beschreibung dieser Figur näher erläutert; das mit dem Polypeptid (d) gebildete Antiserum wurde als Negativkontrolle verwendet. Wie aus einer Überprüfung der Figur 5 ersichtlich, band sich das oligoklonale Rezeptoren enthaltende Serum, das mit dem von sis-abstammenden (verwandten) Polypeptid, dem Polypeptid (c) gebildet wurde, an drei proteinhaltige Moleküle (Streifen 2). Eines dieser Moleküle hatte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 K Dalton und zwei davon hatten ein scheinbares Molekulargewicht von jeweils etwa 16 bis 18 K Dalton. Der Streifen 4 erläutert auch die Bindung durch oligoklonale Rezeptoren, die in dem von anti-sis abstammenden Polypeptid-Serum enthalten sind. Erwartungsgemäß ergab sich nur eine nicht-spezifische Bindung durch oligoklonale Rezeptoren, die mit dem aus myb stammenden Polypeptid, dem Polypeptid (d) gebildet wurden (Streifen 4 und 5).
Unter der Annahme, daß die Aminosäurerest-Sequenzen von PDGF-1 und -2 colinear sind mit der Sequenz von p28sis, entspricht die Aminosäurerest-Sequenz des Polypeptids (c) den Positionen 67 bis 83 bzw. 73 bis 89 von PDGF-1 bzw. -2. Die Aminosäurerest-Sequenz der Reste 73 bis 80 von PDGF-2 wurde bestimmt [Doolittle et al., "Science", 221, 275-277 (1983)] und alle diese Reste sind identisch mit den ersten (Amino-terminalen) 8 Resten des Polypeptids (c). Außerdem wurde ein Polypeptid aus PDGF, das den Resten 147 bis 155 des p28sis-Onkoproteins entsprach, sequenziert [Waterfield, "Nature", 304, 35-39 (1983)], und von den auf diese Weise identifizierten neun Resten waren alle identisch mit den entsprechenden Resten des Polypeptids (c). Somit sind 16 der 17 Reste des Polypeptids (c) identisch mit und sie liegen vor in der gleichen Sequenz wie die Reste in beiden PDGF, die aus Menschen stammen und, in p28sis, das aus einer Linie von mit einem Retrovirus transformierten Zellen stammt.
Die obigen Ergebnisse erläutern somit die Immunogenizität und Antigenizität von zwei zusätzlichen Polypeptiden, die für Immunisierungen verwendbar sind, die zur Herstellung von Hybridomen führen, die erfindungsgemäße monoklonale Rezeptoren sekretieren. Diese Ergebnisse zeigen auch, daß die oligoklonalen Rezeptoren, die mit dem Polypeptid (c) gebildet wurden, sich ebenfalls an ein Onkoprotein, d.h. an PDGF, PDGF-1 und PDGF-2, binden.
Es wurden weitere synthetische Polypeptide, die verschiedene Regionen beider PDGF-Sequenzen repräsentieren, hergestellt. Die Amino-Termini von PDGF-1 und PDGF-2 sowie der zentrale und Carboxyl-terminale Abschnitt von PDGF-2 wurden synthetisiert, an das immunogene Träger-Keyhole Limpet-Hämocyanin (RLH) konjugiert und Mäusen injiziert, um die Bildung von oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiseren zu induzieren, die den vorstehend beschriebenen 50 %-Bindungstiter aufwiesen.
Das Polypeptid, das die einzelne Region des PDGF-2 repräsentiert, enthält die ersten 17 Aminosäuren dieser Sequenz und wird als PDGF-2(1-17) bezeichnet, wobei die in Klammern angegebenen Ziffern die Aminosäure-Reste des entsprechenden Moleküls anzeigen, numeriert ab dem Amino-Terminus. Die einzelne Region von PDGF-1 wird dargestellt durch ein Polypeptid PDGF-1(1-12), das die ersten 12 Aminosäuren diese Sequenz enthält. 6 dieser 12 Aminosäuren sind gemeinsam mit PDGF-2, jedoch nur drei sind aufeinanderfolgend, wie oben angegeben. Das dritte Polypeptid, PDGF-2 (73-89) wird hier auch als Polypeptid (c) bezeichnet. Es repräsentiert die vorhergesagten Aminosäurereste 139-155 von p28sis und enthält ein zusätzliches Cystein als seinen Carboxy-Terminus für Kupplungszwecke. Dieses Polypeptid erkennt, wenn es an KLH gekuppelt ist, das die Bildung von Antikörpern induziert, die reduzierten Subeinheiten von gereinigtem PDGF, die Proteine Mr 31 000, 30 000, 21 000 und 18 000-14 000 in einem Blutplättchen-Extrakt und ein 56 K Dalton-Protein in mit SSV infizierten Krallenaffen (Marmoset)-Zellen. Das vierte Polypeptid, das PDGF-2 (126- 145) wurde ebenfalls vorhergesagt durch die v-sis-Sequenz (die Reste 192-211 von p28sis). Die Aminosäuresequenzen dieser Polypeptide wurden weiter oben erläutert.
Um die Spezifität der oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiseren zu untersuchen, die gegenüber diesen synthetischen Polypeptid-Konjugaten gebildet wurden, wurde PDGF mit diesen Antiseren untersucht. Gereinigtes PDGF wurde reduziert und elektrophoretisch behandelt in einem Polyacrylamid-Gel und dann unter Anwendung eines Western-Transfer-Verfahrens auf Nitrocellulose übertragen (Fig. 6, Streifen A bis F). In den Streifen A und B wurden zwei Antiseren, die gegen PDGF-1(1-12) gerichtet sind, einer Immunreaktion mit einem Protein von etwa 18 000 Dalton unterworfen. Die Sequenzanalyse des gereinigten PDGF zeigt, daß der Hauptanteil der PDGF-1-Kette an diesen Punkt wandert [Antonaides et al., "Science", 220, 963-965 (1983)]. Die geringe Reaktivität mit diesen Antiseren läßt vermuten, daß das Amino-terminale Ende von PDGF-1 für die Antikörper-Bindung nicht leicht zugänglich sein kann.
Im Gegensatz dazu läßt sich für das Antiserum gegenüber dem Amino-Terminus von PDGF-2(1-17) (Streifen C) leicht ein wanderndes Protein bei etwa 18 000 und 14 000 Dalton nachweisen in Übereinstimmung mit der Sequenzanalyse von PDGF-2 (Antonaides et al., supra).
Die durch PDGF-2(73-89) induzierten Antiseren ergaben die gleichen Aktivitäten (Streifen D, E), wie aus dem Streifen C ersichtlich. Im Gegensatz dazu wiesen die Antiseren gegen PDGF-2(126-145) keine nachweisbare Aktivität gegenüber gereinigtem PDGF auf.
Da sich die Sequenz des PDGF-2(126-145)-Polypeptids in der Position 145 von c-PDGF unterscheidet (Josephs et al., supra), ist es möglich, daß diese Aminosäurerest-Änderung innerhalb der Epitop-Stelle enthalten ist. Dies ist unwahrscheinlich, weil das Polypeptid 20 Aminosäurereste lang ist und die Änderung nur an der Carboxy-terminalen Position vorliegt, die zum Kuppeln des Polypeptids an das KLH-Träger-Protein verwendet wird. Der Mangel an Aktivität ist somit nicht auf die Bildung von Onkopolypeptid-spezifischen Antikörpern zurückzuführen, weil dieses Antiserum mit aus einer Zelle stammenden PDGF-artigen Molekülen reagiert. Die Größe des nachgewiesenen PDGF von 14 000 bis 18 000 Dalton in gereinigten Präparaten läßt vermuten, daß dem größten Teil dieses Materials das Carboxy-terminale Ende der vorhergesagten Sequenz von p28sis fehlt, wodurch die gesamte oder ein Teil der PDGF-antigenen Stelle, die dieses Antiserum erkennt, entfernt würde.
Um zu bestimmen, ob PDGF-artige Proteine auch in anderen transformierten Zellinien synthetisiert werden können, wurden Extrakte hergestellt und einer Immunreaktion mit verschiedenen oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiseren gegen PDGF-verwandte Polypeptide unterworfen. SSV- transformierte NIH 3T3-Zellen wurden mit einem oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiserum, induziert durch PDGF-1(1-12) und durch PDGF-2(73-89), untersucht. Von den beiden Seren gegen PDGF-2(73-89) (Fig. 6, Streifen D und E) ergab das in Fig. 6, Streifen D, verwendete Serum eine etwas geringere Aktivität mit dem gereinigten PDGF. Eine starke Reaktionsfähigkeit mit einem Protein von etwa 70 000 Dalton wurde jedoch beobachtet, die durch Vorinkubation mit dem immunisierenden Polypeptid PDGF-2(73-89) (Streifen D) blockiert wurde, die jedoch nicht blockiert wurde durch die Vorinkubation des Antiserums mit PDGF-1 (1-12) (Daten nicht angegeben).
Die spezifische Reaktionsfähigkeit mit den Onkoproteinen durch beide Antiseren zeigt somit, daß diese nicht eine zufällige Überkreuzreaktion mit einer kleinen Region von PDGF ist, sondern daß dieses Molekül Sequenzen enthält, die homolog mindestens zu dem Amino-Terminus von PDGF-1 und der zentralen Region von PDGF-2 sind. Die Menge an p28sis und p20sis lagen unterhalb der Nachweisgrenze mit diesem Anti-PDGF-2(73-89)-Serum. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit weiteren Antiseren, obgleich eine übermäßige Einwirkung gelegentlich eine 20 000 Dalton-Bande zeigte, die spezifisch nachgewiesen wurde (Daten nicht angegeben). Die Analyse von Extrakten von zwei anderen, mit diesen Antiseren nicht verwandten transformierten Zellen ergaben ähnliche Ergebnisse. Die TRD1-Zellinie ist eine spontan transformierte Balb/3T3-Zellinie [Bowen-Pope et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 81, 2396-2400 (1984)].
Diese Linie exprimiert auch ein 70 000 Dalton-Protein sowie ein stärker immunologisch verwandtes Protein von etwa 100 000 Dalton. Eine dritte Zellinie MSTF und eine Nerz- Lungenzellinie (CCL64), die produktiv infiziert war mit FeLV-B und dem Snyder-Theilen-Stamm von FeSV, exprimierte ebenfalls ein Protein der gleichen Größe (Daten nicht angegeben).
Zusätzlich zu dem 70 000 Dalton-Onkoprotein zeigte ein oligoklonale Rezeptoren enthaltendes Antiserum gegen PDGF- 1(1-12) Proteine von etwa 53 000 Dalton an (Daten nicht angegeben). Diese Proteine sind keine Serum-Verunreinigungen, da sie in Extrakten von Zellen nachgewiesen werden, die einen Monat lang in Abwesenheit des Serums gezüchtet wurden, und in dem Serum gefunden werden, daß frei von den durch die TRD1-Zellinien konditionierte Medien ist. Alle untersuchten Zellinien enthalten diese beiden PDGF-artigen Proteine (Daten nicht angegeben).
Die Expression von PDGF-artigen Molekülen in einem breiten Zellen-Spektrum einschließlich der Zellen, die nicht onkogen transformiert worden sind (normale Diploid-glatte Muskel-Zellen von Ratten und Human-Lungenfibroblaste) zeigt, daß an der Transformation andere Prozesse beteiligt sind. obgleich alle Zellinien 70 000- und 53 000 Dalton-Proteine enthielten, die mit oligoklonale Rezeptoren enthaltenden Antiseren, induziert durch PDGF-1(1-12), nachgewiesen wurden, waren die Zellen völlig heterogen in bezug auf die Größe und Intensität der anderen Proteine, die mit Antiseren nachgewiesen wurden, die gegen Determinanten gerichtet sind, die vorausgesagt wurden durch die Sequenz der PDGF- 2-Region (Daten nicht dargestellt). Die Art dieser Unterschiede ist derzeit unbekannt.
Auf ähnliche Weise kann jedes der vier immunogenen Polypeptide mit der nachstehend angegebenen Bezeichnung (e-h) dazu verwendet werden, oligoklonale Rezeptoren zu induzieren, die sich sowohl an diese immunogenen Polypeptide, die zur Induktion ihrer Bildung verwendet wurden, als auch an jedes der beiden Onkoproteine, die durch das ras-Onkogen codiert wurden, binden. Die Sequenzen dieser vier von ras abstammenden (verwandten) Polypeptide in der Richtung von links nach rechts und ab dem Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus, sind dargestellt durch die folgenden Formeln:
Polypeptid e KLVVVGARGVGK;
Polypeptid f KLVVVGASGVGK;
Polypeptid g KLVVVGAVGVGK;
Polypeptid h KLVVVGAGGVGK; oder
durch die kombinierte Formel:
Polypeptid (e-h) KLVVVGAR(S,V,G)GVGK;
worin die Aminosäurereste in Klammern jeweils eine Alternative zu dem in der Formel unmittelbar vorhergehenden Aminosäurerest darstellen.
Die so hergestellten oligoklonalen Rezeptoren weisen eine 50 % Bindungstiter-Verdünnung von mehr als 1 : 400 auf nach zwei Immunisierungen innerhalb eines Zeitraums von 1 Monat, wie vorstehend beschrieben. Außerdem wurde gezeigt, daß sich jeder von ras abstammende (verwandte) oligoklonale Rezeptor, der durch die Polypeptide (e), (f) und (h) induziert wurde, sich an ein Onkoprotein band, das in lysierten Zellextrakten aus (a) Human-T24-Blasen-Carcinom- Zellen und auch aus (b) Harvey-Maus-Sarcom-Virus-infizierten Maus 3T3-Zellen vorhanden war (Daten nicht angegeben).
Die Verwendung von erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptoren, beispielsweise solchen, die gebildet (induziert) wurden mit dem von sis-(PDGF) stammenden Polypeptid (c) oder mit dem von fes stammenden Polypeptiden (a) oder (b) oder mit dem von ras stammenden Polypeptiden (e-h) oder mit aus einem anderen Onkoprotein stammenden Polypeptiden, wie sie hier in den nachstehend beschriebenen Affinitäts-Sorbentien beschrieben sind, stellen eine bequeme und weniger schwierige Art der Herstellung von in der Natur vorkommenden Protein-haltigen Materialien dar, die sonst in gereinigter Form, beispielsweise als PDGF, nur schwer herzustellen wären. Anstatt das lange Verfahren zur Herstellung von gereinigtem PDGF zu durchlaufen, wie es nachstehend diskutiert wird, braucht man nur die Zellen zu lysieren, zu zentrifugieren, die überstehende Flüssigkeit durch eine Affinitäts-Sorbens-Säule zu gießen, die einen gebundenen Anti-Polypeptid(c)-Rezeptor enthält, und das gereinigte Protein nach dem Dissoziieren des gebildeten, reversiblen Liganden-Komplexes zu eluieren. Obgleich etwas zusätzliches Protein-haltiges Material nicht-spezifisch an die Affinitäts-Sorbens-Säule gebunden sein kann, wird die Isolierung von gereinigten Proteinen, die sonst in dieser Form schwierig herzustellen wären, durch Verwendung dieser Sorbentien stark verbessert.

III. Diagnostische Systeme und Verfahren

Ein diagnostisches System, vorzugsweise in einer Kit-Form, stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Dieses System ist verwendbar zur Bestimmung der Anwesenheit eines Onkoprotein-Liganden durch Bildung einer Immun- Reaktion. Dieses System umfaßt mindestens eine Packung, die biologisch aktive erfindungsgemäße monoklonale Rezeptormoleküle enthält. Der Rezeptor bindet sich somit an (a) ein Polypeptid, das etwa 7 bis etwa 40, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 30 Aminosäurereste in einer Aminosäurerest-Sequenz enthält, die einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz eines Onkoprotein-Liganden entspricht, der durch ein Gen eines Retrovirus codiert wird, und (b) an den Onkoprotein- Liganden, der durch das Retrovirus-Gen codiert wird. Wenn eine vorgegebene Menge von monoklonalen Rezeptor-Molekülen mit einer vorgegebenen Menge einer wäßrigen Zusammensetzung gemischt wird, die einen Onkoprotein-Liganden enthält, tritt eine immunologische Reaktion auf, bei der ein Komplex aus dem Rezeptor und dem Ligand gebildet wird. Beispielhafte wäßrige Zusammensetzungen, die ein Onkoprotein enthalten, umfassen ohne Beschränkung Zellysate, Serum, Plasma, Urin und Amnion-Flüssigkeit. Ein spezieller neuer Aspekt dieser Erfindung besteht darin, Urin nach den hier beschriebenen Verfahren zu untersuchen.
Eine Mischung zwischen dem Rezeptor und einem Liganden tritt in einer wäßrigen Zusammensetzung auf. Der Rezeptor oder der Ligand kann aber auch im wesentlichen trocken und wasserfrei vorliegen vor Herstellung der Mischung. So kann eine Lösung des Rezeptors in einer überstehenden Hybridom- Flüssigkeit, Ascitesflüssigkeit oder ein Puffer mit einem wäßrigen Zellextrakt gemischt werden, um die Reagentien von zwei wäßrigen Zusammensetzungen miteinander zu mischen; der Rezeptor kann in Form eines Überzugs auf die Wände einer Mikrotiter-Platte aufgebracht und dann mit einem Zellextrakt oder mit einem den Liganden enthaltenden Serum gemischt werden; oder der Ligand kann in Form einer Schicht aufgebracht werden auf Mikrotiter-Platten-Wände oder auf eine Nitrocellulose-Platte in einem Acrylamid-Gel oder dgl. oder er kann in einem Gewebeabschnitt und in einer überstehenden Hybridom-Flüssigkeit, Ascites-Flüssigkeit oder in einer Pufferlösung, die den Rezeptor damit gemischt enthält, vorhanden sein.
Die Verwendung von beispielhaften diagnostischen Systemen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird in den Diskussionen der Figuren 1 bis 3 erläutert. Es werden die Onkoprotein-Liganden, die in Form eines Überzugs auf Nitrocellulose aufgebracht und dann mit einem erfindungsgemäßen Rezeptor gemischt wurden, in Beziehung zu den Figuren 1 und 2 diskutiert, während ein Zellextrakt, der mit der überstehenden Hybridom-Flüssigkeit inkubiert wird, unter Bildung eines immunologischen Komplexes, in bezug auf die Fig. 3 diskutiert wird.
Die Rezeptoren werden verwendet zusammen mit einer "Indikator-Gruppe" oder einer "Markierung". Die Indikator Gruppe oder Markierung wird in Verbindung mit dem Rezeptor als Mittel zur Bestimmung, ob eine Immun-Reaktion stattgefunden hat und sich ein immunologischer Komplex gebildet hat, und in einigen Fällen zur Bestimmung des Umfangs einer solchen Reaktion verwendet.
Die Indikator-Gruppe kann ein einzelnes Atom sein wie im Falle von radioaktiven Elementen, wie Jod 125 oder 131, Wasserstoff 3 oder Schwefel 35 oder Kohlenstoff 14, oder der NMR-aktiven Elemente, wie Fluor 19 oder Stickstoff 15. Die Indikator-Gruppe kann auch ein Molekül sein, beispielsweise ein fluoreszierender Farbstoff, wie Fluorescein, Rhodamin B oder ein Enzym wie Rettich-Peroxidase (HRP) oder Glucose-Oxidase oder dgl.
Die Indikator-Gruppe kann an den Rezeptor gebunden sein wie wenn ein Antikörper mit ¹²&sup5;J markiert ist. Die Indikator-Gruppe kann auch das gesamte oder einen Teil eines getrennten Moleküls oder Atoms darstellen, das mit dem Rezeptormolekül, wie z.B. HRP, gebunden an Kaninchen-Antimaus-Antikörper, reagiert, wobei der Antikörper-Rezeptor in einer Maus gebildet (induziert) wurde oder ein radioaktives Element, wie ¹²&sup5;J an Protein A gebunden ist, das aus Staphylococcus aureus erhalten wurde.
Wenn die Haupt-Indikator-Gruppe ein Enzym, wie z.B. HRP oder Glucose-Oxidase ist, sind zusätzliche Reagentien erforderlich, um den Umstand sichtbar zu machen, daß eine Tmmun-Reaktion aufgetreten ist und sich der Rezeptor-Ligand-Komplex gebildet hat. Zu solchen zusätzlichen Reagentien für HRP gehören Wasserstoffperoxid und ein Oxidationsfarbstoff-Vorläufer, wie Diaminobenzidin. Zu Beispielen für weitere Reagentien, die mit Glucose-Oxidase verwendbar sind, gehören ABTS-Farbstoff, Glucose und HRP.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Indikator-Gruppe" oder "Markierung" umfassen einzelne Atome und Moleküle, die an den Rezeptor gebunden sind oder getrennt verwendet werden und unabhängig davon, ob diese Atome oder Moleküle allein oder in Kombination mit weiteren Reagentien verwendet werden. Diese Indikator-Gruppen oder Markierungen sind in der Immunchemie an sich bekannt und stellen einen Teil dieser Erfindung nur insofern dar, als sie zusammen mit ansonsten neuen Rezeptoren, Verfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Eine Indikator-Gruppe oder eine Markierung wird vorzugsweise zusammen mit dem Rezeptor geliefert und kann zusammen damit verpackt oder getrennt verpackt sein. Zusätzliche Reagentien, wie Wasserstoffperoxid und Diaminobenzidin, können ebenfalls in dem System enthalten sein, wenn eine Indikator-Gruppe wie HRP verwendet wird. Diese Materialien sind im Handel leicht erhältlich ebenso wie viele Indikator-Gruppen und brauchen nicht zusammen mit dem diagnostischen System geliefert zu werden. Außerdem zersetzen sich einige Reagentien wie Wasserstoffperoxid beim Stehenlassen oder haben sonst eine kurze Lebensdauer wie radioaktive Elemente und werden besser vom Endverbraucher geliefert (bereitgestellt).
Das diagnostische System kann auch eine Feststoffmatrix umfassen, bei der es sich um eine Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen handeln kann, die unter der Bezeichnung Immulon II von der Firma Dynatech, Alexanderia, VA, vertrieben wird. Der Mikrotiter-Streifen oder die Mikrotiter-Platte besteht aus einem klaren Kunststoffmaterial, vorzugsweise Polyvinylchlorid oder Polystyrol. Alternative Feststoffmatrices für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen diagnostischen System und in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von etwa 1 bis etwa 5 mm, erhältlich von der Firma Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA; Polystyrol-Rohre, -Stäbe oder Schaufeln einer geeigneten Größe und ein Polystyrollatex, dessen Polystyrolteilchen eine Größe von etwa 1 um haben und durch Zentrifugieren von dem Latex getrennt werden können.
Die Feststoffmatrix kann auch aus einer Vielzahl von Materialien, beispielsweise vernetztem Dextran, wie Sephadex G-25, -50,- 100, -200 und dgl., erhältlich von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA, Agarose und vernetzter Agarose, wie Sepharose-6B, CL-6B, 4B, CL46 und dgl., ebenfalls erhältlich von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, bestehen.
Das diagnostische System kann außerdem umfassen einen Standard, mit dem die Versuchsergebnisse verglichen werden, und verschiedene Puffer in trockener oder flüssiger Form, um unter anderem die Mikrotiterplatten-Wände zu waschen, die Probe zu verdünnen, das markierte Reagens zu verdünnen oder dgl.
Ein ELISA-Assay stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Dabei wird eine wäßrige Zusammensetzung, die auf die Anwesenheit eines Onkoprotein-Liganden untersucht werden soll, wie z.B. konzentrierter Urin, an eine Feststoffmatrix, z.B. eine Mikrotiter-Test-Vertiefung gebunden oder anderweitig daran fixiert unter Bildung eines festen Trägers. Eine flüssige Lösung, beispielsweise eine Phosphat-gepufferte Salzlösung, die überstehende Hybridom- Flüssigkeit oder Ascites-Flüssigkeit, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptor enthält, wird mit dem festen Träger gemischt unter Bildung einer Feststoff- Flüssigphasen-Mischung. Die Feststoff-Flüssigphasen-Mischung wird eine ausreichende Zeitspanne lang gehalten, so daß sich der monoklonale Rezeptor an den Onkoprotein-Liganden des festen Trägers binden kann (oder eine Immunreaktion damit eingehen kann), d.h. sich an der festen Matrix fixieren kann. Der Feststoffund die Flüssigphase werden anschließend voneinander getrennt und die Menge des an den festen Träger gebundenen monoklonalen Rezeptors und damit die Menge des Onkoprotein-Liganden in der untersuchten Probe werden bestimmt. Diese Bestimmungen werden in der Regel unter Verwendung eines mit einem Radioisotop oder mit einem Enzym markierten Antikörpers oder mit Staphylococcus aureus-Protein A, das sich spezifisch an einen erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptor bindet, durchgeführt.

IV. Affinitäts-Sorbentien

Affinitäts-Sorbentien, in denen die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptormoleküle die aktiven, bindenden Anteile darstellen, stellen eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar.
Bei dieser Ausführungsforrn werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptormoleküle an einen festen Träger gebunden, der gegenüber den Onkoprotein-Liganden chemisch inert ist, die durch diese Sorbentien gereinigt werden sollen. Der hier verwendete Ausdruck "chemisch inert" bedeutet, daß keine chemische Reaktion zwischen dein festen Träger und den Onkoprotein-Liganden auftritt. Es können jedoch physikalische Wechselwirkungen zwischen dem festen Träger und den Onkoprotein-Liganden, beispielsweise eine nicht-spezifische Bindung, auftreten und sie treten auch auf, obgleich solche Wechselwirkungen vorzugsweise minimiert werden.
Der feste Träger kann aus einer Vielzahl von Materialien bestehen, beispielsweise aus vernetztem Dextran, wie Sephadex G-25, -50, -100, -200 und dgl., die von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Yersey, USA, erhältlich sind, Agarose und vernetzter Agarose, beispielsweise Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL4B und dgl., die ebenfalls von der Firma Pharmacia Fine Chemicals erhältlich sind, oder aus Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M, A-50M und dgl., die erhältlich sind von der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien, USA, oder aus Polyacrylamid-Perlen, wie Bio-Gel P-2, P-30, P-100, P-300 und dgl., die ebenfalls von der Firma Bio-Rad Laboratories erhältlich sind. Polyacrylamid-Perlen haben die geringste Neigung zu einer nicht-spezifischen Bindung unter den obengenannten Trägern, sie weisen jedoch in der Regel eine geringe Porosität auf, die ihre Bindungskapazität begrenzt. Die Agarose- und vernetzten Agarose-Materialien sind hier bevorzugt und sie werden beispielhaft als fester Träger erläutert.
Der Agarose-Träger wird in der Regel aktiviert für die Erzielung einer Bindung unter Verwendung von Bromcyan. Der aktivierte Träger wird dann gewaschen und an die Rezeptormoleküle gebunden, ohne den aktivierten Träger zu trocknen. Der an den Träger gebundene Rezeptor wird dann gewaschen und ist verwendungsfertig. Die nicht-umgesetzten reaktiven Gruppen an dem Träger können gewünchtenfalls mit einem Amin, wie Ethanolamin oder Tris, umgesetzt werden, obgleich diese reaktiven Gruppen schnell zerfallen.
Das Affinitäts-Sorbens kann in seinem losen Zustand, z.B. in einem Becher oder in einem Kolben, verwendet werden oder es kann in einer Säule enthalten sein. Vor der Verwendung wird das Affinitäts-Sorbens vorzugsweise in dem Puffer oder in einem anderen wäßrigen Medium, der für die Onkoprotein-Reinigung verwendet sind, gewaschen, um nicht- spezifisch gebundedne Proteine oder solche Rezeptoren, die instabil an den Träger gebunden waren, zu eliminieren.
Es wird eine wäßrige Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Onkoprotein-Liganden enthält, der eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die der Aminosäurerest-Sequenz des Polypeptids entspricht, an den sich der gebundene Rezeptor des Affinitäts-Sorbens bindet, beispielsweise ein Serum oder ein Zell-Extrakt, und dann wird sie mit dem Affinitäts-Sorbens gemischt. Diese Mischung bildet einen reversiblen gebundener Rezeptor-Ligand-Komplex zwischen dem gebundenen Rezeptor und dem Onkoprotein-Liganden.
Der gebundene Rezeptor-Ligand-Komplex wird dann von dem Rest der nicht-komplex gebundenen wäBrigen Zusammensetzung abgetrennt, um dadurch das Onkoprotein in gereinigter Form, gebunden an das Affinitäts-Sorbens, zu erhalten. Wenn das Mischen in einem Becher oder in einem Kolben durchgeführt wird, kann diese Trennung durch Filtrieren und Waschen durchgeführt werden. Wenn das Sorbens in einer Säule vorliegt, kann die Trennung durch Elution des nicht- komplex gebundenen wäßrigen Mediums, woran sich wiederum vorzugsweise eine Waschstufe anschgließt, durchgeführt werden.
Wenn das gereinigte Protein frei von dem Affinitäts-Sorbens sein soll, kann es in der Regel nach einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden. Bei jedem dieser Verfahren wird der reversible gebundene Rezeptor-Ligand-Komplex in seine Komponententeile aus dem Träger-gebundenen Rezeptor und dem Onkoprotein-Ligand dissoziiert, woran sich die Abtrennung des Liganden von dem gebundenen Rezeptor anschließt unter Bildung des gereinigten Onkoproteins, das frei von dem Affinitäts-Sorbens ist.
Die Dissoziation des reversiblen Komplexes kann auf eine Reihe von Arten durchgeführt werden. In der Regel wird eine 0,2 molare Glycinhydrochlorid-Lösung bei einem pH- Wert von etwa 2,5 verwendet. Alternativ kann der gebundene Ligand aus dem gebundenen Rezeptor verdrängt werden durch Mischung des reversiblen Komplexes mit einem Überschuß an dem immunogenen Polypeptid, das zur Bildung des Rezeptors verwendets wurde. Durch eine solche Verdrängung wird eine mögliche Denaturierung des Liganden vermieden. Die Abtrennung des dissoziierten Onkoprotein-Liganden von dem Affinitäts-Sorbens kann wie oben durchgeführt werden.
Die Herstellung von Affinitäts-Sorbentien und ihre Verwendung ist allgemein bekannt. Solche Materialien und ihre Verwendung, welche die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle enthalten, waren bisher jedoch nicht bekannt. Eine detaillierte Beschreibung von Affinitäts-Sorbentien, ihrer Herstellungsverfahren und ihrer Verwendung, wobei das Antigen an den Träger gebunden ist, ist zu finden in "Antibody as a Tool", Marchalonis and Warr eds. John Wiley & Sons, New York, S. 64-67 und 76-97 (1982)

V. Materialien und Verfahren

A. Züchtung von Viren und Zellinien

Eine nicht-infizierte Nerz-Lungenzellinie (CCL64), die gleiche Linie, die produktiv transformiert wurde mit dem Snyder-Theilen-Stamm des Katzen-Sarcom-Virus (ST-FeSV) und des Katzen-Leukämie-Virus B (FeLV-B) und als MSTF bezeichnet wird, sowie die gleiche Linie, die nicht-produktiv infiziert wurde mit dem Gardner-Arnstein-Katzen-Sarcom-Virus (GA-FeSV) und als 64F3C17 bezeichnet wird, wurden wie in Sen et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 1246-1250 (1983), beschrieben, kultiviert (gezüchtet). Eine nicht- produzierende Vogel-Myeloblast-Zellinie, die nicht-produktiv mit Vogel-Myeloblastose-Virus infiziert worden war, wurde wie in Duesberg et al, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 77, 5120-5124 (1980), beschrieben, kultiviert. Die nicht- produzierende Kralalenaffen (Marmoset)-Zellinie, die nicht-produktiv infiziert wurde mit dem Simian-Sarcom-Virus (SSV) und als NPV/SiSV und als NPVI/SiSV bezeichnet wird, wurden wie in Devare et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 731-735 (1983), beschrieben kultiviert (gezüchtet). Die nicht-produktiv transformierte Vogel-Fibroblast-Zellinie, die mit dem FujinamiSarcom-Virus (FSV) infiziert war, war ein Geschenk des B. Sefton of the Salk Institute, La Jolla, Californien, USA. Nicht-infizierte Maus NIH 3T3 Fibroblast-Zellen und Maus NIH 3T3 Fibroblast-Zellen, die produktiv mit dem Harvey-Maus-Sarcom-Virus infiziert worden waren, wurden wie von Todaro et al., "J. Cell Biol.", 17, 299-313 (1963), und Harvey, "Nature", 204, 1104-1105 (1964), beschrieben, kultiviert (gezüchtet). Human T24-Blasen-Carcinom-Zellen wurden wie von Bubenik et al., "Int. J. Cancer", 11, 765-773 (1973), beschrieben, kultiviert (gezüchtet).

B. Synthese von Peptiden

Polypeptide wurden synthetisiert unter Anwendung von Festphasen-Verfahren, wie sie von Marglin und Merrifield, "A. Rev. Biochem." 39 841-866 (1970), beschrieben sind, und sie wurden durch Aminosäure-Analyse bestätigt. Die Sequenzinformation stammt aus einer Aminosäure-Sequenzierung des Virus-Proteins oder aus Vorhersagen auf der Basis einer Nucleotid-Sequenzierung. Die Quellen für die Sequenz- Information waren diejenigen, die in den Fußnoten in bezug auf diese Sequenzen und ihre Onkogene aufgezählt sind.
Für Polypeptide mit weniger als 35 Resten, die in Immunisierungs-Inokula verwendet wurden, wurde ein Cystein-Rest zu dem Amino-Terminus oder dem Carboxyl-Terminus jedes Polypeptids zugegeben, dessen entsprechende Onkoprotein-Sequenz diesen Rest nicht enthielt. Die Cys-Reste wurden verwendet, um die Kupplung an einen Protein-Träger, wie nachstehend beschrieben, zu untersützen. Bei der Herstellung eines brauchbaren synthetischen Polypeptids nach dem obigen Festphasen-Verfahren wurden die Aminosäurereste mit einem vernetzten Harz (der festen Phase) über eine Ester- Bindung ab dem Carboxy-terminalen Rest verbunden. Wenn das Polypeptid über einen Cys-Rest an einen Träger gebunden wurde, wurde dieser Cys-Rest zweckmäßig als Carboxy-terminaler Rest verwendet, der über einen Ester an das Harz gebunden war.
Die α-Aminogruppe jeder zugegebenen Aminosäure wurde in der Regel durch eine tert-Butoxycarbonyl (t-BOC)-Gruppe geschützt, bevor die Aminosäure zu der wachsenden Polypeptid-Kette zugegeben wurde. Die t-BOC-Gruppe wurde dann durch Standardverfahren entfernt, bevor die nächste Aminosäure zu der wachsenden Polypeptid-Kette zugegeben wurde.
Die reaktiven Arninosäure-Seitenketten wurden während der Synthese der Polypeptide ebenfalls geschützt. Für die übrigen Aminosäurereste wurden die folgenden üblichen Seitenketten-Schutzgruppen verwendet:
O-(p-Bromobenzyloxycarbonyl) für Tyrosin: O-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure und Glutaminsäure; S-Methoxybenzyl für Cystein, Dinitrophenyl für Histidin; 2-Chlorobenzoxycarbonyl für Lysin und Tosyl für Arginin.
Geschützte Aminosäuren wurden aus geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert, wobei man in der Dünnschichtchromatographie einzelne Flecken erhielt. Die Kupplungen wurden in der Regel durchgeführt unter Verwendung eines 10-fachen molaren Überschusses an sowohl geschützter Aminosäure als auch Dicyclohexcylcarbodiimid gegenüber der Anzahl der Milliäquivalente der anfänglichen N-terminalen Aminosäure. Ein zweifacher molarer Überschuß an beiden Reagentien kann ebenfalls angewendet werden. Für Asparagin wurde eine gleiche molare Menge an N-Hydroxybenzotriazol zu der geschützten Aminosäure zugegeben und Dimethylformamid wurde als Lösungsmittel verwendet. Alle Kupplungsreaktionen wurden durch den Picrinsäure-Test von Gisin, "Anal. Chem. Acta", 58, 248-249 (1972), zu mehr als 99 % beendet.
Nach der Herstellung des gewünschten Polypeptids wurde ein Teil des resultierenden geschützten Polypeptids (etwa 1 g) mit 2 ml Anisol behandelt und es wurden etwa 20 ml wasserfreier Fluorwasserstoff in dem Reaktionsbehälter bei Trockeneistemperatur kondensiert. Die resultierende Mischung wurde etwa 1 h lang bei etwa 4ºC gerührt, um die Schutzgruppen abzuspalten und da Polypeptid aus dem Harz zu entfernen. Nach dem Eindampfen des Fluorwasserstoffs bei einer Temperatur von 4ºC unter einem N&sub2;-Strom wurde der Rückstand 3 mal mit wasserfreiem Diethyläther extrahiert, um das Anisol zu entfernen, und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet.
Das im Vakuum getrocknete Material wurde mit (3 x 50 ml) 5 %iger wäßriger Essigsäure extrahiert, um das freie Polypeptid von dem Harz zu trennen. Die den Extrakt enthaltende Lösung wurde lyophilisiert, wobei man ein nicht-oxidiertes synthetisches Polypeptid erhielt.

C. Kupplung von synthetischen Polypeptiden an ein Trägerprotein

Die nicht-oxidierten synthetischen Polypeptide wurden an das Träger-Protein Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) über einen Cystein-Rest (Cys; C) des Polypeptids gekupopelt unter Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid- Ester als Kupplungsreagens, wie in Green et al., "Cell", 28, 477-487 (1982), beschrieben. Wenn ein Cys-Rest ein terminaler Rest in einer Sequenz war, wurde kein weiterer Cystein-Rest zugegeben.
Kurz gesagt wurden als generalisiertes Verfahren für jedes Polypeptid 4 mg KLH in 0,25 ml eines 10 mmolaren Natriumphosphat-Puffers (pH 7,2) mit 0,7 mg MBS umgesetzt, das in Dimethylformamid (DMF) gelöst war, und die resultierende Mischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Die MBS-Lösung wurde zugetropft, um sicherzustellen, daß die lokale Konzentration von DMF nicht zu hoch war, da KLH bei DMF-Konzentrationen von etwa 30 % oder höher unlöslich ist. Das Reaktionsprodukt KLH-MB wurde in eine Chromatographie-Säule, die mit Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gefüllt war und die mit 50 mmolarem Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert war, laufen gelassen, um freies MBS zu entfernen. Die KLH-Rückgewinnung aus den Peak-Fraktionen des Säulen-Eluats, die bei 280 nm überwacht wurden, betrug, wie geschätzt wurde, etwa 80 %.
Das so hergestellte KLH-MB wurde dann mit 5 mg Polypeptid, gelöst in 5 ml Puffer, umgesetzt. Der pH-Wert der resultierenden Reaktionszusammensetzung wurde auf 7 bis 7,5 eingestellt und die Reaktionszusammensetzung wurde 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt.

D. Immunisierung und Fusion

1. von fes abstammende (verwandte) Polypeptide

Polypeptide, z.B. solche, die in ihrer Aminosäurerest-Sequenz einem Teil des ST-FeSV v-fes-Onkoproteins entsprechen, wurden an KLH gekuppelt und zum Immunisieren von 129 GIX&spplus;-Mäusen verwendet, wie oben und von Niman et al in "Monoclonal Antibodies and T Cell Products", Katz es. (Boca Raton, Florida, CRC Press, Inc., 1982), S. 21-51, beschrieben. Milzzellen aus diesen immunisierten Mäusen wurden mit SP2/0-Ag14-Myelom-Zellen unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) 1500 fusioniert (J.T. Baker Chemco, Phillsburg, New Jersey); PEG-Lösungen für die Fusion wurden mindestens einen Monat vor der Verwendung hergestellt, um den Fusionswirkungsgrad zu fördern. SP2/0- Ag14-Zellen bilden nicht ihre eigenen Ig-Moleküle, wodurch die Isotopie-Analyse und die nachfolgende Reinigung erleichtert werden, diese Zellen bilden auch keine Retroviren. Die fusionierten Zellen wurden dann wieder suspendiert in 400 ml Dulbecco-Minimal-Essential-Medium mit hohem Glucosegehalt (Flow Laboratories, Inc. Inglewood, Californien), das 10 % fötales Kalbsserum, 1,0 x 10&supmin;&sup6; mol Hypoxanthin, 1 x 10&supmin;&sup6; mol Methotrextat und 1,6 x 10&supmin;&sup5; mol Thymidin enthielt. Danach wurden die Zellen in 30 ul-Platten ausgestrichen und wie von Niman et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 1982, supra, beschrieben gezüchtet.

2. Von sis und myb abstammende (verwandte) Polypeptide

Polypeptide (c) und (d), deren Aminosäurereste den Positionen 139-155 der vorhergesagten Sequenz des Simian-Sarcom-Virus-Transformations-Proteins p28sis und den Resten 2 bis 18 der vorhergesagten Sequenz des Vogel-Myeloblastose- Virus-Onkoproteins entsprechen, wurden synthetisiert und mit einem KLH-Träger wie vorstehend beschrieben gekuppelt. Die so hergestellten Konjugate wurden in einer Menge von etwa 50 ug Polypeptid pro 129 GIX&spplus;-Maus pro Injektion verabreicht.
Am Tage 0 wurde jedes Konjugat mit dem vollständigen Freund-Adjuvans gemischt und intraperitoneal injiziert. Am Tage 19 wurde jedes Konjugat mit Alaun gemischt zur Erzielung einer Konzentration von 5 mg pro ml Alaun und intraperitoneal injiziert. Am Tage 62 wurde eine Booster-Injektion von Polypeptid (c) in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung intravenös verabreicht. Am Tag 67 wurde ein Serum, das oligoklonale Antikörper enthielt, durch Orbital- Punktion entnommen. Nach einer zweiten Alaun enthaltenden Immunisierung mit dem Polypeptid (d) am Tage 41 wurde die Booster-Injektion von Polypeptid (d) auf ähnliche Weise am Tage 143 verabreicht, wobei am Tage 148 entsprechende oligoklonale Antikörper erhalten wurden. Das so erhaltene Serum wurde auf die Antigenizität seiner Rezeptoren getestet, wie in Fig. 4 diskutiert.

E. Antikörper-Bindungs-Assay

Hybridome bildende Antipolypeptid-Antikörper wurden mit Hilfe eines Enzym-gebundenen Immunoabsorbens-Assay (ELISA)-Verfahrens nachgewiesen, wie in der Beschreibung der Fig. 4 erläutert und von Niman et al, "Monoclonal Antibodies and T Cell Product", supra, beschrieben. Kurz gesagt wurden etwa 50 umol Polypeptid auf Mikroliter-Platten getrocknet, mit Methanol fixiert und mit der überstehenden Hybridom-Gewebe-Kulturflüssigkeit inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurde die Hybridom-Antikörper-Bildung unter Verwendung eines Kaninchen-Antimaus-Kappa-Ketten- Antikörpers (Litton Bionetics Inc., Kensington, Maryland) und danach mit einer Glucose-Oxidase, die an Ziegen- Antikaninchen-Antiseren konjugiert war, nachgewiesen.
Die Bindung wurde mit einem 2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzothiazolin-sulfonat (6)] (ABTS)-Farbstoff (Boehringer- Mannheim, Indianapolis, Indiana) in Gegenwart von Glucose und Rettich-Peroxidase sichtbar gemacht, wie von Niman et al, "Monoclonal Antibodies and T Cell Products", supra, beschrieben. Der Isotyp wurde bestimmt durch Ersatz der oben beschriebenen Antimaus-Kappa-Kette durch verschiedene Kaninchen-Antimaus-Lambda- oder -Langketten-Seren.

F. Elektrophoretische Übertragung und immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulose

Zellextrakte wurden einer Polyacrylamid-Elektrophorese unterworfen und das Protein wurde auf Nitrocellulose übertragen (Schlecher und Schuell, Inc. Keene, New Hampshire), wie in der Beschreibung der Fig. 5 erläutert und von Niman et al, "Virology", 123, 187-205 (1982), beschrieben. Ein mit Peroxidase markiertes Kaninchen-Antimaus-IgG-Serum (Tagol, Inc., Burlingame, Californien), verdünnt im Verhältnis 1:1000, wurde mit den Transfers 1 h lang bei 25ºC inkubiert, danach gewaschen wie von Niman und Elder in "Monoclonal Antibodies and T-Cell Products", supra, beschrieben. Der gebundene Antikörper wurde durch Inkubation in 10 mmolarem Tris(2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol), pH 7,4, 0,009 % H&sub2;O&sub2;, 0,0025 % 3,3'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid (Eastman-Kodak Co., Rochester, New York) sichtbar gemacht.

G. Herstellung von gereinigtem PDGF

16 Einheiten von gealterten (outdated) Blutplättchen wurden erhalten von der San Diego-Blutbank in San Diego, Californien. Der hier verwendete gereinigte PDGF wurde erhalten nach den ersten zwei Stufen der von Antonides et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 76, 1809-1813 (1979), beschriebenen Verfahren.
Kurz gesagt wurden Blutplättchen durch Zentrifugieren mit 28 000-facher Schwerkraft (g) für 20 min bei 4ºC gesammelt. Die erhalten Blutplättchen wurden durch erneutes Suspendieren in 400 ml einer Mischung, enthaltend (a) 9 Volumenteile 17 mmolare Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 0,15 mol NaCl und 1 % Glucose, und (b) 1 Volumenteil einer Lösung, die auf 100 ml enthielt 0,8 g Citronensäuremonohydrat, 2,2 g wasserfreie Dextrose und 2,6 g Natriumcitratdihydrat, und nachfolgendes weiteres Zentrifugieren bei 28 000 x g für 10 min bei 4ºC gewaschen. Die so gewaschenen Blutplättchen wurden dann in 16 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,008 mol NaCl und 0,01 mol Phosphationen, bei pH 7,4 (NaCl-Phosphationen-Lösung) wieder suspendiert und 10 min lang zum Sieden erhitzt, um die Zellen zu lysieren.
Den lysierten Zellen wurden in Konzentrationen von 1 mmol bzw. 3 % Phenylmethylsulfonylfluorid und Traysylol (von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), Protease-Inhibitoren, zugegeben. Die lysierte Zellmischung wurde erneut zentrifugiert, wobei man ein Pellet und eine überstehende Flüssigkeit erhielt.
Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 8 ml CM Sephadex C- 50 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey)-Perlen gemischt, die vorher in der NaCl-Phosphationen-Lösung äquilibriert worden waren. Die Perlen und die Flüssigkeit wurden in eine Chromatographie-Säule (15 x 1,5 cm) gegossen, die mit 6-Säulen Volumina der obengenannten NaCl- Phosphationen-Lösung gewaschen wurde. Der PDGF, das erste Eluat, wurde erhalten durch Eluieren der Säule mit 2 Säulenvolumina 1 molarem NaCl. Zu dem Eluat wurde Traysylol zugegeben zur Einstellung einer Endkonzentration von 3 % und das Eluat wurde gegen die obengenannte NaCl-Phosphationen-Lösung dialysiert.
Das oben hergestellte lysierte Zellpellet wurde mit einer 1 molaren NaCl-Lösung 24 h lang bei 4ºC extrahiert und dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen die obengenannte NaCl-Phosphationen-Lösung dialysiert, mit dem obengenannten Sephadex gemischt und in eine Säule eingeführt. Die Säule wurde gewaschen und eluiert wie oben, wobei man ein zweites Eluat erhielt, das wie oben dialysiert wurde. Das in diesem Verfahren erhaltene Pellet wurde auf die gleiche Weise behandelt, wobei man ein drittes Eluat erhielt, das erneut wie oben erläutert dialysiert wurde.
Die drei dialysierten Eluate wurden miteinander vereinigt und eingeengt auf ein Volumen von einigen wenigen ml unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrations-Apparatur (Amicon, Lexington, Massachusetts) und eines Filters mit einem Ausschluß von 10k Dalton. Der so gereinigte PDGF wurde dann wie für die Fig. 5 erläutert behandelt.
Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen (Schleicher & Schuel, BA85), wie von Towbin et al. in "Proc. Natl. Academy of Science", 76, 4350-4354 (1976), beschrieben unter Verwendung einer Elektroblot-Apparatur (E.E. Apparatus Corp. in Jacksonville, Florida), wobei der Puffer bestand aus 25 mmol Tris-Base, 192 mmol Glycin, 20 % Methanol und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (pH 8,3). Nach dem Transfer wurde die Nitrocellulose etwa 18 h lang bei 4ºC blockiert in BLOTTO (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer) [5 Gew.-% pro Volumen fettfreie Trockenmilch, 0,01 % Antischaum A-Emulsion (eine 30 %ige wäßrige Emulsion eines Silicon-Polymers, enthaltend anionische Emulgatoren, Sigma A5758), 0,0001 % Merthiolat (Sigma T5125) in PBS] (vgl. Johnson und Elder, "J. Exp. Med.", 159, 1751- 1756 (1983)), um die nicht-spezifische Bindung zu reduzieren. Die Blots wurden dann mit 100 ul Antipeptid-Antikörper in 100 ml BLOTTO 3 h lang reagieren gelassen und danach dreimal 1 h lang mit 50 ul frischem BLOTTO gewaschen.
Die an spezifische Onkoprotein-Liganden gebundenen Antipeptid-Antikörper wurden nachgewiesen durch Umsetzung der Blots mit 20 ul Antiserum A, das mit ¹²&sup5;J markiert war, in 10 ml BLOTTO für 1 h. Die Blots wurden dann in 50 ml frischem BLOTTO 15 min lang viermal gewaschen und dann unter einem kontinuierlichen Wasserstrom 20 min lang gewaschen.

H. Urin-Assay

Der Urin von drei Spendern (Patienten) wurde gesammelt und auf 200 X eingeengt unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrations-Apparatur. Diese Flüssigkeit wurde als Körperflüssigkeitprobe in dem Assay für Proteine verwendet, die codiert wurden durch oder abstammten aus sis- und fes-Antiseren.
Die Urinprobe wurde wie folgt hergestellt: der Urin wurde 10 min lang bei 4ºC mit 5000 UpM geklärt. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann unter Verwendung eines Amicon-Filters unter Ausschluß von 10 000 Dalton eingeengt. Dieser konzentrierte Urin wurde dann dialysiert zur Herstellung von Protein-Fraktionen.
Konzentrierter Urin wurde mit 20 ul pro Streifen in einem 5 - 17-% Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch behandelt und dann auf Nitrocellulose elektrophoretisch übertragen. Der Nitrocellulose-Filter wurde dann bei einer Verdünnung von 1:200 mit beispielsweise Maus-Antiserum in einer Lösung von 3 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Triton und PBS untersucht. Der Nitrocellulose-Filter wurde danach 3 mal gewaschen und mit 10&sup6; cpm Protein A, das mit ¹²&sup5;J markiert war, inkubiert.
Die Bindung wurde mit Verstärkerschirmen bei -70ºC sichtbar gemacht, wie oben in bezug auf die Fig. 6 beschrieben.

I. Onkoproteine und transformierte Zellen

NRK-Zellen und mit SSV transformierte NRK-Zellen wurden zur Verfügung gestellt von S.A. Aaronson und K.C. Robbins des Center for Cancer Research, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. Die Zellen wurden in einem Dulbecco-Minimal-Essential-Medium, das durch 10 % fötales Kalbsserum, 2 mmol L-Glutamin, 100 IU pro ml Penicillin und 100 ug pro ml Streptomycin ergänzt wurde, gezüchtet.
Parallele Kulturen von NRK-Zellen und mit SSV-transformierte NRK-Zellen wurden dreimal in 2 Stunden-Intervallen gewaschen und dann 18 h lang in dem Medium ohne Serum bei 15 ml pro T75 cm²-Kolben inkubiert. Das so konditionierte Medium wurde dann zentrifugiert und im eingefrorenen Zustand bei -70ºC gelagert.
Das konditionierte Medium wurde aufgetaut, unter Anwendung einer Dialyse in 1 molarer Essigsäure auf das 500-fache eingeengt und danach lyophilisiert. Nach der Solubilisierung und Reduktion mit 10 % 2-Mercaptoethanol wurden 50 ul konzentrierte, konditionierte Medien in einem 5 - 17 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch behandelt. Dann wurden die sekretierten Proteine elektrophoretisch übertragen und an Nitrocellulose gebunden. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Vorinkubation des Zellextrakts mit einer Lösung, enthaltend 3 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Polyoxyethylenoctylphenyläther in mit Phosphat gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 blockiert.
Vor der Durchführung der immunologischen Assays wurden 20 ul Maus-Antiseren, induziert durch PDGF-2(1-17) oder PDGF- 2(73-89) (wie oben beschrieben) mit 100 ug eines geeigneten Polypeptids 1 h lang bei 37ºC vorinkubiert. Die oligoklonale Antikörper enthaltende Polypeptid-Reaktionsmischung wurde dann mit der obengenannten Vorinkubationslösung im Verhältnis 1:500 verdünnt. Die so hergestellte verdünnte Lösung wurde dann bei 4ºC mit den an Nitrocellulose gebundenen konditionierten Medien in Kontakt gebracht und dieser Kontakt wurde für eine Zeitspanne von 15 min aufrechterhalten (inkubiert), eine Zeit, die für die Immunreaktion zwischen dem Antikörper (Rezeptor) und dem an die Nitrocellulose gebundenen Protein ausreichte. Die Nitrocellulose wurde anschließend gewaschen.
Die gewaschene Nitrocellulose wurde dann mit Affinitätsgereinigten Kaninchen-Antimaus-IgG&sub1;-Antikörpern (Litton), verdünnt im Verhältnis 1:500 bei 25ºC in Kontakt gebracht. Der Kontakt wurde für eine Zeitspanne von 2 h aufrechterhalten, die ausreichte, um eine Immunreaktion zwischen den Antimaus-IgG&sub1;-Antikörpern und den Antikörpern aus den Antiseren zu bewirken, die sich an die Nitrocellulose gebundenen sekretierten Proteine der konditionierten Medien gebunden hatten. Die Nitrocellulose wurde dann erneut gewaschen.
Die Immunreaktion (Bindung) wurde mit 10&sup6; Zählern pro min von mit ¹²&sup5;J markiertem Staphylococcus aureus-Protein A sichtbar gemacht, wie von Niman, "Nature", 307, 180-183 (1984), beschrieben.

Claims

1. Monoklonales Rezeptormolekül der Ig-Klasse, das sich bindet sowohl (a) an einen Protein-Liganden, der durch ein Retrovirus-Gen codiert worden ist, als auch (b) an ein Polypeptid, das eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die etwa 7 bis etwa 40 Aminosäurereste enthält, die einer Aminosäurerest-Sequenz eines Teils des Proteins entspricht, das durch ein Gen eines Retrovirus codiert worden ist, wobei das Rezeptormolekül gegenüber einem Immunogen gebildeten (induziert) wird, das dieses Polypeptid enthält.

2. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet:

a) an ein Polypeptid, das durch das fes-Gen codiert worden ist und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

b) an ein Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das fes-Gen exprimieren.

3. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

a) an ein Polypeptid, das durch das myb-Gen codiert worden ist und eine Aminosäürerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

b) an ein Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das myb-Gen exprimieren.

4. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

a) an ein Polypeptid, das durch das sis-Gen codiert worden ist und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

b) an ein Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das sis-Gen exprimieren.

5. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

a) an ein Polypeptid, das durch das ras-Gen codiert worden ist und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

wobei die in Klammern angegebenen Aminosäurereste jeweils eine Alternative zu dem unmittelbar vorhergehenden Aminosäurerest in der Formel darstellen, und

b) an ein Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das ras-Gen exprimieren.

6. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

a) an ein Polypeptid, das durch das myc-Gen codiert worden ist und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

b) an ein On)coprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das myc-Gen exprimieren.

7. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

a) an ein Polypeptid, das durch das mos-Gen codiert worden ist und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

b) an ein Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das mos-Gen exprimieren.

8. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 1, das sich bindet

b) an ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, die beseht aus PDGF-1, PDGF-2 und einem Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das sis-Gen exprimieren.

9. Verfahren zur Bildung von monoklonalen Rezeptormolokülen für einen Proteinmolekül-Liganden, das die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung eines immunogenen Polypeptids oder eines Konjugats des genannten Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, wobei das Polypeptid etwa 7 bis etwa 40 Aminosäurereste enthält und eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die einem Teil der Aminosäurerest-Sequenz eines Proteinmolekül-Liganden entspricht, der durch ein Retrovirus-Gen codiert worden ist, wobei das Polypeptid als ein Konjugat, das gebunden ist an ein Keyhole-Limpet-Hämocyanin, wenn es zum Immunisieren einer Maus verwendet wird, ausreichend immunogen und antigen ist, um einen 50 % -Bindungs-Titer des immunisierten Maus-Serums an das genannte Polypeptid in einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 nach drei Immunisierungen innerhalb eines Zeitraums von 1 Monat zu ergeben, wobei jede der genannten Immunisierungen mindestens 10 ug Polypeptid in dem Konjugat enthält und für die erste Immunisierung das vollständige Freund-Adjuvans und danach das Alaun-Adjuvans verwendet wird;

b) Hyperimmunisierung eines Säugetiers mit dem genannten Polypeptid oder mit einem Konjugat des genannten Polypeptids, das an einen Träger gebunden ist, unter Bildung eines Hyperimmun-Serums, das Rezeptormoleküle enthält, die einen 50 %-Bindungs-Titer an das genannte Polypeptid bei einer Verdünnung von mindestens etwa 1:400 aufweisen, wobei die Rezeptormoleküle des Serums sich auch an den Proteinmolekül-Liganden binden, wobei dieses immunogene Polypeptid einem Teil desselben in der Aminosäurerest-Sequenz entspricht;

c) Halten des hyperimmunisierten Säugetiers für eine Zeitspanne, die ausreicht, damit der genannte 50 % -Bindungs-Titer an das Polypeptid des Serums abnimmt bis auf eine Verdünnung von weniger als etwa 1:400;

d) anschließende Verabreichung einer Booster-Immunisierung an das Säugetier zusammen mit dem Polypeptid;

e) Fusionieren der Antikörper-bildenden Zellen des geboosterten Säugetiers mit Myelom-Zellen innerhalb eines Zeitraums von etwa 7 Tagen ab dem Tag der Booster-Verabreichung zur Herstellung von Hybridom-Zellen;

f) Bestimmung der so hergestellten Hybridom-Zellen für die Bildung von Rezeptormolekülen, die sich an den Proteinmolekül-Liganden binden, wobei dieses Polypeptid einem Teil desselben in der Aminosäurerest-Sequenz entspricht; und

g) Kultivieren (Züchten) von Hybridom-Zellen, die Rezeptormoleküle bilden, die sich an den Protein-Liganden binden, zur Herstellung einer zusätzlichen Menge an Hybridom- Zellen und monoklonalen Rezeptoren, die von diesen Zellen sekretiert (ausgeschieden) werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem die folgenden Stufen umfaßt:

e-l) Bestimmung der in der Stufe (e) hergestellten Hybridom-Zellen für die Bildung von Rezeptormolekülen, die sich an das genannte Polypeptid binden;

e-2) Kultivieren (Züchten) von Hybridom-Zellen, die Rezeptormoleküle bilden, die sich an das genannte Polypeptid binden zur Herstellung einer zusätzlichen Menge dieser Zellen;

wobei die hergestellten Hybridom-Zellen, die in der Stufe

(f) bestimmt werden, solche Hybridom-Zellen sind, die durch die Kultivierungsstufe (e-2) hergestellt worden sind, und die Hybridom-Zellen, die in der Stufe (g) kultiviert (gezüchtet) werden, sich an das genannte Polypeptid sowie an den genannten Protein-Liganden binden.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin das immunogene Polypeptid eine Aminosäurerest-Sequenz von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus aufweist, die dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

wobei die in Klammern angegebenen Aminosäurereste jeweils eine Alternative zu dem unmittelbar vorhergehenden Aminosäurerest in der Formel darstellen.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin das immunogene Polypeptid eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

13. Diagnostisches System zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Onkoprotein-Liganden, das mindestens eine Packung umfaßt, die monoklonale Rezeptormoleküle nach Anspruch 1 enthält, wobei eine vorgegebene Menge der Rezeptormoleküle, wenn diese mit einer vorgegebenen Menge einer wäßrigen Zusammensetzung gemischt werden, in der das Vorhandensein eines Onkoprotein-Liganden bestimmt werden soll, einen Komplex zwischen dem Rezeptor und dem Liganden bilden, wenn der Onkoprotein-Ligand eine Aminosäurerest- Sequenz enthält, die der Aminosäurerest-Sequenz des durch das Rezeptormolekül gebundenen Polypeptids entspricht.

14. Diagnostisches System nach Anspruch 13, das außerdem eine zweite Packung umfaßt, die ein Markierungsmittel zum Identifizieren des Vorhandenseins des genannten Komplexes enthält.

15. Diagnostisches System nach Anspruch 13, worin das Polypeptid, an das sich der Rezeptor bindet, eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dargestellt wird durch eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus

16. Affinitäts-Sorbens, das umfaßt einen inerten, festen Träger, an den ein Rezeptormolekül nach Anspruch 1 gebunden ist, wobei das Affinitäts-Sorbens einen reversiblen Rezeptor-Liganden-Komplex bildet, wenn es mit einer wäßrigen Zusammensetzung gemischt wird, die einen Protein-Liganden enthält, der eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die der Aminosäurerest-Sequenz des durch den Rezeptor gebundenen Polypeptids entspricht.

17. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen in gereinigter Form, das die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung des Affinitäts-Sorbens nach Anspruch 16;

b) Bereitstellung einer wäßrigen Zusammensetzung, die ein Onkoprotein enthält, das eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die der Aminosäurerest-Sequenz des Polypeptids entspricht, an das sich der gebundene Rezeptor des Affinitäts-Sorbens bindet;

c) Mischen des Affinitäts-Sorbens mit der wäßrigen Zusammensetzung unter Bildung eines reversiblen gebundenen Rezeptor-Liganden-Komplexes zwischen dem Rezeptor und dem Onkoprotein der Stufe (b);

d) Abtrennung des gebundenen Rezeptor-Liganden-Komplexes von der wäßrigen Zusammensetzung, um dadurch das Onkoprotein in gereinigter Form zu erhalten, das an das Affinitäts-Sorbens gebunden ist;

e) Dissoziieren des Rezeptor-Liganden-Komplexes; und

f) Abtrennung des gereinigten Onkoproteins von dem Affinitäts-Sorbens zur Gewinnung des gereinigten Proteins, das frei von dem Affinitäts-Sorbens ist.

18. Monoklonaler Rezeptor nach Anspruch 1, der von dem als ATCC HB 8596 bezeichneten Hybridom sekretiert (ausgeschieden) worden ist.

19. Monoklonaler Rezeptor nach Anspruch 1, der von dem als ATCC HB 8595 bezeichneten Hybridom sekretiert worden ist.

20. Monoklonaler Rezeptor nach Anspruch 1, der von dem als ATCC HB 8594 bezeichneten Hybridom sekretiert worden ist.

21. Monoklonaler Rezeptor nach Anspruch 1, der von dem als ATCC HB 8593 bezeichneten Hybridom sekretiert worden ist.

22. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8596, das einen monoklonalen Rezeptor nach Anspruch 1 sekretiert.

23. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8595, das einen monoklonalen Rezeptor nach Anspruch 1 sekretiert.

24. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8594, das einen monoklonalen Rezeptor nach Anspruch 1 sekretiert.

25. Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 8593, das einen monoklonalen Rezeptor nach Anspruch 1 sekretiert.

26. Monoklonales Rezeptormolekül der Ig-Klasse, das sich bindet sowohl (a) an einen Protein-Liganden, der durch ein Retrovirus-Gen codiert worden ist, als auch (b) an ein Polypeptid, das eine Aminosäurerest-Sequenz aufweist, die etwa 7 bis etwa 40 Aminosäurereste enthält, die einer Aminosäurerest-Sequenz eines Teils des Proteins entspricht, das codiert worden ist durch oder verwandt ist mit einem Gen eines Retrovirus, wobei das Rezeptormolekül gegenüber einem das Polypeptid enthaltenden Immunogen gebildet (angeregt) worden ist.

27. Monoklonales Rezeptormolekül nach Anspruch 26, das sich bindet

b) an ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PDGF-1, PDGF-2 und einem Onkoprotein, das durch Zellen gebildet worden ist, die das sis-Gen exprimieren.

28. Monoklonaler Antikörper, der gebildet (angeregt) worden ist durch Verwendung eines immunogenen Polypeptids, das durch ein Retrovirus-Gen mit etwa 7 bis etwa 40 Aminosäuren codiert worden ist, wobei der Antikörper sich an ein Protein binden kann, das die entsprechende Aminosäuresequenz des Polypeptids enthält.