DE3218312A1

DE3218312A1 - Monoklonale antikoerper, hybridoma-zellklone, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur erkennung von brustkrebs und maligner lymphogranulomatose

Info

Publication number: DE3218312A1
Application number: DE19823218312
Authority: DE
Inventors: Chaya Tel-Aviv Moroz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-05-15
Filing date: 1982-05-14
Publication date: 1982-12-09
Anticipated expiration: 2002-05-15
Also published as: GB2103238B; GB2103238A; US4954434A; CA1201667A; DE3218312C2; US5871735A; FR2505871A1; IL62879A; IL62879A0; JPH05260990A; JPH0614873B2; JPS57196154A; US4882270A; FR2505871B1; JPH0751062B2

Description

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Gegenstand der Erfindung sind Hybridoma-Zellklone und von ihnen gebildete monoklonale Antikörper, die mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, nicht dagegen mit humanem adultem Milz- oder Leber-Ferritin reagieren. Außerdem betrifft die Erfindung monoklonale Antikörper, die mit dem embryonalen Ferritin aus humaner Plazenta reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren.

Die Erfindung betrifft ferner einen Assay zur Erkennung von Brustkrebs und/oder Mb. Hodgkin (maligne Lymphogranulomatose) bei dem an Körpergeweben und/oder Lymphozyten des Patienten selektiv die Anwesenheit von onkofetalem Ferritin nachgewiesen wird.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofetalem Ferritin durch einen cytotoxischen Assay bestimmt.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofetalem ^⁵ Ferritin durch einen Radio-Immunoassay bestimmt.

Die Assays der vorliegenden Erfindung gründen sich auf die Verwendung bestimmter monoklonaler Antikörper, die.in allen geeigneten Tests zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofötalem Ferritin eingesetzt werden können. Die Gegenwart von onkofetalem Ferritin weist beim Menschen auf einen Brustkrebs'im Stadium I oder II oder auf Mb. Hodgkin hin.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart von humanem onkofetalem Ferritin auf der Oberfläche von peripheren Lymphozyten im Kreislauf des Patienten

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bestimmt. Auch die Gegenwart dieser Art von Ferritin weist auf Brustkrebs oder auf Mb. Hodgkin hin.

Ferritin ist das bedeutendste Eisen-Speicherprotein im Gewebe. Geringe Mengen (65 bis 150 ng/ml) werden auch im Plasma gefunden. Die Analyse von normalem Gewebe-Ferritin durch isoelektrische Fokussierung hat eine beträchtliche Heterogenität der Verbindung aufgezeigt. Marcus und Zimberg (Arch. Biochem. Biophysic. Bd. 162 (1974), S. 493) zeigten,, daß Ferritin, welches aus Brusttumor-Gewebe isoliert wurde, saures Isoferritin enthält, das nicht in adultem Leber-Ferritin gefunden wurde. Drysdale und Singer (Cancer Res., Bd. 44 (1974), S. 3352) wiesen das saure Isoferritin in HeIa-Tumorzellen und in Plazentazellen nach. Sie schlugen die Bezeichnung "carcinofetales" Isoferritin für solches Isoferritin vor.

Marcus und.Zimberg (Clin. Res. Bd. 23, (1975), S.447) und Jacobs und Mitarb. (Br. J. Cancer, Bd. 34, (1976), S. 286) berichteten über erhöhte Serum-Ferritinkonzentrationen bei Patienten mit Brustkrebs. Sie schlugen einen Assay auf diesen Stoff als möglichen Indikator zur Erkennung von Brustkrebs vor. Da jedoch alle heterologen Anti-Ferritin-Sera mit den antigenen Determinanten kreuzreagieren, die. sowohl mit adultem als auch mit carcinofetalem Ferritin assoziiert sind_r können sie nicht zwischen den zwei Isoferritinen unterscheiden»

Die Ergebnisse mit diesen Antisera sind deshalb nur bei ·

Patienten signifikant, bei denen der Ferritinspiegel über dem normalen Bereich liegt ( > 200 ng/ml). In einer neueren Untersuchung haben Moroz und Mitarb. (Cancer Immunol, and Immunotherapy, Bd. 3 (1977), S. 101) bei Brustkrebs-Patienten eine Lymphozyten-Subpopulation identifiziert, die Ferritin

an ihrer Oberfläche trägt. Das Ferritin ist vom carcino-• fötalem Typ und diese Ferritin-positiven Lymphozyten erschei-

-δι nen in den frühen Stadien des Brustkrebses (Stadium I und II). Bei Patienten mit benignen Brusterkrankungen oder bei gesunden Menschen werden diese Lymphozyten nicht festgestellt (Giller und Mitarb., Surgery Gyn. Obst, Bd. 149 (1979), S. 655).

Der Nachweis von an Lymphozyten gebundenem Ferritin oder von seiner Anwesenheit in Gewebeflüssigkeiten ist die Grundlage des Assays zur Früherkennung von Brustkrebs beim Menschen.

In jüngster Zeit wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem Myeloma-Zellen der Maus mit Milz-Zellen der hyperimmunisierten Maus hybridisiert werden (Kohler und Milstein, Nature, Bd. 256 (1975), S. 495). Eine dabei erhaltene Hybridzelle kann einen einzelnen Antikörper produzieren, der gegen eine einzelne antigene Erkennungsstelle (Determinante) gerichtet ist. Nach dem Klonieren einer derartigen Hybridzelle wird ein Klon von Hybridzellen erhalten, die alle den gleichen monoklonalen Antikörper produzieren. Die Ver-Wendung der monoklonalen Antikörper, die gegen eine einzelne antigene Derterminante gerichtet sind, die sich nur an humanem carcinofötalem Ferritin, nicht aber an adultem Ferritin befindet, macht die Identifizierung dieses Isoferritins beim Erwachsenen (im Plasma oder auf Lymphozyten) zu einem besonders spezifischen und empfindlichen Mittel für die Erkennung einer malignen Erkrankung. Die Wahrscheinlichkeit, eine benigne Erkrankung aufzufinden, die mit einer Erhöhung des adulten Ferritins im Serum verbunden ist, ist dagegen erheblich vermindert.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Hybridomazellen zu schaffen, die monoklonale Antikörper bilden, die jeweils spezifisch für eine bestimmte unterschiedliche antigene Determinante an humanem Plazenta-Ferritin sind, nämlich den Zellklon

1) CM-OF-H9, dessen monoklonaler Antikörper gegen eine antigene Derterminante gerichtet ist, die spezifisch für humanes embryonales Ferritin ist, und

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2) CM-0F-3, dessen"monoklonaler Antikörper gegen eine Determinante gerichtet ist, die sowohl bei humanem embryonalem Ferritin als auch bei humanem adultem.Milz-Ferritin vorhanden ist.
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Eine weitere Aufgabe ist die Herstellung der Zellklone und der monoklonalen Antikörper. Schließlich ist es eine Aufgabe, mittels dieser monoklonalen Antikörper einen empfindlichen Assay zur Früherkennung von Brustkrebs und Mb. Hodgkin zu entwickeln. Der Test beruht auf der Identifizierung von "onkofetalem" Ferritin, das im Serum oder in einer anderen Körperflüssigkeit enthalten oder an Lymphozyten gebunden ist. Damit dient der Test zur Früherkennung

von Brustkrebs und zur Erkennung von Mb₀ Hodgkin. 15

Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst,. Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Die besondere Spezifizität des monoklonalen Antikörpers von CM-OF-H9 für Ferritin vom onkofetalem Typ ermöglicht die Unterscheidung zwischen der Erhöhung des Serum-Ferritin-Spiegels, die durch eine maligne Erkrankung verursacht wird, und dem normalen Ferritin oder der mit benignen Erkrankungen (beispielsweise Thalassaemia) verbundenen Erhöhung. Der.monoklonale Antikörper von CM-OF-3 kann die Erhöhung des Ferritinspiegels,in den zwei Gruppen von Erkrankungen feststellen. Ein Test mit beiden Antikörpern läßt zwischen malignen und. benignen Erkrankungen unterscheiden.

. ·

Herstellung von humanem onkofötalem Ferritin

Ferritin wird aus der Plazenta des Menschen nach einer Modifikation des Verfahrens von Beamish.und Mitarb. (J. Clin. Path., 24 (1971), S. 581) hergestellt. Dazu zerkleinert man 500 g Plazentagewebe und ergänzt mit Wasser auf ein Gesamt-

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volumen von 200 ml. Nach der Homogenisierung erhitzt man die Gewebesuspension 20 Minuten auf 75⁰C. Nach dem Abkühlen und 15 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 ü.p.M. behandelt man den Rückstand mit Essigsäure und stellt den pH-Wert auf 4,6 ein. Das ausgefällte Protein entfernt man durch 15 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 U.p.M. Sodann wird der erhaltene klare Überstand mit verdünnter Natronlauge auf einen neutralen pH-Wert eingestellt. Durch 240 Minuten Ultrazeritrifugieren des klaren braunen Uberstands bei 100 000 χ g sammelt sich das suspendierte Ferritin als kleines Pellet am Boden des Zentrifugengefäßes. Man löst den Niederschlag in 0,9 % Kochsalzlösung wieder auf und reinigt das Produkt weiter durchChromatographie an einer

mit Sephadex G 200 gefüllten Säule. 15

Hierauf führt man die Ferritin-Fraktion aus der Säule durch ein DEAE-CeIlulose-Anionenaustauscherharζ, wobei man Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7., 5 und einem Gradienten von 0,02 bis 0,5 M verwendet. Man erhält drei Protein-Peaks, von denen man den am stärksten sauren Peak pi = 4,8 (Nr. Ill) sammelt und zur Analyse verwendet. Die Reinheit der erhaltenen Fraktion bestimmt man durch isoelektrische Fokusierung und Immunelektrophorese gegen Antikörper-Ferritin-Serum und Anti-Human-Vollserum. Das erhaltene Produkt ver-

^ wendet man gemäß nachstehender Beschreibung zur Immunisierung von Mäusen.

Herstellung von Hybridomazellen

Myelomazellen:

Die zur Hybridisierung eingesetzten Myelomazellen PB/NSl/l-Ag4-1 werden in RPMI-1640 mit 20 % fetales Kälberserum (FCS) gezüchtet=

Mäuse:

Es werden weibliche, 4 bis 6 Wochen alte Balb/c-rMäuse verwendet„

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Immunisierungsprotokoll;

. ä_x . sauren

Im Abstand von je einer VJcche führt man drei Immunisierungen mit 50 μΐη / Ferritin in Freund's komplettem Adjuvans durch und hybridisiert 3 Tage nach der letzten Injektion von 10 μ9 Ferritin. Den hyperimmunisierten Mäusen gewährt man vor der letzten Boosterimmunisierung mindestens 1 Monat Ruhe.

Zellpräparation:

Milzzellen;

a) Man entnimmt den Mäusen die Milz in RPMI-O;

b) in der Petrischale spült man zweimal mit RPMI-O?

c) man zerteilt die Milz in RPMI-O mit Nr. 18 Nadeln;

d) die Zellsuspension überführt man in ein Reagensglas und trennt größere Gewebestücke ab; ' "

e) die Einzelzell-Suspension- verbringt man in ein anderes Reagensglas und zentrifugiert 5 Minuten bei 800 U.p.M« (160 χ g); anschließend lysiert man die roten Blutzellen mit 0,83 % NH₄Cl vom pH 7,5;

f) man wäscht die Zellen dreimal mit RPMI-O und suspendiert sie wieder im gleichen Medium; g) man zählt die Zellen mit Trypan Blau.

Myeloma-Zellen:

a) Man entnimmt die Zellen aus dem Kulturgefäß und pipet-.tiert sie vorsichtig in ein 50 ml fassendes Falcon/ Coming-Reagens glas;
b) sodann zentrifugiert man 5 Minuten bei 900 U.p,M.

(200 χ g);

c) man wäscht einmal mit RPMI-O, suspendiert wieder im gleichen Medium und zählt mit Trypan Blau.

Verschmelzung der Milz- und Myelomazellen:

a) Milz- und Myelomazellen kombiniert man im Verhältnis 10 : 1 in einem einzelnen, konischen, 50 ml fassenden Falcon/Corning-Einweg-Zentrifugengefäß;

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b) danach werden die Zellen 5 Minuten bei 900 ü.p.M. (200 χ g) zentrifugiert;

c) man saugt das Medium so vollständig wie möglich ab;

d) alle Lösungen und Medien, die man von jetzt an verwendet, haben Raumtemperatur;

das Zentrifugengefäß mit dem Zellpellet taucht man in ein Bad von 37°C, gibt dann unter leichtem Rühren in 1 Minute 0,2 ml 33 % PEG 1500 zu und zentrifugiert 5 Minuten bei 200xg. Danach suspendiert man die Zellen wieder, rührt 1 Minute leicht und gibt hierauf 5 ml RMPI-O unter leichtem Rühren und anschließend 5 ml RPMI-O mit 20 % fetales Kälberserum zu. Das Hybridgemisch sieht jetzt wie eine schlecht resuspendierte Zellsuspension mit vielen kleinen Klümpchen aus;

e) das Gemisch wird 5 Minuten bei 200 χ g zentrifugiert;

f) danach suspendiert man die Zellen wieder bei 37⁰C in RPMI-HY-HATD in einer Konzentration von 3x10 /cm³, wobei man das Medium auf das Zellpellet spritzt; '

g) man verbringt die. Hybridzellen in eine Titrierplatte mit flachem Boden und 96 Näpfchen, wobei man 2 Tropfen Zellsuspension aus einer 5 ml Pipette oder einem Multipipettor unter Verwendung eines Tropfenabstreichers ..(etwa 65 nl) zufügt, die 100 bis 120 RPMI-HY-HADT enthalten (etwa 2 χ 10⁵ Zellen);

h) man legt Kontrollproben an mit einem Gehalt von NS-1 Zellen und RPMI-HY-HATD mit einer Konzentration von 1 χ 10⁶ Zellen/ml;

i) die Platten kultiviert man 7 Tage;

j) am 8. Tag und danach zweimal wöchentlich saugt man die Hälfte des Kulturmediums sorgfältig ab und ergänzt mit 80 bis 100 μΐ RPMI-HY-HT-Medium;

k) die Untersuchung auf positive Proben (Näpfchen) führt man 3 bis 4 Wochen nach der Hybridisierung durch.

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Medien und Lösungen:

1. RPMI-O (kein FCS)

2. RPMI 1640-HY

600 ml keimfreies destilliertes Wasser 55 ml 10 χ RPMI-1640 6 ml 1,0 N Natriumhydroxid 14 ml 7,5 % Natriumbicarbonat 6 ml Penicillin/Streptomycin^ 10 ml Glutamin · λ + DMEM 86,5 ml FCS j

3. RMPI-HY-HATD - Tag 0 » Tag 7

Für 100 ml des Mediums:

95 ml RPMI - 1640 +20 % FCS. 1,o ml-Pyruvat (10Ox) 2,0 ml 50 χ HAT
2,0 ml 50 χ Desoxycytidin

4. RPMI-HY-HT - Tag 8 > Tag 14

■ für 100 ml Medium:

97 ml RPMI-1649 +20 % FCS 2,0 ml 50 χ HT

1,0 ml Pyruvat (10Ox) 25

Für die Hybridzellen vom Tag 15 an verwendet man. RPMI-1640 + 2Q % FCS und Pyruvat oder hält sie in RPMI-HY-HT.

5- PEG 33 und 25 % Gew./Vol.

Es muß geruch- und farblos sein. Für 100 ml wird die entsprechende Gewichtsmenge 1 ο bis 15 Minuten in einer Glasflasche bei 1,055 atü sterilisiert. Wenn die Flasche genug abgekühlt ist, um in der Hand gehalten zu werden (etwa 50⁰C), wird mit RPMI 1640-O auf 100 ml aufgefüllt und durch Schütteln vermischt. Das Produkt wird bei Raumtemperatur aufbewahrt.

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L-^₄ :

6. HATD - Endkonzentrationen der Reagentien H = Hypoxanthin 1 (T⁴M

A * Aminopterin 10~ M

T = Thymidin 2x10"⁵M

D= Desoxycytidin 2x10~ M ·

HT Vorrat 100x - 100 cm³
Thymidin MG. 242,33 0,04846 g
. Hypoxanthin MG. 136,1 0,1361 g
10

Man füllt mit doppelt destilliertem Wasser auf 100 ml auf und erwärmt zur Lösung auf 60 bis 70⁰C. Danach stellt man das Endvolumen mit doppelt destilliertem Wasser ein. Die erhaltene Lösung wird auf das 50-fache verdünnt und dann durch ein 0,2 n Filter sterilfiltriert. Das Filtrat wird in Mengen von 2 ml unterteilt und bei -20⁰C gelagert.

A Vorrat 100Ox - 100 cm³
Aminopterin MG. 440,3 0,44 g

Man setzt doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Volumen von 50 ml zu und versetzt dann tropfenweise mit

0,1 nNaOH, bis sich das Aminopterin löst. Danach bringt oc doppelt

^⁰ . man das Endvolumen mit/destilliertem Wasser auf 100 ml. Nach der Volumeneinstellung wird sterilfiltriert (0,2 μ. Filter) und das Filtrat bei -20⁰C gelagert.

D Vorrat 100x - 100 cm³
. Desoxycytidin MG. 227,2 0,00454 g

Man löst in doppelt destilliertem Wasser, stellt auf ein Volumen von 100 cm³ ein, verdünnt 5Ox, führt eine Sterilfiltration durch und lagert die Lösung bei -20⁰C. (0,2μ Filter).

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- 15 -

HAT -.5Ox - 200 ml

Man vereinigt 100 ml 100 χ HT mit 10 ml 1000 χ Α + 90 ml doppelt destilliertem Wasser = 50 χ HAT. Sodann wird sterilfiltriert (0,2 μ Filter). Man unterteilt das Filtrat in Mengen von 2 ml und friert es bei -20⁰C ein.

Die Prüfung und Bestimmung der Spezifizität der monoklonalen Antikörper führt man mit Hilfe eines Hämioagglutinationstestes durch. Dazu wird embryonales Plazenta- und adultes Milz-Ferritin durch CrCl₂ an Ox rote Blutzellen (Ox RBC) gebunden.

Man vermischt je 50 μΐ Überstand des Hybridomakulturmediums in steigender Verdünnung - ausgehend vom Verhältnis 1 :"10 - mit 10 μ 1 adultes oder embryonales Ferritin Ox RBC und bestimmt die Hämagglutination. Man seiektioniert die überstände von Klonen, die einen Hämagglutinationstiter von mindestens 1 : 1000 ergeben.

Auf diese Weise wird ein Klon mit der Bezeichnung CM-OF-3 ausgewählt. Der Klon CM-OF-3 bzw. der von ihm gebildete monoklonale Antikörper ist spezifisch für embryonales Ferritin und liefert sowohl mit adultem als auch mit embryonalem Ferritin eine Kreuzreaktion.

Den erhaltenen monoklonalen Antikörper des KIons CM-OF-3 verwendet man zur Blockierung der kreuzreaktiven Determinanten von fetalem und adultem Ferritin, um einen Zellklon mit der Bezeichnung CM-OF-H9 herzustellen, der einen anderen monoklonalen Antikörper erzeugt, welcher nur gegen eine spezifische Determinante von fetalem Ferritin gerichtet ist. Dazu benutzt man folgendes Immunisierungsverfahren:

A. Immunisation, von Verschmelzungsi; rotokoll Man setzt embryonales Ferritin aus menschlicher Plazenta, ein Protein, vom Protein-Peak pi 4,8 (vgl. ooen) mit dem monoklon -

len Antikörper des Klons CM-OF-3 in folgendem Verhältnis um: 90 μg embryonales Ferritin in PBS wird mit Ascit-sflüssigkeit von BALB/c Mäusen vermischt, die 10 ng/ml CM-OF-3 Antiferritin monoklonale Antikörper enthält= .

Danach inkubiert man das Gemisch 30 Minuten bei 37⁰C und anschließend etwa 15 Stunden bei 4⁰C. Das Gemisch zentrifugiert man hierauf bei 10 000xg,verwirft den entstandenen Niederschlag und verwendet den überstand zur Immunisierung. Man immunisiert die BALB/c Mäuse mit einem Gemisch aus dem vorstehend erhaltenen Überstand und Freund's komplettem Adjuvans, das man intradermal 1x wöchentlich während 3 Wochen injiziert. Eine Booster-Immunisierung mit 1/5 der vorstehend genannten Dosis wird intraperitoneal gegeben.

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3 Tage nach der Booster-Injektion entfernt man die Milz der Maus aseptisch und führt die Verschmelzung durch Inkubation

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von' 10 Milzzellen mit 10 /P3-NSI/1-Ag4 Myelomazellen gemäß dem vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren und mit den gleichen Maßnahmen zur Identifizierung positiver Klone durch. Dabei erhält man einen als CM-OF-H9 bezeichneten Klon. ■ ·

B. Charakterisierung des erhaltenen monoklonalen Antikörpers Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers des Klons CM-OF-H9: Der monoklonale Antikörper des Klons CM-OF-H9 gehört zur Klasse IgG; er bildet keine Präzipitate mit Ferritin und bindet Kaninchen-Komplement. Die Antikörperkonzentration in der erhaltenen Ascitesflüssigkeit beträgt etwa 7 mg/ml. 1 ml Ascitesflüssigkeit bindet etwa 2 mg embryonales Ferritin, aber kein adultes Milz- oder Leber-Ferritin.

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Reaktivität der monoklonalen Antikörper

Herkunft des humanen CM-OF-H9 . CM-OF-3

Ferritins

1. Adulte Milz von Thalassaemie-

Patienten - +

2. Normales Serum - +

3. Brustkrebs (PBL)* + + 4. Brustkrebs (Serum) +....+.

5. Mb. Hödgkin (Milz) + +

6. Benigne Brusterkrankung (PBL)* - - · 7 c Benigne. Brusterkrankung (Serum) - . +

* PBL: Periphere Blutlymphozyten 15

Die beiden Antikörper ermäglichen eine schnelle und einfache Erkennung von malignen Brusterkrankungen und Mb. Hodgkin und eine Unterscheidung dieser Erkrankungen von Thalassaemia, die ebenfalls eine Ferritinerhöhung ergibt.

Grundlagen der serologischen Testverfahren Bestimmung des an Lymphozyten gebundenen Ferritins (LBF)

Die Anwesenheit von an Lymphozyten gebundenem Ferritin weist bei menschlichen Patienten auf Brustkrebs hin. Die" Bestimmung dieser Art von Ferritin wird folgendermaßen durchgeführt..:

a) Man isoliert die Lymphozyten aus dem peripheren Blut; b) man bestimmt das an Lymphozyten gebundene Ferritin durch einen herkömmlichen Assay unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung, die spezifisch gegen Ferritin gerichtet sind, das aus menschlicher Plazenta stammt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Test folgendermaßen durchgeführt:

a) Man isoliert die Lymphozyten durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugierung aus dem peripheren Blut; ® b) man bestimmt die Gegenwart oder Abwesenheit von LBF mit irgendeinem üblichen Assay, beispielsweise einem cytotoxischen Test oder Radioimmunoassay. Diese Assays kann man auch mit Serum oder einer anderen Körperflüssigkeit

. durchführen.
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Test zur Früherkennung von Brustkrebs und Hb. Hodgkin Sammeln und Herrichten der Zellen

1. Heparin enthaltende Blutsammelröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 ml?

2. konische Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 25 ml;

3. Pasteur-Pipetten und Küvetten;

4. mit Natriumphosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit dem pH-Wert 7,2;

5. Ficoll-Hypaque-Dichtelösung mit der Dichte 1,077 g/ml.

Zell-Sammelverfahren

1. Man sammelt 15 ml Blut in ein Heparin enthaltendes Blut-Sammelröhrchen und verdünnt im Verhältnis 1 : 2 in PBS vom pH-Wert 7,2;

2. man unterschichtet die Zellsuspension mit 10 ml Ficoll-Hypaque-Dichtelösung;

3. man zentrifugiert 30 Minuten bei Raumtemperatur und

300 χ g;

4. man sammelt die mononukleären Zellen aus der Medium-

Ficoll-Hypaque-Grenzf lache mit einer Pasteur-:, ipette und überführt in ein neues 15 ml fassendes Röhrchen;

5. man wäscht die Zellen 3 mal durch.Suspendieren in 15 ml Waschmedium und 10 Minuten Zentrifugieren bei 4⁰C und 300 χ g;

6. man suspendiert erneut im Warchmedium und bestimmt.die Zahl der Zellen.

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Radioimmunoassay (RIA)

Zusätzlich benötigtes Material;

1. Minisorp-Teströhrchen 100 χ 15 mm;

2. RPMI 1640;

3. Rinder-Serumalbumin (BSA) 5 % in PBS, pH-Wert 7,2,

mit einem Gehalt von 0,025 % Natriumazid; 4.. Normales Kaninchenserum (NRS);

5. Monoklonale Antikörper CMH-9

6. Weiße Ascitesflüssigkeit;
7. ¹²⁵J Anti-Maus IgG. .

Radioimmunoassay - 1

Man isoliert die peripheren mononucleären Blutzellen durch Ficoll-Hypaque Gradienten zentrifugieren. .

Der Test wird dreifach durchgeführt. A = Blindprobe; B = Test.

1. Man bringt 2x10 -3x10 Zellen in jedes der 6 Teströhrchen und pelletisiert die Zellen durch 10 Minuten

zentrifugieren bei 300 χ g;
2c man fügt 20 μΐ NRS, verdünnt im Verhältnis 1 : 10 in PBS hinzu und inkubiert 60 Minuten bei 4⁰C;

3. man fügt. 30 μΐ Ascites-Flüssigkeit (10~⁵-fache Verdünnung in 5 % BSA) zu jeweils 3 Röhrchen hinzu.

A. Kontroll-Ascitesflüssigkeit. mit einem Gehalt an IgG₁ nicht spezifischem monoklonalen Antikörper, nicht reaktiv mit onkofetalem Ferritin;

B. monoklonale Antikörper CMH-9;

, man vermischt sorgfältig und inkubiert 2 Stunden bei Raumtemperatur;

4. man wäscht die Zellen zweimal mit 100 ml RPMI-1640 und

zentrifugiert 10 Minuten bei 4°C und 300 χ g;

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5. man fügt 0,1 μθί J-Kaninchen Anti-.iaur IgG hinzu

(¹²⁵J Kaninchen IqG I\iCl/\iq) , inkubiert 60 Minuten bei 4°C, wäscht zweimal mit kaltem RPMI-1640 gemäß Punkt 4 und zählt die Radioaktivität;

Positiver Test: Cpm A- CpmB <500. L . ■ ' J

Radioimmunoassay - 2

Nach der Stufe 1, RIA - 1, setzt man das Testverfahren fol- ' gendermaßen fort:

CMH-9 F(ab)₂ wird durch peptidische Verdauung von CMH-9 IgG gemäß ütsumi und Karush (Biochem., Bd. 4 (1965), S. 1766) und aus nicht spezifischem IgG₁ erhalten; vgl. Kontrolle bei RIA-1. Die F(ab)₂~Fragmente, die dabei erhalten werden, verwendet man folgendermaßen:

Rohr Äs Kontrolle F(ab)₂ in 5 % BSA in PBS, pH-Wert: 7,2, und 0,025 % Natriumazid;

Rohr B: CMH-9 F(ab)_ in 5 % BSA in PBS, pH-Wert: 7,2, und 0,025 % Natriumazid.

Man inkubiert 60 Minuten bei Raumtemperatur und wäscht einmal mit 2 ml 1 % BSA in PBS, PH-Wert 7,2. Sodann versetzt

125 man die Röhrchen A und B mit dem J-markierten Liganden

5 125

(etwa 10 cpm), und zwar entweder J-markiertes onkofäta-

1 25 les Ferritin oder ein Komplex von J-polyklonalem antionkofötalem Ferritin mit onkofetalem Ferritin. Der Komplex wurde vorher hergestellt mit einem Antigen-Antikörper-Molverhältnis von 1 : 1 bis 1 : 2. Seine Bestandteile wurden miteinander 1 Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend inkubiert man den markierten Liganden zusammen mit den Zellen 1 Stunde bei Raumtemperatur, wäscht zweimal mit 1 % BSA in PBS, pH-Wert 7,2, entfernt nicht gebundenen .markierten Liganden und zählt die Radioaktivität. Wenn der Wert für B höher liegt als für A, ist der Test positiv.

Cytotoxischer Assay

Der Test wird zweifach durchgeführt; A = Kontrolle, B = Test.

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1. Man suspendiert PBL mit einer Dichte von 5x10 Zellen/ ml in RPMI-1640;

2. man bringt 150 μΐ PBL jeweils in.4 Teströhrchen mit den Abmessungen 12 χ 75 mm und fügt 30 μΐ Ascitesflüssig-

keit (Verdünnung: 10~⁴) hinzu.

A. Kontroll-Ascitesflüssigkeit (2 Röhrchen);

B. CMH-9 (2 Röhrchen);

man inkubiert 45 Minuten bei 4⁰C,

3. Sodann fügt man 100 μΐ Kaninchen-Komplement, verdünnt im Verhältnis 1 : 5 in PBS hinzu und inkubiert 60 Minuten bei 37⁰C unter langsamem Rühren;

4. man zählt die lebenden Zellen mit Trypan Bläu.

Positiver Test:
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Anzahl lebende Zellen Anzahl lebende Zellen in A ~ in B

-x 100 > 4%

Anzahl lebende Zellen in A Cytotoxischer Testsatz

1. Monoklonale Antikörper CMH-9

2. Monoklonale Antikörper, nicht spezifisch

3. Komplement vom Kaninchen

4. Herkömmliche Adjuvants in standardisierter Lösung

RIA-Testsatz

ί. F(ab)₂ von CMH-9

2. F(ab)₉ von nicht-spezifischen monoklonalen Antikörpern

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3. J-markierter Ligand.

RIA-I-Testsatz

1. Monoklonale Anti :örper CMH-9

1. Monoklonale Ant.i.<örper, nicht spezifisch

3. ^{1 25} J-Anti-Maus-IgG..

4. Adjuvants und standardisierte Lösungen.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIU5S:::TAfJCH.N.5«"-;HEUNE-MANN · RAUH SIEBERTSTRASSE * · 8ΟΟΟ MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89).+7*O7B CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN · TELEX 5-2Θ4Ο3 VOPAT D u.Z.: R 838 (Ra/Vo/kä) 14. Mai 1982 Case: 47333/82 Chaya MOROZ Tel Aviv, Israel 10 " Monoklonale Antikörper, Hybridoma-Zellklone, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Erkennung von Brustkrebs und maligner Lymphogranulomatose " Patentansprüche

1. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit humanem onkofetalem Ferritin reagieren und mit humanem Milz- oder Leber-Ferritin nicht reagieren.

2. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet _r daß sie mit humanem onkofetalem Ferritin der Plazenta reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren.

3. Hybridoma-Zellklon mit der Bezeichnung CM-0F-H9, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1 erzeugt und gemäß Anspruch 6 erhältlich ist.

4. Hybridoma-Zellklon mit der Bezeichnung CM-OF-3, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 2 erzeugt und gemäß Anspruch 5 erhältlich ist.

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5. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoma-Zellklons, der monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 2 erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Mäuse mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, von an Brustkrebs erkrankten Menschen oder aus der Milz von an maligner Lymphogranulomatose (Mb. Hodgkin) erkrankten Menschen immunisiert,

(b) die Milz-Lymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomazellen hybridisiert und

(c) einen Klon mit der Bezeichnung CM-OF-3 selektioniert, der Antikörper erzeugt _e welche mit humanem embryonalem Ferritin reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren«

6.. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoma-Zellklons, der monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1 erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Mäuse mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, aus an Brustkrebs erkrankten Menschen oder aus der Milz von an maligner Lymphogranulomatose erkrankten Menschen immunisiert, nachdem man das Ferritin mit dem monoklonalen Antikörper des Klons CM-OF-3 umgesetzt hat,

(c) einen Klon selektioniert, der Antikörper erzeugt, welche nur mit humanem embryonalem Ferritin reagieren.

7. Verfahren zur Herstellung der monoklonalen antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Mäuse mit embryonalem Ferri :in aus humaner Plazenta, von an Brustkrebs erkrankten Mensc.ien oder aus dar Milz von an maligner Lymphe granulomatose erkrankten Menschen immunisiert, nachdem man das Ferriein mit dem monoklonalen Antikörper des Klons CM-CF-3 umgesetzt hat,

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(b) die Milz-Lymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomazellen hybridisiert,

(c) einen Klon selektioniert, der Antikörper erzeugt, welche nur mit humanem embryonalem Ferritin reagie-

5 ren,

(d) den selektionierten Klon kultiviert, um gegen das humane onkofetale Ferritin gerichtete monoklonale Antikörper zu erhalten, und gegebenenfalls

(e) den Klon in Mäuse injiziert und die Ascitesflüssigkeit gewinnt, die den monoklonalen Antikörper enthält. _; ·■'■_■

8«. Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper

gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Mäuse mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, aus an Brustkrebs erkrankten Menschen oder aus der Milz von an maligner Lymphogranulomatose erkrankten Menschen immunisiert,

(c) einen Klon selektioniert, der Antikörper erzeugt, welche mit humanem embryonalem Ferritin reagieren und mit adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren,

(d) den selektionierten Klon kultiviert, um gegen das humane onkofetale Ferritin gerichtete monoklonale

Antikörper zu erhalten, und gegebenenfalls

(e) den Klon in Mäuse injiziert und die Ascitesflüssigkeit gewinnt, die den monoklonalen Antikörper enthält.

.9. Verfahren nach Anspruch 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man weibliche Balb/c-Mäuse einsetzt.

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10. Verfahren nach Anspruch 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit onkofötalem Ferritin in Freund 's komplettem Adjuvaris durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Milz- und Myeloma-Zellen in einem Verhältnis von 20 : 1 bis 1 : 1 kombiniert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis etwa 10 % 1 beträgt.

13. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 und 2 zur Erkennung von Brustkrebs oder maligner Lymphogranulomatose.

14. Testverfahren zur Erkennung von Brustkrebs oder maligner Lymphogranulomatose, dadurch gekennzeichnet, daß man das onkofötale Ferritin mit einem cytotoxischen Assay bestimmt.

15. Verfahren zur Erkennung von Brustkrebs oder maligner Lymphogranulomatose, dadurch gekennzeichnet _r daß man

das onkofötale Ferritin durch einen Immunoassay bestimmt. .25

16. Testsatz zur Durchführung des Assays gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er standardisierte monoklonale Antikörper CMH-9, nicht spezifische monoklonale Antikörper, Komplement von Kaninchen, Adjuvants.und standardisierte Lösungen enthält.

17. Testsatz zur Durchführung eines. Radioimmunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß er standardisiertes F(ab)₂ von CMH-9, F(ab)_ von nicht spezifischen monoklonalen

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Antikörpern und einen J-markierten Liganden enthält.

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1 18. Testsatz zur Durchführung eines Radioimmunoassays,

dadurch gekennzeichnet, daß er standardisierte mono-

klonale Antikörper CMH-9, nicht spezifische monoklo-

1 nale Antikörper, J-Antimaus IgG₁, Adjuvants und

standardisierte Lösungen enthält.

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