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Die vorliegende Erfindung betrifft monodonale Antikörper, die spezifisch
für Derf II sind, welches ein Hauptallergen der Hausstaubmilben
Dermatophagoides farinae ist, Zellinien zur Produktion der Antikörper, ein
Immunassay, in welchem die monodonalen Antikörper verwendet werden und einen
Imniunassay-Satz zum Nachweis von Derf II.
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Hausstaub ist ein Hauptallergen für bronchiales Asthma, allergische
Rhinitis und dergleichen. Es wird gesagt, daß das Allergen durch Milben
hervorgerufen wird (Sakamoto, Kagaku bis Seibutsu, Vol 26, No. 2 (1988),
Vorhoost, R. et al, J. Allergy, 39, 325 (1967)) und daß mindestens 90 % der
Personen, die in einem Pflastertest positiv für Hausstaub sind, auch
positiv für Milben sind (Hayakawa und Shida, Nippon Rinsho, Vol 45, No. 8
(1987)). Die als Ursache von Allergenen bedeutsamen Milben sind die
Dermatophagoides farinae und Dermatophagoides pteronyssinus(T. Miyamoto et al.,
J. Allergy, 42, 14, (1968)). In Dermatophagoides farinae befinden sich zwei
Hauptallergene, die Derf I (Molekulargewicht 24.000) und Derf II
(Molekulargewicht 15.000 bis 16.000) genannt werden. Derf I ist enthalten
in den Milbenexkrementen und Derf II ist enthalten in den Milbenkörpern
(und den toten Körpern und deren Teilen).
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75 ist grundsätzlich wichtig bei einer medizinischen Behandlung von
allergischen Krankheiten das originäre Allergen festzustellen. Es ist
zweckmäßig, einen Patienten klinisch so zu führen, daß das originäre Allergen
vermieden wird. (Sakamoto, Kagaku bis Seibutsu, Vol 26, No. 2 (1988), Platts-
Mills, T. A. E., J. Allergy, 83, 416-427 (1989)). Ferner werden eine
Quantifizierung und eine Bestimmung des Milbenallergens in der Umgebung des
atienten benötigt. Daher sind Verfahren zur Bestimmung von
Milbenallerenen in Hausstaub vorgeschlagen worden.
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Bei diesen Verfahren wird eine Farbreaktion eines Proteins, welches aus den
Exkrementen der Hausstaubmilben gewonnen und mit Alkohol extrahiert worden
ist, mit einer aromatischen Diazo-Verbindung (Japanische Patente,
Offenlegungs-Veröffentlichungsnummern 60-135844, 60-171459 und 61-59261) in einem
nicht einfachen Prozeß durchgeführt.
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Obwohl die Anwesenheit eines Milbenallergens durch die Reaktion erkennbar
ist, ist es unmöglich, das Allergen zu identifizieren und zu bestimmen.
Obwohl das Verfahren einfach ist, ist es unmöglich, bei Farbreaktionen von
Körperflüssigkeiten kleiner Lebewesen und Chemikalien (Japanische Patente,
Offenlegungs-Veröffentlichungsnummern 62-296828 und 62-296829) ein
Milbenallergen zu identifizieren und zu bestimmen, weil kleine von den
Milbenallergenen unterschiedliche Tierallergene festgestellt werden. Darüber
hinaus wird in einem Nachweisverfahren ein Antiserum verwendet, das durch
Immunisierung eines Lebewesens unter Verwendung eines Extrakts von
Milbenkörpern gewonnen worden ist (Japanisches Patent,
Offenlegungs-Veröffentlichungsnummer 63-191961), obwohl es möglich ist, lebende Körper von
Staubmilben nachzuweisen und zu bestimmen, wobei der Nachweis und die Bestimmung
von toten Körpern, Teilen und Exkrementen unerläutert bleiben, so daß es
unmöglich ist, das Allergen zu identifizieren und zu bestimmen.
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Bei der Behandlung von Milbenallergien wird üblicherweise eine
Desensibilisierungstherapie durch Benutzung eines Milbenallergenextrakts durchgeführt.
Diese Therapie erfordert es, das zu verabreichende Allergen zu bestimmen
und zu reinigen (Eda, Nippon Rinsho, Vol 44, eine besondere Ausgabe 1986).
In diesem Zusammenhang ist die Spezifizierung von monodonalen Antikörpern,
die von durch Milbenkörper oder [xkremente immunisierten Säugern
hergestellt sind, unbekannt.
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P. W. Heymann et al in J. Allergy Clin. Immunol. 83 (6) 1055-1067 (1989)
beschreiben monodonale Anti Derf II Antikörper, die mit derselben Klasse
von Staubmilbenallergenen gekreuzt reagieren.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben stehenden
Probleme der Identifizierung und der Bestimmung von Allergenen zu lösen und
ein einfaches und hochsensibles Verfahren zur immunologischen
Identifizierung und Bestimmung von Derf II in Staub zur Verfügung zu stellen.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben monodonale Antikörper
bereitgestellt, die für Derf II spezifisch sind und ein Immunuassay durch
Verwendung der Antikörper untersucht. Als Ergebnis haben sie gefunden, daß
die monoclonalen Antikörper als Reagenz zur Bestimmung von Derf II
brauchbar sind und die vorliegende Erfindung vollendet.
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Die Erfindung stellt einen Anti Derf II monodonalen Antikörper zur
Verfügung, der sich selektiv ausschließlich mit Derf II alleine und nicht mit
Derp I, Derp II und Derf I verbindet, wobei der Antikörper durch die
Hybridom-Zellinie 15E11 (FERM BP-3249) oder 13A4 (FERM BP-3251) produziert wird.
Die Erfindung stellt auch diese Hybridom-Zellinien bereit.
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Außerdem stellt die Erfindung ein Immunuassay zum selektiven Nachweis von
Derf II bereit, wobei Derp I, Derp II und Derf I nicht nachgewiesen werden,
welcher in folgendem besteht: Kontaktieren eines monoclonalen Antikörpers
wie in dem vorstehenden Absatz beschrieben mit einer vermutlich Derf II
enthaltenden Probe und Feststellung einer einer Reaktion zwischen dem
monoclonalen Antikörper und jedwedem Derf II in der Probe; und einem Satz zum
selektiven Nachweis von Derf II, wobei Derp I, Derf I und Derp II nicht
nachgewiesen werden, durch ein Immunassay, welches einen monoclonalen
Antikörper wie in dem vorstehenden Paragraphen beschrieben, einen
Festphasenträger für den monodonalen Antikörper, ein Blockiermittel, einen
markierten Anti-(Maus Ig) Antikörper, ein Farbe produzierendes Substrat, eine
Waschlösung und Standard Derf II umfaßt.
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Der erfindungsgemäße monodonale Antikörper kann nach einem bekannten
Zellverschmelzungsverfahren hergestellt werden. Im einzelnen wird der
erfindungsgemäße
monoclonale Antikörper über die folgenden Schritte (1) bis (4)
gewonnen:
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(1) einen Schritt zur Vorbereitung von zur Bildung von Antikörpern
benutzten Zellen,
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(2) eine Verschmelzung sowie Screening- und Klonschritte,
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(3) einen Schritt zum Kultivieren von Hybridom-Zellen und
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(4) falls notwendig, einen Reinigungsschritt.
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In der folgenden Beschreibung werden die Schritte im Detail
dargestellt.
(1) Schritt zur Vorbereitung von zur Bildung von Antikörpern benutzten
Zellen.
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Anti Derf II Antikörper herstellende Zellen können aus der Milz einer
Balb/c Maus oder einer A/J Maus zubereitet werden, die mit einem
Antigen von Derf II entsprechend immunisiert worden ist. Eine Mischung von
10 bis 30 µg/Maus an Derf II und die gleiche Menge eines vollständigen
oder invollständigen Freundschen Adjuvans werden intraperitonal
verabreicht und es wird dieser Vorgang mit Intervallen von zwei bis vier
Wochen wiederholt. Nachdem festgestellt worden ist, daß der Antikörper-
Titer im Blut hinreichend erhöht ist, wird die gleiche Menge an Derf II
ohne das oben angegebene Adjuvans intraperitonal verabreicht oder
intravenös in den Schwanz der Maus injiziert, so daß die Maus schließlich
immunisiert ist. Zwei bis fünf Tage nach der abschließenden
Immunisierung werden die Antikörper produzierenden Zellen aus der Milz der Maus
zubereitet.
(2) Verschemelzung, Screening- und Klonschritte.
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Im Rahmen des Verschmelzungsschrittes werden die obigen, von einer Maus
abgeleiteten Antikörper produzierenden Zellen mit bekannten
Mäuse-Myelom-Zellen nach einem bekannten Verfahren in Gegenwart eines die
Verschmelzung verbessernden Mittels verschmolzen.
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Die Myelom-Zellen, welche sich in einem hybridom-selektiven Medium
nicht entwickeln können und keine Antikörper produzieren können, werden
allgemein bevorzugt. Solche Maus-Myelom-Zellen sind z.B. die
Maus-Myelom-Zellen P3-NSI-1-Ag4-1 (im folgenden abgekürzt als NS-1), Sp-2/0-
Ag14 (als Sp-2 abgekürzt) und ähnliche Zellen.
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Das Verhältnis der Myelom-Zellen zu den Antikörper produzierenden
Zellen beträgt gewöhnlicherweise 1 bis 20. Als die Zellverschmelzung
verbesserndes Mittel wird vorzugsweise beispielsweise Polyethylenglycol
mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 7500 benutzt. Die Kultur der
Hybridom-Zellen wird wie folgt geführt: Beispielsweise nachdem die
Hybridom-Zellen zwecks Entfernung des die Zellfusion verbessernden
Mittels gewaschen worden sind, werden jeweils 100 bis 200 µl der
Hybridomsuspension in dem hybridom-selektiven Medium in 96, in einer Platte
befindliche Aufnahmen eingebracht, und zwar in einer Atmosphäre von 5 %
CO&sub2;-Gas-Luft bei einer Temperatur von ungefähr 37º C.
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Der Soreening-Schritt der gewünschten Hybridomzellen wird durchgeführt
indem der Antikörper-liter in der Kulturlösung bestimmt wird. Nachdem
nämlich Derf II in einer jeden Aufnahme der genannten Platte gebunden
ist und die Aufnahmen unter Verwendung von Rinder-Albuminserum
blockiert werden, wird der Überstand der Kultur, in welchem die
Hybridomzellen hinreichend gewachsen sind, einer jeden Aufnahme der
genannten Platte zugefügt. Nach einer angemessenen Inkubationszeit und einer
Antigen-Antikörperreaktion in den Aufnahmen wird der Überstand entfernt
und es wird die Platte gewaschen. Anschließend wird ein mit Avidin
markierter
Anti-Maus IgG Antikorper den Aufnahmen zugefügt, woraufhin die
Platte gewaschen wird und den Aufnahmen eine mit Biotin markierte
alkalische Phosphatase zugeführt wird , woraufhin die Platte gewaschen wird
und jede Aufnahme unter Hinzufügung eines
p-Nitrophenylphosphatsubstrats gefärbt wird.
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Hybridomzellen, deren Antikörper Produktion positiv ist, werden mittels
einer höchst zulässigen Verdünnung geklont, so daß auf diese Weise der
gewünschte Hybridom-Klon hergestellt werden kann.
(3) Schritt zur Bildung von Hybridomzellen
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Die in dem obigen Schritt geklonten Hybridom-Zellen werden im
Reagenzglas oder im lebenden Organismus gebildet, um die gewünschten
monoclonalen Antikörper zuzubereiten. Die Bildung im Reagenzglas beginnt mit
einer 96 Aufnahmen aufweisenden Platte, um einige Hybridomzellen zu
gewinnen, woraufhin eine allmähliche Maßstabsvergrößerung vorgenommen
wird. Die Bildung im lebenden Organismus wird durchgeführt, indem die
Hybridom-Zellen intraperitonal einer Maus eingeimpft werden, die mit
Pristan (2, 6, 10, 14-Tetra-Methylpentadecan: hergestellt durch Aldrich
Company) behandelt worden ist, welches zur einfachen Verbreitung der
verschmolzenen Zellen benutzt wird. Nach sieben bis fünfzehn Tagen
kommt es im lebenden Organismus zu einer Ansammlung von
Ascites-Flüssigkeit, welche die monoklonalen Antikörper enthält.
(4) Reinigungsschritt
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Der Reinigungsschritt wird durchgeführt, wenn dies notwendig sein
sollte. Bei diesem Schritt können die in den vorangegangenen Schritten
gewonnenen monoclonalen Antikörper durch eine Kombination herkömmlicher
physikalisch-chemischer Jechniken, z.B. Aussalzen, Zentrifugieren,
Dialyse, Ionenaustauscher-Chromatographie und dergleichen gereinigt
werden. Wenn es sich bei der Antikörper Unterklasse der monoclonalen
Antikörper
um IgG1 handelt, wird dieses durch Absorption und Elution
mittels einer Protein A Säule nur unvollständig gewonnen, welche für die
anderen Unterklassen benutzt wird. Es wird wirksam durch Absorption und
Elution mittels einer Protein G Säule gewonnen.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können mittels der obigen Schritte
unterschiedliche Arten monoclonaler Antikörper, welche Derf II
erkennen, gewonnen werden. Auf diese Weise ist es möglich, an sich bekannte
Immunassays als kompetitive Verfahren zu benutzen wie die
Sandwichmethode und dergleichen, indem die monodonalen Antikörper benutzt
werden, die in spezifischer Weise mit Derf II kombiniert werden können,
welche mittels den obigen Schritten gewonnen worden sind.
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Bei einem Immunassay beispielsweise nach Art des Sandwichverfahrens
können die Antikörper auf einem Feststoffträger nach einem
herkömmlichen Verfahren immobilisiert werden. Als feste Phase werden
beispielsweise eine Mikrotiterplatte und Partikel jeweils aus Polystyrol,
Polyethylen, Polyvinylchlorid, Latex, Agarose, Zellulose, Methacrylat,
Glas und dergleichen vorzugsweise benutzt.
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Es können ferner ohne Einschränkungen herkömmliche Verfahren als
Verfahren zur Markierung von Antikörpern benutzt werden. Beispielsweise
kann jeder der folgenden Stoffe benutzt werden, nämlich Enzyme,
fluoreszierende Farbstoffe, chemisch leuchtende Stoffe, Radioisotope oder
eine Kombination dieser Verbindungen.
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Als Markierungsmittel sind Peroxidase, β-D-Galactosidase, alkalische
Phosphatase und dergleichen in einem Verfahren nutzbar, bei welchem ein
Enzym verwendet wird, ¹²&sup5;I, ³H und dergleichen in einem Verfahren, bei
welchem ein Radioisotop benutzt wird und Fluorescamin, Fluorescein
Isothiocyanat und dergleichen in einem Verfahren, bei welchem ein
fluoreszierender Farbstoff verwendet wird. Es können jedoch auch andere
Verbindungen im Rahmen der obigen Verfahren benutzt werden.
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Falls das Markierungsmittel das Enzym ist, wird ein Substrat zur
Bestimmung der Aktivität des Enzyms benutzt. Beispielsweise sind 2,2-
Azino di-(3-Ethylbenzthiazolin Sulfonsäure)-2 Ammoniumsalz-H&sub2;O&sub2;,
5-Aminosalycilsäure-H&sub2;O&sub2;, o-Phenylendiamin -H&sub2;O&sub2; oder dergleichen als Substrat
von Peroxidase, o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranosid als Substrat von β-
D-Galactosidase und p-Nitrophenylsulfonylphosphat als Substrat
alkalischer Phosphatase brauchbar. Um die Aktivität zu bestimmen, können ein
bekanntes Reagenz wie ein Lösungsmittel, ein Waschmittel, ein
Reaktionsbegrenzer oder dergleichen benutzt werden. Ein Immunassay Satz, bei
welchem diese Reagenzien benutzt werden, wird durch die vorliegende
Erfindung mit umfaßt.
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Ein Immunassay, bei welchem ein Sandwich-Verfahren benutzt wird, ist
dadurch gekennzeichnet, daß der erste monodonale Antikörper, der einen
zu bestimmenden Stoff (Antigen) erkennt und der zweite monoclonale
Antikörper, der eine Determinante des Antigens erkennt, der von dem
ersten monodonalen Antikörper verschieden ist, benutzt werden, wobei der
erste monodonale Antikörper auf einem Feststoff immobilisiert ist und
wobei der zweite monodonale Antikörper markiert ist. Erfindungsgemäß
wird ein monodonaler Antikörper gewonnen, der in spezifischer Weise
mit Derf II verbunden werden kann. Es wird eine hochempfindliche
Bestimmung von Derf II bereitgestellt, welche eine niedrige Konzentration
von 10 bis 300 nglml aufweist. Das erfindungsgemäße Immunassay ist ein
Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Derf II. Das Verfahren ist
einfach im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren, bei denen eine
chemische Reaktion benutzt wird. Es liefert eine wesentlich
empfindlichere und spezifischere Methode zur Feststellung von Derf II als ein
herkömmliches Verfahren, bei welchem ein monodonaler Antikörper
benutzt wird, der durch Immunisierung von Staubmilben gewonnen worden
ist. Schließlich wird es möglich, Derf II in Proben einfach und
effektiv zu reinigen, indem monodonale Antikörper der vorliegenden
Erfindung benutzt werden.
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Fig. 1 zeigt eine grafische Darstellung der Werte von gereinigtem Derf I,
Derf II, Derp I, Derp II, welche gemäß (4) des Beispiels 1 gewonn&n worden
sind, wobei die Ordinatenachse 0.D. Werte bei einer Wellenlänge von 405 nm
und die Abszissenachse die bestimmten Konzentrationen der Proben in µg/ml
zeigen. Geschlossener Kreis: Derf II, offener Kreis: Derf I, offeres
Dreieck: Derp I und geschlossenes Dreieck: Derp II.
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Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Western Blot Technik bei gereinigtem Derf
II und gefriergetrocknetem Pulver aus Milbenkörpern, welche gemäß Beispiel
3 gewonnen worden sind.
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Spur 1: Markierungsmittel, Coomassie Brilliant Blue (C.B.B.) Färbung,
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Spur 2: Derf II, C.B.B. Färbung,
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Spur 3: Gefriergetrocknetes Pulver aus Milbenkörpern, C.B.B. Färbung, Spur
4: Derf II 13A4, Spur 5: Derf II 15 E11, Spur 6: Derf II 18 G8, Srur 7:
Gefriergetrocknetes Milbenpulver 13A4: Spur 8: Gefriergetrocknetes
Milbenpulver 15E11 und Spur 9: Gefriergetrocknetes Milbenpulver 18G8.
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Fig. 3 zeigt eine grafische Darstellung von O.D. Werten, die gemäß Beispiel
4 durch Umsetzung markierter Antikörper gewonnen worden sind, wobei die
Ordinatenachse Bn/Bo Werte zeigt, bei welchen Bo ein O.D. Wert ist, der durch
Umsetzung des markierten Antikörpers alleine und Bn ein O.D. Wert ist, der
aus jeder Konzentration von miteinander existierenden unmarkierter
Antikörpern gewonnen worden ist. Die Abszissenachse zeigt Konzentrationer der
miteinander existierenden unmarkierten Antikörper (µg/ml).
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Fig. A zeigt einen Vergleich von 13A4* mit unmarkierten Antikörpern und
Fig. B zeigt einen Vergleich von 18G8* mit unmarkierten Antikörpern. Ein
offener Kreis bedeutet 15E11, ein geschlossener Kreis bedeutet 13A4 und ein
offenes Dreieck bedeutet 18G8.
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Fig. 4 zeigt eine grafische Darstellung der Ergebnisse, die über die
Bestimmung der Bereiche gewonnen worden ist, bei denen Derf II alleie in
Gegenwart von Derf I (offener Kreis), Derp I (geschlossener Kreis) und Derp
II (offenes Dreieck) festgestellt worden ist und welche gemäß Beispiel 5
gewonnen worden sind. Die Ordinatenachse zeigt Bn/Bo Werte, bei welchen Bo
ein O.D. Wert von Derf II alleine und bei welchen Bn ein O.D. Wert ist, der
aus jeder Konzentration miteinander existierender anderer Antigene gewonnen
worden ist. Die Abzissenachse zeigt die Konzentrationen der miteinander
existierenden Antigene (µg/ml).
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Fig. 5 zeigt eine grafische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der
Anzahl der Hausstaubmilben und der gemäß Beispiel 6 erreichten Absorption
zeigt. Die Ordinatenachse zeigt die O.D. Werte bei einer Wellenlänge von
405 nm. Die Abszissenachse zeigt die Anzahl der hinzugefügten Milbenkörper.
Ein geschlossener Kreis bezieht sich auf den Fall einer PBS-Tween
Extraktion und ein offener Kreis bezieht sich auf den Fall einer PBS Extraktion.
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Fig. 6 zeigt eine grafische Darstellung, welche die Reinigung von Derf II
in den gemäß Beispiel 7 gewonnenen Fraktionen zeigt, wobei die
Ordinatenachse die O.D. Werte (geschlossener Kreis) bei einer Wellenlänge von 280
nm oder die Mengen an Derf II (µg/ml) (offener Kreis) zeigt, die in der
Fraktion enthalten sind und welche mittels eines ELISA Systems bestimmt
worden sind. Die Abszissenachse zeigt die Fraktionszahlen.
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Fig. 7 zeigt eine SDS-PAGE Silberfleckenbildung der gemäß Beispiel 7
gewonnenen Fraktion, wobei Spur 1 ein Standardmarkierungsmittel, Spur 2 ein
Standard Derf II, Spur 3 eine Lösung von gefriergetrocknetem Pulver aus
Milbenkörpern, die Spuren 4 und 5 jeweils Säulen nicht adsorbierter
Fraktionen (die Fraktionszahlen beziehen sich auf Fig. 6) die Spuren 6, 7 und 8
jeweils gereinigte Fraktionen zeigen, die durch Spülen adsorbierter
Fraktionen aus einer Säule gewonnen worden sind (die Fraktionen beziehen sich
auf Fig. 6).
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Fig. 8 zeigt eine grafische Darstellung der Korrelation zwischen den Mengen
an Derf II und der Zahl der Milben in Hausstaubproben. Die Ordinatenachse
zeigt die Mengen an Derf II (µg/ml), die in einem Gramm Hausstaub enthalten
sind und die mittels ELISA bestimmt worden sind, wobei die Abszissenachse
die Anzahl der Milben in einem Gramm des Hausstaubes zeigt, wobei n--16
beträgt und wobei der Korrelationskoeffizient r=O.884 beträgt.
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Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung im Detail. Diese
Beispiele sind jedoch nicht dazu angelegt, um den Schutzumfang der Erfindung
zu begrenzen.
Beispiel 1
(1) Zubereitung von Anti Derf II monoclonalen Antikörpern
Anti Derf II monoclonale Antikörper wurden nach dem folgenden Verfahren
hergestellt.
a) Immunisierung
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Hausstaubmilben wurden durch Flotation in einer gesättigten Salzlösung
gesammelt und es wurden die Milben unter Verwendung einer mit Phosphat
gepufferten Salzlösung extrahiert (im folgenden als PBS abgekürzt). Der
Extrakt wurde mit einer 60 %igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung einem
Trennungsverfahren unterzogen. Nach Entfernung eines Fällproduktes wurde
die aufschwimmende Lösung einem DEAE-Sephacell (0.05M Tris Cl, pH8.0)
aufgegeben und die nicht adsorbierte Fraktion wurde mittels S-Sepharose
(0.02M Acetatpuffer, pH5.5 0.2M NaCl (linearer Gradient)), behandelt.
80 mM NaCl Elutionsfraktion wurden auf einem Sephadex G-75 behandelt und
die Spitzenfraktion wurde als grob gereinigte Derf II Antikörper zur
Immunisierung wiedergewonnen.
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Die gleichen Mengen des rohen und vollständigen Freundschen Adjuvans
(FCA, hergestellt durch Difco) wurden gemischt und emulgiert, um 30
µg/100µl (10µg/100µl für eine A/J Maus) an Derf II zu gewinnen. Die
gemischte Emulsion wurde intraperitonal in einer Menge von 30 µg/Balb/c
Maus (Männchen) und 10 µg/Maus bei A/J Mäusen (Männchen) verabreicht.
Nach Maßgabe von Intervallen von zwei bis vier Wochen wurde die gleiche
Menge an in einem unvollständigen Freundschen Adjuvans emulgiertem Derf
II (FIA, hergestellt durch Difco) intraperitonal fünf mal verabreicht,
um die Mäuse zu immunisieren. Bei der letzten Immunisierung wurde PBS,
welches 30 µg Derf II enthielt, den Mäuseschwänzen von Balb/c Mäusen
verabreicht (ein PBS, welches 5 µg an Derf II enthielt, wurde
intraperitonal den A/J Mäusen verabreicht), wobei der Antikörpertiter im Blut
drei Tage vor der Zellfusion positiv wurde (als die Konzentration des
Serums auf 1/1000 oder weniger verdünnt wurde, war der Immunassay der
festen Derf II Phase positiv).
b) Vorbereitung der Zellen
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Drei Tage nach der abschließenden Immunisierung wurde die Milz der Maus
entnommen, wobei die Milzzellen in einem RPMI-Medium dispergiert wurden,
welches 10% fötales Rinderserum enthielt (FLOW Lab. Co., LTD, im
folgenden als RPMI abgekürzt), wobei die Mischung nach Maßgabe eires
rostfreien 200 mis Siebes gefiltert und die Zellen dreimal mit dem RPMI
Medium gewaschen wurden, welches frei von fötalem Rinderserum war (im
folgenden abgekürzt als -RPMI). NS-1 für die Balb/c Mäuse und SP-2 für die
A/J Mäuse wurden als Mausmyelomzellen der Fusionspartner verwerdet. Die
Zellen wurden bis eine Woche vor der Zellfusion mit RPMI kultiviert, dem
30 µg/ml an 8-Azaguanin vorher hinzugefügt wurden. Anschließend wurden
die nach Maßgabe eines logarithmischen Wachstums gebildeten und mit RPMI
kultivierten Zellen dreimal mit -RPMI gewaschen.
c) Zellfusion und Auswahl der Antikörper produzierenden Hybridomzellen
1-2 × 18&sup8; Zellen von Milzzellen und Myelomzellen wurden in einem
Verhältnis von 5 : 1 gemischt und zentrifugiert, um Pellets zu erhalten.
Ein ml - RPMI, welches 50 % Polyethylenglycol enthielt (PEG 4C00, Kanto
Kagaku) wurde tropfenweise während einer Minute hinzugefügt und während
einer weiteren Minute umgerührt. 8 ml an RPMI wurden der Mischung
hinzugefügt und zwar unter Umrührung während acht Minuten. Nach Hinzufügung
von 10 ml RPMI wurde die Mischung zentrifugiert und es wurden die
Pellets suspendiert, um eine Konzentration von 5 × 10&sup6;/ml Milzzellen zu
erhalten, woraufhin die Suspension einer 96 Aufnahmen aufweisenden Platte
zugeführt wurde (hergestellt durch Sumitomo Bakelite Company), und zwar
in einem Verhältnis von 100 µl pro Aufnahme. Beginnend mit dem nächsten
Tag wurden RPMI, welches 0.1 mM an Hypoxanthin enthielt, 0.4 µM an
Aminopterin und 16 µm an Thymidin hinzugefügt (abgekürzt im folgenden als
HAT Medium), und zwar in einem Verhältnis von 100 µl/behältnis
Anschließend, ungefähr ein bis zwei Wochen später wurden jede der 100 µl
Teilmengen des HAT Mediums durch 100 µl eines frischen HAT Mediums
ausgewechselt, bevor eine Kolonie an Hybridomzellen auftauchte und anti
Derf II Antikörper entdeckt wurden, wobei Zellen von positiv befundenen
Aufnahmen geklont wurden, indem die Verdünnung begrenzt wurde. Nachdem
die Zellen mit RPMI kultiviert wurden, welches 0.1 mM Hypoxanthin und 16
µM Thymidin enthielt, wurden die zweite höchstzulässige Verdünrung und
ein Klonen durchgeführt. Anschließend wurden Hybridomzellen erralten,
welche monodonale Anti Derf II Antikörper herstellten.
d) Herstellung der monoclonalen Antikörper
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Nachdem die geklonten Hybridomzellen, die monodonale Antikörper
herstellten, mit RPMI verbreitet waren, wurden die Hybridomzellen
intraperitonal Balb/c Mäusen eingegeben, denen zwei Wochen vorher 0.5 ml
Pristan injiziert worden war (im Falle der von A/J Mäusen gewonnenen
Hybridomzellen wurden die Hybridomzellen CAF-1 Mäusen intraperitonal
eingegeben), und zwar in einem Verhältnis von 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen/Maus. Nach zwei
Wochen wurde die sich im Bauchraum gebildete Ascitesflüssigkeit
gesammelt und die aus dieser gewonnenen monodonalen Antikörper gereinigt.
e) Reinigung der monoclonalen Antikörper
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Die Ascitesflüssigkeit wurde bei 10,000 rpm während 20 Minuten
zentrifugiert, um Fällprodukte zu entfernen und mittels eines sterilisierten
Filters gefiltert (MILLEX (Handelsmarke) 0.3 µm, Milipore Ltd.). Die
Proteinkonzentration des Filtrats wurde nach einer Lowry Methode
bestimmt.
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Das 100 mg bis 150 mg Protein enthaltende Filtrat wurde einem Protein G
Säulensatz (Mab Trap G, hergestellt durch Pharmacia Company) aufgegeben,
wobei die gereinigte Fraktion gegen PBS dialysiert wurde. Die Reinheit
der dialysierten Lösung wurde mittels einer
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (im folgenden abgekürzt als SDS-Page)
geprüft. Nachdem in einem Western-Blot ein einzelner Streifen festgestellt
wurde, wurden monodonale Antikörper gewonnen.
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Für die gewonnenen monoclonalen Antikörper wurden sechs Arten
Hybridomzellinien beim Fermentation Research Institut (FRL), Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and
Industry in Japan auf der Grundlage des Budapester Vertrages hinterlegt. Die
Hinterlegungsnummern sind wie folgt:
(2) Herstellung von mit Antikörpern beschichteten Platten
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Einer jeden Aufnahme einer unbehandelten, 96 Aufnahmen aufweisenden
Mikrotiterplatte (Immulon 1, hergestellt durch Dynatech Laboratories
Inc., im folgenden als Mikrotiterplatte abgekürzt), wurden 50 µl einer
PBS-Lösung, in welcher 5 µg/ml an 15 E11 gelöst waren, welches ein Maus
Anti Derf II monoclonaler Antikörper ist, hinzugefügt und es wurde die
Platte während zwei Stunden unter Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Lösung aus einer jeden Aufnahme entfernt, woraufhin die
Platte mit PBS gewaschen wurde, welches 0.05 % Tween 20 enthielt (im
folgenden abgekürzt als PBS-Tween). Die Waschung wurde dreimal
wiederholt und es wurde die Platte mit PBS, welches 1 % BSA oder 1 % Tween 20
enthielt, bei Raumtemperatur während einer Stunde oder bei 4º C über
Nacht blockiert. Die mit PBS-Tween dreimal gewaschene Platte wurde
benutzt. Es war möglich, die Platte bei einer niedrigen Temperatur
von - 30º C zu lagern.
(3) Zubereitung von mit alkalischer Rinderpankreasphosphatase markierten
Antikörpern
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5 mg alkalischer Rinderpankreasphosphatase (EIA Grad: Hergestellt durch
Boehringer Mannheim Company) wurden 1.7 mg gereinigte monoclonale
Antikörper hinzugefügt und es wurde die Mischung gegen PBS üler Nacht
dialysiert. Das Volumen des Dialysats wurde bestimmt und 1/10 des
Volumens bestehend aus 20 % Glutaralehyd (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.) wurde dem Dialysat hinzugefügt und es wurde die Mischung während
zwei Stunden bei Raumtemperatur umgerührt. Nachdem die Lösung
aufgefangen war und gegen PBS über Nacht dialysiert wurde&sub1; wurde sie gegen 0.25
M Tris-HCl bei einem pH-Wert 8.0 über Nacht dialysiert, um ene
markierte Antikörperlösung zu gewinnen. Natriumazid wurde der Lösung mit
einer abschließenden Konzentration von 0.02 % hinzugefügt und es wurde
die Lösung bei 4º C aufbewahrt.
(4) Einstellung mit gereinigtem Derf I und gereinigtem Derf II
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Einer Mikrotiterplatte, die mit 15 E11 beschichtet war, bei welchem es
sich um einen monodonalen Antikörper handelt, der nach dem im (2)
beschriebenen Verfahren zubereitet worden war, wurden 50 µl an PBS (oder
PBS-Tween), welches 0 bis 0.3 µg/ml an gereinigtem Derf II enthielt,
hinzugefügt. 50 µl PBS (oder PBS-Tween), welche 0 bis 0.3 µg/ml eines
anderen Allergens Derf I (Molekulargewicht: 24K) enthielt und welches
aus D. farinae abgeleitet worden war und das Allergen Derp I
(Molekulargewicht: 24K) oder Derp II (Molekulargewicht: 15K), welche
aus D. pteronyssinus abgeleitet waren, wurden einer jeden Aufnahme zur
spezifischen Bindungskontrolle zugegeben. Nach einer Inkubationszeit
von zwei Stunden wurden die Aufnahmen dreimal mit PBS-Tween gewaschen
und 50 µl einer Lösung eines mit alkalischer Phosphatase markierten
Anti Derf II, welches gemäß (3) zubereitet war, (abgekürzt als 13A4*)
mit PBS (oder PBS-Tween) in einem Verhältnis von 9 µg/ml wurden den
Aufnahmen zugefügt. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden wurden
die Aufnahmen mit PBS-Tween gewaschen und 100 µl einer Substratlösung,
welche in einem Verhältnis von 5 ml einen Diethanolaminpuffer mit einem
pH-Wert von 9.8 und eine Substrattablette (1 mg hergestellt durch Sigma
Chemicals, Co.) (die Lösung wird im folgenden als Substratlösung
abgekürzt wiedergegeben) enthielt, wurden einer jeden Aufnahme zugefügt.
Man ließ die farbigen Aufnahmen unter Raumtemperatur während zehn
Minuten reagieren und 50 µl aus 5N NaOH wurden hinzugefügt, um die Reaktion
zu beenden. Die Absorption einer jeden Aufnahme wurde bestimmt bei
einer Wellenlänge von 405 nm mittels eines micro auto reader (hergestellt
durch Corona Company, im folgenden abgekürzt als Autoreader) und die
Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Beispiel 2
-
Die Beziehung zwischen der Bestimmung von Derf II in einer Probe und die
Anzahl der Milbenkörper wurde mit Anti Derf II monoclonalen Antikörpern
geprüft, welche nach (1) des Beispiels 1 gewonnen wurden.
-
Mit den, nach den in (1) und (2) des Beispiels 1 beschriebenen Verfahren
hergestellten monodonalen Antikörpern isell wurde eine Mikrotiterplatte
beschichtet. 50 µl des gereinigten Derf II (0 bis 300 ng/ml) oder der
Überstand der Proben wurden einer jeden Aufnahme der Platte zugefügt. Die
Proben enthielten menschliche Haare (5 mg), Haare eines Hundes, der außerhalb
gehalten worden ist (5 mg), Haare eines Hundes der innerhalb gehalten
worden ist (4 mg), Haare einer Hauskatze (1 mg) und Baumwolle 5 mg, denen 50
Milben (D, farinae) hinzugefügt wurden oder die Milben wurden jeweils nicht
hinzugefügt. Der Überstand der Proben wurde gewonnen, indem 500 µl an PBS-
Tween einer zu untersuchenden Probe zugegeben wurden, wobei diese während
10 Sekunden umgerührt wurde, wobei man die Mischung anschließend 10 Minuten
stehen ließ und diese anschließend während zwei Minuten bei 10,000 rpm
zentrifugierte. Die Aufnahmen wurden während zwei Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert und mit PBS-Iween dreimal gewachen. 13A4*, welches gemäß
(3) zubereitet wurde, wurde mit PBS-Tween verdünnt, um eine Konzertration
von 9 µg/ml zu erreichen. Die verdünnte Lösung wurde in einem Verhältnis
von 50 µl pro Aufnahme aufgegeben.
-
Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die
Aufnahmen mit PBS-Tween dreimal gewaschen und gefärbt, indem 100 µl der
Substratlösung hinzugefügt wurden. Nachdem die Aufnahmen unter
Raumtemperatur während zehn Minuten reagierten, wurden 50 µl von 5N NaOH in eine
jede Aufnahme eingebracht und die Reaktion beendet. Die Absorption -n einer
jeden Aufnahme wurde unter Verwendung einer Wellenlänge von 405 nm mittels
eines Autoreaders bestimmt und es sind die Ergebnisse in Tabelle
1 gezeigt.
Tabelle 1
-
Tabelle 1 zeigt die Beziehung zwischen der Bestimmung von Derf II und der
Zahl der Milbenkörper in Gegenwart der anderen in Beispiel 2 angeoebenen
Materialien. Sobald Milben nicht hinzugefügt werden, betragen die O.D.
Werte einer jeden Probe bei einer Wellenlänge von 405 nm 0. Werderi
andererseits 50 Milben hinzugefügt, zeigen die O.D. Werte einer jeden Probe nahezu
sämtlich den gleichen Wert an, der dem Kontrollwert entspricht, der
gewonnen wurde unter Hinzufügung der Milben zu PBS.
Beispiel 3
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Drei Arten von monodonalen Anti Derf II monoclonalen Antikörpern welche
gemäß (1) nach Beispiel 1 gewonnen wurden, 18G8, 13A4 und 15E11 wurden
verwendet, um ein Western-Blot-Verfahren bei gefriergetrockneten Milbenkörpern
(D, farinae) und gereinigten Derf II anzuwenden.
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10 mg gefriergetrocknete Milbenkörper (D,farinae) wurden in einem ml PBS
gelöst. Sechs µg/ml des gereinigten Derf II in PBS wurden zubereitet. Jede
Probe wurde mit SDS in Gegenwart von β-Merkaptoethanol nach einem bekannten
Verfahren behandelt. 20 µl der früheren Probe und 10 µl der letzteren Probe
wurden elektrophoretisch behandelt mit 20 % Polyacrylamidgel (SDS-PAGE
Minigel, hergestellt durch TEFCO Company)) bei 20 mA während 1.5 Stunden.
Nach der Elektrophorese wurde jede probe auf ein Blot Papier übertragen
(PVDF: Hergestellt durch Milipore Ltd.) und zwar bei 160 mA während einer
Stunde. Anschließend wurde das Blot-Papier bei Raumtemperatur während einer
Stunde mit PBS blockiert, welches 3 % BSA enthielt und mit PBS-Tween
gewaschen 18G8, 13A4 und 15E11 wurden mit PBS verdünnt, welches zwei mg/ml BSA
enthielt, um eine Konzentration von jeweils 50 µg/ml erhalten. Das
Blot-Papier wurde geschnitten und jedes Stück wurde in eine jede Antikörperlösung
eingetaucht und in dieser zwecks Reaktion über Nacht bei 4º C belassen. Die
Teile des Blot-Papiers wurden mit PBS-Tween gewaschen, wobei die Teile in
ein mit Peroxydase markiertes Anti-Maus IgG (Anti-Maus IgG-HRP, hergestellt
durch Bio-Rad Laboratories) eingetaucht wurden, welches mit PBS verdünnt
wurde, welches 2 mg/ml BSA enthielt, wobei der Eintauchvorgang während zwei
Stunden beibehalten wurde. Nach Waschen mit PBS-Tween wurden die Stücke
eingetaucht und in einer Lösung von 4-Chlor-2-Naphtol als Substrat gefärbt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 4
-
Um die Unterscheidung der Antigendeterminanten durch die Antikörper
abzuschätzen, würden drei Arten monodonaler Anti Derf II Antikörper, welche
gemäß (1) von Beispiel 1 gewonnen wurden, 18G8, 13A4 und isell und 18G8*
und 13A4*, welche mit alkalischer Phosphatase markiert wurden, zulereitet
und anschließend einer Vergleichsprüfung unterzogen.
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Einer jeden Aufnahme der Mikrotiterplatte wurden 50 µl einer Lösung, in der
das gereinigte Derf II mit PBS verdünnt war, in einer Konzentration von 30
µg/ml zugegeben. Jede Aufnahme wurde unter Raumtemperatur während zwei
Stunden inkubiert und mit PBS-Tween dreimal gewaschen. Eine Lösung, welche
eine gewisse Konzentration an 18G8* (9µg/ml) und eine Lösung, welche mit
PBS in Gegenwart eines unmarkierten 18G8, 13A4 oder 15E11 zubereitet wurde,
und zwar in einer Konzentration von 0 bis 10 µg/ml wurden den anderen
Aufnahmen in einer Menge von 50 pl jeweils zugegeben. In der gleichen Weise
wurden eine Lösung, die eine gewisse Konzentration an 13A4* (9 µg/ml)
und
eine Lösung, welche mit PBS in Gegenwart eines unmarkierten 18G8, 13A4 oder
15E11 zubereitet wurde, und zwar in einer Konzentration von 0 bis 10 µg/ml
den anderen Aufnahmen in einer Menge von jeweils 50 µl zugegeben. Die
Aufnahmen wurden während zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und mit
PBS-Tween gewaschen. 100 µl einer Substratlösung wurden einer jeden
Aufnahme zugegeben, um während zwei Stunden unter Raumtemperatur eine Reaktion
durchzuführen. 50 µl von 5N NaOH wurden einer jeden Aufnahme zugegeben, um
die Reaktion zu beenden. Die Absorption wurde mittels eines Autoreaders bei
einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß eine
Vergleichsreaktion zwischen 13A4 gegenüber 15E11 nicht beobachtet wurde,
aber zwischen 18G8 gegenüber 13A4 und 18G8 gegenüber 15E11. Demzufolge sind
13A4 und 15E11 offensichtlich in der Lage unterschiedliche Epitope
voneinander zu erkennen (vgl. Fig. 3).
Beispiel 5
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Unter Verwendung des Immunassays, bei welchem monodonale Antikörper 15E11
und 13A4* verwendet werden, welche gemäß Beispiel 2 eingesetzt werden,
wurde die Konzentration bestimmt, wobei lediglich Derf II festgestellt
wurde, und zwar in Gegenwart von Derf I, Derp I oder Derp II.
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Eine Mikrotiterplatte, auf welcher isell immobisiert war, wie in (2) des
Beispiels 1 beschrieben, wurde vorbereitet. Eine Lösung, welche mit PBS-
Tween in Gegenwart von Derf II zubereitet wurde, und zwar mit einer Menge
von 0.3 µg/ml und Derf I, Derp I oder Derp II in einer Konzentraton von
bis 30 pg/ml wurde einer jeden Aufnahme in einer Menge von 50 µl zugefügt.
Jede Aufnahme wurde während zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubert und
mit PBS-Tween gewaschen. 100 pl einer Substratlösung wurde einer jeden
Aufnahme zwecks Färbung zugegeben. Die Aufnahmen wurden bei Raumtemperatur
während zehn Minuten reagiert. 50 µl von 5N NaOH wurden einer jeden
Aufnahme hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption wurde bei
einer Wellenlänge von 405 nm mittels eines Autoreaders ermittelt. Die
Ergebnisse
zeigen, daß offensichtlich Derf II alleine festgestellt wurde, und
zwar trotz der Gegenwart von Derf I, Derp 1 und Derp II (vgl. Fig 4).
Beispiel 6
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Die Beziehung zwischen den Zahlen der Hausstaubmilbenkörper und der
Absorption mittels eines Immunuassays, bei welchem monodonale Antikörper,
15E11 und 13A4* verwendet wurden.
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Wie unter (2) von Beispiel 1 beschrieben, wurde eine Mikrotiterplatte, auf
welcher 15E11 immobilisiert wurde, vorbereitet. Um das Milbenallergen zu
extrahieren, wurden jeweils 500 µl PBS-Tween, welche 0 bis 100
Hausstaubmilben (D, farinae) enthielten, während zehn Sekunden umgerührt und
anschließend während zehn Minuten stehengelassen, wobei schließlich während
zwei Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert wurde. Jedwede 50 µl des Überstands
wurden einer jeden Aufnahme zugefügt. Jede Aufnahme wurde bei
Raumtemperatur während zwei Stunden inkubiert und mit PBS-Tween dreimal gewaschen. 50
µl einer PBS-Tween Lösung, die mit 9 µg/ml an 13A4* zubereitet wurde, wurde
jeweils einer Aufnahme aufgegeben. Jede Aufnahme wurde bei Raumtemperatur
während zwei Stunden inkubiert und mit PBS-Tween dreimal gewaschen. 100 µl
einer Substratlösung wurden einer jeden Aufnahme aufgegeben. Jede Aufnahme
wurde unter Raumtemperatur während zehn Minuten einer Reaktion überlassen
und 50 µl einer 5N NaOH Lösung wurden zwecks Beendigung der Reaktion
hinzugegeben. Die Absorption einer jeden Aufnahme wurde mittels eines
Autoreaders bei 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Die
festgestellte Absorption war proportional der Zahl der Milbenkörper. Anhand der
Ergebnisse wurde festgestellt, daß die Zahl der Milbenkörper in der Probe
anhand der festgestellten Absorption abgeschätzt werden kann.
Beispiel 7
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Derf II wurde von den gefriergetrockneten Milbenkörpern mittels der
Affinitätschromatographie mit einem solchen Gel gereinigt, in welchem der
monoclonale Antikörper 13A4, der gemäß (1) des Beispiels 1 gewonnen wurde,
als Ligand enthalten war.
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1.5 g CNBr-Sepharose (hergestellt durch Pharmacia Company) wurde in 1mM HCL
gequellt und gründlich mit einer Pufferlösung aus 0.1M NaHCO&sub3; - 0.5M NaCl
bei einem pH-Wert von 8.3 gewaschen (im folgenden abgekürzt als C Puffer).
5 ml einer 13A4 (732 µg/ml) Lösung, welche vorab gegenüber einem C Puffer
dialysiert wurde und 20 ml des C Puffers wurden dem Gel zugefügt und es
wurde die Mischung bei Raumtemperatur während zwei Stunden geschüttelt.
-
Das Reaktans wurde während zehn Minuten bei 2,500 rpm zentrifugiert. 25 ml
eines 0.2M Glycinpuffers wurden bei einem pH-Wert von 8.0 dem Gel zugefügt
und es wurde die Mischung bei Raumtemperatur während zwei Stunden
geschüttelt. Die Mischung wurde anschließend während zehn Minuten bei 2,5-00 rpm
zentrifugiert. Das gewonnene Gel wurde abwechselnd mit einem C-Puffer und
einem 0.1M Essigsäure - 0.5M NaCl Puffer bei einem pH-Wert von 4.0 zweimal
gewaschen und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Das Gel wurde in eine
Kunststoffspritze eingebracht, um eine Säule zu bilden. Die Säule wurde
abwechselnd mit einem 0.2M Glycin-HCL-Puffer bei einem pH-Wert von 2.3 (im
folgenden abgekürzt als Elutionspuffer) und einem PBS-0.5M NaCl Puffer (im
folgenden abgekürzt als Waschpuffer) gewaschen und es wurde die Säule
anschließend mit einem Waschpuffer neutralisiert. 0.05 g
angefriergetrockneten Milbenkörpern, wurden in 500 µl PBS aufgelöst und die Lösung unter
Verwendung eines 0.3 µ Filters (MILLEX, Handelsmarke, hergestellt durch
Milipore Ltd.) gefiltert und 500 µl des Filtrates wurden der Säule
aufgegeben.
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Nach Maßgabe einer Durchflußrate von 92 Sekunden/ml wurde die Säule mit
einem Waschpuffer gewaschen und Derf II mit einem Elutionspuffer gespült. Die
Absorption einer jeden Fraktion wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm
bestimmt. Jede Fraktion wurde mittels SDS-PAGE geprüft, wobei gleichzeitig
die Menge an Derf II einer jeden Fraktion mittels eines Immunassays mit
15E11 und 13A4* der gemäß Beispiel 2 verwendeten monoclonalen Antikörper
bestimmt wurden. Die Ergebnisse. zeigen offensichtlich, daß lediglich Derf
II, welches in den gefriergetrockneten Milbenkörpern enthalten war in
spezifischer Weise durch das Gel absorbiert wurde. Dementsprechend kann Derf
II in einem Schritt aus den gefriergetrockneten Milben zubereitet werden
(vgl. Fig. 6 und 7).
Beispiel 8
-
Die Menge an Derf II im Hausstaub wurde unter Verwendung eines Satzes
bestimmt, der monodonale Antikörper umfaßte, die gemäß (1) des Beispiels 1
ermittelt wurden.
-
Der Satz war beispielsweise wie folgt zusammengesetzt:
-
1. Eine primäre, mit Antikörpern beschichtete Platte (im folgenden als
Platte abgekürzt),
-
2. ein Gefäß zum Extrahieren der Antikörper (im folgenden als Gefäb
abgekürzt,
-
3. eine Waschlösung,
-
4. eine, durch ein Enzym markierte sekundäre Antikörperlösung,
-
5. ein farbgebendes Substrat,
-
6. eine das Substrat auflösende Flüssigkeit,
-
7. eine die Reaktion beendende Flüssigkeit und
-
8. ein Standard Derf II.
-
Hausstaubproben wurden gewonnen indem Hausstaub wahrend drei Minuten oder
länger an unspezifischen Plätzen unter Verwendung unspezifischer,
handelsüblich verfügbarer elektrischer Vakuumreiniger absorbiert wurde. Der
erhaltene Hausstaub wurde in Teilmengen von 0.05 g bis 0.1 g unterteilt und in
Gefäße eingebracht. Die Gefäße wurden geschüttelt und anschließend während
zehn Minuten stehengelassen, um Extrakte zu gewinnen. 50 µl des Extraktes
wurden tropfenweise in eine jede Aufnahme der Platte eingebracht. Nach
Inkubation bei Raumtemperatur während zwei Stunden wurde die Platte mittels
einer Waschlösung gewaschen. 50 µl einer Mischung, welche 5 ml der
Waschlösung und einen Tropfen einer mit einem Enzym markierten sekundären
Antikörperlösung enthielt, wurden tropfenweise in eine jede Aufnahme der Platte
eingebracht und es wurden die Aufnahmen während zwei Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Platte mit der Waschlösung gewaschen worden
war, wurden einer jeden Aufnahme 100 µl einer solchen Lösung, welche eine
Tablette aus einem farbproduzierenden Substrat in 5 ml einer das Substrat
lösenden Flüssigkeit enthielt, zugefügt. Nach zehn Minuten bei
Raumtemperatur wurden 50 µl einer die Reaktion beendenden Flüssigkeit den Aufnahmen
aufgegeben und es wurde die Absorption einer jeden Aufnahme bei ener
Wellenlänge von 405 nm bestimmt. Nach dem gleichen Verfahren, nämlich unter
Verwendung einer solchen Lösung, bei welcher ein Standard Derf II mit der
Waschlösung verdünnt war, wurde die Kalibrierkurve von Derf II gewonnen.
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50 % Ethanol wurden dem in dem Gefäß verbleibenden Hausstaub hinzugegeben,
um den Hausstaub zu waschen und diesen wiederzugewinnen. Die
Hausstaublösung wurde durch ein rostfreies Sieb (355 µ) gefiltert. Methylenblau wurde
dem Filtrat zugegeben, um eine Konzentration einer 1 % Methylenblau-Lösung
zu gewinnen. Die Lösung wurde mittels eines 80 µm-Filters (hergestellt
durch Fuji Photo Film Company, Mikrofilter) gefiltert, um die Milten unter
einem stereoskopischen Mikroskop mit zwanzigfacher Vergrößerung
wiederzugewinnen. Das Milbenpräparat wurde nach einer Chloralhydratmethode gewonnen
und die in dem Hausstaub identifizierten Milben gezählt.
-
Die Menge an Derf II und die Anzahl der Milben in dem Hausstaub wurden in
Wechselbeziehung zueinander gesetzt