DE3852761T3

DE3852761T3 - Saponin-hilfsmittel.

Info

Publication number: DE3852761T3
Application number: DE3852761T
Authority: DE
Inventors: Gerald Beltz; Chung-Ho Hung; Charlotte Kensil; Dante Marciani
Original assignee: Aquila Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-31
Publication date: 2000-06-21
Anticipated expiration: 2008-06-01
Also published as: DK602989A; AU616670B2; EP0362279A4; JPH02504266A; EP0362279A1; DE3852761D1; DK175739B1; EP0362279B2; DK602989D0; CA1331443C; EP0362279B1; AU1934088A; ATE116993T1; DE3852761T2; WO1988009336A1; JP2731563B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunadjuvantien, das Verfahren zur Herstellung derselben und die Verwendung derselben als Immunadjuvantien und Impfstoffe.

Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Die US-A-4335113 (Combier et al.) verweist auf ein triterpenes Saponin, welches aus Caulophyllogenin hergeleitet wurde.
Die JP-A-54-132218 und die JP-A-61-7286 wurden ebenso wie T. Nagasawa et al., Chem. Pharm Bull. 28(7): 2059-2064 (1980) dieser Anmeldung entgegengehalten. Das letztere Dokument bezieht sich auf die Hauptkomponenten von Ginseng-Saponinen.
J. Zhou et al., Chem. Pharm. Bull. 29(): 2844-2850 (1981), bezieht sich auf die Isolierung von Dammaran-Saponinen aus den Wurzeln von Panax notoginseng.
Kartnig et al., Plante. Med. 23(3): 269-271 (1973), bezieht sich auf die Isolierung von drei Saponinbestandteilen, von denen alle Hydrolyseprodukte sind, aus der Rinde von Quillaja saponaria.
A. A. McColm et al., Parasite Immunology 4 : 337-347 (1982), bezieht sich auf die Schutzwirkung der Immunität, welche vermeintlich durch Injektion eines saponinhältigen Impfstoffes übertragen wurde.
R. Bomford Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 57 : 127-131 (1982), betrifft die Verwendung von Saponin als Adjuvans für Antigene.
Quillaja-Saponine sind eine Mischung aus Triterpenglucosiden, extrahiert aus der Rinde des Baums Quillaja saponaria. Rohsaponine wurden ausgiebig als Adjuvans in Impfstoffen gegen Maul- und Klauenseuche und im Verstärken der Immunschutzwirkung, die durch experimentelle Impfstoffe gegen protozoe Parasiten wie Trypanosoma cruzi Plasmodium übertragen wird, und auch der Reaktion der Körperflüssigkeit auf rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) angewendet. (Bomford, Int. Arch. Allerg. appl. Immun., 67 : 127 (1982)).
Saponine sind natürliche Produkte, die durch eine Anzahl gemeinsamer Eigenschaften gekennzeichnet sind. Die Fähigkeit, in wässrigen Lösungen Schaum zu produzieren, gab dieser Gruppe den Namen. Weitere Kennzeichen sind die hämolytische Aktivität, die Giftigkeit für Fische, die Komplexbildung mit Cholesterin und in einigen Fällen antibiotische Aktivität. Kofler, Die Saponine (Springer Verlag), Berlin, 1927; Tschesche et al., Chemie und Biologie der Saponine, Fortscher. Chem. Org. Naturst. XXX: 461 (1972).
Die gemeinsamen Eigenschaften der Saponine widerspiegeln sich nicht in einer gemeinsamen chemischen Zusammensetzung. Obgleich alle Saponine Glucoside sind, können Aglycone zu den Steroiden, den Triterpenoiden oder den Steroidalkaloiden gehören. Die Zahl der Zucker und Zuckerketten, die an den Glucosebindungen haften, kann stark variieren. Saponine werden kommerziell hergestellt und haben viele Verwendungen. Die kommerziell erhältlichen Quillaja Saponine sind Rohmischungen, welche auf Grund ihrer Veränderlichkeit zur Verwendung in der tierärztlichen Praxis oder bei pharmazeutischen Zusammensetzungen für Menschen nicht wünschenswert sind. Auf Grund der Veränderlichkeit und Heterogenität muß jede Charge in Tierexperimenten getestet werden, um die Adjuvansaktivität und Giftigkeit zu bestimmen. Die Verunreinigungen in kommerziell erhältlichen Produkten können nachteilige Reaktionen hervorrufen. Zusätzlich kann der Inhalt der aktiven Substanzen einer gegebenen Charge von Saponin variieren, wodurch die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge reduziert wird.
Ein früher Versuch, Quillaja Saponinadjuvantien zu reinigen, wurde von Dalsgaard, Archiv fuer die gesamte Virusforschung 44 : 243 (1974) gemacht. Dalsgaard reinigte teilweise einen wässrigen Extrakt von Saponin Adjuvansmaterial von Quillaja saponaria Molina. Dalsgaards Präparat, kommerziell erhältlich von Superfos unter dem Namen "Quil-A", wurde aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria Molina isoliert und ist chemisch charakterisiert als Kohlenhydratanteil an Glucosidbindung mit der Triterpenoid- Quillasäure. Gleichwohl das Saponin "Quil-A" von Dalsgaard eine wesentliche Verbesserung gegenüber den kommerziell erhältlichen Saponinen darstellt, zeigt es doch beachtliche Heterogenität.
Higuchi et al., Phytochemistry 26 : 229 (Jänner, 1987), behandelte eine Quillaja Saponinrohmischung mit alkalischer Hydrolyse in 6% NH&sub4;HCO&sub3; in 50% Methanol und erzeugte zwei wesentliche Desacylsaponine, genannt DS-1 und DS-2. Es wurde bewiesen, daß DS-1 Glucuronsäure, Galaktose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Apiose und Quillasäure enthält, während DS-2 dieselben Komponenten mit einer zusätzlichen Glykose enthält. Nebenprodukte dieser Deacyklierung erzeugten verschiedene Komponenten einschließlich 3,5-Dihydroxy-6-methyloktansäure, 3,5-Dihydroxy-6-methyloktansäure, 5-0-α-L- Arabinofuranosid und 5-0-α-L-Rhamnopyranosyl-(1-> 2)-α-L-Arabinofuranosid (Higuchi et al., Phytochemistry 26 : 2357 (August, 1987)).
Tokimitsu et al., 28th Symposium on the Chemistry of Natural Products, Symposiumunterlagen 224-230. Sendai 1986 offenbart auf Seite 229 die Struktur eines Saponins, das darin als QS-III und hierin als QA-17 bezeichnet wird und folgende Formel aufweist:

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Brechungsindexprofil von dialysiertem, methanol-solubilisiertem Quillaja Rindenextrakt auf Phasenumkehr-HPLC.
Fig. 2 zeigt die Brechungsindexspitzen der vorigen Probe, verglichen mit den Kohlenhydratspitzen.
Fig. 3 zeigt den Vergleich von Superfos "Quil-A" und dialysiertem, methanollöslichem Rindenextrakt durch HPLC.
Fig. 4 zeigt die Reinigung von QA-7, QA-17, QA-18, QA-19, und QA-21 von "Quil- A", einer Saponinrohmischung, durch Quarzchromatographie (4A) und anschließender Phasenumkehrchromatographie (4B, 4C, 4D).
Fig. 5 demonstriert die Reinheit von QA-7, QA-17, QA-18, und QA-21 mit Phasenumkehr- (5A) und Normalphasen- (5B) Dünnschichtchromatographie.
Fig. 6A zeigt das UV-Spektrum von QA-7. Fig. 6B zeigt das UV-Spektrum von QA-17. Fig. 6C zeigt das UV-Spektrum von QA-18. Fig. 6D zeigt das UV-Spektrum von QA-21.
Fig. 7A zeigt 'H Kernspinresonanz ("NMR") von QA-7. Fig. 7B zeigt 'H NMR von QA-18. Fig. 7C zeigt'H NMR von QA-21.
Fig. 8A zeigt das Massenspektroskopie-Spektrum bei Beschuß mit schnellen Atomen ("MS-FAB") von QA-7. Fig. 8B zeigt das MS-FAB Spektrum von QA-17. Fig. 8C zeigt das MS-FAB Spektrum von QA-21.
Fig. 9 zeigt das Elutionsprofil von reinen QA-18 Mizellen und reinen QA-21 Mizellen bei Gel-Filtration mit BioGel P-200 in PBS, abgeglichen mit der kritischen mizellaren Konzentration desselben Saponins und einen Vergleich mit der Elutionsposition von Standardproteinen.
Fig. 10 zeigt die Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A".
Fig. 11 zeigt die typischen Titerumschlagpunkte für die Immunisierung mit BSA Antigenen unter der Anwesenheit von HPLC-gereinigten Anteilen von Rindenextrakt. Die von der antigenspezifischen Antikörperbindung abhängige dekadische Extinktion wurde als Funktion des Logarithmus der Serumverdünnung aufgetragen.
Fig. 12 demonstriert den Vergleich der Adjuvanseffekte von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 bei verschiedenen Antigenkonzentrationen und mit Freunds Volladjuvans zur Immunisierung mit dem Antigen BSA.
Fig. 13 zeigt den Adjuvanseffekt von HPLC-gereinigten Adjuvantien, die in Verbindung mit Al(OH)&sub3;, einem anderen Adjuvans, verwendet werden, auf die Immunisierung mit dem Antigen gp70R-delta.
Fig. 14 faßt die Effekte von HPLC-gereinigten Quillaja Saponinen allein und in Verbindung untereinander und mit anderen Adjuvantien auf die Immunisierung mit dem akylierten gp70R-delta Antigen zusammen.
Fig. 15 zeigt einen Vergleich der Adjuvanseffekte von QA-18, QA-18H, QA- 21 und QA-21H auf die Immunisierung mit dem Antigen BSA.

Zusammenfassung der Erfindung

Es besteht ein Bedarf nach im wesentlichen reinen Saponin, welches als Adjuvans in relativ kleinen Mengen mit geringer Giftigkeit und Nebenwirkungen verwendet werden kann.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung im wesentlichen reine Saponinadjuvantien, das Verfahren zur Reinigung derselben und ein Verfahren für die Verwendung der im wesentlichen reinen Saponine als Immunadjuvantien zur Verfügung. Die Erfindung umfaßt weiters eine Immunreaktion herausfordernde Zusammenstellungen, umfassend Saponinadjuvantien in Verbindung mit einer Antigenkomponente.
Die Erfindung bezieht sich auf im wesentlichen reine Saponine zur Verwendung als Immunadjuvantien, wie sie in den unabhängigen Patentansprüchen 1, 4 und 5 definiert sind, und auf im wesentlichen reine Saponine an sich, wie sie in den unabhängigen Patentansprüchen 2, 3 und 6 bis 8 definiert sind, sowie ihre Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen und zur Verstärkung der Immunreaktion.
Adjuvanssaponine sind identifiziert und aus einem wässrigen Extrakt der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria Molina geläutert worden. Zumindest 22 Spitzen mit Saponinaktivität waren trennbar. Die überwiegenden, gereinigten Quillaja- Saponine wurden identifiziert als QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21. Diese Saponine wurden mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Niederdruckquarzchromatographie gereinigt. Diese vier Saponine haben Adjuvanseffekte in Mäusen. QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, geläutert von Superfos "Quil-A", einer Quillaja-Saponin Rohaufbereitung, sind bei Mäusen weniger toxisch als "Quil-A"; QA-17 und QA-18 sind bei Katzen weniger toxisch als "Quil-A" (QA-7, QA-21 wurden nicht getestet). Außerdem wurde eine toxische Komponente von Superfos "Quil-A" als QA-19 identifiziert; diese Komponente ist bei Mäusen bei geringeren Dosierungen als "Quil-A" oder QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 toxisch. Die gesteigerte Giftigkeit von QA-19, verglichen mit QA-7, QA-17, QA-18 und QA- 21, ist unerwartet, da diese Komponente ein Saponin ist, eine ähnliche Kohlenhydratzusammensetzung hat, bei Mäusen bei geringeren Dosierungen als die toxische Dosierung Adjuvantienaktivität zeigt und ein ähnliches chromatographisches Verhalten aufweist. Alle oben genannten Saponine können von wässrigen Extrakten der Quillaja saponaria Molina- Rinde isoliert werden. Die im wesentlichen reinen Saponine der vorliegenden Erfindung sind als Immunadjuvantien verwendbar und steigern die Immunreaktion bei Individuen bei einer bedeutend geringeren Konzentration als die früher verfügbaren heterogenen Saponinpräparate ohne die toxischen Effekte, die mit Saponin Rohpräparaten verbunden sind. Saponinkomponenten, die bei der Erfindung speziell ins Auge gefaßt wurden, sind QA-7, QA-17 und QA-21 zur Verwendung als Immunadjuvantien und QA-7 und QA-21 an sich, aber nicht QA-18 oder QA-19.

Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen

Die Saponine der vorliegenden Erfindung können vom Baum Quillaja saponaria Molina erhalten werden. Der Begriff "Saponin", wie er hierin verwendet wird, umfaßt glykosidische Triterpenoidpräparate, welche in wässrigen Lösungen Schaum erzeugen, welche in den meisten Fällen hämolytische Aktivität haben und welche Immunadjuvansaktivität besitzen. Die Erfindung umfaßt sowohl das Saponin an sich, als auch natürliche und pharmazeutisch zulässige Salze und pharmazeutisch zulässige Derivate. Der Begriff "Saponin" umfaßt auch biologisch aktive Fragmente davon.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen wie immunologische Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere, im wesentlichen reine Saponinfragmente beinhalten und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen als Immunadjuvantien.
Der Begriff "Immunadjuvans", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Verbindungen, welche, wenn sie einem Individuum verabreicht oder in vitro getestet werden, die Immunreaktion auf ein Antigen bei einem Individuum oder einem Testsystem, welchen das Antigen verabreicht wurde, erhöhen. Einige Antigene sind schwach immunogen, wenn sie allein verabreicht werden, oder toxisch für das Individuum bei Konzentrationen, welche die Immunreaktion in besagtem Individuum hervorrufen. Ein Immunadjuvans kann die Immunreaktion eines Individuums auf ein Antigen steigern, indem es das Antigen stärker immunogen macht. Die Adjuvanswirkung kann die Dosierung des Antigens auch verringern, die notwendig ist, um eine Immunreaktion in besagtem Individuum zu erreichen.
Die Adjuvansaktivität der Saponine kann mit jeder einer Anzahl von Verfahren bestimmt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die Zunahme im Titer von Antikörpern gegen bestimmte Antigene nach Verabreichung eines Adjuvans kann als Kriterium für die Adjuvansaktivität verwendet werden (Dalsgaard, K. (1978), Acta Veterinia Scandinavica 69, 1-40, Scott, M. T., Gross-Samsom, M., and Bomford, R. (1985), Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77, 409-412). In Kürze gesagt, umfaßt ein derartiger Test die Injektion bei CD-1 Mäusen intradermal mit einem Antigen, das mit unterschiedlichen Mengen eines möglichen Adjuvans vermischt ist (beispielsweise Rindereiweißserum, BSA). Die Seren wurden 2 Wochen später von Mäusen gewonnen und mittels ELISA auf Anti-BSA Antikörper getestet. Ein Vergleich der Adjuvanseffekte des dialysierten, methanollöslichen Rindenextrakts und "Quil-A" zeigte, daß, wenn das Antigen BSA in Anwesenheit von Saponinpräparaten verabreicht worden war, die Antikörpertiter um zwei Größenordnungen größer waren, als wenn BSA allein mit PBS verabreicht worden war. Das Rindenextrakt besaß gute Adjuvansaktivität, wenn es in einer Adjuvansdosierung von 12 ug Kohlenhydrat (wie mittels Anthron analysiert wurde) oder mehr verabreicht wurde. Die Adjuvansansprechung auf "Quil-A" war niedriger als für den Rindenextrakt, war aber offensichtlich bei Dosierungen im Bereich von 9-23 ug Kohlenhydrat. Das Kohlenhydratgewicht (bestimmt durch Testen mit Anthron unter Verwendung von Glucose als Standard) ist ungefähr 30% des Trockengewichtes dieser Adjuvans-Rohextrakte.
Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet im wesentlichen frei von Verbindungen, welche normalerweise mit dem Saponin in seinem Naturzustand assoziiert sind und konstante und eine reproduzierbare chromatographische Reaktion, Elutionsprofile und biologische Aktivität aufweisen. Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet nicht, künstliche oder synthetische Mischungen der Saponine mit anderen Verbindungen auszuschließen.
Das im wesentlichen reine Saponin ist vorzugsweise gereinigt nach einem oder mehreren der folgenden Standards:
1) es erscheint als ausschließliches einzelnes Kohlenhydrat-Hauptfarbband auf Silikagel TLC (EM Science HPTLC Si60) in einem Lösungssystem von 40mM Essigsäure in Chloroform/Methanol/Wasser (60/45/10, v/v/v),
2) es erscheint als ausschließliches einzelnes Kohlenhydrat-Hauptfarbband auf Phasenumkehr-TLC (EM Science Silikagel RP-8) in einem Lösungssystem von Methanol/Wasser (70/30, v/v),
3) es erscheint als ausschließliche einzelne Hauptspitze bei Phasenumkehr-HPLC auf Vydac C&sub4; (5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, v/v).
In der bevorzugten Ausgestaltung wird das Saponinadjuvans der vorliegenden Erfindung aus Quillaja saponaria Molina Rinde geläutert. Wäßrige Extrakte der Quillaja saponaria Molina Rinde wurden gegen Wasser dialysiert. Der dialysierte Extrakt wurde bis zur Trockenheit gefriergetrocknet, mit Methanol extrahiert, und der methanollösliche Extrakt wurde weiter mit Silikachromatographie und mit Phasenumkehr-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) fraktioniert. Die einzelnen Saponine wurden durch Phasenumkehr-HPLC, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrennt. Zumindest 22 Spitzen (bezeichnet als QA-1 bis QA-22) waren auflösbar. Jede Spitze korrespondiert, wie in Fig. 2 gezeigt, mit einer Kohlenhydratspitze und zeigt nur ein Einfachband bei der Phasenumkehr- Dünnschichtchromatographie. Die einzelnen Komponenten wurden durch die Retentionszeitmessung auf einer Vydac C&sub4; HPLC-Säule als die folgenden identifiziert:
Spitze Retentionszeit (Minuten)
QA-1 Lösungsmittelfront
QA-2 4,6
QA-3 5,6
QA-4 6,4
QA-5 7,2
QA-6 9,2
QA-7 9,6
QA-8 10,6
QA-9 13,0
QA-10 17,2
QA-11 19,0
QA-12 21,2
QA-13 22,6
QA-14 24,0
QA-15 25,6
QA-16 28,6
QA-17 35,2
QA-18 38,2
QA-19 43,6
QA-20 47,6
QA-21 51,6
QA-22 61,0
Die Immunadjuvansaktivität wurde durch Messen der Fähigkeit der gereinigten Saponine, die Immunreaktion in Mäusen auf exogen verabreichte Antigene getestet. Die gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung zeigen Adjuvanseffekte bei geringeren Dosierungen als die Rohextrakte. Insbesondere die vorherrschenden Saponine im Rindenextrakt (QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21) zeigen Adjuvansaktivität bei Dosierungen von 4,5 ug Kohlenhydrat oder weniger (wie mittels Anthron analysiert wurde). Die gereinigten Saponine wurden weiters gekennzeichnet durch den Kohlenhydratgehalt, Phasenumkehr- und Normalphasen-TLC, UV, Infrarot, NMR Spektren und Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen.
Der durchschnittliche Abtötungskoeffizient, der für 1% (w/v) Lösungen in Methanol bei 205 nm von einigen der bevorzugteren gereinigten Saponine bestimmt wurde, stellt sich wie folgt dar:
1% E&sub2;&sub0;&sub5; (nm)
QA-7 34
QA-17 27
QA-18 27
QA-21 28
In einigen Fällen wurde der Kohlenhydratgehalt verwendet, um die Saponine zu quantifizieren. Zur Kohlenhydratanalyse wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, die Anthronmethode von Scott und Melvin (Anal. Chem. 25 : 1656 (1953)) unter Verwendung von Glucose als Standard angewendet. Diese Analyse wurde verwendet, um das Verhältnis des Ausmaßes der Anthronreaktion (ausgedrückt in Glucoseäquivalenten) pro mg gereinigten Saponins (Trockengewicht) zu bestimmen, so daß das Trockengewicht eines bestimmten Präparats durch die Verwendung der Anthronanalyse geschätzt werden konnte. Es muß darauf hingewiesen werden, daß Unterschiede in der Reaktionsfähigkeit mit Anthron für verschiedene Saponine eher durch die Kohlenhydratzusammensetzung als durch die Menge hervorgerufen werden sein könnte, da unterschiedliche Monosaccharide in dieser Analyse unterschiedlich reagieren.
Das im wesentlichen reine QA-7 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 35% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 9-10 Minuten bei RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; v/v) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 52-53% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,06% in Wasser und 0,07 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, keine feststellbare Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 200 ug/ml oder weniger verursacht, und die Monosaccharidrückstände terminale Rhamnose, terminale Xylose, terminale Glucose, terminale Galactose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose, 2,3-Fucose, 2,3-Glucuronsäure und Apiose (Bindung nicht bestimmt) enthält.
Das im wesentlichen reine QA-17 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 29% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 35 Minuten bei RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; v/v) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 63-64% Methanol von einer Vydac Ca-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,06% (w/v) in Wasser und 0,03% (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 ug/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharidrückstände terminale Rhamnose, terminale Xylose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose, 2,3-Glucuronsäure, terminale Glucose, 2-Arabinose, terminale Galactose und Apiose (Bindung nicht bestimmt) enthält.
Das im wesentlichen reine QA-18 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 25-26% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 38 Minuten bei RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; v/v) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 64-65% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm 117 · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,04% (w/v) in Wasser und 0,02% (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 ug/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharide terminale Rhamnose, terminale Apiose, terminale Xylose, terminale Glucose, terminale Galactose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure enthält.
Das im wesentlichen reine QA-21 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 22% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 51 Minuten bei RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; v/v) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, 69-70% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID · 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,03% (w/v) in Wasser und 0,02% (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 ug/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharide terminale Rhamnose, terminale Arabinose, terminale Apiose, terminale Xylose, 4-Rhamnose, terminale Glucose, terminale Galactose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4- Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure enthält.
Der Begriff "Individuum" bedeutet jedes Tier, welches Immunreaktionen hervorbringen kann, inklusive des Menschen.
Die gereinigten Saponine zeigen über einen weiten Bereich von Dosierungen, in denen sie verabreicht werden, und über einen weiten Bereich von Verhältnissen zu den verabreichten Antigenen Adjuvanseffekte. In einer Ausgestaltung werden die Saponine in einem Verhältnis von Adjuvans zu Antigen (w/w) von 3,0 oder weniger, vorzugsweise 1,0 oder weniger, verabreicht.
Die gereinigten Saponine können entweder einzeln oder vermischt mit anderen, im wesentlichen reinen Adjuvantien verabreicht werden, um eine Steigerung der Immunreaktion auf Antigene zu erreichen. Unter den Adjuvansmischungen, die in der vorliegenden Erfindung wirksam sind, sind Anteile von QA-7 und QA-17.
Gereinigte Saponine können auch gemeinsam mit Nicht-Saponin Adjuvantien verabreicht werden. Derartige, mit der vorliegenden Erfindung brauchbare Nicht-Saponin Adjuvantien sind Öladjuvantien (zum Beispiel Freunds Complete und Incomplete), Liposome, Mineralsalze (zum Beispiel AlK(SO&sub4;)&sub2;, AlNa(SO&sub4;)&sub2;, AlNH&sub4;(SO&sub4;), Kieselerde, Alaun, Al(OH)&sub3;, Ca(PO&sub4;)&sub2;, Kaolin und Kohlenstoff, Polynukleotide (zum Beispiel Poly-IC und Poly-AU-Säuren) und bestimmte natürliche Substanzen (zum Beispiel Wachs D vom Mycobacterium tubercolosis, als auch Substanzen, die man in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitglieder der Gattung Brucella findet).
Die gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung können zur Verstärkung der Immunreaktion auf jedes Antigen verwendet werden. Typische, auf die Immunreaktion hervorrufenden Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung passende Antigene beinhalten Antigene, die von irgendeinem der folgenden hergeleitet sind: Viren wie Influenza, Tollwut, Masern, Hepatitis B, Maul- und Klauenseuche oder HTLV-III; Bakterien wie Milzbrand, Diphtherie oder Tuberkulose; oder Protozoon wie Babeosis bovis oder Plasmodium.
Ein besonderes Beispiel ist die Verwendung der gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung zur Verstärkung der Immunreaktion auf gp70 Rekombinationsprotein. Ein gp70 Rekombinationsprotein ist ein Antigen, welches den Polypeptidanteil von FeLV gp70 Hüllprotein enthält. Dieses Rekombinationsantigen wird als "gp70R", "rec-gp70" oder "Rgp70" bezeichnet. Ein anderes Antigenpräparat, welches den Polypeptidanteil von FeLV gp70 zusammen mit den 40 Amino-terminale Aminosäuren (als "Rgp70-delta" bezeichnet) oder mit der gesamten Aminosäuresequenz (als "Rgp90" bezeichnet) des p15e Hüllproteins der FeLV Untergruppe A enthält, wird hergestellt unter Verwendung von DNA Rekombinationstechniken. Dieses gp70-Rekombinationsmaterial, welches Polypeptide, gp70R, gp70R-delta und gp90R enthält, wird in der Folge allgemein als gp70-enthaltendes Protein bezeichnet. Mit dem Ausdruck gp70-enthaltendes Protein ist beabsichtigt, Polypeptide, welche dieselbe Aminosäuresequenz als das natürlich vorkommende gp70-enthaltende Protein haben, und Analoge miteinzuschließen. Mit dem Begriff "Analoge" ist beabsichtigt, Proteine oder Polypeptide, welche von gp70, gp70-delta oder gp90 durch Hinzufügen, Entfernen oder Ersetzen von einer oder mehrerer Aminosäuren, einzuschließen; vorausgesetzt, daß die genannten Polypeptide im wesentlichen die biologische Aktivität von gp70 Proteinen zeigen.
Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbare Verabreichung der Verbindungen kann parenteral, intravenös, intramusculär, subcutan, intranasal oder in jeder anderen passenden Form erfolgen. Die verabreichte Dosierung kann vom Alter, Gewicht, gegebenenfalls von der Art einer gleichzeitigen Behandlung und von der Art der verabreichten Antigene abhängen. Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbare, tatsächliche Zusammensetzung kann in Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elexieren für mündliche Verabreichung oder sterile, flüssige Formen wie Lösungen oder Suspensionen verwendet werden. Jede inerte Trägersubstanz wie Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder jede derartige Trägersubstanz, in welcher die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen passende Löslichkeitseigenschaften für die Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung haben, kann vorzugsweise verwendet werden.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, kann dieselbe durch Verweis auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden, welche Beispiele, soweit nicht ausdrücklich Gegenteiliges festgestellt wird, nicht als beschränkend betrachtet werden.

Beispiel 1

Einleitende Zubereitung von Quillaja saponaria molinA Rindenextrakt

Quillaja saponaria Molina Rinde wurde mit einem Überschuß von Wasser (10% w/v) gerührt, um die Saponine zu extrahieren. Der wäßrige Extrakt wurde anschließend gefiltert und in 0,1% NaN&sub3; gelagert. 150 ml dieses Extrakts wurden bei 20.000 · g für 30 Minuten zentrifugiert, um die verbleibenden Rindenfragmente zu entfernen. Der Überschuß, welcher leicht braun war, wurde lyophilisiert, in 16 ml Wasser erneut gelöst und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 160 ul von 1 N Essigsäure auf weniger als 4 eingestellt. Die Lösung wurde in einer Dialyseröhre mit einer 12.000 MW Sicherung plaziert und gegen 1 Liter Wasser dialysiert. Das Wasser wurde nach 8 Stunden Dialyse gewechselt und der Dialyse wurde ermöglicht, über Nacht fortzuschreiten. Nach dem ersten und zweiten Dialysezyklus wurden Proben der Dialysate gezogen. Der dialysierte Extrakt wurde lyophilisiert und mit 40 ml Methanol bei 60ºC für 15 Minuten und anschließend durch Absetzen mittels Zentrifugierung bei 1.000 · g für 10 Minuten das ungelöste Material extrahiert. Dieses Material wurde zwei zusätzlichen Extraktionen mit Methanol ausgesetzt. Die Methanolextrakte wurden zusammengefaßt, in einem Rotationsevaporator zur Trockne eingedampft, in 5,5 ml Methanol erneut gelöst und durch ein 0,2 u Nylon-66-Sieb filtriert, um verbleibendes, ungelöstes Material zu entfernen. Die Bestandteile wurden durch Phasenumkehr- Dünnschichtchromatographie (RP-TLC) auf C8 Platten (E. M. Science RP-TLC, C8) in einem Lösungssystem von 70% Methanol / 30% Wasser oder durch Normalphasen-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60 TLC Platten in einem Lösungssystem von n- Butanol, Äthanol, Wasser und Ammoniak (30160/29/21, v/v/v/v) analysiert. Die Kohlen hydratbänder wurden mit Bial's Reagens sichtbar gemacht, wodurch alle wesentlichen Bänder beim Carbonisieren mit Schwefelsäure durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der Schwefelsäurecarbonisierungsmethode bestimmbar waren. Die Bial's-Reagens-Kohlenhydratflecken wurden routinemäßig als Nachweisreagens auf TLC Platten verwendet. Alle wesentlichen Bänder wurden glykosyliert.
Die Dialyse entfernte ein wesentliches kohlenhydrathältiges Band (RF = 0,82 auf EM Science RP TLC, C8 in Methanol/Wasser (70/30, v/v)), ebenso wie einige unbedeutende Komponenten. Zusätzlich entfernte die Dialyse Komponenten mit starken Absorptionsmaxima bei 280 und 310 nm. Ungefähr 80% der Kohlenhydrate (wie mittels Anthron analysiert wurde) wurden durch die Dialyse entfernt, hingegen blieben etwa 95% der hämolytischen Aktivität während der Dialyse erhalten.
Von den meisten Saponinadjuvantien ist bekannt, daß sie Detergenteigenschaften wie die Hämolyse roter Blutkörperchen aufweisen, daher ist die Beibehaltung der hämolytischen Aktivität ein grober Indikator über die Beibehaltung der Adjuvanssaponine. Einige Bänder blieben bei der Dialyse zurück und zeigten somit ihre Detergentnatur an. Methanol löste alle im dialysierten Extrakt vorhanden TLC-Bänder außer einem TLC-Band (RF = 0 auf Phasenumkehr und ebenso auf Silica-TLC-Platten). Das methanolunlöslich Material war rötlich braun. Das Material, welches methanollöslich war, erschien nach der Lyophilisation weiß.
Die Kohlenhydratkonzentration wurde nach dem Verfahren von Scott und Melvin (Scott, T. A., und Melvin, E. H. Anal. Chem. 25, 1656 (1953)) bestimmt. Kurzgesagt, wird eine zu testende wäßrige Probe oder Glucose als Standardkohlenhydratlösung (450 ml) mit 900 ul von 0,2% Anthron (w/v) in Schwefelsäure gemischt und für 16 min bei 90-100 C inkubiert. Die dekadische Extinktion wurde bei 625 nm gefunden. Glucose wurde als Standard verwendet.
Die hämolytische Aktivität der Proben wurde wie folgt bestimmt: kurzgesagt, wurden die Proben in einer Rundbodenmikrotiterplatte mit 1 : 2 Verdünnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in aufeinanderfolgenden Reihen (100 ul/ Vertiefung) verdünnt. 10 ul normales Hasenblut in Alsevers-Lösung (Hazelton) wurde zu jeder Vertiefung dazugegeben und gemischt. Die Platten wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend in einem Sorvall RT6000 zentrifugiert, um nichthämolysierte Zellen abzusetzen.
Die Abwesenheit der Hämolyse wurde durch die Anwesenheit eines Kügelchens nichthämolysierter Zellen am Boden der Vertiefung bestimmt.

Beispiel 2

Vergleich von dialysiertem, methanollöslichen Rindenextrakt mit Superfos "Quil-A" durch TLC und HPLC

Superfos "Quil-A" und dialysierte, methanollösliche Komponenten des Rindenextrakts, welche wie in Beispiel 1 präpariert waren, wurden mit Phasenumkehr-TLC, wie im Beispiel 1 beschrieben, verglichen. Alle Bänder, die im Rindenextrakt nach der Dialyse und Solubilisation mit Methanol vorhanden waren, waren auch in "Quil-A" vorhanden. Zusätzlich enthielt "Quil-A" ein Band mit rf = 0 auf Phasenumkehr-TLC-Platten; diese Komponente wurde durch die oben beschriebene Methanolsolubilisation entfernt. Die Ähnlichkeit in der Zusammensetzung von dialysiertem, methanollöslichem Rindenextrakt und "Quil-A" wurde durch HPLC bestätigt. Die einzelnen Komponenten des Rindenextrakts waren durch Phasenumkehr-HPLC auf Vydac C&sub4; (5 um Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID · 25 cm L) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, v/v) trennbar. Der Brechungskoeffizient der einzelnen Bestandteile wurde bestimmt. Fig. 1 stellt das Brechungskoeffizientenprofil der Spitzen (benannt QA-1 bis QA-22 in der Ordnung ansteigender Retentionszeiten) vom RP-HPLC dar. Das relative Verhältnis von jeder Spitze in Rindenextrakt und in Superfos "Quil-A" ist in untenstehender Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Relatives Verhältnis der HPLC-Anteile von Saponinrohextrakt und Superfos "Quil-A" (Brechungskoeffizient)
Die individuellen Spitzen stehen in Übereinstimmung mit einzelnen Dünnschichtchromatographiebändern auf Phasenumkehr-TLC-Platten. Ein anderes typischen Experiment, das in Fig. 2 gezeigt wird, demonstriert, daß die Spitzen des Brechungskoeffizienten auch mit den Kohlenhydratspitzen übereinstimmen, was bestätigt, daß alle wesentlichen Komponenten des Rindenextrakts Glycoside (HPLC Anteile analysiert auf Kohlenhydrate durch die Anthronanalyse) sind.
Dialysiertes, methanollösliches Rindenextrakt und "Quil-A" wurden in diesem HPLC- System direkt verglichen. Die einzelnen Komponenten wurden durch die Retentionszeit identifiziert. Alle Spitzen, die in dialysiertem, methanollöslichen Rindenextrakt vorhanden waren, waren auch in "Quil-A" in ähnlichen Verhältnissen mit der Ausnahme eines höheren Verhältnisses der Komponente QA-8 und eines geringeren Verhältnisses der Komponente QA-17 in Superfos "Quil-A", verglichen mit dem Rindenextrakt, vorhanden. Fig. 3 zeigt einen Vergleich von dialysiertem, methanollöslichen Rindenextrakt mit Superfos "Quil-A" unter Verwendung eines semipräparativen Vydac C&sub4; (10 mm ID · 25 cm L, 330 Å Porengröße, 5 um Teilchengröße). Der Probe wird 50% Methanol in 40 mM Essigsäure zugesetzt und ein Methanolgradient in 40 mM Essigsäure wird verwendet (dargestellt in Fig. 3), um die Proben zu eluieren. Die dekadische Extinktion wurde bei 214 nm gefunden. Verschiedene Proben von Quillaja Rinde wurden extrahiert und mit HPLC analysiert.
Es wurde einiges an Unterschiedlichkeit der relativen Verhältnisse der einzelnen Spitzen gefunden, es waren aber immer dieselben Spitzen vorhanden. Es ist derzeit nicht bekannt, ob die Unterschiedlichkeit in den Verhältnissen auf Unterschiedlichkeiten in der Effizienz des Extraktionsprozesses oder auf Rinde verschiedener Quellen zurückzuführen ist.
Aufgrund der bequemen Verfügbarkeit von "Quil-A" und der dem Rindenextrakt ähnlichen Zusammensetzung wurde "Quil-A" verwendet, um mg-Mengen von Material herzu stellen. Adjuvansaktivität in Mäusen unter Verwendung von BSA als Antigen wurde als den Spitzen 4, 7, 11, 12, 1 S. 16, 17, 18, 19 und 20 (Tabelle 2) bei Dosierungen von 3,0 ug Kohlenhydrat (bestimmt mit der Anthronanalyse) zugehörig gefunden. Die von der Antigen- spezifische Antikörper-Bindung (zwei Wochen Postimmunisation, bestimmt durch ELISA) bei einer Serumverdünnung von 1 : 10 abhängige dekadische Extinktion liefert eine semiquantitative Schätzung der Adjuvantienaktivität (im Bereich von 0,07 bei in Abwesenheit von Adjuvantien immunisierten Mäusen bis zu 1,24 bei unter Vorhandensein von QA-20 immunisierten Mäusen). Tabelle 2: Adjuvantienaktivität in Mäusen
*Die dekadische Extinktion ist abhängig von der Antigen-spezifischen Antikörper- Bindung bei einer Serumsverdünnung von 1 : 10.
Aufgrund des Übergewichtes der Spitzen QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 im Rindenextrakt wurden diese vier Komponenten in einem größeren Rahmen geläutert, wie in den untenstehenden Beispielen 3 und 4 beschrieben ist. QA-18 ist für Vergleichszwecke vorgesehen.

Beispiel 3

Läuterung mit Silikachromatographie

1 Gramm "Quil-A" wurde in 75 ml Methanol suspendiert, für 15 Minuten auf 60ºC erhitzt und filtriert. Das ungelöste Material wurde ein zweites Mal mit 50 ml Methanol bei 60 ºC extrahiert und filtriert. Die Filtrate wurden auf einem Rotoevaporator zur Trockne eingedampft. Eine Lichropep Silica Si60 Säule (E. M. Science, 25 mm ID · 310 m L, 40-63 um Teilchengröße) wurde vorabgeglichen in 40 mM Essigsäure in Chloroform/Methanol/Wasser (62/32/6, v/v/v).
Das getrocknete "Quil-A", eine Saponinenrohmischung, wurde in 5 ml Säulenlösungsmittel gelöst und durch das Silikat isokratisch in diesem Lösungsmittelsystem bei einer Durchflußrate von 1 ml/min eluiert. Kohlenhydratanalysen, Dünnschichtchromatographie und HPLC wurden verwendet, um die Anteile von QA-7, QA- 17, QA-18 und QA-21 aufzuzeigen. Die Anteile 19-30 wurden in QA-21 angereichert und für die weitere Läuterung von QA-21 zusammengefaßt. Die Anteile 31-60 wurden in QA-8 und QA-18 angereichert und zur weiteren Läuterung dieser Komponenten zusammengefaßt. Die Anteile 85-104 wurden mit QA-7 und QA-17 angereichert und zur weiteren Läuterung dieser Komponenten zusammengefaßt. Diese Zusammenfassungen wurden vor der weiteren Läuterung schnellverdampft.

Beispiel 4

Weitere Läuterung durch phasenumkehr-hplc

Die Silikatanteile wurden weiter geläutert durch semipräparative Phasenumkehr- HPLC auf Vydac C&sub4; (10 mm ID · 25 cm L), Fig. 4. Silikatanteile (10-20 mg) wurden im entsprechenden Lösungsmittel gelöst und auf Vydac C&sub4; gebracht. Ein Methanolgradient wurde verwendet, um die Anteile zu eluieren. Die Durchflußrate war 3 ml pro Minute. Die Anteile wurden bei einer dekadischen Extinktion von 214 nm festgestellt. Fig. 4B zeigt die Läuterung von QA-21 aus den Silikatanteilen 19-30 unter Anwendung isokratischer Separation in 40 mM Essigsäure in 58% Methanol/42% Wasser. Die Anteile, welche mit einer Retentionszeit zwischen 65 und 72 Minuten eluierten, wurden durch Phasenumkehr- TLC als QA-21 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Fig. 4C zeigt die Läuterung von QA-18 von den Silikatanteilen 31-60 unter Verwendung eines Methanolgradienten in 40 mM Essigsäure (50-56% Methanol/0-10 min. 56-69% Methanol/10-79 min). Die Anteile, die mit einer Retentionszeit zwischen 46 und 48 Minuten eluierten, wurden durch Phasenumkehr-TLC als QA-18 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Fig. 4D zeigt die Läuterung von QA-7 und QA-17 aus den Silikatanteilen 85-104 unter Verwendung desselben Gradienten, wie er in Fig. 4C verwendet wurde. Anteile, die mit einer Retentionszeit zwischen 21 und 23 Minuten eluierten, wurden durch Phasenumkehr-TLC als QA-7 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Anteile, die mit einer Retentionszeit zwischen 44 und 46 Minuten eluierten, wurden durch Phasenumkehr-TLC als QA-17 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt.

Beispiel 5

Reinheit und Charakterisierung der durch Silika- und Phasenumkehrchromatographie geläuterten Adjuvantien

Reinheit

Fig. 5a zeigt eine Phasenumkehr-TLC (E. M. Science RP-TLC, C8 (Lösungsmittel = 70% Methanol, Visualisierungsspray = Bial's Reagens)). Jeweils 5 ug von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, welche entsprechend der Beispiele 3 und 4 geläutert worden waren, wurden chromatographiert. Jedes der Adjuvantien erschien als Einzelband in diesem TLC System.
Fig. 5b zeigt die Anteile QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und "Quil-A" auf EM Si60 HPTLC Platte (Lösungsmittel = 40 mM Essigsäure in Chloroform/Methanol, H&sub2;O (60/45/10, v/v/v), Visualisierungsspray = Bial's Reagens). Jeweils 2 ug von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, gereinigt wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben, und 20 ug "Quil-A", ein Saponinrohextrakt, wurden chromatographiert. Das HPLC-gereinigte Material erschien überwiegend als Einzelband.

Spektroskopie

Die UV-Spektren von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 in Methanol sind in dieser Reihenfolge in den Fig. 6A-D gezeigt. Dalsgaards (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavica Supp. 69 : 1-40 (1978)) Adjuvantienanteil hatte eine Spitze der dekadischen Extinktion bei 280 nm; wie auch immer, die HPLC-gereinigten Anteile der vorliegenden Erfindung haben nicht diese Spitze bei 280 nm, haben aber eine wesentliche Spitze zwischen 200 und 220 nm mit einer bei 260 nm zentrierten Schulter.
Fouriertransformation-Infrarotresonanz ("FT-IR")-Spektren zeigten geringe Unterschiede zwischen den Adjuvantien, was die Vermutung nahelegt, daß alle dieselben Funktionalgruppen haben. Obwohl eine Identifikation der Struktur nicht vom IR gemacht werden kann, sind die Spektraldaten konsistent mit der Anwesenheit einer Carboxylgruppe, wie es von Dalsgaard (Dalsgaard, K., supra) vermutet wurde.
'H-NMR der geläuterten Saponine in CD&sub3;OD bei 250 MHz zeigt die komplexe Natur der geläuterten Saponine QA-7 (Fig. 7A), QA-18 (Fig. 7B) und QA-21 (Fig. 7C). Die Signale im Bereich zwischen 4,1 und 5,4 ppm demonstrieren klar die Anwesenheit von Vielfachsignalen von den anomeren Protonen der Monosaccharide, was eine Vielzahl von verbliebenen Monosacchariden anzeigt. Wie auch immer, die NMR Spektren der Saponine sind zu komplex, um eine Strukturbestimmung zu ermöglichen.
MS-FAB der geläuterten Saponine QA-7, QA-17 und QA-21 (Fig. 8A, 8B, 8C, in dieser Reihenfolge) zeigten ungefähr entsprechende pseudomolekulare Ionenmassen von 1870, 2310 und 1988. MS-FAB wurde von QA-18 auf Grund der Schwierigkeiten beim Lösen dieser Komponente nicht bestimmt. Diese Molekulargewichte sind in Übereinstimmung mit den für ein Triterpen, welches mit acht bis zehn Monosaccharidresten verbunden ist, erwarteten und sind im gleichen Bereich der monomeren Molekulargewichte, die durch Größenausschluß-HPLC von gereinigten Saponinen in Methanol (Zorbax PSM 60 Si Säule, 25 cm · 6,2 mm, 1 ml/min Durchflußrate, Molekulargewichtsstandard = 18-β- Glycyrrhetinsäure und Ginenosid Rb&sub1;) bestimmt wurden, was ungefähre Molekulargewichte von 2600, 2400, 1800 und 2400 für QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 ergab. Der Unterschied zwischen FAB-MS und Größenausschluß-HPLC sind höchstwahrscheinlich auf Unterschiede in der Form zwischen den Saponinen und den Molekulargewichtsstandards zurückzuführen.

Kohlenhydratzusammensetzung

Die untenstehende Tabelle 3 zeigt die Kohlenhydratzusammensetzung und die Bindungsanalyse der geläuterten Saponine QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und QA-19. Das Kohlenhydrat in den Saponinen wurde durch Erwärmen von 0,2 mg Saponin in 0,3 ml 2 N Trifluoressigsäure, welche 0,1 mg/ml Inosit enthielt, für zwei Stunden bei 120ºC in Alditolazetat umgewandelt. Die Säure wurde mit einem Luftdurchfluß entfernt, verbleibende Säure wurde durch Zugabe von Isopropanol (2 · 0,25 ml) und anschließendem Trockenblasen mit Luft entfernt. Der erhaltene Trockenrückstand wurde in 1 M Ammoniumhydroxid (0,25 ml), welches 10 mg/ml Natriumbordeuterid enthielt, gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Eisessig (0, I ml) wurde hinzugegeben und die Lösung trockengeblasen. Verbleibende Borate wurden durch Mitdestillation mit 10% Essigsäure in Methanol (3 · 0,25 ml) und anschließend mit Methanol (2 · 0,25 ml) entfernt. Der Trockenrückstand in Essigsäureanhydrid (0,1 ml) und Pyridin (0,1 ml) wurde für 20 Minuten bei 120ºC erwärmt. Toluol (9,02 ml) wurde der abgekühlten Lösung zugegeben und die Lösungsmittel mit Luftdurchfluß entfernt. Dieses Verfahren der Zugabe von Toluol und Entfernung von Pyridin und Essigsäureanhydrid wurde zweimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (0,5 ml) aufgenommen und mit Wasser extrahiert (0,5 ml). Die organische Phase wurde in eine saubere Röhre transferiert und getrocknet. Vor der GLC-Analyse (Flüssigkeits-Gas-Chromatographie) wurde der Rückstand in Azeton (0,1 ml) aufgelöst. Die Alditolazetate wurden auf einer SP2330 Kapillar-GLC Säule (30 m · 0,25 mm) bei 235ºC mit einem Flammen-Ionisations-Detektor analysiert. Die Kohlenhydrate in den Saponinen wurden in trimethylsilatierte Methylglycoside durch Erhitzen von 0,1 mg der Probe in 50 ug/ml Inositol enthaltender methanolischer HCl (0,3 ml) für 16 Stunden auf 80ºC umgewandelt. Die Probe wurde trockengeblasen und verbleibende Säure durch Zugabe von t- Butyl-Alkohol (2 · 0,25 ml) und anschließender Trocknung mit Luftdurchfluß entfernt. Der Trockenrückstand wurde in einer Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorosilan (5 : 1 : 0,5 v/v, "Tri-Sil") enthaltenden Lösung (0,2 ml) aufgelöst und für 20 Minuten auf 80ºC erhitzt. Das silylierende Reagens wurde bei Raumtemperatur verdampft und der Rückstand in Hexan (1 ml) aufgelöst. Nach Entfernen des unlöslichen Rückstandes durch Filtration unter Verwendung eines Glaswollbausches wurde das Filtrat in eine reine Röhre transferiert und eingedampft. Vor der GLC-Analyse wurde der Rückstand in Hexan (0,2 ml) aufgelöst. Die trimethylsilatierten Methylglycoside wurden auf einer GLC Säule von geschmolzenem Silikat DB1 (25 m · 0,25 mm) für 3 Minuten bei 160ºC und anschließend mit einer Zunahme von 2º/min auf 200ºC und dann mit einer Zunahme von 10º/min auf 260ºC mit einem Flammen- Ionisations-Detektor analysiert.
Glycosidbindungsanalysen wurden mit der folgenden Methode durchgeführt: Zu der in trockenen Dimethylsulfoxid (0,2 ml) aufgelösten Probe (~1 mg) wurden 0,2 ml Kalium- Dimethylsulfinyl-Anion (2 M) beigegeben und die Mischung für 12 Stunden unter Argon gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Eis gekühlt, und Methyliodid (0,2 ml) wurde tröpfchenweise beigegeben. Die verbleibende Mischung wurde beschallt und bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Das methylierte Material wurde unter Verwendung von Sep-Pak C18 Kartuschen, die mit Äthanol (20 ml), Azetonitril (8 ml) und Wasser (10 ml) konditioniert waren, isoliert. Wasser (1 ml) wurde der Methylationsreaktionsmischung zugegeben und der Überschuß von Methyliodid mittels Stickstoffdurchgang durch die Lösung entfernt. Die klare Lösung wurde auf eine mit Wasser (8 ml) und 20% Azetonitril (5 ml) gewaschene Kartusche aufgebracht. Das methylierte Material wurde von der Kartusche mit 100% Azetonitril (4 ml) und Äthanol (4 ml) eluiert. Die Lösungsmittel wurden mittels Luftdurchfluß entfernt. Das getrocknete methylierte Material wurde mit 0,3 ml "Super Deuterid"-Lösung bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt, um die Uronsäurerückstände zu den entsprechenden Hexosen zu reduzieren. Nach Zerstörung der Überschußreagens mit Eisessig (0,1 ml) wurde die Reaktionsmischung mit 10% Essigsäure/Methanol trockengeblasen und zwei weitere Male trockengeblasen. Das verbleibende reduzierte methylierte Material wurde durch eine Dowex - 50 W(H&spplus;) Säule geschickt, und der erhaltene Abfluß wurde getrocknet. Das reduzierte methylierte Material wurde, wie im obenstehenden Abschnitt 1 beschrieben, in methylierte Alditole umgewandelt und mittels GLC (SP 2330 Säule mit geschmolzenem Silikat (30 m · 0,25 mm), 3 min bei 170 ºC gefolgt von 4º/min auf 240ºC) und GLC-MS (SP 2330 Säule mit geschmolzenem Silikat (30 m · 0,25 mm), 2 min bei 80ºC, gefolgt von 30º/min auf 170ºC, gefolgt von 4º/min auf 240ºC, gefolgt vom Halten der Temperatur bei 240ºC für 10 min. Massenspektrenanalysen mittels Hewlett-Packard MSD) analysiert.
Trotz der Ähnlichkeit in der Kohlenhydratzusammensetzung kennzeichnen feine Unterschiede die einzelnen Saponine, insbesondere die Abwesenheit von Arabinose in QA-7 und verminderte Glucose in QA-21, verglichen mit den anderen Saponinen. Tabelle 3: Kohlenhydratzusammensetzung und Bindungsanalyse der geläuterten Saponine
a Alditolazetat (ug/mg Saponin)
b Trimethylsiliertes Methylglucosid (relative Verhältnisse)
c T-terminale Glycosilrückstände, das heißt, durch C-1 gebunden, mit keinen anderen gebundenen Rückständen
3,4 = ein Glycosilrückstand, durch C-1 gebunden, mit anderen Glycosilrückständen glycosidisch gebunden durch C-3 und C-4.
d Nicht geprüft
e Schwache Erholung als Alditolazetat

Charakterisierung der Saponine als Detergentien

Die kritische mizellare Konzentration der Adjuvantien QA-7, QA-17, QA-18 und QA- 21 wurde mit der Methode von DeVendittis et al. (DeVendittis, E., Palumbo, G., Parlato, G. und Bocchini, V. (1981) Anal. Biochem. 115, 278-286) wie folgt bestimmt: Das Emissionsspektrum von 1-Anilonaphthalin-8-Sulfonäure (ANS) in Wasser wurde bei Adjuvans-Trockengewichtskonzentrationen im Bereich von 0,01 bis 0,10% (w/v) bestimmt, um den Bereich unter und über der kritischen mizellaren Konzentration abzudecken. Oberhalb der kritischen mizellaren Konzentration nimmt die Fluoreszenzausbeute von ANS zu und die Wellenlänge der maximalen Emission, verursacht durch die Partitionierung des Fluoreszenzfarbstoffes in den Mizellen, ab. Ähnliche kritische mizellare Konzentrationen wurden für QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 in Wasser gefunden (0,06%, 0,06%, 0,04% und 0,03%, in dieser Reihenfolge) mit leicht geringeren Konzentrationen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bestimmt wurden (0,07%, 0,03%, 0,02% und 0,02%, in dieser Reihenfolge).
Fig. 9 zeigt den Gelfiltrationschromatographen für, aus geläuterten QA-18 und QA- 21 (auf Bio-Gel P-200 (6,6 mm ID · 90 cm ht)) geformten Mizellen (vorabgeglichen in einer Konzentration von gereinigtem Saponin, die gleichwertig der kritischen Mizellkonzentration dieses Saponins in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ist, um das Monomermizellgleichgewicht am Verringern des sichtbaren Radius der Mizellen zu hindern). QA-18 und QA-21 Mizelle eluierten mit einer Größe, die ähnlich zu der des Proteinrinderserums Albumin ist.
Die hämolytische Aktivität der Adjuvantien wurde mit folgender Methode bestimmt: Verdünnungen der Adjuvantien QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A" wurden auf einer Rundbodenmikrotiterplatte (75 ul pro Vertiefung) gemacht. Dreimal mit PBS gewaschene rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) wurden mit PBS auf 4% verdünnt. SRBC (25 ul) wurden in jeder Vertiefung dazugegeben und mit Adjuvans gemischt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten bei 1000 Umdrehungen/min 5 min gesponnen in einem Sorvall RT-6000, H-1000 Rotor, um nichthämolysierte Zellen abzusetzen. 50 ul des obenstehenden Materials jeder Vertiefung wurde in derselben Vertiefung einer Flachbodenmikrotiterplatte transferiert und auf 200 ul mit H&sub2;O verdünnt. Die dekadische Extinktion wurde bei 570 nm mit einem Dynatech Mikrotiter-Plattenleser bestimmt (Fig. 9). Die Hämolyse erhöhte die dekadische Extinktion bei 570 nm, verursacht durch die Freisetzung von Hämoglobin aus den abgesetzten Zellen. Signifikante Unterschiede in der Hämolyse zwischen den Adjuvantien wurden beobachtet. QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A" verursachten partiale Hämolyse bei niedrigen Konzentrationen von 25 ug/ml, während bei QA-8 partiale Hämolyse bei 150 ug/ml beobachtet wurde. Bei QA-7 wurde bei den untersuchten Konzentrationen (200 ug/ml und weniger) keine Hämolyse beobachtet.

(vergleichendes) Beispiel 6

Isolierung der toxischen Komponente QA-19

Die toxische Komponente QA-19 cochromatographiert mit QA-18 auf Silikat und ist in den Silikatanteilen 31-60 angereichert. Diese Anteile wurden zusammengefaßt und vor der weiteren Läuterung schnellverdampft. Fig. 4C zeigt die Separation von QA-19 aus QA-18 durch Phasenumkehr-HPLC auf Vydac C&sub4; (10 mm ID · 25 cm L) unter Anwendung eines Methanolgradienten. Anteile, welche mit einer Retentionszeit zwischen 50 und 52 Minuten eluierten, wurden mit Phasenumkehr-TLC und analytischer HPLC als QA-19 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. QA-19 konnte weiters in zwei Spitzen durch erneute Läuterung in einem seichteren Methanolgradienten aufgelöst werden, wobei die Spitze mit der kürzeren Retentionszeit mit QA-19a und die Spitze mit der längeren Retentionszeit mit QA-19b bezeichnet wurde. Kohlenhydratanalysen der Spitze QA-19a, welche in Mäusen toxischer ist als QA-19b, zeigte eine Kohlenhydratzusammensetzung, welche zu der der anderen Saponine ähnlich ist (Tabelle 3).

(vergleichendes) Beispiel 7

Isolierung des alkalischen Hydrolyseprodukts

Die Bearbeitung von QA-18 mittels kurzer alkalischer Hydrolyse lieferte ein kohlenhydrathältiges, alkalisches Haupthydrolyseprodukt (als QA-18 H bezeichnet). Geläutertes QA-18 H wurde aus QA-18 präpariert und in der folgenden Art isoliert:
Ein ml QA-18 (5 mg/ml) wurde mit 25 ul 1 N NaOH für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 ul 1 N Essigsäure gestoppt. Unter Verwendung dieser Hydrolysebedingungen wurde QA-18 zur Gänze in ein Haupthydrolyseprodukt (QA-18 H) umgewandelt, welches in einer Spitze mit der Retentionszeit von 8,0 min. verglichen mit 66,8 min für nichthydrolysiertes QA-18, eluierte, was die erhöhte Hydrophilizität von QA-18 H anzeigte (Chromatographie auf Vydac C&sub4; (4,6 mm ID · 25 cm L) in 0,1% Trifluoroessigsäure in 55/45 Methanol/Wasser (v/v) und eluiert in einem Gradienten von 64/36 Methanol/Wasser (v/v) über 180 Minuten, Durchflußrate von 1 ml/Minute). Die reines QA-18 H enthaltende Spitze (Retentionszeit 8,0 min) wurde zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Das QA-21 H bezeichnete Hydrolyseprodukt von QA-21 wurde in derselben Art präpariert und geläutert. QA-21 H hat eine Retentionszeit von 9,3 Minuten, verglichen mit den 80,4 Minuten von nichthydrolysiertem QA-21. Es wurde mittels Retentionszeit bei HPLC und Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie gezeigt, daß diese Hydrolyseprodukte identisch zu den Haupthydrolyseprodukten sind, die mit dem Verfahren von Higuchi et al., Phytochemistry 26 : 229 (1987), welches schwach alkalische Hydrolyse in NH&sub4;HCO&sub3; verwendet, hergestellt wurden (Tabelle 4). Zusätzlich wurde gezeigt, daß diese Produkte, QA-18 H und QA-19 H, die Hauptzerlegungsprodukte der Hydrolyse von "Quil-A", einer QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 und andere Saponine enthaltenden Saponinrohmischung darstellen, was bedeutet, daß die Hydrolyseprodukte QA-21 H und QA- 18 H dieselben Hydrolyseprodukte sind wie die von Higuchi et al., supra, zur Strukturbestimmung isolierten. QA-18 H und QA-21 H wurden zur weiteren Bestimmung der Adjuvantienaktivität gesammelt.

Tabelle 4

Retentionszeit der alkalischen Haupthydrolyseprodukte

QA-17 H 8,0a
QA-18 H 8,0a
8,2b
QA-21 H 9,3a
9,5b
Hydrolysiertes "Quil-A" 8,2a, 9,3a
a Cambridge BioScience Hydrolysebedingungen: 5 mg/ml Saponin, pH 13, Reaktionszeit 15 Minuten bei Raumtemperatur
b Higuchi et al. Hydrolysebedingungen: 5 mg/ml Saponin, 6% NH&sub4;HCO&sub3;, Methanol/H&sub2;O (1/1, v/v), Reaktionszeit 60 Minuten bei 100ºC
HPLC Bedingungen: Vydac C&sub4;, 5 um Teilchengröße, 300 Å
Porengröße, 0; 46 · 25 cm
Lösungsmittel A = 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Lösungsmittel B = 0,1% Trifluoressigsäure in Methanol
Gradient = 55-64% B/ 180 Minuten
Durchflußrate = 1 ml/min

Beispiel 8

Untersuchung auf Adjuvantieneffekte unter Verwendung von BSA als Antigen

In Kürze gesagt, wird der Adjuvantieneffekt aus einer Zunahme der Antigen- spezifischer Antikörpertiter, verursacht durch die Addition von Potentialadjuvans in den Immunisierungsansatz, geschätzt. Die Zunahme der Titer rührt von einer Zunahme der Antikörperkonzentrationen und/oder der Antigen/Antikörperaffinität her. Adjuvantieneffekte der Saponine sind bisher durch die Zunahme im Titer von neutralisierenden Antikörpern zu Maul- und Klauenseucheimpfstoffen in Guineaschweinen (Dalsgaard, K., Archiv. für die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974)), Zunahme im Titer von ausgefällten Antikörpern zu BSA (wie mittels Radialimmundiffusion gemessen wurde) in mit BSA/Saponinmischungen geimpften Guineaschweinen (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavia 69, 1-40 (1978)) und auch durch die Zunahme im Titer von Anti-Keyhole- Limpet-Hämocyanin (KLH) Antikörper (gemessen mittels ELISA) in mit KLH/Saponin immunisierten Mäusen (Scot, M. T., Gross-Samson, M., und Bomford, R., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77 : 409-412 (1985)) gemessen worden.
In dieser Studie erfolgte die Bewertung der Adjuvantieneffekte durch die Zunahme der Anti-BSA Antikörper, die der Immunisierung mit BSA/Saponin folgte, verglichen mit der Immunisierung mit BSA in Abwesenheit von Saponin. Die Adjuvantienaktivität im geläuterten Anteil wurde wie folgt gemessen: CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit folgendem Ansatz immunisiert: 10 ug BSA (Sigma 7030, fettsäurefrei) und Quillaja Adjuvans (mit Dosierungen im Bereich von 1,5 bis 45 ug Kohlenhydrate, gemessen mit Anthron) in 200 ul PBS. Die Seren wurden zwei Wochen nach der Immunisierung gewonnen. Anti-BSA Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt: Immulon II Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit 100 ul fettsäurefreier BSA (10 ug/ml in PBS) in Reihen A, C, E und G beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen. Nichtspezifische Bindung wurde durch Inkubation für 1,5 h bei 37ºC mit 100 ul Verdünnungsmittel (2% Kaseinsäurehydrolysat (Oxoid, w/v) in PBS) pro Vertiefung in allen Vertiefungen verhindert. Die Platten wurden viermal mit 0,05% Tween 20 in destilliertem Wasser gewaschen. Seren mit Verdünnungen von 10, 102, 103 und 104 wurden in Reihen A+B, C+D, E+F und G+H (100 ul/Vertiefung) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen. Boehringer-Mannheim Meerrettich-peroxydasekonjugiertem Ziegen- Anti-Maus-Antikörper (1/5000 in 5 % BSA in Verdünnung) wurden für 30 min bei Raumtemperatur (100 ul pro Vertiefung, alle Vertiefungen) inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen. Der Überschuß an Peroxydasereaktion wurde durch Reaktion mit 2,2'-Azino-bis(3-äthylbenzthiazolin)-6-Sulfonat (30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur, dekadische Extinktion gemessen bei 410 nm) oder mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (10 min Reaktion bei Raumtemperatur, dekadische Extinktion gemessen bei 450 nm) bestimmt. Der Beitrag von nichtspezifischer Antikörperbindung zur gesamten Antikörperbindung wurde durch Subtraktion der dekadischen Extinktion der Antigen- Negativvertiefung von der dekadischen Extinktion der Antigen-Positivvertiefung für jede Serenverdünnung entfernt. Die durch die antigenspezifische Bindung verursachte dekadische Extinktion wurde als Funktion des Logarithmus der Serenverdünnung aufgetragen (Fig. 11). Typische Äquivalenzpunkttiter wurden typischerweise bei Serenverdünnungen von 10 oder weniger für Immunisierung in der Abwesenheit von Adjuvans und waren in der Höhe von 103 im Beisein von Saponinadjuvans. Dialysierter, methanollöslicher Rindenextrakt bei einer Adjuvansdosierung von 12 ug Kohlenhydrat oder höher (Kohlenhydrat mittels Anthron gemessen) erhöhte die Titer um 2 Größenordnungen verglichen mit BSA in PBS. Ein guter Adjuvanseffekt wurde bei Dosierungen von "Quil-A" zwischen 9 und 23 ug Kohlenhydrat beobachtet.

Beispiel 9

Adjuvantienmessung von HPLC-gereinigten Extraktkomponenten

Durch die in Beispiel 8 beschriebenen Kriterien haben die Spitzen QA-7, QA-11, QA- 12, QA-15, QA-17, QA-18, QA-19 und QA-20 unterschiedliche Ausmaße an Adjuvantieneffekte, wobei QA-15, QA-17, QA-18, QA-19 und QA-20 in diesem speziellen Experiment insbesondere bei Dosierungen von 3,0 ug Kohlenhydrat effektiv sind. Bedingt durch die pro Immunisation verwendete kleine Anzahl von Mäusen (2) und der natürlichen Unterschiedlichkeit in der Immunreaktion zwischen den einzelnen Mäusen kann dieses Experiment nicht dazu verwendet werden, die relativen Adjuvantieneffekte dieser Spitzen quantitativ zu analysieren. Wie auch immer, es liefert eine qualitative Analyse über das Vorhandensein von Adjuvantieneffekten. Es muß darauf hingewiesen werden, daß das Fehlen von sichtbaren Effekten bei QA-2, QA-3, QA-10, QA-13 und QA-14 keinen Adjuvantieneffekt bei unterschiedlichen Adjuvansdosierungen oder bei einem unterschiedlichen Adjuvans-Proteinverhältnis ausschließt.
Weitere Adjuvansuntersuchungen wurden mit QA-7, QA-17 und QA-18 bei verschiedenen Protein-Adjuvansverhältnissen durchgeführt. Allgemein wurde ein guter Adjuvanseffekt bei QA-7, QA-17 und QA-18 beobachtet, wenn ein Protein- Adjuvansverhältnis (Proteingewicht/Kohlenhydratgewicht) von ungefähr 3 : 1 bis 9 : 1 verwendet wurde (Fig. 12). QA-21 (in dieser Studie nur bei einem Protein- Kohlenhydratgewichtsverhältnis von 6 : 1 untersucht) zeigte auch einen Adjuvanseffekt. Dennoch sollte darauf hingewiesen werden, daß das richtige Adjuvans-Proteinverhältnis für eine optimale Immunreaktion eine Funktion sowohl vom besonderen Saponinadjuvans, als auch vom verwendeten besonderen Antigen ist. Die Adjuvansverknüpfung mit dem Antigen spielt eine wichtige Rolle im Aktionsmechanismus des Saponinadjuvanseffektes. Im Fall der Saponinbindung an Protein sind hydrophobische Interaktionen der vorherrschende Faktor. Folglich beeinflussen Unterschiede in der Hydrophobizität der HPLC-geläuterten Adjuvantien die Bindungskonstante der hydrophobischen Proteine. Zusätzlich wird die Zahl der hydrophobischen Bindungsplätze des Proteins die Fähigkeit, mit Saponinadjuvantien zu assonieren, beeinflussen. Folglich ist es notwendig, die optimale Adjuvansdosierung für jedes individuelle Adjuvans und Antigen zu bestimmen. Eine solche Optimierung ist mit durchschnittlicher Facherfahrung möglich.
HPLC-geläuterte Adjuvantien wurden auch mit Freunds Complete-Adjuvans verglichen, und es wurde festgestellt, daß sie in einem ähnlichen Niveau der Immunreaktion resultieren (Fig. 12, Tafel b).

Beispiel 10

Präparation von FeLV rekombinierenden gp70r-delta

Präparation des Einschlußkörpers

Rekombinierende E. coli Klone R16-38 wurden in mit 1% Glucose und 0,1% Kasaminosäuren ergänztem LB-Medium bei 32ºC bis zu einer optischen Dichte (560 nm) von 0,4-0.6 gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf 42ºC gebracht und für weitere 2 Stunden inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 g für 30 Minuten gesammelt, mit 50 Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und abschließend neuerlich in 200 ml 50 Tris-HCl, welcher 1 ml 0,1 M Phenylmethylsulfonylfluorid in Isopropanol (Endkonzentration = 0,5) und 0,4 ml von 5 mg/ml Aprotinin (Endkonzentration = 10,0 ug/ml) beigesetzt waren, suspendiert. Die Zellen wurden durch enzymatische Digestion mit Lysozym (Endkonzentration = 0,5 mg/ml) unter Anwesenheit von 0,2% Tritin X-100 lysiert. Nach 30minütigem Rühren wurden 2 ml MgCl&sub2; (0,5 M), 5 ml DNaseI (1 mg/ml) und 1 ml 0,1 M Phenylmethylsulfonylfluorid beigefügt. Nach weiterem 30minütigem Rühren wurden 40 ml EDTA (0,25 M, pH 7,5) und 4 ml Triton X-100 (10% w/v) zugesetzt. Das Präparat wurde für 30 Minuten bei 4ºC und 10.000 · g zentrifugiert, und die Tabletten wurden neuerlich in 50 ml 50 Tris HCl, pH 7,5, suspendiert. Die Tabletten wurden mit niedrigen Geschwindigkeiten für 15 Sekunden homogenisiert. Lysozym wurde bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml beigefügt, und 0,6 ml von 10% Triton X-100 wurden zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurden 10 ml von MgCl&sub2; (0,5 M) und 1 ml DNaseI (1 mg/ml) zugesetzt und das Rühren wurde für weitere 15 Minuten beibehalten. Nach Einrichten des Volumens mit 50 Tris, pH 9,0 auf 300 ml, wurden 40 ml von 10% Triton X-100 und 51,2 ml von EDTA (0,25 M, pH 7,5) zugesetzt und das abschließende Volumen von 400 ml mit 50 Tris, pH 9,0, eingestellt. Nach 30minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 · g für 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und die Tabletten neuerlich in 400 ml 50 Tris-HCl, pH 7,5, welche 4 M Harnstoff, 50 EDTA und 1% Triton X-100 enthielt, suspendiert. Nach 15mütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 · g und 4ºC für 30 Minuten zentrifugiert, und die Tabletten wurden neuerlich in 400 ml, 0,1 M NaCl enthaltender, 50 Tris-HCl, pH 7,5 suspendiert. Nach 15minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 · g und 4ºC für 30 Minuten zentrifugiert und die Tabletten neuerlich in 400 ml 50 Tris-HCl, pH 7,5, welche 6 M Harnstoff und 5 EDTA enthielt, suspendiert. Nach 15minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 · g und 4ºC für 30 Minuten zentrifugiert. An diesem Punkt wurden die Kügelchen der Einschlußkörper entweder für zukünftige Verwendung eingefroren oder in 50 Tris-HCl, pH 9,5, welche 6 M Guanidin-HCL, 50 EDTA und 0,5% Beta- Merkaptoäthanol enthielt, solubilisiert. Das gp70R-delta Polypeptid wurde dann bei einer der Verfahren des untenstehenden Beispiels 11 geläutert.

Beispiel 11

Läuterung von FeLv rekombinierenden gp70R-delta

Verfahren I

Das solubilisierte Protein vom Beispiel 8 wurde gegenüber 6 M Harnstoff, 50 Tris-Cl, pH 8,0, 5 EDTA und 1 Dithiothreitol (DTT) dialysiert. Ungefähr 120 mg des Proteins auf einer mit demselben Puffer vorabgeglichenen CM-TSK Säule (EM Science, 1,5 cm ID · 4 cm) aufgebracht. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl (0-1,0 M in 150 ml) in demselben Puffer eluiert. Die Anteile wurden gesammelt und mit Elektrophorese auf 10 % SDS-Polyacrylamidgele analysiert. Agalmaschwärzung wurde verwendet, um das gp70R- delta Protein zu identifizieren. Die bei ungefähr 0,1 M NaCl eluierten Anteile 25-31 wurden gesammelt und zur Immunisierung verwendet.

Verfahren II

Um die Hydrophobizität von gp70R-delta zu verringern, wurden die Sulfhydrylgruppen mit Iodidacetamid alkyliert, und die Lysinrückstände wurden mit Citraconsäureanhydrid n-alkyliert. Das wie im Beispiel 8 zubereitete Protein wurde in 6 M Guaninidin-HCl in 50 mM Borat, pH 9,0, 0,5% Beta-Merkaptoäthanol (v/v) solubilisiert. Iodidacetamid wurde zu einem molaren Verhältnis von 1 : 1 (Iodidacetamid: gesamte Sulfhydrylgruppen) zugesetzt. Die Alkylierung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur in der Dunkelheit durchgeführt. Die Alkylierung aller Sulfhydrylgruppen (in den Proteinen und Beta-Merkaptoäthanol) wurde mit DTNB (Ellman's Reagens) überwacht, um eine komplette Alkylierung sicherzustellen. Die Proteinkonzentration wurde auf 2 mg/ml eingestellt.
Die Proteine wurden in der Dunkelheit durch Zugabe von Citraconsäureanhydrid citraconylatiert (0,0022 ml pro mg Protein; ungefähr 50 molaren Überschuß über den freien Lysinen). Das Präparat wurde mehrmals in der Dunkelheit gegenüber 50 mM Borat, pH 9,0, dialysiert. Die Vervollständigung der Acyklierung der Protein-Lysingruppen wurde durch Reaktion mit Trinitrobenzolschwefelsäure (TNBS), welche Rückstände von freien Lysingruppen feststellt, bestimmt. TNBS (200 ul von 10 mM) wurde zu 200 ug alkyliertem, citraconylatiertem, dialysiertem gp70R-delta in 1 ml 50 mM Natriumborat, pH 9,0, zugefügt. Die Mischung wurde für 2 Stunden in der Dunkelheit bei 40ºC inkubiert, die Reaktion mit 0,5 ml von 1 N HCl und 0,5 ml 1% SDS abgeschreckt und die dekadische Extinktion bei 340 nm festgestellt. Die Konzentration der TNP-Lysine wurde unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 10.400 bestimmt.
Die Läuterung des alkylierten, citraconylatierten gp70R-delta wurde bei pH 9,0 durchgeführt, um das Entblocken der Lysingruppen zu verhindern. Harnstoff mit einer Endkonzentration von 4 M wurde dem modifizierten Protein zugesetzt. Das Protein wurde durch Ultrafiltration auf 3 mg/ml konzentriert und auf eine Sepharose 6B-Cl Säule (1,5 · 86 cm) aufgebracht. Das gp70R-delta Protein wurde bei einer Durchflußrate von 6,6 ml/h mit 4 M Harnstoff, 50 mM Natriumborat, pH 9,0, eluiert. Die Anteile (5,3 ml/Anteil) wurden gesammelt, und das gp70R-delta wurde durch Proteinanalyse und SDS- Polyacrylamidelektrophorese in den Anteilen 13-15 bestimmt.
Die Citroconylation von gp70R-delta wurde durch Dialysieren von 5 ml alkylierten, citraconylatiertem gp70R-delta (1,0 mg/ml) gegenüber 6 M Harnstoff in 50 mM Natriumzitrat, pH 5,5, für 48 Stunden bei Raumtemperatur rückgängig gemacht. Das gp70R- delta wurde gegen 6 M Harnstoff in 100 mM Natriumbicarbonat, pH 8,0, dialysiert und die Proteinkonzentration vor der Absorption von Aluminiumhydroxid auf 0,8 mg/ml eingestellt.

Verfahren III

Eine Änderung obiger Läuterung von alkyliertem, cityconylatiertem gp70R-delta wurde entwickelt. Kurzgesagt, ist das alkylisierte, citraconylisierte gp70R-delta wie oben beschrieben, verändert und gegenüber 50 mM Natriumborat, pH 9,0, dialysiert. Harnstoff wurde bis zu einer Endkonzentration von 8,0 M zugesetzt. Das Protein wurde durch Ultrafiltration mit einer PM-30 Membran konzentriert, um 2,5 mg Protein/ml zu liefern. Die Proteinlösung wurde auf einer Sephacryl S-400 Säule (1,5 · 90 cm) in einem 50 mM Natriumboratpuffer, pH 9,0, welcher 8 M Harnstoff enthielt und mit demselben Puffer eluiert war, aufgebracht. Die Anteile (2,9 ml/Anteil) wurden gesammelt und die gp70R-delta enthaltenden Anteile 34-37 wurden zusammenfaßt. Einundzwanzig mg des Proteins dieser Anteile wurden zu einer Endkonzentration von 4 M Harnstoff mit 50 mM Natriumborat, pH 9,0, verdünnt und auf eine DEAE-TSK Säule (1,5 · 11 cm) aufgebracht. Das Protein wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-0,5 M) in 50 mM 4M Harnstoff enthaltendem Natriumborat, pH 9,0, eluiert. Drei ml Anteile wurden gesammelt. Die gp70R-delta enthaltenden Anteile 89-95 wurden zusammengefaßt und 15 mg von gp70r-delta wurden rückgewonnen.

Beispiel 12

Immunisierung mit Aluminiumhydroxidabsorbiertem gp70r-delta

Aluminiumhydroxid, von dem Adjuvanseffekte für viele Proteine gefunden worden waren und das abgekühlt in Impfstoffen verwendet wird, wurde als Träger für gp70R-delta verwendet. Nach dem Verfahren I im obenstehenden Beispiel 11 hergestelltes gp70R-delta wird fest von 10% Aluminiumhydroxid in der Anwesenheit von 50 mM 6M Harnstoff enthaltendem Tris-Cl, pH 8,0, absorbiert. Ungefähr 3 ug gp70R-delta wurden pro 100 ug Aluminiumhydroxid absorbiert. Das vom Aluminiumhydroxid absorbierte gp70R-delta wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, neuerlich in PBS suspendiert und zur Immunisierung von Tieren verwendet.
CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit von Al(OH)&sub3; absorbierten gp70R-delta in einem Gesamtvolumen von 200 ul PBS in An- und Abwesenheit der HPLC- gereinigten Saponine QA-17 oder QA-18 oder einer Mischung von QA-17 und QA-18 immunisiert. Zwanzig bis fünfundzwanzig ug von gp70R-delta wurden pro Dosierung injiziert. Die HPLC-gereinigten Saponine QA-17 oder QA-18 oder eine Mischung von QA-17 und QA-18 wurden bei einer Trockengewichtsdosierung von 10 ug verwendet. Mit jedem Ansatz wurden zwei Mäuse injiziert. Sechs Wochen nach der Erstinjektion wurde den Mäusen eine Verstärkerinjektion von gp70R-delta/Aluminiumhydroxid verabreicht. Die Mausseren wurden auf Reaktivität mit FEA, einer FeLV Untergruppe A, bei 2, 4 und 8 Wochen Postimmunisierung mittels ELISA Immunoanalyse analysiert. Vier Wochen im Anschluß an die Immunisierung wurde eine durch das rekombinierte gp70R-delta hervorgerufene Anti-FeLV-Reaktion beobachtet. Die HPLC-gereinigte Saponinadjuvantien QA-17 und QA-18 verstärkten diese Reaktion. Die Reaktion in Anwesenheit von QA-17, verglichen mit der Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvans war bei vier Wochen Postimmunisierung um zwei Größenordnungen stärker. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Fig. 13 gezeigt.
Anti-FEA Antikörper wurden mittels ELISA-Analyse analysiert. FEA Viren (10 ug/ml in PBS) wurden von Immulon II Platten (100 ug/Vertiefung) über Nacht bei 4ºC absorbiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, und nichtspezifische Antikörperbindung wurde durch Inkubation für 1 Stunde mit 10% normalem Ziegenserum in PBS (100u1/Vertiefung) bei Raumtemperatur unterbunden. Die Platten wurden dann mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser gewaschen. Die Seren wurden in 10% normalem Ziegenserum in PBS verdünnt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf der Platte bei Serenverdünnungen von 10, 102, 103 und 104 (100 ul/Vertiefung) inkubiert. Nach dem Waschen der Platten mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser wurden sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100u1/Vertiefung von peroxydasekonjugiertem Ziegen-Anti-Maus IgG (Boehringer- Mannheim), 1/5000 verdünnt in PBS, inkubiert. Nach dem Waschen der Platten mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser wurde der Betrag der IgG-Bindung durch Peroxidasereaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin aus der auf einem Dynatech Mikrotiterplattenleser bestimmten dekadischen Extinktion bei 450 nm bestimmt.

Beispiel 13

Immunisierung mit Aluminiumhydroxidabsorbiertem, alkylisiertem gp70r-delta

CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit 15 ug/Dosierung von alkylisiertem, nach dem Verfahren II des Beispiels 11 (von Aluminumhydroxid absorbiert, wie im Beispiel 12 beschrieben) geläutertem gp70R-delta in 200 ul PBS immunisiert. HPLC- gereinigte Adjuvantien QA-7, QA-17, QA-18 und Mischungen dieser drei Adjuvantien wurden bei Trockengewichtsdosierungen von 10 ug verwendet. Mit jedem Ansatz wurden drei Mäuse injiziert. Die Mausseren wurden mit ELISA bei 2 und 4 Wochen Postimmunisierung wie im Beispiel 10 beschrieben, auf Reaktivität auf FEA analysiert. Wie bei der Immunisierung mit unverändertem gp70R-delta im Beispiel 10 gezeigt wurde, ruft die Immunisierung mit alkylisiertem gp70R-delta eine virale Anti-FeLV Reaktion bei vier Wochen Postimmunisierung hervor. Die HPLC-gereinigte Adjuvantien QA-7, QA-17, QA-18 verstärken alle die Immunreaktion, verglichen mit der Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvantien. QA-17 und Mischungen von QA-17 und QA-18 induzierten die stärksten Reaktionen, induzierten beinahe zwei Größenordnungen stärkere Äquivalenzpunkttiter als die Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvantien. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 14 zusammengefaßt.

Beispiel 14

Toxizität von QA-7, QA-17, QA-18, QA-19, QA-21, "Quil-A"

Mit Quillaja Rohsaponin erscheint die Nekrose der Leber als ein Hauptsymptom der Toxizität. Gereinigte Saponine wurden Mäusen injiziert, um die Effekte auf die Leber zu bestimmen. Die Mäuse wurden intradermal mit jeweils 150 ug QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und "Quil-A", dem Saponinrohextrakt, das als Rohmaterial für die Läuterung der anderen Komponenten verwendet wurde, injiziert. Mit QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 injizierte Tiere erschienen anfangs leicht krank, schienen sich aber innerhalb weniger Stunden nach der Injektion voll zu erholen. "Quil-A" verursachte schwere Symptome, die über 48 Stunden andauerten. Alle Mäuse wurden nach 48 Stunden zur Post-mortem-Untersuchung der Leber geopfert. "Quil-A" verursachte eine schwere Schädigung der Leber, wobei eine akute Nekrosis in Flächen mit unterschiedlicher Stärke offensichtlich war. Es hatte den Anschein, daß QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 die Leber nicht signifikant beeinflußten. QA-17 und QA-18 wurden auch in Kätzchen mit subcutaner Injektion von jeweils 100 ug bei 8 und 10 Wochen getestet, wobei klinisch oder in der chemischen Blutzusammensetzung keine Toxizität beobachtet werden konnte. Im Gegensatz dazu induzierte "Quil-A" eine pyrogene Reaktion, welche in den Kätzchen einige Stunden andauerte. Folglich erschienen die geläuterten Saponine sowohl in Mäusen und Kätzchen weniger toxisch als "Quil-A" zu sein, was andeutete, daß der Reinigungsprozess diese Saponine von einer oder mehreren, im Quillaja Rohextrakt vorkommenden toxischen Komponenten trennt. Eine dieser toxischen Komponenten wurde vorläufig als QA-19 identifiziert; Dosierungen von 50 ug oder mehr waren in Mäusen innerhalb weniger Tage nach der Injektion tödlich. Weitere Läuterung von QA-19 zeigte, daß es in zwei Spitzen, QA-19a und QA-19b getrennt werden konnte. QA-19a war in Mäusen bei Dosierungen von 100 ug oder mehr tödlich, während QA-19b offensichtlich bis zu Dosierungen von 150 ug nicht tödlich war; folglich kann ein, eine erhöhte Toxizität in der Mischung von QA-19a und QA-19b hervorrufender synergetischer Effekt nicht ausgeschlossen werden. Eine vorläufige Klassifizierung anderer kleinerer, von "Quil-A" isolierter Spitzen deutete darauf hin, daß die anderen Anteile auch toxisch sein könnten. Folglich erlauben die Läuterungsverfahren die Trennung der adjuvansaktiven Saponine von ähnlichen, aber unterschiedlichen Zusammensetzungen, welche toxischer sind oder welche mit toxischen Verseuchungsstoffen cochromatographieren.

(vergleichendes) Beispiel 15

QA-18H und QA-21H, welche wie im Beispiel 7 beschrieben vorbereitet wurden, wurden auf Adjuvanseffekte mit BSA im direkten Vergleich mit dem nichthydrolysierten Originalprodukten QA-18 und QA-21, die wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben vorbereitet waren, getestet. QA-18 und QA-21 erhöhen die Immunreaktion der Körperflüssigkeiten auf BSA in Mäusen zumindest um eine Größenordnung bei zwei Wochen Postimmunisierung. Wie auch immer, die Hydrolyseprodukte QA-18H und QA-21H erhöhen die Reaktion bei der gleichen Gewichtsdosierung nicht signifikant (Fig. 15). Folglich wird der optimale Adjuvanseffekt bei den intakten Saponinen beobachtet; die wesentliche für eine Adjuvantienaktivität notwendige Struktur geht verloren oder wird geändert, wenn QA-18 und QA-21 zu QA-18H und QA-21H hydrolysiert werden.

Claims

1. Im wesentlichen reines Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin bei der Analyse des Extraktes durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit einer Korngröße von 5 um, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser · 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als Spitze erscheint, wobei das Saponin Immunadjuvansaktivität aufweist und als Adjuvans weniger toxisch ist als das Quillaja saponaria-Extrakt, zur Verwendung als ein Immunadjuvans.

2. Im wesentlichen reines QA-7 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4- Säule mit einer Korngröße von 5 um, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser · 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als eine Spitze aufscheint, die in Fig. 1 als QA-7 gekennzeichnet ist.

3. Im wesentlichen reines QA-7 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin eine angezeigte ungefähre pseudomolekulare Ionenmasse von 1870 durch Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen (MS- FAB) aufweist.

4. Im wesentlichen reines QA-17 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4- Säule mit einer Korngröße von 5 um, 330 A Poren, 4,6 mm Innendurchmesser · 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als eine Spitze aufscheint, die in Fig. 1 als QA-17 gekennzeichnet ist, zur Verwendung als ein Immunadjuvans.

5. Im wesentlichen reines QA-17 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin eine angezeigte ungefähre pseudomolekulare Ionenmasse von 2310 durch Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen (MS- FAB) aufweist, zur Verwendung als ein Immunadjuvans.

6. Im wesentlichen reines QA-21 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4- Säule mit einer Korngröße von 5 um, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser · 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als eine Spitze aufscheint, die in Fig. 1 als QA-21 gekennzeichnet ist.

7. Im wesentlichen reines QA-21 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin eine angezeigte ungefähre pseudomolekulare Ionenmasse von 1988 durch Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen (MS- FAB) aufweist.

8. Im wesentlichen reines Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria- Rohextrakt erhältlich ist, wobei das Saponin bei der Analyse des Extraktes durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule mit einer Korngröße von 5 um, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser · 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als Spitze erscheint, wobei das Saponin Immunadjuvansaktivität aufweist und als Adjuvans weniger toxisch ist als das Quillaja saponaria-Extrakt, abgesehen von einem Saponin, als QA-17 gekennzeichnet, mit der Formel:

9. Verwendung von im wesentlichen reinen Saponin nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung eines Mittels zum Verstärken einer Immunreaktion auf ein Antigen in einem Individuum.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche zweckmäßig ist, um die Produktion von Antikörpern auf ein Antigen in einem Individuum zu bewirken und welche eine immunogen wirksame Menge eines Antigens und ein im wesentlichen reines Saponin nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Menge enthält, welche ausreicht, um die Immunreaktion des Individuums auf das Antigen zu verstärken.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Individuum ein Mensch oder ein Tier ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Antigen ein gp70 enthaltendes Protein ist.