KR102391734B1 - 자기조립형 합성 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한정하지 않지만 자가 항원을 포함한 면역원성이 결핍된 항원을 포함하는 복합 단백질 또는 펩티드에 대한 포유류의 면역 반응을 증대시키기 위한 면역조절제로서 사용되는 합성 면역원성 단백질을 제공한다. 본 발명의 키메라 면역원성 단백질은 이것에 한정하지는 않지만 암, 감염 질환, 자가면역 질환, 알러지, 및 포유류 숙주의 면역 반응을 수반 또는 영향을 주는 임상적 표시를 포함하는 다수의 질병 치료에 사용될 수 있다.

Description

자기조립형 합성 단백질{SELF-ASSEMBLING SYNTHETIC PROTEINS}

본 발명은 숙주 면역계에 항원을 전달 및 제시하는 합성 단백질의 사용에 있어서 유리한 특정 기능 및 생물물리학적 특징을 나타내고, 상기 항원이 숙주에 대해 난면역원성 또는 비면역원성인 경우에도 숙주가 항원에 대해 특정 항체 반응이 일어나도록 유발시키는 합성 단백질 골격의 생성에 관한 것이다. 포유류의 면역계에 대해 면역원성이고, 안정한 규정된 다량체에 조립할 수 있는 합성 단백질에 대해서 기재한다. 더욱이, 난면역원성 또는 비면역원성 펩티드에 면역원성을 부여하고 또한 특정 항체 반응을 유발하는 상기 단백질의 사용방법에 대해서 기재한다.

척추동물의 면역계로의 이물질(비자기 물질), 즉 항원의 도입은 일반적으로 항원에 대한 숙주에 의한 면역 반응의 유발을 야기한다. 통상적으로, 이것은 B-림프구 및/또는 T-림프구의 자극, 및 항체를 인식하여 결합하는 면역 글로불린 분자(항체)의 생산을 수반한다. 어떠한 물질이 숙주에 있어서 면역 반응을 유발시키는 정도에 영향을 미치는 팩터는 매우 많이 있다. 면역계는 '자기'에 대해 무반응이도록 진화 및 발달되어 왔기 때문에, 이질성의 정도는 중요하다. 또한, 일반적으로 큰 분자일수록 작은 분자보다 면역원성이 높기 때문에, 크기도 중요한 팩터이다. 분자량이 ~1000Da 이하인 분자(합텐으로 분류됨)는 항원성이더라도 너무 작아서 분리시 면역계에 의해 보여지지 않으므로 비면역원성이다.

큰 분자일수록 복잡하므로, 다중 면역원성 에피토프를 포함할 가능성이 더 많고, 또한 항원 제시 세포(APC)에 의해 둘러싸여 처리되기 더 쉽다. 또한, 단백질은 가장 면역원성으로 되기 쉽기 때문에 물질의 조성도 중요하다. 다당류는 훨씬 더 면역원성(분리시)이 아니고, 핵산 및 지질은 본질적으로 비면역원성이다. 마찬가지로, 미립자상 또는 변성 항원은 가용성 분자 및 본래 분자보다 면역원성이 높다. 또한, 이물질의 노광 활성 및 생물학적 활성의 경로도 숙주에 의한 임의의 면역 반응의 성질 및 정도에 상당히 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 면역계의 성분 또는 세포와 상호작용하는 물질의 비경구 주사는 상대적으로 불활성 또는 비활성 물질의 점막 노출(섭취/흡입)보다 더욱 강한 반응을 일으킨다.

T-세포 및 B-세포는 다른 방식으로 외부 항원을 인식하고 반응한다. 특수 항원 제시 세포(또는 APC)(대식 세포, 수지상 세포 및 B-세포)는 세포외 공간으로부터 거대 분자 및 전체 미생물을 포함한 분자를 수집하고, 이들의 단백질 정보를 처리함으로써 그 환경을 계속적으로 조사한다. 외인성 단백질은 엔도솜에 있어서의 프로테아제 효소의 패널에 의해 소화되고, 얻어진 펩티드는 MHC II 분자의 그루브에 있어서의 세포 표면 상에 디스플레이된다. 결과적으로, 이들은 T-세포(TCR)의 표면 상의 전문 수용체에 의해 인식된다. T-세포 발달 과정은 자기-펩티드를 포함하는 MHC II와 반응하는 T-세포 디스플레이 수용체는 고갈되게 하고, 또한 외래 서열을 인식하는 T-세포 디스플레이 수용체만이 성공적으로 성숙되게 한다. T-세포(T-세포 에피토프)에 의해 인식된 펩티드는 예외없이 직쇄상이지만, 이것으로부터 유도되는 본래의 접힌 단백질에 항상 노출되거나 또는 접근가능한 것은 아니다.

반대로, B-세포 표면 수용체 또는 면역글로불린(BCR)은 가용성 단백질(구조적 에피토프와 변성 에피토프 양자 모두), 합텐, 다당류에 대해, 또한 그보다 정도는 덜하지만 일부 지질 및 핵산에 대해 주로 인식하고 상호작용한다. BCR의 특이성은 B-세포가 분비할 수 있는 항체의 특이성과 동일하다. 그 동족 항원의 결합시, BCR은 내재화되어 그 결합된 항원을 처리한다. 이것이 단백질이거나 또는 단백질 성분에 부착되었을 경우에만 MHC II 컴플렉스의 일부로서 세포 표면에 제시된다. 이들 조건 하에서, 제시된 펩티드를 인식하는 TCR을 갖는 보조 T-세포에 의해 자극되도록 B-세포를 이용할 수 있다. 따라서, 거대 또는 복합 단백질의 경우에는, 모두가 BCR과 동일한 항원 에피토프를 반드시 인식할 필요는 없지만, 그 모두는 동일 단백질의 펩티드 성분은 인식하는 다수의 상이한 T-세포에 의해 B-세포는 활성화될 수 있다. 이것이 본래 면역원성이 아닌 항원 결정기에 대해 항체를 발생시키는 척추동물의 면역계의 능력이다.

효과적인 백신을 개발하기 위해서는, T-림프구 및 B-림프구를 모두 포함한 강한 면역 반응을 자극하는 방식으로 숙주 면역계에 대해 항원 에피토프를 제시하는 것이 필요하다. 효과기(보조) T-세포의 활성화 및 이들에 의한 이어지는 B-세포의 자극을 포함하지 않는 면역 반응은 통상적으로 오래가지 못하고, 또한 항원이 기억되지 않게 되어, 즉 숙주가 재차 면역원에 노출되었을 때 더욱 공격적이고 더욱 빠르게 항체 반응을 일으키지 않는다.

또한, 백신에 대해 타켓의 기능 활성을 억제, 차단 또는 무력화시켜서 숙주를 보호할 수 있는 항체를 유도하는 것이 요구되는 경우가 있다. 이것은 다수의 이유 때문에 중대한 과제가 존재할 수 있다. 종종, 항체 반응에 의해 타겟이 될 필요가 있는 이들 에피토프는 타겟에 관련된 구조-기능 데이터의 부족으로 인하여 식별되지 않았다. 타겟과 그 상호 작용에 관한 정보가 상세하다고 하여도, 식별된 에피토프는 면역 우성이 아닐 수 있으므로, 대부분의 환자에게 필요한 반응을 일으키지 않을 수 있다. 다른 경우에 있어서, 핵심의 보호 항원 결정기는 단백질이 아니라, 예를 들면 병원체 당단백질 상의 다당류이어서, 분리시 면역원성(T-세포 의존성)이 아닐 수 있다.

백신의 대부분이 비경구적 루트를 통해 전달되지만; 점막 전달이 환자 규정, 자가 투여, 감염 위험의 감소, 및 점막 면역과 전신 면역의 양자를 유도할 가능성 등의 많은 이점이 있다. 또한, 극복해야 할 많은 장애, 예를 들면 백신 희석, 마이크로플로라의 존재, 구강 투여시 낮은 pH를 견디어서 멤브레인을 통과할 필요성, 및 강력한 아쥬반트(Vajdy et. al., 2004년)의 필요성이 있다. 더욱이, 점박 투여는 면역 반응 보다는 오히려 B-세포 면역내성을 야기할 수 있다. 또한, 용량도 면역 반응에 중대한 영향을 미칠 수 있다. 면역원이 면역계에 의해 효과적으로 소거되지 않거나, 또는 지나치게 높은 용량이 면역계로 쇄도할 경우, 내성이 유발될 수 있다. 역으로, 지나치게 용량이 낮아도 내성을 유발할 수 있거나 또는 충분한 면역 세포를 전혀 자극할 수 없다.

이들 문제를 극복하는데 도움이 되기 위해 다수의 접근이 개발되어 왔다. 대부분의 경우, 백신은 소정의 형태의 아쥬반트와 함께 투여된다. 근본적으로 아쥬반트는 면역원과 함께 투여될 경우, 주사 부위에서의 면역원의 지속, 보조 자극 신호의 증대, 림프구 증식 또는 육아종 형성의 비특이적 자극 중 하나 이상을 야기하는 임의의 제제이다. 이들은 다양한 형태를 취하고, 예를 들면 프로이드의 완전 아쥬반트는 불활성화된 마이코박테리아로 이루어지는 반면, 다른 것들은 수중유(예를 들면, 스쿠알렌)형 에멀젼을 포함한다. 이들은 주사 부위에 부작용을 야기할 수 있기 때문에, 거의 일반적으로 동물에 사용된다. 인간 백신에 있어서는 Montanide^ⓒ(식물성 성분을 포함하는 미네랄 오일계) 등의 일부 유기계 아쥬반트가 사용되지만, 더욱 일반적으로는 알루미늄염 등의 무기계이다.

특히 낮은 면역원성을 극복하기 위해서 가장 대중적이고 널리 채용된 방법은 동정된 또는 소망한 항원 또는 항원 결정기를 면역원성이 강한 면역원성 캐리어와 결합시키는 것이다. 이것은 이종으로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드이고, 예를 들면 동물에 있어서 항체를 생성하기 위해서 소 혈청 알부민(BSA) 및 키홀-림펫 헤모사이아닌(KLH)을 화학적으로 접합된 합텐과 작은 펩티드의 케리어로서 사용되는 경우가 있다(Berzofsky 및 Berzofsky, 1993년). 상기 캐리어는 숙주의 면역계에 의해 인지되어 처리될 정도로 충분히 큰 분자 상에 합텐을 제시하고, 또한 본질적으로 면역원성임으로써 숙주의 면역 반응을 자극한다.

일반적으로 말하면, 캐리어 단백질은 수용자에게서 계통학적으로 더욱 먼 근원으로부터 유래된 것일수록 좋다. 그러면, 캐리어는 숙주 단백질과 더욱 상이할 수 있으므로, 더욱 이질적이다. 캐리어 단백질의 선택시 더욱 중요한 고려 사항은 캐리어 단백질이 숙주 단백질의 동족체인지의 여부의 가능성과, 상당한 상동성을 공유하면 유도된 면역 반응은 숙주 단백질과 반응하여 불리한 부작용을 야기할 수 있다고 하는 가능성이다. 비단백질 항원은 화학적으로만 결합될 수 있어서, 캐리어 상에 어디에 부착할지와 어떻게 제시할지에 있어서 한정 제어될 수 있다. 작은 펩티드끼리는 화학적으로 또는 유전학적으로 결합될 수 있다. 다른 연구 분야에 있어서는, 현대의 생물 정보학의 발달은 면역원, 특히 펩티드의 이론적 설계에 있어서 발전을 이끌어 왔다.

펩티드 백신의 개념은, 예를 들면 타겟 분자의 B-세포 에피토프를 널리 알려진 T-세포 에피토프와 결합시켜서 면역원성으로 하는 것(Naz R.K. 및 Dabir P. 2007년)과 같은, 면역 우성이고 또한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 B-세포 및 T-세포 에피토프의 식별 및 화학적 합성에 기초한다. 펩티드는 더욱 크고 복잡한 단백질 항원과 비교했을 때 비교적 용이하게 제조되는 것으로 보여진다. 또한,유리한 화학적 안정성을 갖고, 또한 발암 가능성 또는 전염 가능성이 없는 점이 이들을 매력적인 백신 후보로 만들 수 있다. 그러나, 고유의 면역원성이 낮은 경우가 있는 점 및 더욱 우수한 아쥬반트 및 캐리어를 필요로 하는 점을 포함한, 여러 가지의 장애가 펩티드 백신의 광범위한 유용성을 제한한다. 다른 연구에서는 T 보조 에피토프가 탠덤 반복체로서 포함되면 재조합 키메라 단백질이 더욱 면역원성으로 될 수 있다고 제안하였다(Kjerrulf M, et. al., 1997년).

또 다른 캐리어 단백질의 일반적인 부류는 세균 톡소이드이다. 간염 증상이 독소의 작용에 의해 야기되는 세균성 감염에 대한 백신의 경우에는, 이것은 백신 자체로서 사용될 수 있다. 물론, 이들을 화학적으로 또는 무독성 성분을 사용하여 불활성으로 할 필요가 있다. 이러한 약화된 독소, 예를 들면 20세기에 개발되어진 디프테리아 및 파상풍 백신을 톡소이드라고 칭한다. Wyeth(Pfizer), Aventis Pasteur, GSK, Merck 등과 같은 회사에 의해 사용되거나 또는 후기 단계 개발되고 있는 다당류-단백질 접합 백신은 파상풍, 디프테리아 또는 기타 톡소이드를 사용한다.

콜레라 독소 또는 대장균 이열성 엔테로톡신(LT)의 B 서브유닛이 각종의 백신 적용을 위한 유용한 캐리어 단백질로서 다수에 의해 제안되어 있다(Nemchinov, L.G et al.(2000년), George-Chandy, A. et al. (2001년), 미국 특허 6,153,203). 이것은 면역원성이 높고, CT-A 서브유닛의 부재시 무독성이다. 널리 사용되는 콜레라 백신을 토대로 형성하는 것이 전신적으로 사용했을 때의 안전한 형태인 것이 증명되어 있다. 반면 상대적으로 작을 경우(~12kDa), 안정한 오량체에 조립하여 더욱 높은 분자량을 부여할 수 있다.

특히 다수의 연구원들에게 특히 관심을 끈 것은 유핵 세포의 표면에서 발견된 분기상 5당류, G_M1 강글리오사이드에 대한 CTB 및 엔테로톡신 오량체의 친화성을 이용하는 것이다. 콜레라 간염시, 이것은 장관 상피에 걸쳐서 홀로톡신의 전좌를 용이하게 하는 결합이다. CTB의 화학적 또는 유전적 융합에 기초한 백신은 경구적으로 또는 비강내로 투여했을 경우에 점막 면역력을 자극하는데 효과적일 수 있다는 것이 문헌에 다수 보고되어 있다(Georgy-Chandy, A. et al.(2001년), Houhui Song et al.(2003년), Shenghua Li et al.(2009년), Harakuni, A. et al.(2005년)). 인접한 CTB 서브유닛 사이에 형성된 포켓에서 결합하는 G_M1 강글리오사이드와 반응하는 능력을 유지하기 위해서는 타겟 항원이 G_M1 결합 부위에 블록 어세스하지 않고, 또한 CTB 다량체의 조립을 방해하지 않는 것이 필수이다.

유전적 융합은 CTB가 G_M1 결합을 성공적으로 유지하게 할 수 있지만, 한계가 있다는 것은 입증되어 있다. Liljeqvist, S. et al(1997년)은 연쇄상 구균의 단백질 G의 혈청 알부민 결합 도메인은 일반적으로 CTB의 N-말단 또는 C-말단, 또는 양 말단에 동시에 융합될 수 있고, G_M1 결합을 유지할 수 있다는 것은 증명되어 있다. 그러나, N-말단의 융합 단백질 및 2중 융합 단백질은 안정한 오량체의 형성시 효과가 현저히 떨어지고, G_M1과의 결합에 있어서 효과가 덜하다. 마찬가지로, 많은 유전적 융합은 키메라형의 CTB와 와일드형의 CTB 모두 이종 혼합물이 존재하는 한, 오량체를 형성할 수 없다는 것이 증명되어 있다(Harakuni A. et al.(2005년)).

본 개시에 의하면, 합성 캐리어의 높은 면역원성 성질은 그 고유의 면역부활성 및 아쥬반트 유사 특성 때문에, 포함된 가변성 서열에 대해 숙주 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 합성 캐리어가 가변성 서열에 의해 적어도 부분적으로 인코딩된 '자가' 항원 결정기에 대해서 숙주가 항체 반응을 일으키도록 하는 것을 개시한다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 안정한 호모-오량체에 조립될 수 있고, 여기에서 각각의 모노머는 타겟 단백질로부터 유래된 1개 이상의 항원 결정기를 포함한다.

다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 안정한 헤테로-오량체에 조립될 수 있고, 여기에서 다른 항원 결정기를 발현하는 모노머는 함께 조립된다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 하기 서열과 실질적으로 유사하다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 링커 서열 또는 스페이서 서열을 포함함으로써, 합성 캐리어의 하나의 말단 또는 양 말단에 위치한 가변성 서열이 합성 캐리어로부터 분리되고, 이러한 방식으로 수 개의 재조합 단백질로부터의 합성 캐리어 요소끼리를 연합할 수 있게 된다. 성장 인자에 부착하는 링커 서열을 갖는 재조합 합성 단백질은 하기 서열과 실질적으로 유사하다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 환 형상으로 안정한 오량체와 연합한다. 다른 다량체 조립체로서는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이량체, 삼량체, 사량체 및 더 큰 다량체를 들 수 있고, 또한 본 발명의 범위 내에서 예상된다. 링커 서열은 다양할 수 있고, 최소한 가변성 항원 결정기 서열이 합성 캐리어 도메인의 연합에 의해 다량체의 조립을 입체적으로 억제하는 것을 방지할 정도로 충분히 길이어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 링커 또는 스페이서는 안정한 오량체의 형성을 가능하게 하는 유연성을 가질 수 있다고 생각된다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 다량체인 오량체의 구조는 적어도 하나의 안정화 분자의 도입에 의해 안정화된다. 안정화 분자는 합성 분자로서 동일 세포 중에서 공발현될 수 있고, 또는 외부적으로 첨가될 수 있다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 안정화 분자는 콜레라 독소의 CT-A2 도메인과 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

다른 예시적인 실시형태에 있어서, 안정화 분자는 합성 단백질과 상호작용하여 다량체를 안정화시키는 서열을 포함한다. 또한, 이러한 안정화에 의해 본 분야에 공지된 승인된 제조 기술을 이용하여 대부분의 오량체 형태가 얻어질 수 있다고 생각된다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 안정화 분자는 합성 단백질의 다량체 형태에 항원 도메인을 고정하는데 기여할 수 있다.

더 더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 안정화 분자의 단속적 반복은 합성 단백질의 2개 이상의 다량체 형태를 결합시키는데 기여할 수 있다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 링커 또는 스페이서 서열은 일반적으로 소수성이고, 또한 유연하여 규정된 2차 구조를 포함하지 않는다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 링커 서열은 합성 캐리어 도메인 또는 가변성 항원 결정기 도메인의 접힘에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치지 않는다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 링커 서열은 세포외 프로테아제에 의한 단백질 분해에 내성을 갖는다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 링커 또는 스페이서 서열은 한정되지는 않지만, SSG, SSGGG, SGG, GGSGG, GGGGS, SSGGGSGGSSG, GGSGGTSGGGSG, SGGTSGGGGSGG, GGSGGTSGGGGSGG, SSGGGSGGSSG, SSGGGGSGGGSSG, SSGGGSGGSSGGG, 및 SSGGGGSGGGSSGGG를 포함한다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 링커 서열은 단독으로 또는 가변성 항원 결정기 또는 합성 캐리어의 플랭킹 서열과 함께 T-세포 에피토프를 형성하는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 T-세포 에피토프는 MHC(주조직 적합성 복합체) II형 단백질에 의해 결합되었을 때 인간 보조 T-세포에 의해 인식될 수 있는 T-세포 에피토프이다. 바람직하게는, 상기 T-세포 에피토프는 HLA(인간 백혈구 항원)-DR-아종의 MHC II 분자에 의해 결합될 수 있다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 세균성 홀로톡신의 A1B5군의 B-서브유닛과 구조적으로 상동이다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질의 다량체는 G_M1 강글리오사이드와 결합할 수 있다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 포유류의 숙주에 있어서 면역 반응을 유발하는 면역원성 단백질이다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 재조합 합성 단백질은 환자에 의해 면역 반응이 일어나는 것이 바람직한 면연원성 결정자를 제시하는 하나 이상의 가변성 서열을 포함하는 면역원성 단백질이다. 가변성 서열은 합성 캐리어를 인코딩하는 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하거나, 또는 합성 캐리어 인코딩 서열 내에 조립되어, 면역계의 세포에 적당히 제시될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 가변성 서열은 그들이 유래된 정상 분자 내에서 서열을 디스플레이하는 구조를 복제하는 방식으로 제시되고, 또한 B-세포의 면역글로불린 세포 표면 수용체로 접근가능하다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 가변성 항원 결정기는 신호 분자로부터 유래하고, 예를 들면 아드레노메둘린(AM), 앙기오포이에틴(Ang), 골 형성 단백질, 상피세포 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 간세포 성장 인자(HGF), 유사인슐린 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 기타 뉴로트로핀, 혈소판 유래 성장 인자(PDFG), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 및 혈관내피 성장 인자(VEGF)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 실시형태에 있어서, 가변성 항원 결정기는 질병의 전개 또는 진행에 관여하는 다른 리간드 분자로부터 유래되고, 예를 들면 PDL1을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 실시형태에 있어서, 가변성 항원 결정기는 세포의 표면에서 발견되는 수용체로부터 유래되고, 성장 인자의 정상 수용체 등의 세포의 성장을 조절하는 시그널링 이벤트에 관여한다.

더욱 실시형태에 있어서, 가변성 항원 결정기는 종양 항원으로부터 유래된다.

더욱 또 다른 실시형태에 있어서, 가변성 항원 결정기는 세균성, 바이러스성, 곰팡이성, 또는 기타 병원체로부터 유래된다.

본 발명에 기재된 실시형태를 첨부한 도면에 나타내지만, 이것은 예시일 뿐이며 한정하는 것은 아니고, 도면에 있어서 동일한 부호는 동일 또는 상응하는 부분을 나타내는 것이다.
도 1은 고정된 갈라토오스 함유 분자(GM1)에 결합시킨 후, 3단계의 선별을 행한 가용성 돌연변이 클론의 패널에 의해 생성된 ELISA 시그널을 도시한다.
도 2는 SDS 겔 상에서 전기영동된 돌연변이 라이브러리 중 하나로부터의 가용성 돌연변이 단백질의 웨스턴 블롯을 도시하는 것으로, 일부는 오량체를 형성하는 능력을 유지하고, 그 외는 유지하지 못하는 것을 도시한다.
도 3은 수개의 돌연변이 라이브러리를 선별 및 스크리닝한 후 식별된 선별 돌연변이를 도시하는 것으로, 도 3a는 7개의 분리 돌연변이 라이브러리 중 하나로부터 각각 단리된 선별 돌연변이의 서열 및 변이된 잔기의 분포를 도시하고, 도 3b는 수개의 상이한 돌연변이 클론으로부터 유래하는 컴파일링 돌연변이로부터 유래하는 합성 단백질의 서열을 도시한다.
도 4는 2개의 클론은 갈락토오스 결합 활성을 유지하고 있고, 2개는 유지하지 못하는 것을 나타내는 4개의 컴파일링 돌연변이의 GM1 결합 ELISA 데이타를 도시한다.
도 5는 완전한 콜레라 홀로톡신 분자의 구조를 도시한다.
도 6은 본 발명에 의한 합성 단백질의 서열(서열 ID: 1); 및 인간 TGF 베타 1(굵은체), 플렉시블 링커(이태리체), 및 합성 단백질 캐리어를 인코딩하는 서열을 포함하는 본 개시에 의한 합성 단백질의 서열(서열 ID: 2)을 도시한다.

본 발명의 재조합 단백질 또는 백신의 상세한 실시형태를 여기에 개시하지만, 개시된 실시형태는 단지 설명하는 것일 뿐이며, 각종 형태로 구현될 수 있다. 그러므로, 여기에 개시된 특정한 기능에 대한 상세는 한정적으로 해석되는 것이 아니라, 클레임의 기준 및 여기에 개시된 재조합 단백질을 다양하게 채용하는 것을 당업자에게 설명하기 위한 대표적인 기준으로서만 해석된다.

본 개시는 최대수의 성장 인자 에피토프, 종양 항원 에피토프, 및/또는 면역원성 재조합 단백질의 요소로서의 수용체 결합 부위의 제시를 개선하기 위한 합성 재조합 단백질을 제공한다.

한 예시적인 실시형태에 있어서, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 인간 형질전환 성장 인자(TGF), 종양 항원, 및/또는 수용체를 포함하는 적어도 하나의 성장 인자를 함유하는 서열 ID: 2에 나타낸 바와 같은 합성 재조합 단백질을 기재하고 있다. 다른 예시 실시형태에 있어서, 합성 재조합 단백질은 공지의 면역원성 단백질에 근거하여 모델로 한 다른 면역원성 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 인간 면역계에 대한 면역원성이 높은 폴리펩티드를 발현할 수 있다는 것은 본 개시 내용 내에서 고려된다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 키메라 단백질에 추가 성능, 예를 들면 높은 발현 수율 및 제조 용이성, 경구 안정성 및 소화기관으로부터 혈류로 교차하는 능력, 및/또는 인간에 있어서 안전한 사전 사용성을 부여한다.

여기에 제공된 바와 같은 소정의 예시적인 실시형태는 재조합 단백질 이외에, 아쥬반트 활성을 갖는 조성물 중의 성분을 지칭하는 아쥬반트를 적어도 1개 포함하는 의약 조성물을 포함한, 백신 조성물 및 면역원성 아쥬반트 조성물 내에 본 개시에 의한 재조합 단백질을 포함한다.

이러한 아쥬반트 활성을 갖는 아쥬반트로서는 피투여자, 예를 들면 인간(예를 들면, 사람 환자), 비인간 영장류, 포유류 또는 인식된 면역계를 갖는 다른 고등 진핵생물에 투여했을 때에 면역 반응의 효력 및/또는 지속성을 변화(즉, 통계적으로 현저한 방식으로 증가 또는 감소시키고, 또한 소정의 바람직한 실시형태에 있어서는 개선 또는 증가)시킬 수 있는 조성물을 들 수 있다. 여기에 개시된 소정의 예시적인 실시형태에 있어서는, 소정의 예시적인 실시형태에 한정되는 것은 아니지만, 소망한 항원 및/또는 복수의 항원은 단백질 캐리어 중에 필요에 따라 하나 이상의 아쥬반트를 포함함으로써, 동시에 투여될 수 있거나 또는 시간 및/또는 공간(예를 들면 상이한 해부학적 부위)에 차이를 두고 투여될 수 있는 상기 소망한 항원 및/또는 복수의 항원에 대한 면역 반응을, 예를 들면 유도하거나 또는 증대시키는 등 변화시킬 수 있고, 따라서 특정 항원은 포함하지 않고, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 1개 이상의 코아쥬반트(co-adjuvant)인 이미다졸퀴놀린 면역 반응 조절물질을 포함해도 좋은 조성물로 재조합 단백질을 투여하는 것도 고려된다.

상술한 바와 같이, 아쥬반트는 사포닌 및 사포닌 모방물 등의 아쥬반트 효과를 갖는 조성물을 포함하고, 예를 들면 QS21 및 QS21 모방물(예를 들면 미국특허 No. 5,057,540; 유럽특허 0 362 279 B1; WO95/17210 참조), 알룸, 토마틴 등의 식물 알칼로이드, 사포닌(한정되지 않음) 등의 세척제, 폴리소르베이트 80, Span 85 및 스테아릴 티로신, 1개 이상의 사이토카인(예를 들면, GM-CSF, IL-2, IL-7, KL-12, TNF-알파, IFN-감마), 이미다졸퀴놀린 면역 반응 조절물질, 및 이중 스템 루프 면역 조절물질(dSLIM, 예를 들면 Weeratna et al., 2005년, Vaccine 23:5263)을 들 수 있다.

사포닌을 포함한 세척제에 대해서는 미국 특허 No.6,544,518; Lacaille-Dubois, M 및 Wagner H.(1996년 Phytomedicine 2:363-386), 미국 특허 No.5,057,540, Kensil, Crit. Rev Ther Drug Carrier Syst., 1996년, 12(1-2):1-55, 및 EP 0 632 279 B1에 교시되어 있다. Quil A(사포닌)의 분획물을 포함하고, 면역자극 복합체(ISCOMS)라고 불리는 미립자 구조체는 용형성이고, 백신의 제조시 사용되어 왔다(Morein, B., EP 0 109 942 B1). 이들 구조체는 아쥬반트 활성을 갖는다고 보고되어 있다(EP 0 109 942 B1; WO 96/11711). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17(Quil A의 HPLC 정제 분획물)은 강력한 전신 아쥬반트로서 기재되어 있고, 그 제조방법은 미국 특허 No. 5,057,540 및 EP 0 362 279 B1에 개시되어 있다. 또한, 이들 참조 문헌에는 전신 백신용의 강력한 아쥬반트로서 작용되는 QS7(Quil A의 비용혈성 분획물)의 사용에 대해서 기재되어 있다. QS21의 사용에 대해서는 Kensil et al. (1991년, J. Immunology 146:431-437)에 더욱 기재되어 있다.

또한, QS21과 폴리소르베이트 또는 시클로덱스트린의 조합도 공지되어 있다(WO 99/10008). QS21 및 QS7 등의 Quil A의 분획물을 포함하는 미립자상 아쥬반트 시스템에 대해서는 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 기재되어 있다. 전신적 백신 접종 연구에 사용되고 있는 기타 사포닌으로는 안개꽃 및 사포나리아 등의 기타 식물종으로부터 유래하는 것들을 들 수 있다(Bomford et al, Vaccine, 10(9):572-577, 1992). [0203]에스신은 여기에 개시된 실시형태의 아쥬반트 조성물에 사용되는 사포닌에 관련된 또 다른 세척제이다. 에스신은 칠엽수인 호스 체스넛 나무의 씨앗에 존재하는 사포닌의 혼합물로서 머크 인덱스(12.sup.th Ed.: entry 3737)에 기재되어 있다. 그 단리에 대해서는 크로마토그래피 및 정제에 의한 것(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953년)) 및 이온교환 수지에 의한 것(Erbring et al, U.S. Pat. No. 3,238,190)이 기재되어 있다. 에스신의 분획물(아에스신이라고도 공지됨)은 정제되어 생물학적 활성을 나타낸다(Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996년 8월; 44(8): 1454-1464)). 디지토닌은 또 다른 세척제이고, 머크 인덱스(12th Ed., entry 3204)에 사포닌으로서 기재되어 있고, 디기탈리스의 씨앗으로부터 유래하고, Gisvold et al, J. Am. Pharm. Assoc., 1934년, 23, 664; 및 Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955년, 301, 621에 의해 기재된 과정에 의해 정제된다.

여기에 개시된 소정의 실시형태에 의해 사용되는 기타 아쥬반트 또는 코아쥬반트로는 당업자에게 친숙한 일종의 중합성 화합물을 지칭하는 블록 코폴리머 또는 생분해성 폴리머를 들 수 있다. 백신 조성물 또는 면역 아쥬반트에 포함될 수 있는 블록 코폴리머 또는 생분해성 폴리머의 예로서는 Pluronic. RTM. L121 (BASF Corp., Mount Olive, N.J.; 예를 들면 Yeh et al, 1996년, Pharm. Res. 13: 1693 참조)를 들 수 있다.

소정의 더욱 예시적인 실시형태에서는, 한정하지는 않지만, 오일을 포함하는 면역 아쥬반트를 고려하고, 여기서 일부 이러한 실시형태에서는 코아쥬반트 활성을 부여해도 좋고, 또한 다른 이러한 실시형태에 있어서는 추가로 또는 대체로서 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 제공해도 좋다. 적합한 오일이 다수 공지되어 있으므로, 선택하여 본 개시에 의거한 백신 조성물 및 면역 아쥬반트 조성물 중에 포함시킬 수 있다. 이러한 오일의 예로서는 스쿠알렌, 스쿠알란, 미네랄 오일, 올리브 오일, 콜레스테롤 및 만나이드 모노올레이트를 들 수 있고, 이것에 한정되는 것은 아니다.

또한, 이미다졸퀴놀린 등의 면역 반응 조절물질은 본 분야에 공지되어 있고, 또한 여기에 개시된 소정의 실시형태에 아쥬반트 또는 코아쥬반트로서 포함되어도 좋다. 또한 상술한 바와 같이, 여기에 기재된 바와 같은 본 개시에 의한 백신 조성물에 사용되는 아쥬반트 또는 코아쥬반트의 1종은 일반적으로 "알룸"이라고 칭해지는 알루미늄 코아쥬반트이어도 좋다. 알룸 코아쥬만트는 알루미늄 옥시-히드록사이드; 알루미늄 히드록시포스포에이트; 또는 각종의 시판의 염에 의거한다. 알룸 코아쥬반트는 양호한 안정성 기록을 갖고, 항체 반응을 증가시키고, 항원을 안정화시키고, 또한 양산이 비교적 간단하기 때문에 유리하다(Edelman, 2002년, Mol. Biotechnol. 21 : 129-148; Edelman, R. 1980년, Rev. Infect. Dis. 2:370-383.).

약학적 조성물

소정 실시형태에 있어서, 약학적 조성물은 본 개시에 의한 재조합 단백질뿐만 아니라, 여기에 규정된 바와 같은 TLR 아고니스트, 코아쥬반트(예를 들면, 사이토카인, 이미다졸퀴놀린 면역 반응 조절물질 및/또는 dSLIM을 포함함) 등에서 선택되는 1개 이상의 성분을 더 포함해도 좋은 백신 조성물 및/또는 약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 희석제와 조합한 재조합 발현 구조체이다.

예시적 캐리어는 채용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 무독성이어야 한다. 재조합 단백질을 포함하는 백신에 대해서는, 통상적으로 진피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 루트로 또는 기타 루트로 약 0.01 mu.g/체중 kg~100mg/체중 kg이 투여된다. 투여 횟수 및 빈도는 숙주의 반응에 의존적인 것은 당업자에게 있어서 명백하다. 치료목적 용도의 "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 약학분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985년)에 기재되어 있다. 예를 들면, 생리적 pH의 살균 식염수 및 포스페이트 완충 식염수를 사용해도 좋다. 보존제, 안정제, 염료, 및 향미제도 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 예를 들면, 보존제로서 나트륨 벤조에이트, 아스코르브산, 및 p-히드록시벤조산의 에스테르가 첨가될 수 있다. 또한, 산화방지제 및 현탁제를 사용해도 좋다.

약학적 조성물의 형태는 조성물을 환자에게 투여할 수 있으면 어떠한 형태이어도 좋다. 예를 들면, 조성물은 고체, 액체 또는 가스(에어로졸)의 형태이어도 좋다. 대표적인 투여 루트로는, 경구, 국소, 비경구(예를 들면, 설하 또는 협측), 설하, 직장, 질내, 및 비강(예를 들면 스프레이로서)을 들 수 있고, 이들에 한정되는 것은 아니다. 여기서 사용된 용어인 비경구는 이온영동 투여, 초음파영동 투여, 수동적 경피 투여, 마이크로니들 투여뿐만 아니라, 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면체내, 척추강내, 내이강이도내, 요도내 주사 또는 주입 기술도 포함한다. 특정 실시형태에 있어서는, 여기에 기재된 바와 같은 조성물(백신 및 약학적 조성물을 포함)은 이온영동, 미세 공동화, 초음파영동 또는 마이크로니들에서 선택되는 기술에 의해 진피내로 투여된다.

약학적 조성물은 환자에게 약학적 조성물의 투여시 그것에 포함된 활성 성분이 생물학적으로 이용가능하게 되도록 조제된다. 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 용량 단위의 형태를 취한다. 예를 들면 정제는 단일의 용량 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 하나 이상의 화합물의 용기는 복수의 용량 단위를 수용할 수 있다.

경구 투여용에는 부형제 및/또는 바인더가 존재해도 좋다. 예를 들면, 수크로오스, 카올린, 글리세린, 스타치 덱스트린, 나트륨 알기네이트, 카르복시메틸셀룰로오스 및 에틸셀룰로오스를 들 수 있다. 착색제 및/또는 착향료가 존재해도 좋다. 코팅쉘이 채용되어도 좋다.

상기 조성물은 액체 형태, 예를 들면 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액이어도 좋다. 상기 액체는 2개의 예로서 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용이어도 좋다. 경구 투여용일 경우, 바람직한 조성물은 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 증진제 중 하나 이상을 함유한다. 주사에 의해 투여할 목적의 조성물에는 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장화제 중 하나 이상이 포함되어도 좋다.

여기서 사용되는 액상의 약학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사 형태의 형태에 상관없이 하기 캐리어 또는 부형제 중 하나 이상을 포함해도 좋다: 주사용 증류수, 염류 용액, 바람직하게는 생리적 염류 용액, 링거액, 등장성 염화나트륨 등의 멸균 희석액, 스쿠알렌, 스쿠알란, 미네랄 오일, 만나이드 모노올레이트, 콜레스테롤 등의 고정유, 및/또는 용제 또는 현탁 매체로서 제공될 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 기타 용제; 벤질알콜 또는 메틸파라벤 등의 항세균제; 아스코르브산 또는 나트륨 비술파이트 등의 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 등의 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스 등의 강직성 조정제. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱제의 앰플, 1회용 주사기 또는 주사액병에 동봉될 수 있다. 주사용 약학적 조성물은 무균인 것이 바람직하다.

특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학적 또는 백신 조성물은 안정한 수성 현탁액을 0.2㎛ 미만 포함하고, 또한 인지질, 지방산, 계면활성제, 세척제, 사포닌, 플로오데이티드 지질 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 더 포함한다.

또한, 백신 또는 약학적 조성물 중에는 전달 비히클, 예를 들면 이것에 한정되는 것은 아니지만, 알루미늄염, 유중수 에멀전, 생분해성 오일 비히클, 수중유 에멀전, 생분해성의 마이크로캡슐, 및 리포솜 등의 기타 성분을 포함하는 것도 바람직하다. 이러한 비히클에 사용되는 부가적인 면역자극 물질(코아쥬반트)의 예는 상기 기재되어 있고, 또한 N-아세틸무라밀-L-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론 및 IL-12를 들 수 있다.

당업자에게 알려진 임의의 적합한 캐리어를 본 발명의 약학적 조성물에 채용해도 좋지만, 투여 방식 및 서방성이 요구되는지의 여부에 따라 캐리어의 종류는 달라질 수 있다. 피하 주사 등의 비경구 투여용에 있어서는, 캐리어는 물, 생리 식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함하는 것이 바람직하다. 경구 투여용에 있어서는, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탤컴, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 및 마그네슘 카보네이트 등의 고체 캐리어 또는 상기 캐리어 중 어느 것이 사용되어도 좋다. 또한, 생분해성의 마이크로스피어(예를 들면, 폴리악틱 갈락티드)도 본 발명의 약학적 조성물용 캐리어로서 사용되어도 좋다.

또한, 약학적 조성물은 완충제 등의 희석제, 아스코르브산 등의 산화방지제, 저분자(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물, EDTA, 글루타티온 등의 킬레이트제, 및 기타 안정제 및 부형제를 포함해도 좋다. 중성의 완충 생리 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합한 생리 식염수가 적당한 희석제로서 예시된다. 바람직하게는, 희석제로서 적당한 부형제 용액(예를 들면 수크로오스)을 사용하여 리오필리제이트로서 생성물이 조제될 수 있다.

예시적인 실시형태에 있어서, 천연 폴리펩티드 서열로부터 유래되었거나 또는 합성 폴리펩티드 서열로부터 유래되었거나에 상관없이, 재조합 단백질의 에피토프 또는 수용체 지지 도메인은 적당한 화학적/환경적 조건 하에서 올리고머 다량체로 자가 조립하거나 또는 대체 조건 하에서 모노머로 축소되는 능력을 가져야 한다. 이상적으로는, 다량화 도메인을 이산(離散)적인 수의 서브유닛을 가진 안정한 다량체, 예를 들면 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등으로 조립하여, 균질한 사이즈의 생성물을 생성한다. 특정 이론에 의해 하등 한정되지 않고, 서열 ID: 1에 개시되어 있듯이, 재조합 합성 단백질에 의해 수수의 서브유닛을 안정한 다량체에 조립될 수 있다. 천연 폴리펩티드의 예로서는 류신지퍼, 락 리프레서 단백질, 스트렙타비딘/아비딘, 콜레라톡신 B 서브유닛, 슈도모나스 삼량체화 도메인, 및 바이러스 외피 단백질을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 개시에 의하면, 성장 인자 또는 그 일부, 세포 수용체 또는 그 일부, 종양 항원 또는 그 일부인지에 상관없이 재조합 단백질은 성장 인자 및 수용체에 대한 만성 질환 또는 암에 관련된 광범위한 세포 경로 중 하나에 관련되어 있고, 또한 상기 합성 단백질 내의 종양 항원을 이용하는 가장 광범위한 가능 범위의 고형 종양에 관련되어 있다. 상기 단백질은 재조합 단백질의 형태이고, 또한 만성 질환, 예를 들면 유방암, 허파암, 방광암, 난소암, 외음부암, 결장암, 폐암, 뇌암, 대장암, 장암, 두경부암, 및 식도암을 치료하는데 유용할 수 있다. 상기 질환에 있어서 상이한 종양 항원이 발현될 수 있고, 또한 다중 세포 수용체 및 성장 인자가 재차 발현될 수 있기 때문에, 후술하는 단백질은 상기 질환과 관련된 하나의 또는 다중의 세포 경로의 1개 이상의 상이한 종양 항원, 1개 이상의 상이한 수용체 또는 성장 인자를 함유할 수 있다. 이들 단백질을 "다가"라고 칭한다.

본 개시의 문맥에 있어서, "중화 도메인"이란, 특이적 결합쌍, 예를 들면 성장 인자와 그 동족 수용체의 멤버 중 하나 또는 양쪽의 영역으로서 정의되고, 여기서 상기 영역에의 특이적 결합쌍의 멤버가 아닌 제 3 분자의 결합은 특이적 결합쌍의 2개의 멤버의 연속되는 결합을 방지한다. 제 3 분자는, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 항체를 포함한 다른 단백질 분자일 수 있고, 또는 작은 비단백질 분자일 수 있고, 또한 기원이 천연일 수 있고 또는 합성일 수 있다. 중화 도메인은 보통 결합시 직접적으로 접촉하는 특이적 결합쌍의 멤버의 영역을 포함하고, 또한 제 3 분자의 결합시 충분한 입체 장애를 유발하여 특이적 결합쌍의 멤버가 직접 결합하는 것을 방지하는 상기 영역 외의 영역을 포함한다.

동족 수용체에 의한 리간드의 특이적 인식은 수용체의 결합 부위와 리간드의 특정한 분자 서명(에피토프) 사이의 상호 작용에 의해 규정된다는 것은 본 분야에 있어서 확고히 정립되어 있다. 따라서, 수용체 결합 부위와 결합 또는 차단하거나, 또는 리간드의 인식 에피토프와 결합 또는 차단하는 항체는 리간드 수용체 상호작용을 억제할 수 있다. 이러한 항체를 "중화"라고 기재한다. 본 개시의 문맥에 있어서, 중화 항체는 재조합 단백질의 투여시 숙주에 의해 생성되고, 따라서 단백질 서열은 기능적(본래의) 구조에 있어서 수용체 결합에 필요한 에피토프가 제시되도록 성장 인자 또는 종양 항원의 전부 중 하나 이상 또는 이것으로부터 유래하는 적합한 서열을 발현 또는 포함할 수 있다.

신체적 부위당 단일 종양 항원, 수용체 및/또는 성장 인자 또는 그 일부로서, 및/또는 종양 항원, 수용체 및/또는 성장 인자 서열의 반복쇄(예를 들면, n=1 이상)로서 제시되는 단일 종양 항원, 수용체 및/또는 인자의 다중 복제물을 발현하는 것 이외에; 본 개시에 의한 단백질은 1개 이상의 에피토프의 발현을 포함할 수도 있고, 또는 2개 이상의 상이한 종양 항원, 수용체 및/또는 성장 인자로부터의 결합 부위를 재조합 단백질의 서열 내의 상이한 위치에 단독으로 또는 쇄로서 제시한다.

예시적인 실시형태에 있어서, 1개 이상의 상피세포 성장 인자(EGF) 중화 도메인을 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질이 개시된다. 상기 단백질은 재조합 단백질의 형태이고, 만성 질환, 예를 들면 유방암, 허파암, 방광암, 난소암, 외음부암, 결장암, 폐암, 뇌암, 대장암, 장암, 두경부암, 및 식도암을 치료하는데 유용할 수 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 EGF 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다. 한 예시적인 실시형태에 있어서, 합성 폴리펩티드 서열은 서열 ID: 1과 실질적으로 유사하다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 FGF 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

더 더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 형질전환 성장 인자(TGF-β1)를 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 TGF-β1 서열 및 합성 폴리펩티드를 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 형질전환 성장 인자(TGF-β1)를 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 TGF-β1 서열 및 서열 ID: 2와 실질적으로 유사한 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)를 발현하는 것을 개시한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 단백질은 IGF-1 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이고, 1개의 간세포 성장 인자(HGF)를 발현하는 균일한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 HGF 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

더욱 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 1개의 인슐인 유사 성장 인자-2를 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 IGF-1 서열, IGF-2 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 1개의 혈관내피 성장 인자-A(VEGF-A) 및 1개의 혈관내피 성장 인자-C(VEGF-C)를 발현하는 균질한 재조합 단백질로 구성된 단백질을 개시한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 상기 단백질은 본 개시에 의한 VEGF-A 중화 도메인 서열, VEGF-C 서열 및 합성 폴리펩티드 서열을 발현 또는 포함하는 재조합 단백질이다.

실시예

본 개시의 양태를 하기 실시예에서와 같이 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 개시의 범위를 이하에 기재하는 방법론 또는 구성의 정확한 세부 사항에 한정하고자 하는 것이 아니다. 실질적이고 예시적인 실시형태를 하기 실시예에서 예시 및 설명한다. 그러나, 본 개시의 정신 및 범위 내에서 변형 및 개선이 이루어질 수 있는 것은 당업자에게 있어서 명백하다.

실시예 1: 선별가능 탄수화물 결합 디스플레이 시스템의 구성

선별가능 표현형 및 인코딩 유전자형의 다양한 클론 집단 간의 물리적 연결을 포함하는, 돌연변이 라이브러리를 생성하여 소망한 특징을 갖는 돌연변이를 스크리닝할 수 있는 시스템이 필요했다. 이러한 시스템은 특히 항체 공학 분야에 있어서 매우 효과적으로 채용된 정립된 기술을 이용하여 개발되었다.

선별된 탄수화물 결합 도메인을 인코딩하는 유전자는 적합한 선택 마커(M13-KO7 '파지')를 갖는 완전 독립적 기능성의 M13 '파지' 벡터와, 바이러스로부터의 F1 패킹 영역 및 외피 단백질 인코딩 유전자만을 포함하는 '파지미드' 벡터 모두에 있어서 M13 박테리오파지의 외피 단백질 유전자(유전자 III)의 인프렘 및 상류에 클로닝됐다. 전자의 벡터는 대장균 등의 적합한 세균 숙주에 도입하여 적당히 증식시켰을 경우, 외피 단백질 P3(유전자 III에 의해 인코딩됨)의 N-말단 융합으로서 섬사상 바이러스 입자의 한 말단에 선택된 탄수화물 결합 도메인을 5카피 디스플레이하는 바이러스 입자를 생성한다.

후자의 벡터는 당업자에게 친숙한 파지미드/보조 파지 시스템을 이용했을 경우, 바이러스 증식의 특성에 기인하여 상기 집단의 소수만이 상기와 동일한 탄수화물 결합 도메인-P3 융합 단백질을 통상적으로 1카피 미만 디스플레이하는 바이러스 입자를 생성한다.

각각의 벡터로부터 유래하는 클론을 당업자에게 잘 알려진 적당한 조건 하에서 증식시키고, 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청에 대해 탄수화물 결합 도메인에 의해 인식된 주요 탄수화물에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 스크리닝했다. 이 실시예에서는, 원위에 갈락토오스기를 포함하고, 통상의 96웰의 면역분석 플레이트 상에 흡수에 의해 고정화할 수 있는 복합 분자를 사용했다. 탄수화물기에 결합하기 위해서는, 인접한 도메인 사이에 탄화수소 결합 포켓이 형성되기 때문에, 2개 이상의 탄수화물 결합 도메인을 복합체로 연합시킬 필요가 있다.

전자의 '파지'의 실시예에 있어서, 파지는 단일의 비리온 상의 인접한 P3 융합 단백질 사이에 잠재적으로 형성되어, 융합 단백질 또는 별개의 바이러스 입자 사이에서 허용가능한 배향 제약을 행하게 할 수 있었다. 파지미드 시스템의 이용시, 단독의 비리온 상에 2개 이상의 융합 단백질을 포함하는 바이러스의 비율이 매우 작을 것으로 예측되기 때문에, 이러한 연합은 2개 이상의 별개의 바이러스 입자 사이에서 형성할 가능성이 더 크다.

상술한 클론을 스크리닝했을 때, 5가 파지 클론보다 '1가' 파지미드 유래 클론으로부터 상당히 더욱 강한 ELISA 시그널이 생성되었고, 5가 파지 클론은 감염 바이러스 입자의 타이터가 더욱 낮았다. 본 실시예에 있어서의 파지 시스템의 열화한 성능은 상기 프로세스에 있어서의 시스템의 유용성을 제한하지는 않지만, 아마도 여기에 사용된 유전적 연쇄에 의해 시스템에 부과된 입체적 제약 또는 배향적 제약의 기능 및/또는 단백질 융합(P3 외피 단백질이 바이러스 감염의 매개체임)에 의해 부과된 감염성 한정의 기능이 있다고 생각된다. 그러므로, 선택되어진 파지미드계 시스템은 변종 돌연변이 단백질을 생성 및 선택한다.

실시예 2: 돌연변이 클론 라이브러리의 생성

돌연변이 폴리펩티드 인코딩 클론의 라이브러리를 탄수화물 결합 자기조립 단백질 도메인으로부터 유래하는 유전적 주형으로부터 생성했다. 본 실시예에 있어서, 단백질 도메인은 세균성 홀로톡신의 A1B5군에서 선택했다. 단백질 데이타 베이스(Protein Data Base) 등의 공개된 데이타 베이스 및 학술 문헌으로부터 얻어진 구조 및 기능 정보는 주형 단백질 도메인의 안정한 호모-오량체를 형성하거나 또는 포유류 세포 형태의 표면 상에서 발견되는 특이적 탄수화물 함유 부위와 상호작용하는 능력에 관련되는 것이 잠재적으로 고려되거나 증명된 영역 및/또는 특이적 잔기를 식별하는데 사용되었다. 이들 영역/잔기는 이어지는 돌연변이 유발 및 돌연변이 스크리닝 단계로부터 제외되었다.

잠재적으로 돌연변이되기 쉽고 또한 소망한 특성에 관여하지 않는 것으로서 정의된 상술한 바와 같은 영역 또는 잔기를 선택하고, 적절하다고 판단되는 합리적 또는 무작위 돌연변이유발의 타겟으로 했다. 주형 도메인으로부터 분기된 탄수화물 결합 변종을 생성 및 선별하는 기회를 최대로 하기 위해서, 돌연변이를 규제하여 라이브러리 구조 스크리닝의 각각의 순차 단계에 있어서 매우 근접하여 있는 잔기의 수를 한정된 수로 제한했다.

타겟으로 하는 상기 영역 또는 잔기에 따라서, 주형 도메인에서 발견되는 것들과 유사한 생물물리학적 및/또는 화학적 특성을 나타내는 잔기에 대해서는 합리적으로 가능하면 돌연변이를 무작위(즉, 잠재적으로는 20 아미노산 전부를 포함함) 또는 기능적으로 규제했다.

이러한 경우와 관련된다고 생각되는 특성으로는 측쇄 사이즈, 전하, 극성, 소수성/친수성, 및 α-나선 등의 특이적 2차 구조의 형태에 참여하는 능력을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 가능한/실현가능한 경우, 임의의 주어진 위치에서 주형에 의해 인코딩된 잔기는 돌연변이 라이브러리로부터 제외시켜서 비돌연변이체의 선택을 회피했다.

라이브러리는 주형 유전자에 상동하여 적당한 조건 하에서 프라이머(구체적으로 3'-말단)를 주형 DNA에 고정하는 서열 영역과, 하나 이상의 위치에서 다양한 아미노산을 인코딩하도록 적당한 축중을 포함하는 다른 영역을 모두 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계함으로써 생성했다.

본 실시예에 있어서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 임의의 다양한 위치의 DNA 염기가 필요에 따라 등량의 2-4 염기(G, A, T 또는 C)를 포함하는 당업자에게 잘 알려진 규정된 축중을 이용하여 구성했다. 또한, 트리뉴클레오티드 포스포라미디트의 위치적 혼합으로부터 생성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 특이적 잔기(아미노산) 및 그 상대적 비율을 각각의 다양한 위치에서 정밀하게 조절함으로써 더욱 제어된 다양성이 예측된다.

돌연변이체를 한 말단에 도입했을 경우, 요구되는 유전적 다양성을 도입하기 위해서, 단일의 PCR 반응을 1개 또는 2개의 축중 프라이머를 사용하여 행했다(필요할 따라 반복함). 플랭킹(flanking) 제한 부위를 포함하는(프라이머 유래) 얻어진 생성물을 상기 실시예 1에서 나타낸 파지미드 벡터로 크로닝하여, 변종 단백질의 라이브러리를 인페임 유전적 융합으로서 M13 박테리오파지의 외피 P3 단백질 인코딩 유전자(유전자 III)에 대해 인코딩했다.

주형 유전자의 말단에 대해 원위인 영역에 다양성을 도입하는 것을 소망한 경우에는, 각각의 쌍이 주형 서열과 정확히 매칭되는 1개의 말단(5' 또는 3') 프라이머 및 필요한 다양성의 일부, 전부 또는 전무를 인코딩하는 1개의 축중 프라이머를 포함하도록 2쌍의 프라이머를 사용했다. 축중 프라이머의 3'-말단은 i) 각각은 주형 서열과 정확히 매칭하고, ii) 각각은 제 2 프라이머쌍으로부터 축중 프라이머에 정확히 상보적이도록 설계되었다.

이러한 방식으로, 2개의 PCR 생성물을 생성한 다음, 축중 프라이머로부터 유래하는 상보적 오버랩핑 서열을 통하여 서로 어닐링하여 연결했다. 이어서, 얻어진 생성물을 유전자 III 외피 단백질 유전자를 가진 인페임 유전적 융합으로서 파지미드 벡터에 클로닝했다. 연속 라이브러리를 이전 라이브러리로부터의 1개 이상의 클론을 스크리닝하여 선택한 산출물을 기반으로 구축하거나, 또는 주형 또는 1개 이상의 선택된 돌연변이 클론으로부터 동시에 구축하고 스크리닝했다.

모든 유전자 구축 라이브러리를 표준 방법을 이용한 전기천공법에 의해 숙주 대장균 TG1 세포에 도입하고, 형질전환체를 선택 배지에 평판 배양했다. 적당한 배양 후, 박테리아의 콜로니를 평판으로부터 긁어내고, 필요에 따라 보존 및/또는 스크리닝했다.

실시예 3: 돌연변이 라이브러리의 스크리닝

예상되는 다양성의 표시를 100-1000배 포함하는데 충분한 세포가 포함되고, 또한 OD₆₀₀이 0.1의 영역 내에 있는 것을 보장하는데 충분한 체적이 포함되도록, 라이브러리로부터 돌연변이체의 선별을 행하기 위해서, 배양물(라이브러리의)을 액체 배지(2xTY, 100㎍/ml 암피실린, 1% 글루코오스)에 주입했다. 그 다음, 배양물을 약 37℃에서 OD₆₀₀이 0.4~0.6(즉, 대수기 성장)에 도달할 때까지 배양했다(진탕하면서). 그 다음, 배양물을 M13 KO7 보조 파지를 세균 세포당 ~20보조 파지의 비율로 첨가하여 감염시켰다(0.1의 OD₆₀₀은 ~0.8×10⁸세포/ml를 취함). 대략 30분간의 정적 배양 후, 추가로 30분가 진탕하면서 세포를 배양했다. 카나마이신을 50㎍/ml 첨가하고, 그 배양물을 진탕하면서 30℃에서 오버나잇 배양했다.

다음날 아침, 배양물을 약 25-30분간 ~8,000g으로 원심분리하여 세포를 펠릿으로 하고, 상청액을 제거하고 보존했다. 세포 펠릿은 폐기했다. 상기 배양 상청액에 20체적%의 200mM NaCl, 20% PEG 6,000을 첨가하고, 얼음 위헤서 약 1시간 배양하여 파지 입자를 침전시켰다. 파지를 ~8,000g으로 약 25-30분간 펠릿화하고, 본래의 20체적%의 PBS(인산 완충 생리 식염수) 중에 재부유했다. 재차, 새로운 20체적%의 200mM NaCl, 20% PEG 6,000을 첨가하고, 파지를 얼음 위에서 25-30분간 배양했다. 파지를 재차 ~8,000g으로 약 25-30분간 펠릿화하고, 이 펠릿을 ~2mL PBS(인산 완충 생리 식염수) 중에 재부유했다. 얻어진 부유액을 에펜도르프 튜브로 옮기고, 5분간 최대 속도로 펠릿화하여, 임의의 잔존하는 세균 세포/파편을 펠릿으로 했다. 그 다음, 파지 부유물을 선별에 사용했다.

선별을 행하기 위해서, 이뮤노튜브를 고정화 갈락토오스의 유도체 또는 B-서브유닛의 천연 리간드 등의 적합한 항원으로 1-10㎍/ml(통상적으로 5ml)으로 4-8℃에서 오버나잇 또는 실온에서 1시간 코팅했다. PBS로 3-5회 세척(간단히 이뮤노튜브에 붓고 다시 따라버림)한 후, MPBS(2% 밀크 파우더를 함유하는 PBS)를 37℃에서 1-2시간 첨가하여 튜브를 차단했다. MPBS를 상술한 바와 같이 세척하고, 대략 1×10¹¹~1×10¹² 이상의 파지 입자를 첨가했다.

체적을 ~5mL 이하로 하고, 나노튜브를 예를 들면 파라필름으로 밀봉했다. 그 다음, 약 30분간 텀블링(빙글빙글 회전시킴)한 후, 약 90분간 정치하여 배양하여, 고정 리간드를 인식할 수 있는 돌연변이 라이브러리로부터 단백질을 디스플레이하는 이들 파지를 이것에 결합시켰다. 결합되지 않았거나 또는 단지 약하게 결합된 파지는 세정하여 제거했다. 선별의 충실성은 필요에 따라 사용되는 세척 횟수, 세척에의 PBST(0.1% Tween 20을 함유하는 PBS)의 사용, 또는 리간드의 코팅 농도의 조절에 의해 변화되었다.

결합된 파지 입자를 1ml 100mM 트리에틸아민(TEA)를 첨가하고, 최대 10분간(장기간의 배양은 파지 생존 능력에 악영향을 미침) 텀블링한 즉시, 0.5ml 1M 트리스-HCl(pH 7.4)에 부어서 중화시킴으로써 이뮤로튜브로부터 용출시켰다. 약 0.75mL의 용출된 파지를 TG1(Agilent) 등의 적당한 대장균 스트레인의 10ml 대수기 배양물에 첨가했다. 배양물을 진탕하지 않고 약 37℃에서 배양하여 감염시켰다. 감염된 세포의 샘플의 계단 희석물을 100㎍/ml 암피실린과 1% 글루코오스를 함유하는 소형 TYE 플레이트에 스프레딩했다. 잔존하는 세포를 상기와 동일한 배지를 갖는 더 큰 바이오에세이 플레이트에 플레이팅했다. 이들 모두를 약 30℃에서 오버나잇 배양했다. 다른 0.75ml 파지 중 ~75㎕를 ~1ml 대수기 대장균 HB2151 세포에 상기와 같이 감염시키고, 상기와 같이 계단 희석물을 플레이팅하고 배양했다. 나머지 파지를 약 -80℃에서 글리세롤 스톡(~15% 글리세롤)으로서 보존했다.

다음날 대형 바이오에세이 플레이트를 긁어내어 세포를 제거한 다음, 글리세롤 스톡으로서 보존 또는 성장시키고, 상술한 바와 같은 M13 KO7 보조 파지로 '구조'하여, 다음 단계의 선별용의 농축 파지 집단을 제조했다. 통상적으로 2개~3개의 순차 선별 단계를 행했다. 선별 종료시, HB2151 세포의 소형의 계단 희석 플레이트로부터 개개의 콜로니를 100㎍/ml 암피실린을 갖는 100~㎕/웰 2×TY를 함유하는 96웰 배양 플레이트에 피킹하고, 37℃에서 오버나잇 진탕 배양했다. 다음날, 각각의 웰로부터의 대략 5㎕의 배양물을 ~150㎕ 배지/웰을 가진 프레쉬 플레이트에 접종하고, 37℃에서 약 2시간 진탕 배양했다. 1M IPTG를 함유하는 배지를 추가로 첨가하여 최종 농도를 1mM IPTG로 하고, 플레이트를 30℃에서 오버나잇 진탕 배양했다. HB2151 세포에 있어서, IPTG를 이용하여 유도함으로써, 대장균 TG1 세포의 경우처럼 바이러스 입자 성분에 융합된 단백질보다는 검출가능한 c-myc 펩티드 태그를 포함하는 가용성 돌연변이 단백질이 발현되게 된다. 최초 96웰 배양 플레이트를 약 -80℃에서 보존했다.

다음날, 유도된 96웰 플레이트로부터의 배양 상청액을 통상의 ELISA 프로토콜을 사용하여 고정화 탄수화물에의 결합 및 즉시 사용가능한 HRP 표지된 안티-c-Myc 항체를 사용하여 검출된 결합을 분석했다(도 1). 쉐이딩된 세포에 있어서 GM1에의 결합에 대해 강하게 양성인 클론이 보여졌다. 양성 컨트롤 및 음성 컨트롤은 박스를 쳤다.

결합 ELISA에 있어서 강하게 양성인 클론으로부터의 배양 상청액을 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 더 분석하여, 도 2에 도시한 바와 같은 오량체의 존재 및 기타 다량체의 상태를 평가했다. 전기영동 이전에는 샘플을 환원시키거나 비등시키지 않았고, HRP 표지된 안티-c-Myc 항체를 이용하여 단백질을 검출했다. 나타낸 실시예에 있어서, 클론 C1 및 C3은 ~60kDa의 오량체로 즉시 조립하는 양성 컨트롤이다. 클론 C2는 사용된 조건하에서 12kDa 모노머로서 작용하는 음성 컨트롤이다. 클론 A1 및 A3은 주로 오량체로서 작용하는 것으로 보여질 수 있는 반면, 클론 B12의 상당한 비율이 모노머를 형성한다. 나머지 클론은 모노머(B1, B7)만을 형성하거나 다수의 다량체의 형태를 형성한다.

실시예 4: 돌연변이의 편성

돌연변이가 수용하는 최대 잔기수의 용량을 평가하기 위해서, 주형의 상이한 잔기 또는 영역을 각각 타겟으로 하는 수개의 상이한 라이브러리를 구성하고 스크리닝했다. 그 결과, 다수의 클론이 고정화 탄수화물 유도체에 결합하고 대부분 오량체를 형성하는 소망한 선별 기준을 나타내는 것이 확인되었지만, 도 3a에 도시한 바와 같이, 각각은 다수의 특유의 돌연변이/상이점을 포함했다. 잠재적으로 개선된 특성을 갖는 클론을 생성하기 위해서는, 이들 다양한 서열을 소수의 클론에 조합시키는 것이 필요했다.

돌연변이 발생 및 선별과정은 3개 이상의 상이한 잔기가 수용될 수 있는 수개의 위치가 확인되어 있기 때문에, 도 3b에 도시한 바와 같이 총 4개의 조합 돌연변이(A-D)가 설계되었다. 조합된 돌연변이를 포함하는 4개의 클론이 발현되었고, 도 4에 도시한 바와 같이, 합성 단백질에 대해서 그 결합을 ELISA에 의해 적당한 컨트롤과 비교하여 평가했다. 2개의 클론(A 및 C)은 약한 결합만을 갖지만, 다른 2개의 클론(B 및 D)은 GM1에 매우 강하게 결합될 수 있었다. 이것은 별개의 클론으로부터 유래하는 돌연변이는 성공적으로 조합되지만, 선별된 결합 특성의 개선 또는 유지 조차도 보장되지 않는 것을 나타낸다.

실시예 5: 호모- 오량체의 안정화

본래의 모든 기능 형태에 있어서, 그룹명 'A1B5'로 기재된 세균성 홀로톡신은 5개의 B-서브유닛 및 1개의 A-서브유닛을 포함한다. B-서브유닛은 중앙의 '포어'를 가진 오량체환에 조립한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 1개의 A-서브유닛은 상기 링의 정상에 위치하고, 보이드 내로 삽입되어 있다. A-서브유닛 자체는 2개의 별개의 도메인을 포함한다. 홀로톡신이 세포로 전위될 때에 방출되는 A1 도메인은 단백질 복합체의 독성과 연관된 효소 활성을 포함한다. A2 도메인이 홀로톡신의 일부로서 유지된다. 이것은 A1 도메인이 N-말단에 위치하고, C-말단이 5개의 B-서브유닛에 의해 형성된 포어로 돌출되는 알파 나선 구조를 갖는다. A2의 C-말단의 일부 잔기는 B-서브유닛의 잔기와 상호작용을 형성한다. B-서브유닛과 A2 도메인의 특정 잔기 간의 상호작용이 확인되어 있는 바와 같이(Zhang R.G., et al(1995년), A-서브유닛, 구체적으로는 A2 도메인의 존재는 오량체의 B-서브유닛 환을 안정화시키는데 기여한다는 것이 타당하게 제시된다. 특정 이론에 하등 한정되는 것은 아니지만, 2개의 A-서브유닛 도메인 사이의 구조적 및 기능적 차이로 인하여, A2 도메인 단독이 B-서브유닛 오량체에 대해 이러한 안정화 효과를 부여한다고 생각된다. 마찬가지로, B-서브유닛은 A-서브유닛의 완전한 부재시에 오량체환을 형성할 수 있는 것이 알려져 있는 바와 같이, 아마도 A2 도메인과 연합할 수 있으므로, B-서브유닛과 공발현하거나 또는 외부적으로 첨가됨으로써 B-서브유닛 오량체에 안정화 효과를 발휘한다고 추정된다.

합성으로 또는 비자연적으로 발생한 폴리펩티드는 홀로톡신 B-서브유닛과 충분히 유사한 구조를 공유하고, 오량체환을 포함한 다량체에 조립될 수 있고, 또한 홀로톡신 B-서브유닛 중의 A2와 상호작용하는 것과 상응하는 잔기가 같거나 또는 동일한 생물물리학적 특성을 공유한다는 것이 제안되므로, 이러한 합성 단백질 오량체가 유사한 안정화 이점을 경험할 수 있다. 더욱이, 천연의 A2 도메인의 부재시, 합성 폴리펩티드는 '파지 디스플레이'와 같이 당업자에게 익숙한 기술을 이용하여 적합한 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리되고, 오량체에의 조립시 2개 이상의 천연 또는 합성 모노머의 노출면에 적어도 부분적으로 결합하여 구조를 안정화시킬 수 있다는 것이 제안된다.

자연 발생 A2 도메인은 홀로톡신의 그외 다른 성분과 그 자체가 상호작용하지 않는 구조적으로 독립적인 A1 도메인을 지지하므로, 아마도 A2 도메인 또는 기능적 합성 등가물이 또 다른 폴리펩티드 도메인을 고정하는 수단을 제공할 수 있다고 추정된다. 특정 이론에 하등 한정되지 않지만, 서열 ID: 1에 기재된 폴리펩티드와 충분히 유사한 구조를 공유하는 비자연 발생 폴리펩티드는 본 개시 내에 기재된 바와 같이 에피토프를 부착을 가능하게 하는 안정한 오량체환 구조를 표시하는 오량체환을 형성하는 것에 단독으로 기여한다고 생각된다.

장치, 시스템, 및 방법을 소정의 실시형태와 관련하여 기재 및 설명했지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 각종 변형 및 변경이 가해질 수 있는 것은 당업자에게 있어서 명백하다. 따라서, 본 개시는 상기 설명한 방법 또는 구성의 상세를 구체적으로 한정하는 것은 아니지만, 이러한 변형 및 변경은 본 개시의 범위 내에 포함되어야 한다.

채용된 용어 및 표현은 기재 용어로서 사용한 것이고, 한정되는 것은 아니고, 또한 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 이것에 상응하는 특징 또는 그 일부를 개시 및 설명하는 것을 제외하는 것은 아니지만, 각종 변경은 청구된 본 발명의 내용 내에서 가능하다는 것은 인정된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시형태 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 여기에 개시된 개념의 변경 및 변형이 당업자에 의해 가해질 수 있고, 이러한 변경 및 변형은 첨부한 청구범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 고려되어야 하는 것을 이해되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Charlton, Keith A. D'Hondt, Erik A. Verhamme, Daniel T. <120> SELF-ASSEMBLING SYNTHETIC PROTEINS <130> 48199-101CIP <140> US 14/854,224 <141> 2015-09-15 <150> PCT/IB14/01125 <151> 2014-03-17 <150> 61/791,268 <151> 2013-03-15 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Thr Asp Ile Ile Thr Asp Ile Cys Gly Glu Tyr His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Val 20 25 30 Gly Lys Glu Ile Ile Leu Val Asn Phe Lys Gly Gly Ala Thr Phe Gln 35 40 45 Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile 50 55 60 Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Asn Ser Lys 65 70 75 80 Ile Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Lys Thr Pro His Ser Ile Ala Ala 85 90 95 Ile Ser Met Val Arg 100 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Asp Thr Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Cys Cys Val Arg 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His 20 25 30 Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr 35 40 45 Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn 50 55 60 Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala 65 70 75 80 Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val 85 90 95 Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Phe Thr Asp Ile 115 120 125 Ile Thr Asp Ile Cys Gly Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu 130 135 140 Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Val Gly Lys Arg Glu 145 150 155 160 Ile Ile Leu Val Asn Phe Lys Gly Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val 165 170 175 Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met 180 185 190 Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Asn Ser Lys Ile Glu Lys 195 200 205 Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ser Ile Ala Ala Ile Ser 210 215 220 Met Val Arg 225 <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct <400> 3 Ile Gln Asp Gly Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile His Thr Leu Asn Asp Arg Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Ile Ile Leu Val Asn Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Phe Val Ser Thr Leu Gln Ala Ala Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Gly Ala 65 70 75 80 Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Ser Gly 100 <210> 4 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct <400> 4 Ile Gln Asp Gly Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile His Thr Leu Asn Asp Arg Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 20 25 30 Asp Lys Arg Glu Ile Ile Leu Val Asn Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Phe Val Ser Thr Leu Gln Ala Ala Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Asp Ala Tyr Leu Thr Gly Ala 65 70 75 80 Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 115 120 125 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 130 135 140 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 145 150 155 160 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 165 170 175 Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp 180 185 190 Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 195 200 205 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 210 215 220 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 225 230 235 240 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser 245 250 255 Ala Lys Ser <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 5 Ser Ser Gly 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 6 Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 7 Ser Gly Gly 1 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 8 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 10 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 11 Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 12 Ser Gly Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 13 Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 14 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 15 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 16 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 17 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 103 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 18 Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala 65 70 75 80 Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 100

Claims (29)

1. 안정한 호모-다량체로 조립될 수 있는 모노머 폴리펩티드 서열이며, 돌연변이 T1F, P2T, Q3D, N4I, M37I, A38I, I39L, I40V, T41N, T78S, E79N, A80S, A95S, A102V, 및 N103R를 포함하고, 상기 돌연변이는 TPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAY LTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN 에 대해 넘버링된 것인 콜레라톡신 B (CTB) 서브유닛 유래의 세균성 홀로톡신의 A1B5군의 합성 β 서브유닛을 포함하는 모노머 폴리펩티드 서열;
   펩티드 스페이서; 및
   성장 인자 또는 그 일부를 포함하는 폴리펩티드;
   를 포함하고,
   상기 폴리펩티드는 상기 펩티드 스페이서에 의해 상기 합성 β 서브유닛으로부터 분리되는, 재조합 합성 단백질.
2. 제 1 항에 있어서,
   각각의 모노머 폴리펩티드 서열은 1개 이상의 추가 폴리펩티드 서열을 포함하는, 재조합 합성 단백질.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 콜레라톡신 B (CTB) 서브유닛은 L8I, A10G, F25L, A32V, N44G, 및 V82I로 이루어지는 군에서 선택되는 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 합성 단백질.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 성장 인자는 형질전환 성장 인자(TGF) 또는 상피세포 성장 인자(EGF)를 포함하는, 재조합 합성 단백질.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 성장 인자의 일부는 성장 인자의 중화 도메인을 포함하는, 재조합 합성 단백질.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 IGF-1, IGF-2, FGF1, FGF2, TGF-α, TGF-β, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF, NGF, EGF, HGF, BMP, PDL1 및 IL 1-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 성장 인자 중 1개 이상의 전장 또는 그 일부를 더 포함하는, 재조합 합성 단백질.
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 성장 인자는 1개 이상의 성장 인자의 전장 또는 중화 도메인을 단일 도메인으로서 또는 2개 이상의 다중 반복체로서 포함하는, 재조합 합성 단백질.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드 스페이서는 SSG (서열번호 5), SSGGG (서열번호 6), SGG (서열번호 7), GGSGG (서열번호 8), GGGGS (서열번호 9), SSGGGSGGSSG (서열번호 10), GGSGGTSGGGSG (서열번호 11), SGGTSGGGGSGG (서열번호 12), GGSGGTSGGGGSGG (서열번호 13), SSGGGSGGSSG (서열번호 14), SSGGGGSGGGSSG (서열번호 15), SSGGGSGGSSGGG (서열번호 16), 및 SSGGGGSGGGSSGGG (서열번호 17)로 이루이지는 군에서 선택되는, 재조합 합성 단백질.
11. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드 스페이서는 성장 인자 또는 그 중화 도메인의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 합성 단백질.
12. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드 스페이서는 1개 이상의 숙주 T-세포 에피토프를 포함하는, 재조합 합성 단백질.
13. 제 1 항에 기재된 재조합 합성 단백질 1개 이상으로부터 다량체를 조립하여 다가 분자를 형성하는 것을 포함하는, 다가 분자의 제조방법.
14. 제 1 항에 기재된 재조합 합성 단백질 1개 이상을 혼합하여 백신 제제를 얻는 것을 포함하는, 백신 제제의 제조방법.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
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23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
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28. 삭제
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