DE3852761T2

DE3852761T2 - Saponin-hilfsmittel.

Info

Publication number: DE3852761T2
Application number: DE3852761T
Authority: DE
Inventors: Gerald Beltz; Chung-Ho Hung; Charlotte Kensil; Dante Marciani
Original assignee: Cambridge Biotech Corp
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-31
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2008-06-01
Also published as: DK602989A; AU616670B2; EP0362279A4; JPH02504266A; EP0362279A1; DE3852761D1; DK175739B1; EP0362279B2; DK602989D0; CA1331443C; EP0362279B1; DE3852761T3; AU1934088A; ATE116993T1; WO1988009336A1; JP2731563B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunadjuvantien, das Verfahren zur Herstellung derselben und die Verwendung derselben als Immunadjuvantien und Impfstoffe.

KURZE BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

Die US-A-4335 113 (Combier et al.) verweist auf ein triterpenes Saponin, welches aus Caulophyllogenin hergeleitet wurde.
Die JP-A-54-132218 und die JP-A-61-7286 wurden ebenso wie T. Nagasawa et al., Chem. Pharm Bull. 28(7): 2059-2064 (1980) dieser Anmeldung entgegengehalten. Das letztere Dokument bezieht sich auf die Hauptkomponenten von Ginseng-Saponinen. J. Zhou et al., Chem. Pharm. Bull. 290: 2844-2850 (1981), bezieht sich auf die Isolierung von Dammaran-Saponinen aus den Wurzeln von Panax notoginseng.
Kartnig et al., Plante. Med. 23(3): 269-271(1973), bezieht sich auf die Isolierung von drei Saponinbestandteilen, von denen alle Hydrolyseprodukte sind, aus der Rinde von Quillaja saponaria.
A.A. McColm et al., Parasite Immunology 4: 337-347 (1982), bezieht sich auf die Schutzimmunität, welche angeblich durch Injektion eines saponinhältigen Impfstoffes erreicht wurde.
R. Bomford Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 57: 127-131 (1982), betrifft die Verwendung von Saponin als Adjuvans für Antigene.
Quillaja-Saponine sind eine Mischung aus Triterpenglucosiden, extrahiert aus der Rinde des Baums Quillaja saponaria. Rohsaponine wurden ausgiebig als Adjuvans in Impfstoffen gegen Maul- und Klauenseuche und im Verstärken der Schutzimmunität, die durch experimentelle Impfstoffe gegen protozoe Parasiten wie Trypanosoma cruzi Plasmodium übertragen wird, und auch der Reaktion der Körperflüssigkeit auf rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) angewendet. (Bomford, Int. Arch. Allerg. appl. Immun.. 67:127 (1982)). Saponine sind natürliche Produkte, die durch eine Anzahl gemeinsamer Eigenschaften gekennzeichnet sind. Die Fähigkeit, in wässerigen Lösungen Schaum zu produzieren, gab dieser Gruppe den Namen. Weitere Kennzeichen sind die hämolytische Aktivität, die Giftigkeit für Fische, die Komplexbildung mit Cholesterin und in einigen Fällen antibiotische Aktivität. Kofler, Die Saponine (Springer Verlag), Berlin, 1927; Tschesche et al., Chemie und Biologie der Saponine Fortscher. Chem. Org. Naturst. XXX:461 (1972).
Die gemeinsamen Eigenschaften der Saponine widerspiegeln sich nicht in einer gemeinsamen chemischen Zusammensetzung. Obgleich alle Saponine Glycoside sind, können Aglycone zu den Steroiden, den Triterpenoiden oder den Steroidalkaloiden gehören. Die Zahl der Zucker und Zuckerketten, die an den glycosidischen Bindungen haften, kann stark variieren. Saponine werden kommerziell hergestellt und haben viele Verwendungen. Die kommerziell erhältlichen Quillaja Saponine sind Rohmischungen, welche auf Grund ihrer Veränderlichkeit zur Verwendung in der tierärztlichen Praxis oder bei pharmazeutischen Zusammensetzungen für Menschen nicht wünschenswert sind. Auf Grund der Veränderlichkeit und Heterogenität muß jede Charge in Tierexperimenten getestet werden, um die Adjuvansaktivität und Giftigkeit zu bestimmen. Die Verunreinigungen in kommerziell erhältlichen Produkten kann nachteilige Reaktionen hervorrufen. Zusätzlich kann der Inhalt der aktiven Substanzen einer gegebenen Charge von Saponin variieren, wodurch die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge reduziert wird.
Ein früher Versuch, Quillaja Saponinadjuvantien zu reinigen wurde von Dalsgaard, Archiv für die gesamte Virusforschung 44:243 (1974) gemacht. Dalsgaard reinigte teilweise einen wässrigen Extrakt von Saponin Adjuvansmaterial von Quillaja saponaria Molina. Dalsgaards Präparat, kommerziell erhältlich von Superfos unter dem Namen "Quil-A", wurde aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria Molina isoliert und ist chemisch charakterisiert als Kohlenhydratanteil in glycosidische Bindung mit der Triterpenoid-Quillasäure. Wenngleich das Saponin "Quil-A" von Dalsgaard eine wesentliche Verbesserung gegenüber den kommerziell erhältlichen Saponinen darstellt, zeigt es doch beachtliche Heterogenität.
Higuchi et al., Phytochemistry 26:229 (Jänner, 1987), behandelte eine Quillaja Saponinrohmischung mit alkalischer Hydrolyse in 6% NH&sub4;HCO&sub3; in 50% Methanol und erzeugte zwei wesentliche Desacylsaponine, genannt DS-1 und DS-2. Es wurde gezeigt, daß DS-1 Glucuronsäure, Galaktose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Apiose und Quillasäure enthält, während DS-2 dieselben Komponenten mit einer zusätzlichen Glukose enthält. Nebenprodukte dieser Deacylierung erzeugten verschiedene Komponenten einschließlich 3,5-Dihydroxy-6-methyloktansäure, 3,5-Dihydroxy-6-methyloktansäure, 5-0-α-L-Arabinofuranosid und 5-0-α-L-Rhamnopyranosyl-(1T2)-α-L-Arabinofuranosid (Higuchi et al., Phytochemistry 26:2357 (August, 1987)).

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt das Brechungsindexprofil von dialysiertem, methanol-solubilisiertem Quillaja Rindenextrakt auf Umkehrphasen-HPLC.
Figur 2 zeigt die Brechungsindexspitzen der vorigen Probe, verglichen mit den Kohlenhydratspitzen.
Figur 3 zeigt den Vergleich von Superfos "Quil-A" und dialysiertem, methanollöslichem Rindenextrakt durch HPLC.
Figur 4 zeigt die Reinigung von QA-7, QA-17, QA-18, QA-19, und QA-21 von "Quil-A", eine Saponinröhmischung, durch Siliciumdioxid chromatographie (4A) und anschließender Umkehrphasenchromatographie (4B, 4C, 4D).
Figur 5 veranschaulicht die Reinheit von QA-7, QA-17, QA-18, und QA-21 mit Umkehrphasen- (SA) und Normal phasen- (SB) Dünnschichtchromatographie.
Figur 6A zeigt das UV-Spektrum von QA-7. Figur 6B zeigt das UV-Spektrum von QA-17. Figur 6C zeigt das UV-Spektrum von QA-18. Figur 6D zeigt das UV-Spektrum von QA-21.
Figur 7A zeigt 'H Kernspinresonanz ("NMR") von QA-7. Figur 7B zeigt 'H NMR von QA-18. Figur 7C zeigt 'HNMRvon QA-21.
Figur 8A zeigt das Massenspektroskopie-Spektrum bei Beschuß mit schnellen Atomen ("MS-FAB") von QA-7. Figur 8B zeigt das MS-FAB Spektrum von QA-17. Figur 8C zeigt das MS-FAB Spektrum von QA-21.
Figur 9 zeigt das Elutionsprofil von reinen QA-18 Mizellen und reinen QA-21 Mizellen bei Gel-Filtration mit BioGel P-200 in PBS äqulibriert mit der kritischen mizellaren Konzentration desselben Saponins und einen Vergleich mit der Elutionsposition von Standardproteinen.
Figur 10 zeigt die Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A".
Figur 11 zeigt die typischen Titrationsendpunkte für die Immunisierung mit BSA Antigenen in Anwesenheit von HPLC-gereinigten Fraktionen von Rindenextrakt. Die von der antigenspeziflschen Antikörperbindung abhängige Extinktion wurde als Funktion des Logarithmus der Serumverdünnung aufgetragen.
Figur 12 demonstriert den Vergleich der Adjuvanseffekte von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 bei verschiedenen Antigenkonzentrationen und mit Freund's Volladjuvans zur Immunisierung mit dem Antigen BSA.
Figur 13 zeigt den Adjuvanseffekt von HPLC-gereinigten Adjuvantien, die in Verbindung mit Al(OH)&sub3;, einem anderen Adjuvans, verwendet werden, auf die Immunisierung mit dem Antigen gp70R-delta.
Figur 14 faßt die Effekte von HPLC-gereinigten Quillaja Saponinen allein und in Verbindung untereinander und mit einem anderen Adjuvans auf die Immunisierung mit dem akyliertes gp70R-delta Antigen zusammen.
Figur 15 zeigt einen Vergleich der Adjuvanseffekte von QA-18, QA-18H, QA-21 und QA-21H auf die Immunisierung mit dem Antigen BSA.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es besteht Bedarf nach im wesentlichen reinen Saponin, welches als Adjuvans in relativ kleinen Mengen mit geringer Giftigkeit und Nebenwirkungen verwendet werden kann. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung im wesentlichen reine Saponinadjuvantien, das Verfahren zur Reinigung derselben und ein Verfahren für die Verwendung der im wesentlichen reinen Saponine als Immunadjuvantien zur Verfügung. Die Erfindung umfaßt weiters eine Immunreaktion herausfordernde Zusammenstell ungen, umfassend Saponinadjuvantien in Verbindung mit einer Antigenkomponente.
Die Erfindung bezieht sich auf im wesentlichen reine Saponine, wie sie in den unabhängigen Patentansprüchen 1, 2, 5 und 8 definiert sind, und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen und zur Verstärkung der Immunreaktion.
Adjuvanssaponine sind aus einem wässerigen Extrakt der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria Molina identifiziert und gereinigt worden. Zumindest 22 Spitzen mit Saponinaktivität waren trennbar. Die überwiegenden, gereinigten Quillaja-Saponine wurden identifiziert als QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21. Diese Saponine wurden mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Niederdrucksiliciumdioxidchromatographie gereinigt. Diese vier Saponine haben Adjuvanseffekte in Mäusen. QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, gereinigt aus Superfos "Quil-A", einer Quillaja-Saponin Rohaufbereitung, sind bei Mäusen weniger toxisch als "Quil-A"; QA-17 und QA-18 sind bei Katzen weniger toxisch als "Quil-A" (QA-7, QA-21 wurden nicht getestet). Außerdem wurde eine toxische Komponente von Superfos "Quil-A" als QA-19 identifiziert; diese Komponente ist bei Mäusen bei geringeren Dosierungen als "Quil-A" oder QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 toxisch. Die gesteigerte Giftigkeit von QA-19, verglichen mit QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, ist unerwartet, da diese Komponente ein Saponin ist, eine ähnliche Kohlenhydratzusammensetzung hat, bei Mäusen bei geringeren Dosierungen als die toxische Dosierung Adjuvantienaktivität zeigt und ein ähnliches chromatographisches Verhalten aufweist. Alle oben genannten Saponine können von wässrigen Extrakten der Quillaia saponaria Molina-Rinde isoliert werden. Die im wesentlichen reinen Saponine der vorliegenden Erfindung sind als Immunadjuvantien verwendbar und steigern die Immunreaktion bei Individuen bei einer bedeutend geringeren Konzentration als die früher verfügbaren heterogenen Saponinpräparate ohne die toxischen Effekte, die mit Saponin Rohpräparaten verbunden sind. Saponinkomponenten, die bei der Erfindung speziell ins Auge gefaßt wurden, sind QA-7, QA-17 und QA-21, aber nicht QA-18 oder QA-19.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN

Die Saponine der vorliegenden Erfindung können vom Baum Quillaja saponaria Molina erhalten werden.
Der Begriff "Saponin", wie er hierin verwendet wird, umfaßt glykosidische Triterpenoidverbindungen, welche in wässerigen Lösungen Schaum erzeugen, in den meisten Fällen hämolytische Aktivität haben und Immunadjuvansaktivität besitzen. Die Erfindung umfaßt sowohl das Saponin an sich, als auch natürliche und pharmazeutisch zulässige Salze und pharmazeutisch zulässige Derivate. Der Begriff "Saponin" umfaßt auch biologisch aktive Fragmente davon.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen wie immunologische Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere im wesentlichen reine Saponinfragmente beinhalten und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen als Immunadjuvantien.
Der Begriff "Immunadjuvans", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Verbindungen, welche, wenn sie einem Individuum verabreicht oder in vitro getestet werden, die Immunreaktion auf ein Antigen bei einem Individuum oder einem Testsystem, welchen das Antigen verabreicht wurde, erhöhen. Einige Antigene sind schwach immunogen, wenn sie allein verabreicht werden, oder toxisch für das Individuum bei Konzentrationen, welche die Immunreaktion in besagtem Individuum hervorrufen. Ein Immunadjuvans kann die Immunreaktion eines Individuums auf ein Antigen steigern, indem es das Antigen stärker immunogen macht. Die Adjuvanswirkung kann die Dosierung des Antigens auch verringern, die notwendig ist, um eine Immunreaktion in besagtem Individuum zu erreichen.
Die Adjuvansaktivität der Saponine kann mit jedem einer Anzahl von Verfahren bestimmt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die Zunahme im Titer von Antikörpern gegen bestimmte Antigene nach Verabreichung eines Adjuvans kann als Kriterium für die Adjuvansaktivität verwendet werden (Dalsgaard, K. (1978), Acta Veterinia Scandinavica 69. 1-40, Scott, M.T., Gross-Samsom, M., and Bomford, R. (1985), Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77 409-412). In Kürze gesagt, umfaßt ein derartiger Test die Injektion bei CD-1 Mäusen intradermal mit einem Antigen, das mit unterschiedlichen Mengen eines möglichen Adjuvans vermischt ist (beispielsweise Rindereiweißserum, BSA). Die Seren wurden zwei Wochen später von Mäusen gewonnen und mittels ELISA auf Anti-BSA Antikörper getestet. Ein Vergleich der Adjuvanseffekte des dialysierten, methanollöslichen Rindenextrakts und "Quil-A" zeigte, daß, wenn das Antigen BSA in Anwesenheit von Saponinpräparaten verabreicht worden war, die Antikörpertiter um zwei Größenordnungen größer waren, als wenn BSA allein mit PBS verabreicht worden war. Der Rindenextrakt besaß gute Adjuvansaktivität, wenn es in einer Adjuvansdosierung von 12 µg Kohlenhydrat (wie mittels Anthron analysiert wurde) oder mehr verabreicht wurde. Die Adjuvansansprechung auf "Quil-A" war niedriger als für den Rindenextrakt, war aber offensichtlich bei Dosierungen im Bereich von 9-23 µg Kohlenhydrat. Das Kohlenhydratgewicht (bestimmt durch Testen mit Anthron unter Verwendung von Glucose als Standard) ist ungefähr 30% des Trockengewichtes dieser Adjuvans-Rohextrakte. Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet im wesentlichen frei von Verbindungen, welche normalerweise mit dem Saponin in seinem Naturzustand assoziert sind und konstante und eine reproduzierbare chromatographische Reaktion, Elutionsprofile und biologische Aktivität aufweisen. Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet nicht, künstliche oder synthetische Mischungen der Saponine mit anderen Verbindungen auszuschließen.
Das im wesentlichen reine Saponin ist vorzugsweise gereinigt nach einem oder mehreren der folgenden Standards: 1) es erscheint als ausschließliches einzelnes Kohleiihydrat-Hauptfarbband auf Silikagel TLC (EM Science HPTLC Si60) in einem Lösungssystem von 40mM Essigsäure in Chloroform/Methanol/Wasser (60/45/10, Vol/Vol/Vol), 2) es erscheint als ausschließliches einzelnes Kohlenhydrat-Hauptfarbband auf Umkehrphasen-TLC (EM Science Silikagel RP-8) in einem Lösungssystem von MethanollWasser (70130, Vol/Vol), 3) es erscheint als ausschließliche einzelne Hauptspitze bei Umkehrphasen-HPLC auf Vydac C&sub4; (5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID x 25 cm L) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, Vol/Vol).
In der bevorzugten Ausgestaltung wird das Saponinadjuvans der vorliegenden Erfindung aus Quillaja saponaria Molina Rinde gereinigt. Wässerige Extrakte der Quillaja saponaria Molina Rinde wurden gegen Wasser dialysiert. Der dialysierte Extrakt wurde bis zur Trockenheit gefiiergetrocknet, mit Methanol extrahiert, und der methanollösliche Extrakt wurde weiter mit Silciumdioxidchromatographie und mit
Umkehrphasen-Hochdrucldlüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) fraktioniert. Die einzelnen Saponine wurden durch Umkehrphasen-HPLC, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrennt. Zumindest 22 Spitzen (bezeichnet als QA-i bis QA-22) waren trennbar. Jede Spitze korrespondiert, wie in Figur 2 gezeigt, mit einer Kohlenhydratspitze und zeigt nur ein Einfachband bei der Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie. Die einzelnen Komponenten wurden durch die Retentionszeitmessung auf einer Vydac C&sub4; HPLC-Säule als die folgenden identifiziert: Spitze Retentionszeit (Minuten) Lösungsmittelfront
Die Immunadjuvansaktivität wurde durch Messen der Fähigkeit der gereinigten Saponine, die Immunreaktion in Mäusen auf exogen verabreichte Antigene getestet. Die gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung zeigen Adjuvanseffekte bei geringeren Dosierungen als die Rohextrakte. Insbesondere die vorherrschenden Saponine im Rindenextrakt (QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21) zeigen Adjuvansaktivität bei Dosierungen von 4,5 µg Kohlenhydrat oder weniger (wie mittels Anthron analysiert wurde). Die gereinigten Saponine wurden weiters gekennzeichnet durch den Kohlenhydratgehalt, Umkehrphasen- und Normalphasen-TLC, UV, Infrarot, NMR Spektren und Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen.
Der durchschnittliche Abtötungskoeffizient, der für 1% (Gew/Vol) Lösungen in Methanol bei 205 nm von einigen der bevorzugteren gereinigten Saponine bestimmt wurde, stellt sich wie folgt dar:
In einigen Fällen wurde der Kohlenhydratgehalt verwendet, um die Saponine zu quantifizieren. Zur Kohlenhydratanalyse wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, die Anthronmethode von Scott und Melvin (Anal. Chem. 25:1656 (1953)) unter Verwendung von Glucose als Standard angewendet. Diese Analyse wurde verwendet, um das Verhältnis des Ausmaßes der Anthronreaktion (ausgedrückt in Glucoseäquivalenten) pro mg gereinigten Saponins (Trockengewicht) zu bestimmen, so daß das Trockengewicht eines bestimmten Präparats durch die Verwendung der Anthronanalyse geschätzt werden konnte. Es muß darauf hingewiesen werden, daß Unterschiede in der Reaktionsfähigkeit mit Anthron für verschiedene Saponine eher durch die Kohlenhydratzusammensetzung als durch die Menge hervorgerufen werden sein könnte, da unterschiedliche Monosaccharide in dieser Analyse unterschiedlich reagieren.
Das im wesentlichen reine QA-7 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 35% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 9 - 10 Minuten auf RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID X 25 cm L in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; VolfVol) bei einer Durchflußrate von 1 mllmin aufweist, mit 52-53% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,06% in Wasser und 0,07% in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf\veist, keine feststellbare Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 200 µg/ml oder weniger verursacht, und die Monosaccharidrückstände terminale Rhamnose, terminale Xylose, terminale Glucose, terminale Galactose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose, 2,3-Fucose, 2,3-Glucuronsäure und Apiose (Bindung nicht bestimmt) enthält.
Das im wesentlichen reine QA-17 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität auf\veist, ungefähr 29% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 35 Minuten auf RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol/Vol) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 20 63-64% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,06% (Gew/Vol) in Wasser und 0,03% (Gew/Vol) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 µg/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharidrückstände terminale Rhamnose, terminale Xylose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose, 2,3-Glucuronsaure, terminale Glucose, 2-Arabinose, terminale Galactose und Apiose (Bindung nicht bestimmt) enthält.
Das im wesentlichen reine QA-18 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivitat aufweist, ungefahr 25-26% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthalt wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefahr 38 Minuten auf RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Saule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol/Vol) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 64-65% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,04% (Gew/Vol) in Wasser und 0,02% (Gew/Vol) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 ptg/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharide terminale Rhamnose, terminale Apiose, terminale Xylose, terminale Glucose, terminale Galactose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure enthält.
Das im wesentlichen reine QA-21 Saponin ist dadurch gekennzeichnet, daß es Immunadjuvansaktivität aufweist, ungefähr 22% Kohlenhydrat im Trockengewicht enthält (wie mittels Anthron analysiert wurde), ein UV-Absorptionsmaximum bei 205-210 nm, eine Retentionszeit von ungefähr 51 Minuten auf RP-HPLC auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol/Vol) bei einer Durchflußrate von 1 ml/min aufweist, mit 69-70% Methanol von einer Vydac C&sub4;-Säule mit 5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 10 mm ID X 25 cm L, in einer Lösung von 40 mM Essigsäure mit Gradientenelution von 50 bis 80% Methanol eluiert, eine kritische Mizellkonzentration von ungefähr 0,03% (Gew/Vol) in Wasser und 0,02% (Gew/Vol) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist, eine Hämolyse von roten Blutkörperchen von Schafen bei Konzentrationen von 25 µg/ml oder höher verursacht, und die Monosaccharide terminale Rhamnose, terminale Arabinose, terminale Apiose, terminale Xylose, 4-Rhamnose, terminale Glucose, terminale Galactose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure enthält.
Der Begriff "Individuum" bedeutet jedes Tier, welches Immunreaktionen hervorbringen kann, inklusive des Menschen.
Die gereinigten Saponine zeigen über einen weiten Bereich von Dosierungen, in denen sie verabreicht werden, und über einen weiten Bereich von Verhältnissen zu den verabreichten Antigenen Adjuvanseffekte. In einer Ausgestaltung werden die Saponine in einem Verhältnis von Adjuvans zu Antigen (Gew/Gew) von 3,0 oder weniger, vorzugsweise 1,0 oder weniger, verabreicht.
Die gereinigten Saponine können entweder einzeln oder vermischt mit anderen, im wesentlichen reinen Adjuvantien verabreicht werden, um eine Steigerung der Immunreaktion auf Antigene zu erreichen. Unter den Adjuvansmischungen, die in der vorliegenden Erfindung wirksam sind, sind Anteile von QA-7 und QA-17.
Gereinigte Saponine können auch gemeinsam mit Nicht-Saponin Adjuvantien verabreicht werden. Derartige, mit der vorliegenden Erfindung brauchbare Nicht-Saponin Adjuvantien sind Öladjuvantien (zum Beispiel Freund's Complete und Incomplete), Liposome, Mineralsalze (zum Beispiel AlK(SO&sub4;)&sub2;, AlNa(SO&sub4;)&sub2;, AlNH&sub4;(SO&sub4;), Siliciumdioxid, Alaun, Al(OH)&sub3;, Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, Kaolin und Kohlenstoft), Polynukleotide (zum Beispiel Poly-IC und Poly-AU-Säuren) und bestimmte natürliche Substanzen (zum Beispiel Wachs D vom Mycobacterium tubercolosis, als auch Substanzen, die man in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitglieder der Gattung Brucella findet).
Die gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung können zur Verstärkung der Immunreaktion auf jedes Antigen verwendet werden. Typische Antigene, die für Immunreaktion hervorrufenden Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung passen, beinhalten Antigene, die von irgendeinem der folgenden hergeleitet sind: Viren wie Influenza, Tollwut, Masern, Hepatitis B, Maul- und Klauenseuche oder HTLV-III; Bakterien wie Milzbrand, Diphtherie oder Tuberkulose; oder Protozoon wie Babeosis bovis oder Plasmodium.
Ein besonderes Beispiel ist die Verwendung der gereinigten Saponine der vorliegenden Erfindung zur Verstärkung der Immunreaktion auf rekombinantes gp70 Protein. Ein rekombinantes gp70 Protein ist ein Antigen, welches den Polypeptidanteil von FeLV gp70 Hüllprotein enthält. Dieses rekombinante Antigen wird als "gp70R", "rec-gp70" oder "Rgp70" bezeichnet. Ein anderes Antigenpräparate, welches den Polypeptidanteil von FeLV gp70 zusammen mit den 40 Amino-terminalen Aminosäuren (als "Rgp70-delta" bezeichnet) oder mit der gesamten Arninosäuresequenz (als "Rgp90" bezeichnet) des p15e Hüllproteins der FeLV Untergruppe A enthält, wird unter Verwendung von DNA Rekombinationstechniken hergestellt. Diese rekombinanten gp70 enthaltenden Polypeptide, gp70R, gp70R-delta und gp90R werden in der Folge allgemein als gp70-enthaltendes Protein bezeichnet. Mit dem Ausdruck gp70-enthaltendes Protein ist beabsichtigt, dieselbe Aminosäuresequenz als das natürlich vorkommende gp70-enthaltende Protein aufweisende Polypeptide und Analoge einzuschließen. Mit dem Begriff "Analoge" ist beabsichtigt, Proteine oder Polypeptide einzuschließen, welche von gp70, gp70-delta oder gp90 durch Hinzufügen, Entfernen oder Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren verschieden sind, vorausgesetzt, daß die genannten Polypeptide im wesentlichen die biologische Aktivität von gp70 Proteinen zeigen.
Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbare Verabreichung der Verbindungen kann parenteral, intravenös, intramusculär, subcutan, intranasal oder in jeder anderen passenden Form erfolgen. Die verabreichte Dosierung kann vom Alter, Gewicht, gegebenenfalls von der Art einer gleichzeitigen Behandlung und von der Art der verabreichten Antigene abhängen. Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbare, tatsächliche Zusammensetzung kann in Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elexieren für mündliche Verabreichung oder sterile, flüssige Formen wie Lösungen oder Suspensionen verwendet werden. Jede inerte Trägersubstanz wie Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder jede derartige Trägersubstanz, in welcher die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen passende Löslichkeitseigenschaften für die Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung haben, kann vorzugsweise verwendet werden.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, kann dieselbe durch Verweis auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden, welche Beispiele, soweit nicht ausdrücklich Gegenteiliges festgestellt wird, nicht als beschränkend betrachtet werden. BEISPIEL

VORBEREITENDE ZUBEREITUNG VON QUILLAJA SAPONARIA MOLINA RINDENEXTRAKT

Quillaja saponaria Molina Rinde wurde mit einem Überschuß von Wasser (10% Gew/Vol) gerührt, um die Saponine zu extrahieren. Der wäßrige Extrakt wurde anschließend gefiltert und in 0,1% NaN&sub3; gelagert. 150 ml dieses Extrakts wurden bei 20.000 x g 30 Minuten zentrifügiert, um die verbleibenden Rindenfragmente zu entfernen. Der Überstand, welcher leicht braun war, wurde lyophilisiert, in 16 ml Wasser erneut gelöst und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 160 µl von 1 N Essigsäure auf weniger als 4 eingestellt. Die Lösung wurde in einer Dialyseröhre mit einer 12.000 MW Trennung plaziert und gegen 1 Liter Wasser dialysiert. Das Wasser wurde nach 8 Stunden Dialyse gewechselt und der Dialyse wurde ermöglicht, über Nacht fortzuschreiten. Nach dem ersten und zweiten Dialysezyklus wurden Proben der Dialysate gezogen. Der dialysierte Extrakt wurde lyophilisiert und mit 40 ml Methanol bei 60ºC 15 Minuten extrahiert und anschließend zum Absetzen des ungelösten Materials bei 1.000 x g 10 Minuten zentrifugiert. Dieses Material wurde zwei zusätzlichen Extraktionen mit Methanol ausgesetzt. Die Methanolextrakte wurden zusammengefaßt, in einem Rotationsevaporator zur Trockenheit eingedampft, in 5,5 ml Methanol erneut gelöst und durch ein 0,2 µ Nylon-66-Sieb filtriert, um verbleibendes, ungelöstes Material zu entfernen. Die Bestandteile wurden durch Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (RP-TLC) auf C8 Platten (E.M. Science RP-TLC, C8) in einem Lösungssystem von 70% Methanol / 30% Wasser oder durch Normalphasen-Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxid 60 TLC Platten in einem Lösungssystem von n-Butanol, Äthanol, Wasser und Ammoniak (30/60/29/21, Vol\Vol\Vol\Vol) analysiert. Die Kohlenhydratbänder wurden mit Bial's Reagens sichtbar gemacht, wodurch alle wesentlichen durch Carbonisieren mit Schwefelsäure aufflndbaren
Banden mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber der Schwefelsäurecarbonisierungsmethode bestimmbar waren. Die Bial's-Reagens-Kohlenhydratfärbung wurden routinemäßig als Nachweisreagens auf TLC Platten verwendet. Alle wesentlichen Banden wurden glykosyliert.
Die Dialyse entfernte ein wesentliches kohlenhydrathältiges Band (RF = 0,82 auf EM Science RP TLC, C8 in Methanol/Wasser (70/30, Vol/Vol)), ebenso wie einige unbedeutende Komponenten. Zusätzlich entfernte die Dialyse Komponenten mit starken Absorptionsmaxima bei 280 und 310 nm. Ungefähr 80% der Kohlenhydrate (wie mittels Anthron analysiert wurde) wurden durch die Dialyse entfernt, hingegen blieben etwa 95% der hämolytischen Aktivität während der Dialyse. erhalten.
Von den meisten Saponinadjuvantien ist bekannt, daß sie Detergenseigenschaften, wie die Hämolyse roter Blutkörperchen, aufweisen, daher ist die Erhaltung der hämolytischen Aktivität ein grober Indikator für die Retention der Adjuvanssaponine. Einige Banden blieben bei der Dialyse erhalten und zeigten somit ihre Detergentnatur an. Methanol löste alle im dialysierten Extrakt vorhanden TLC-Banden außer einem TLC-Band (RF = 0 auf Umkehrphasen- und ebenso auf Siliciumdioxid-TLC-Platten). Das methanolunlöslich Material war rötlich braun. Das Material, welches methanollöslich war, erschien nach der Lyophilisation weiß.
Die Kohlenhydratkonzentration wurde nach dem Verfahren von Scott und Melvin (Scott, T.A., und Melvin, E.H. Anal. Chem. 25. 1656 (1953)) bestimmt. Kurzgesagt, wird eine zu testende wäßrige Probe oder Glucose als Standardkohlenhydratlösung (450 µl) mit 900 µl von 0,2% Anthron (Gew/Vol) in Schwefelsäure gemischt und 16 min bei 90-100 C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 625 nm gemessen. Glucose wurde als Standard verwendet.
Die hämolytische Aktivität der Proben wurde wie folgt bestimmt: kurzgesagt, wurden die Proben in einer Rundbodenmikrotiterplatte mit 1:2 Verdünnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in aufeinanderfolgenden Reihen (100 µl/ Vertiefung) verdünnt. 10 µl normales Hasenblut in Alsevers-Lösung (Hazelton) wurde zu jeder Vertiefung dazugegeben und gemischt. Die Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend in einem Sorvall RT6000 zentrifugiert, um nichthämolysierte Zellen abzusetzen. Die Abwesenheit der Hämolyse wurde durch die Anwesenheit eines Kügelchens nichthämolysierter Zellen am Boden der Vertiefung bestimmt.

BEISPIEL 2

VERGLEICH VON DIALYSIERTEM, METHANOLLÖSLICHEN RINDENEXTRAKT MIT SUPERFOS "QUIL-A" DURCH TLC UND HPLC

Superfos "Quil-A" und dialysierte, methanollösliche Komponenten des Rindenextrakts, welche wie in Beispiel 1 präpariert wurden, wurden mit Umkehrphasen-TLC, wie im Beispiel 1 beschrieben, verglichen. Alle Banden, die im Rindenextrakt nach der Dialyse und Solubilisation mit Methanol vorhanden waren, waren auch in "Quil-A" vorhanden. Zusätzlich enthielt "Quil-A" eine Bande mit rf=0 auf Umkehrphasen-TLC-Platten; diese Komponente wurde durch die oben beschriebene Methanolsolubilisation entfernt. Die Ähnlichkeit in der Zusammensetzung von dialysiertem, methanollöslichem Rindenextrakt und "Quil-A" wurde durch HPLC bestätigt. Die einzelnen Komponenten des Rindenextrakts waren durch Umkehrphasen-HPLC auf Vydac C&sub4; (5 µm Teilchengröße, 330 Å Poren, 4,6 mm ID x 25 cm L) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, Vol/Vol) trennbar. Der Brechungsindex der einzelnen Bestandteile wurde bestimmt. Figur 1 stellt das Brechungsindexprofil der Spitzen (benannt QA-1 bis QA-22 in der Ordnung ansteigender Retentionszeiten) vom RP-HPLC dar. Das relative Verhältnis von jeder Spitze in Rindenextrakt und in Superfos "Quil-A" ist in untenstehender Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Relatives Verhältnis der HPLC-Anteile von Saponinrohextrakt und Superfos "Quil-A" (Brechungskoefflzient) Prozent der Gesamtsumme (Spitzen 2-21) HPLC-Anteil Dialysierter, methanollöslicher Rindenextrakt Superfos "Quil-A"
Die individuellen Spitzenstimmen mit einzelnen Dünnschichtchromatographiebanden auf Umkehrphasen-TLC-Platten überein. Ein anderes typischen Experiment, das in Figur 2 gezeigt wird, demonstriert, daß die Spitzen des Brechungskoeftizienten auch mit den Kohlenhydratspitzen übereinstimmen, was bestätigt, daß alle wesentlichen Komponenten des Rindenextrakts Glycoside (HPLC Anteile analysiert auf Kohlenhydrate durch die Anthronanalyse) sind.
Dialysiertes, methanollösliches Rindenextrakt und "Quil-A" wurden in diesem HPLC-System direkt verglichen. Die einzelnen Komponenten wurden durch die Retentionszeit identifiziert. Alle Spitzen, die in dialysiertem, methanollöslichen Rindenextrakt vorhanden waren, waren auch in "Quil-A" in ähnlichen Verhältnissen mit der Ausnahme eines höheren Verhältnisses der Komponente QA-8 und eines geringeren Verhältnisses der Komponente QA-17 in Superfos "Quil-A", verglichen mit dem Rindenextrakt, vorhanden. Figur 3 zeigt einen Vergleich von dialysiertem, methanollöslichen Rindenextrakt mit Superfos "Quil-A" unter Verwendung eines semipräparativen Vydac C&sub4; (10 mm ID x 25 cm L, 330 Å Porengröße, 5 µm Teilchengröße). Der Probe wird 50% Methanol in 40 mM Essigsäure zugesetzt und ein Methanolgradient in 40 mM Essigsäure wird verwendet (dargestellt in Figur 3), um die Proben zu eluieren. Die Extinktion wurde bei 214 nm gemessen. Verschiedene Proben von Quillaja Rinde wurden extrahiert und mit HPLC analysiert. Es wurde einiges an Unterschiedlichkeit der relativen Verhältnisse der einzelnen Spitzen gefunden, es waren aber immer dieselben Spitzen vorhanden. Es ist derzeit nicht bekannt, ob die Unterschiedlichkeit in den Verhältnissen auf Unterschiedlichkeiten in der Effizienz des Extraktionsprozesses oder auf Rinde verschiedener Quellen zurückzuführen ist. Auf Grund der bequemen Verfugbarkeit von "Quil-A" und der dem Rindenextrakt ähnlichen Zusammensetzung wurde "Quil-A" verwendet, um mg-Mengen von Material herzustellen. Adjuvansaktivität in Mäusen unter Verwendung von BSA als Antigen wurde als den Spitzen 4, 7, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 (Tabelle 2) bei Dosierungen von 3,0 µg Kohlenhydrat (bestimmt mit der Anthronanalyse) zugehörig gefunden. Die von der Antigen-spezifische Antikörper-Bindung (zwei Wochen nach Immunisierung, bestimmt durch ELISA) bei einer Serumverdünnung von 1:10 abhängige dekadische Extinktion liefert eine semiquantitative Schätzung der Adjuvantienaktivität (im Bereich von 0,07 bei in 15 Abwesenheit von Adjuvantien immunisierten Mäusen bis zu 1,24 bei unter Vorhandensein von QA-20 immunisierten Mäusen). Tabelle 2: Adjuvantienaktivität in Mäusen HPLC Anteil Adjuvantien Dosierung (µg Kohlenhydrat) Extinktion* (410 nm) *Die Extinktion ist abhängig von der Antigen-spezifischen Antikörper-Bindung bei einer Serumsverdünnung von 1:10.
Auf Grund des Übergewichtes der Spitzen QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 im Rindenextrakt wurden diese vier Komponenten in einem größeren Rahmen gereinigt, wie in den untenstehenden Beispielen 3 und 4 beschrieben ist. QA- 18 ist für Vergleichszwecke vorgesehen.

BEISPIEL 3

REINIGUNG MIT SILICIUMDIOXIDCHROMATOGRAPHIE

1 Gramm "Quil-A" wurde in 75 ml Methanol suspendiert, 15 Minuten auf 60ºC erhitzt und filtriert. Das ungelöste Material wurde ein zweites Mal mit 50 ml Methanol bei 60ºC extrahiert und filtriert. Die Filtrate wurden auf einem Rotoevaporator zur Trockenheit eingedampft. Eine Lichropep Silica Si60 Säule (E.M. Science, 25 mm ID x 310 m L, 40-63 m Teilchengröße) wurde voräqulibriert in 40 mM Essigsäure in Chloroform/Methanol/Wasser (62/32/6, Vol/Vol/Vol).
Das getrocknete "Quil-A", eine Saponinenrohmischung, wurde in 5 ml Säulenlösungsmittel gelöst und durch das Siliciumdioxid isokratisch in diesem Lösungsmittelsystem bei einer Durchflußrate von 1 ml/min eluiert. Kohlenhydratanalysen, Dünnschichtchromatographie und HPLC wurden verwendet, um die Fraktionen von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 aufzuzeigen. Die Fraktionen 19-30 wurden in QA-21 angereichert und für die weitere Reinigung von QA-21 zusammengefaßt. Die Fraktionen 31-60 wurden in QA-8 und QA- 18 angereichert und zur weiteren Reinigung dieser Komponenten zusammengefaßt. Die Fraktionen 85-104 wurden mit QA-7 und QA-17 angereichert und zur weiteren Reinigung dieser Komponenten zusammengefaßt. Diese Zusammenfassungen wurden vor der weiteren Reinigung schnellverdampft.

BEISPIEL 4

WEITERE REINIGUNG DURCH UMKEHRPHASEN-HPLC

Die Siliciudioxidfraktionen wurden weiter gereinigt durch semipräparative Umkehrphasen-HPLC auf Vydac C&sub4; (10 mm ID x 25 cm L), Figur 4. Siliciudioxidfraktionen (10-20 mg) wurden im entsprechenden Lösungsmittel gelöst und auf Vydac C&sub4; gebracht. Ein Methanolgradient wurde verwendet, um die Fraktionen zu eluieren. Die Durchflußrate war 3 ml pro Minute. Die Fraktionen wurden bei einer Extinktion von 214 nm festgestellt. Figur 4B zeigt die Reinigung von QA-21 aus den Siliciudioxidfraktionen 19-30 unter Anwendung isokratischer Separation in 40 mM Essigsäure in 58% Methanol/42% Wasser. Die Fraktionen, welche mit einer Retentionszeit zwischen 65 und 72 Minuten eluierten, wurden durch Umkehrphasen-TLC als QA-21 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Figur 4C zeigt die Reinigung von QA-18 von den Siliciudioxidfraktionen 31-60 unter Verwendung eines Methanolgradienten in 40 mM Essigsäure (50-56% Methanol/0-10 min, 56-69% Methanol/10-79 min). Die Fraktionen, die mit einer Retentionszeit zwischen 46 und 48 Minuten eluierten, wurden durch Umkehrphasen-TLC als QA-18 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Figur 4D zeigt die Reinigung von QA-7 und QA-17 aus den Siliciudioxidfraktionen 85-104 unter Verwendung desselben Gradienten, wie er in Figur 4C verwendet wurde. Fraktionen, die mit einer Retentionszeit zwischen 21 und 23 Minuten eluierten, wurden durch Umkehrphasen-TLC als QA-7 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Fraktionen, die mit einer Retentionszeit zwischen 44 und 46 Minuten eluierten, wurden durch Umkehrphasen-TLC als QA-17 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt.

BEISPIEL 5

REINHEIT UND CHARAKTERISIERUNG DER DURCH SILICIUMDIOXID- UND UMKEHRPHASENCHROMATOGRAPHIE GEREINIGTEN ADJUVANTIEN

REINHEIT

Figur 5a zeigt eine Umkehrphasen-TLC (E.M. Science RP-TLC, C8 (Lösungsmittel = 70% Methanol, Visualisierungsspray = Bial's Reagens)). Jeweils 5 ptg von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, welche entsprechend der Beispiele 3 und 4 gereinigt worden waren, wurden chromatographiert. Jedes der Adjuvantien erschien als Einzelbande in diesem TLC System.
Figur 5b zeigt die Fraktionen QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und "Quil-A" auf EM Si60 HPTLC Platte (Lösungsmittel = 40 mM Essigsäure in Chloroform/Methanol, H&sub2;O (60/45/10, Vol/Vol/Vol), Visualisierungsspray = Bial's Reagens). Jeweils 2 ptg von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21, gereinigt wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben, und 20 µg "Quil-A", ein Saponinrohextrakt, wurden chromatographiert. Das HPLC-gereinigte Material erschien überwiegend als Einzelbande.

SPEKTROSKOPIE

Die UV-Spektren von QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 in Methanol sind in dieser Reihenfolge in den Figuren 6A-D gezeigt. Dalsgaard's (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavica Supp. 69:1-40 (1978)) Adjuvansfraktion hatte eine Spitze der Extinktion bei 280 nm; jedoch haben die HPLC-gereinigten Fraktionen der vorliegenden Erfindung nicht diese Spitze bei 280 nm, aber eine wesentliche Spitze zwischen 200 und 220 nm mit einer bei 260 nm zentrierten Schulter.
Fouriertransformation-Infrarotresonanz ("FT-IR")-Spektren zeigten geringe Unterschiede zwischen den Adjuvantien, was die Vermutung nahelegt, daß alle dieselben funktionellen Gruppen haben. Obwohl eine Identifikation der Struktur nicht vom IR gemacht werden kann, sind die Spektraldaten konsistent mit der Anwesenheit einer Carboxylgruppe, wie es von Dalsgaard (Dalsgaard, K., supra) vermutet wurde.
'H-NMR der gereinigten Saponine in CD&sub3;OD bei 250 MHz zeigt die komplexe Natur der gereinigten Saponine QA-7 (Figur 7A), QA-18 (Figur 7B) und QA-21 (Figur 7C). Die Signale im Bereich zwischen 4,1 und 5,4 ppm demonstrieren klar die Anwesenheit von Vielfachsignalen von den anomeren Protonen der Monosaccharide, was eine Vielzahl von verbliebenen Monosacchariden anzeigt. Die NMR Spektren der Saponine sind jedoch zu komplex, um eine Strukturbestimmung zu ermöglichen.
MS-FAB der gereinigten Saponine QA-7, QA-17 und QA-21 (Figuren 8A, 8B bzw. 8C) zeigten ungefähre pseudomolekulare Ionenmassen von 1870, 2310 bzw. 1980. MS-FAB wurde von QA-18 auf Grund der Schwierigkeiten beim Lösen dieser Komponente nicht bestimmt. Diese Molekulargewichte sind in Ubereinstimmung mit den für ein Triterpen, welches mit acht bis zehn Monosaccharidresten verbunden ist, erwarteten und sind im gleichen Bereich der monomeren Molekulargewichte, die durch Größenausschluß-HPLC von gereinigten Saponinen in Methanol (Zorbax PSM 60 Si Säule, 25 cm x 6,2 mm, 1 ml/min Durchflußrate, Molekulargewichtsstandard = 18-β-Glycrrhetinsäure und Ginenosid Rb&sub1;) bestimmt wurden, was ungefähre Molekulargewichte von 2600, 2400, 1800 bzw. 2400 für QA-7, QA-17, QA-18 bzw. QA-21 ergab. Der Unterschied zwischen FAB-MS und Größenausschluß-HPLC sind höchstwahrscheinlich auf Unterschiede in der Form zwischen den Saponinen und den Molekulargewichtsstandards zurückzuführen.

KOHLENHYDRATZUSAMMENSETZUNG

Die untenstehende Tabelle 3 zeigt die Kohlenhydratzusammensetzung und die Bindungsanalyse der gereinigten Saponine QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und QA-19. Das Kohlenhydrat in den Saponinen wurde durch Erwärmen von 0,2 mg Saponin in 0,3 mi 2 N Trifluoressigsäure, welche 0,1 mg/ml Inosit enthielt, für zwei Stunden bei 120ºC in Alditolazetat umgewandelt. Die Säure wurde unter Luftstrom entfernt, verbleibende Säure wurde durch Zugabe von Isopropanol (2 x 0,25 ml) und anschließendem Trockenblasen mit Luft entfernt. Der erhaltene Trockenrückstand wurde in 1 M Ammoniumhydroxid (0,25 ml), welches 10 mg/ml Natriumbordeuterid enthielt, gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Eisessig (0, 1 ml) wurde hinzugegeben und die Lösung trockengeblasen. Verbleibende Borate wurden durch Mitdestillation mit 10% Essigsaure in Methanol (3 X 0,25 ml) und anschließend mit Methanol (2 x 0,25 ml) entfernt. Der Trockenruckstand in Essigsäureanhydrid (0,1 ml) und Pyridin (0,1 ml) wurde 20 Minuten bei 120 0C erwärmt. Toluol (9,02 ml) wurde der abgekühlten Lösung zugegeben und die Lösungsmittel unter Luftstrom entfernt. Dieses Verfahren der Zugabe von Toluol und Entfernung von Pyridin und Essigsäureanhydrid wurde zweimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan (0,5 ml) aufgenommen und mit Wasser extrahiert (0,5 ml). Die organische Phase wurde in eine saubere Röhre transferiert und getrocknet. Vor der GLC-Analyse (Flüssigkeits-Gas-Chromatographie) wurde der Rückstand in Azeton (0, 1 ml) aufgelöst. Die Alditolazetate wurden auf einer 5P2330 Kapillar-GLC Säule (30 m x 0,25 mm) bei 235ºC mit einem Flammen-Ionisations-Detektor analysiert. Die Kohlenhydrate in den Saponinen wurden in trimethylsilatierte Methylglycoside durch 16-stündiges Erhitzen auf 80ºC von 0,1 mg der Probe in 50 µg/ml Inositol enthaltender methanolischer HCl (0,3 ml) umgewandelt. Die Probe wurde trockengeblasen und verbleibende Säure durch Zugabe von t-Butyl-Alkohol (2 x 0,25 ml) und anschließend er Trocknung unter Luftstrom entfernt. Der Trockenrückstand wurde in einer Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorosilan (5:1:0,5 Vol/Vol, "Tri-Sil") enthaltenden Lösung (0,2 ml) aufgelöst und 20 Minuten auf 80ºC erhitzt. Das silylierende Reagens wurde bei Raumtemperatur verdampft und der Rückstand in Hexan (1 ml) aufgelöst. Nach Entfernen des unlöslichen Rückstandes durch Filtration unter Verwendung eines Glaswollbausches wurde das Filtrat in eine reine Röhre transferiert und eingedampft. Vor der GLC-Analyse wurde der Rückstand in Hexan (0,2 ml) aufgelöst. Die trimethylsilatierten Methylglycoside wurden auf einer GLC Säule von geschmolzenen Siliciumdioxid DB1 (25 m x 0,25 mm) 3 Minuten bei 160ºC und anschließend mit einer Zunahme von 20/min auf 200ºC und dann mit einer Zunahme von 100/min auf 260ºC mit einem Flammen-Ionisations-Detektor analysiert.
Glycosidbindungsanalysen wurden mit der folgenden Methode durchgeftihrt: Zu der in trockenen Dimethylsulfoxid (0,2 ml) aufgelösten Probe (l mg) wurden 0,2 ml Kalium-Dimethylsulfinyl-Anion (2 M) beigegeben und die Mischung 12 Stunden unter Argon gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Eis gekühlt, und Methyliodid (0,2 ml) wurde tröpfchenweise beigegeben. Die verbleibende Mischung wurde beschallt und bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Das methylierte Material wurde unter Verwendung von Sep-Pak C&sub1;&sub8; Kartuschen, die mit Äthanol (20 ml), Azetonitril (8 ml) und Wasser (10 ml) konditioniert waren, isoliert. Wasser (1 ml) wurde der Methylationsreaktionsmischung zugegeben und der Uberschuß von Methyliodid mittels Stickstoffdurchsatzes durch die Losung entfernt. Die klare Losung wurde auf eine mit Wasser (8 ml) und 20% Azetonitril (5 ml) gewaschene Kartusche aufgebracht. Das methylierte Material wurde von der Kartusche mit 100% Azetonitril (4 ml) und Äthanol (4 ml) eluiert. Die Lösungsmittel wurden mittels Luftstroms entfernt. Das getrocknete methylierte Material wurde mit 0,3 ml "Super Deuterid"-Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde behandelt, um die Uronsäurerückstände zu den entsprechenden Hexosen zu reduzieren. Nach Zerstörung des überschüssigen Reagens mit Eisessig (0, 1 mi) wurde die Reaktionsmischung mit 10% Essigsäure/Methanol trockengeblasen und zwei weitere Male trockengeblasen. Das verbleibende reduzierte methylierte Material wurde durch eine Dowex - 50 W(H&spplus;) Säule geschickt, und der erhaltene Abfluß wurde getrocknet. Das reduzierte methylierte Material wurde, wie im obenstehenden Abschnitt 1 beschrieben, in methylierte Alditole umgewandelt und mittels GLC (SP 2330 verschmolzene Siliciumdioxid-Säule (30 m x 0,25 mm), 3 min bei 170ºC gefolgt von 40/min auf 240ºC) und GLC-MS (SP 2330 verschmolzene Siliciumdioxid-Säule (30 in x 0,25 mm), 2 min bei 80ºC, gefolgt von 300/min auf 170ºC, gefolgt von 40/min auf 240ºC, gefolgt vom Halten der Temperatur bei 240ºC für 10 min, Massenspektrenanalysen mittels Hewlett-Packard MSD) analysiert.
Trotz der Ähnlichkeit in der Kohlenhydratzusammensetzung kennzeichnen feine Unterschiede die einzelnen Saponine, insbesondere die Abwesenheit von Arabinose in QA-7 und verminderte Glucose in QA-21, verglichen mit den anderen Saponinen. TABELLE 3 Kohlenhydratzusammensetzung und Bindungsanalyse der gereinigten Saponine Rhamnose Fucose Arabinose Xylose Galactose Glucose Glucoronsäure Apiosee Spuren Alditolazetat (µg/mg Saponin) Trimethylsiliertes Methylglucosid (relative Verhältnisse) T-terminale Glycosilrückstände, daß heißt, durch C-1 gebunden, mit keinen anderen gebundenen Rückständen 3,4 = ein Glycosilrückständ, durch C-1 gebunden, mit anderen Glycosilrückständen glycosidisch gebunden durch C-3 und C-4. Nicht geprüft e Schwache Erholung als Alditolazetat

CHARAKTERISIERUNG DER SAPONINE ALS DETERGENTIEN

Die kritische mizellare Konzentration der Adjuvantien QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 wurde mit der Methode von De Vendittis et al. (De Vendittis, E., Palumbo, G., Parlato, G. und Bocchini, V. (1981) Anal. Biochem. 115 278-286) wie folgt bestimmt: Das Emissionsspektrum von 1-Anilonaphthalin-8-Sulfonäure (ANS) in Wasser wurde bei Adjuvans-Trockengewichtskonzentrationen im Bereich von 0,01 bis 0,10 % (Gew/Vol) bestimmt, um den Bereich unter und über der kritischen mizellaren Konzentration abzudecken. Oberhalb der kritischen mizellaren Konzentration nimmt die Fluoreszenzausbeute von ANS zu und die Wellenlänge der maximalen Emission, verursacht durch die Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffes in den Mizellen, ab. Ähnliche kritische mizellare Konzentrationen wurden für QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 in Wasser gefunden (0,06%, 0,06%, 0,04% bzw. 0,03%) mit leicht geringeren Konzentrationen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bestimmt wurden (0,07%, 0,03%, 0,02% bzw. 0,02%).
Figur 9 zeigt den Gelfiltrationschromatographen für, aus gereinigten QA-18 und QA-21 (auf Bio-Gel P-200 (6,6 mm ID x 90 cm ht)) geformten Mizellen (äqulibriert in einer Konzentration von gereinigtem Saponin, die gleichwertig der kritischen Mizellkonzentration dieses Saponins in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ist, um das Monomermizellgleichgewicht am Verringern des sichtbaren Radius der Mizellen zu hindern). QA-18 und QA-21 Mizelle eluierten mit einer Größe, die ähnlich der des Proteinrinderserums Albumin ist.
Die hämolytische Aktivität der Adjuvantien wurde mit folgender Methode bestimmt: Verdünnungen der Adjuvantien QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A" wurden auf einer Rundbodenmikrotiterplatte (75 µl pro Vertiefung) durchgeführt. Dreimal mit PBS gewaschene rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) wurden mit PBS auf 4% verdünnt. SRBC (25 µl) wurden in jeder Vertiefung zugesetzt und mit Adjuvans gemischt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten bei 1000 Umdrehungen/min 5 min in einem Sorvall RT-6000, H-1000 Rotor, zentrifugiert, um nichthämolysierte Zellen abzusetzen. 50 µl des Uberstandes jeder Vertiefung wurde in derselben Vertiefung einer Flachbodenmikrotiterplatte transferiert und auf 200 pil mit H&sub2;O verdünnt. Die Extinktion wurde bei 570 nm mit einem Dynatech Mikrotiter-Plattenleser bestimmt (Figur 9). Die Hämolyse erhöhte die Extinktion bei 570 nm, verursacht durch die Freisetzung von Hämoglobin aus den abgesetzten Zellen. Signifikante Unterschiede in der Hämolyse zwischen den Adjuvantien wurden beobachtet. QA-17, QA-18, QA-21 und Superfos "Quil-A" verursachten partiale Hämolyse bei niedrigen Konzentrationen 5 von 25 µg/ml, während bei QA-8 partiale Hämolyse bei 150 µg/ml beobachtet wurde. Bei QA-7 wurde bei den untersuchten Konzentrationen (200 µg/ml und weniger) keine Hämolyse beobachtet.

(VERGLEICHENDES) BEISPIEL 6

ISOLIERUNG DER TOXISCIIEN KOMPONENTE QA-19

Die toxische Komponente QA-19 cochromatographiert mit QA-18 auf Siliciumdioxid und ist in den Siliciumdioxidfraktionen 31-60 angereichert. Diese Fraktionen wurden zusammengefaßt und vor der weiteren Reinigung schnellverdampft. Figur 4C zeigt die Separation von QA-19 aus QA-18 durch Umkehrphasen-HPLC auf Vydac C&sub4; (10 mm ID x 25 cm L) unter Anwendung eines Methanolgradienten. Fraktionen, welche mit einer Retentionszeit zwischen 50 und 52 Minuten eluierten, wurden mit Umkehrphasen-TLC und analytischer HPLC als QA-19 identifiziert und zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. QA- 19 konnte weiters in zwei Spitzen durch erneute Reinigung in einem flacheren Methanolgradienten aufgelöst werden, wobei die Spitze mit der kürzeren Retentionszeit mit QA-19a und die Spitze mit der längeren Retentionszeit mit QA-19b bezeichnet wurde. Kohlenhydratanalysen der Spitze QA-19a, welche in Mäusen toxischer ist als QA-19b, zeigte eine Kohlenhydratzusammensetzung, welche der anderen Saponine ähnlich ist (Tabelle 3).

(VERGLEICHENDES) BEISPIEL 7

ISOLIERUNG DES ALKALISCHEN HYDROLYSEPRODUKTS

Die Bearbeitung von QA-18 mittels kurzer alkalischer Hydrolyse lieferte ein kohlenhydrathältiges, alkali sches Haupthydrolyseprodukt (als QA-18 H bezeichnet). Gereinigtes QA-18 H wurde aus QA-18 präpariert und in der folgenden Art isoliert:Ein ml QA-18 (5 mg/ml) wurde mit 25 µl 1 N NaOH 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl 1 N Essigsäure gestoppt.
Unter Verwendung dieser Hydrolysebedingungen wurde QA-18 zur Gänze in ein Haupthydrolyseprodukt (QA-18 R) umgewandelt, welches in einer Spitze mit der Retentionszeit von 8,0 min, verglichen mit 66,8 min für nichthydrolysiertes QA-18, eluierte, was die erhöhte Hydrophilizität von QA-18 H anzeigte (Chromatographie auf Vydac C&sub4; (4,6 mm ID x 25 cm L) in 0,1% Trifluoroessigsäure in 55/45 Methanol/Wasser (Vol/Vol) und eluiert in einem Gradienten von 64/36 Methanol/Wasser (Vol/Vol) über 180 Minuten, Durchflußrate von 1 ml/Minute). Die reines QA-18 H enthaltende Spitze (Retentionszeit 8,0 min) wurde zur weiteren Bestimmung zusammengefaßt. Das QA-21 H bezeichnete Hydrolyseprodukt von QA-21 wurde in derselben Art präpariert und gereinigt. QA-21 H hat eine Retentionszeit von 9,3 Minuten, verglichen mit den 80,4 Minuten von nichthydrolysiertem QA-21. Es wurde mittels Retentionszeit bei HPLC und Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie gezeigt, daß diese Hydrolyseprodukte identisch mit den Haupthydrolyseprodukten sind, die mit dem Verfahren von Higuchi et al Phytochemistry 26:229 (1987), welches schwach alkalische Hydrolyse in NH&sub4;HCO&sub3; verwendet, hergestellt wurden (Tabelle 4). Zusätzlich wurde gezeigt, daß diese Produkte, QA-18 H und QA-19 H, die Hauptzerlegungsprodukte der Hydrolyse von "Quil-A", einer QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 und andere Saponine enthaltenden Saponinrohmischung darstellen, was bedeutet, daß die Hydrolyseprodukte QA-21 H und QA-18 H dieselben Hydrolyseprodukte sind wie die von Higuchi et al.. supra, zur Strukturbestimmung isolierten. QA-18 H und QA-21 H wurden zur weiteren Bestimmung der Adjuvantienaktivität gesammelt. TABELLE 4 Retentionszeit der alkalischen Haupthydrolyseprodukte Hydrolysiertes "Quil-A" 8,2', 9,3' aCambridge BioScience Hydrolysebedingungen: 5 mg/ml Saponin, pH 13, Reaktionszeit 15 Minuten bei Raumtemperatur b Higuchi et al. Hydrolysebedingungen: 5 mg/ml Saponin, 6% NH&sub4;HCO&sub3;, Methanol/H&sub2;O (1/1, Vol/Vol), Reaktionszeit 60 Minuten bei 100ºC HPLC Bedingungen: Vydac C&sub4;, 5 µm Teilchengröße, 300 Å, Porengröße, 0,46 x 25 cm Lösungsmittel A = 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser Lösungsmittel B = 0, 1% Trifluoressigsäure in Methanol Gradient = 55 - 64% B/ 180 Minuten Durchflußrate = 1 ml/min

BEISPIEL 8

UNTERSUCHUNG AUF ADJUVANTIENEFFEKTE UNTER VERWENDUNG VON BSA ALS ANTIGEN

In Kürze gesagt, wird der Adjuvantieneffekt durch Zunahme der Antigenspezifischer Antikörpertiter, verursacht durch die Addition von Potentialadjuvans in den Immunisierungsansatz, beurteilt. Die Zunahme der Titer rührt von einer Zunahme der Antikörperkonzentrationen und/oder der Antigen/Antikörperaffinität her. Adjuvantieneffekte der Saponine sind bisher durch die Zunahme im Titer von neutralisierenden Antikörpern zu Maul- und Klauenseucheimpfstoffen in Meerschweinchen (Dalsgaard, K., Archiv für die gesamte Virusforschung 44. 243-254 (1974)), Zunahme im Titer von ausgefällten Antikörpern zu BSA (wie mittels Radialimmundiffüsion gemessen wurde) in mit BSA/Saponinmischungen geimpften Meerschweinchen (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavia 69, 1-40 (1978)) und auch durch die Zunahme im Titer von Anti-Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) Antikörper (gemessen mittels ELISA) in mit KLH/Saponin immunisierten Mäusen (Scot, M.T., Gross-Samson, M., und Bomford, R., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77:409-412 (1985)) gemessen worden.
In dieser Studie erfolgte die Bewertung der Adjuvantieneffekte durch die Zunahme der Anti-BSA Antikörper, die der Immunisierung mit BSA/Saponin folgte, verglichen mit der Immunisierung mit BSA in Abwesenheit von Saponin. Die Adjuvantienaktivität in der gereinigten Fraktion wurde wie folgt gemessen: CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit folgendem Ansatz immunisiert: 10 pig BSA (Sigma 7030, fettsäurefrei) und Quillaja Adjuvans (mit Dosierungen im Bereich von 1,5 bis 45 µg Kohlenhydrate, gemessen mit Anthron) in 200 µl PBS. Die Seren wurden zwei Wochen nach der Immunisierung gewonnen. Anti-BSA Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt: Immulon II Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit 100 µl fettsäurefreier BSA (10 ug/ml in PBS) in Reihen A, C, E und G beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen. Nichtspezifische Bindung wurde durch Inkubation 1,5 h bei 37ºC mit 100 µl Verdünnungsmittel (2% Kaseinsäurehydrolysat (Oxoid, Gew/Vol) in PBS) pro Vertiefung in allen Vertiefungen verhindert. Die Platten wurden viermal mit 0,05% Tween 20 in destilliertem Wasser gewaschen. Seren mit Verdünnungen von 10, 10², 10³ und 10&sup4; wurden in Reihen A+B, C+D, E+F und G+H (100 µl/Vertiefung) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen. Boehringer-Mannheim Meerrettichperoxydasekonjugat- Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (1/5000 in 5% BSA in Verdünnung) wurden 30 min bei Raumtemperatur (100 µl pro Vertiefung, alle Vertiefungen) inkubiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen. Der Überschuß an Peroxydasereaktion wurde durch Reaktion mit 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonat (30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur, Extinktion gemessen bei 410 nm) oder mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (10 min Reaktion bei Raumtemperatur, Extinktion gemessen bei 450 nm) bestimmt. Der Beitrag von nichtspezifischer Antikörperbindung zur gesamten Antikörperbindung wurde durch Subtraktion der Extinktion der Antigen-Negativ-Vertiefung von der Extinktion der Antigen-Positiv-Vertiefung für jede Serenverdünnung entfernt. Die durch die antigenspezifische Bindung verursachte Extinktion wurde als Funktion des Logarithmus der Serenverdünnung aufgetragen (Figur 11). Typische Endpunkttiter waren typischerweise bei Serenverdünnungen von 10 oder weniger für Immunisierung in der Abwesenheit von Adjuvans und waren in der Höhe von 10- im Beisein von Saponinadjuvans. Dialysierter, methanollöslicher Rindenextrakt bei einer Adjuvansdosierung von 12 µg Kohlenhydrat oder höher (Kohlenhydrat mittels Anthron gemessen) erhöhte die Titer um 2 Größenordnungen verglichen mit BSA in PBS. Ein guter Adjuvanseffekt wurde bei Dosierungen von "Quil-A" zwischen 9 und 23 µg Kohlenhydrat beobachtet.

BEISPIEL 9

ADJUVANTIENMESSUNG VON HPLC-GEREINIGTEN EXTRAKTKOMPONENTEN

Durch die in Beispiel 8 beschriebenen Kriterien haben die Spitzen QA-7, QA-11, QA-12, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19 und QA-20 unterschiedliche Ausmaße an Adjuvantieneffekte, wobei QA-15, QA-17, QA-18, QA-19 und QA-20 in diesem speziellen Experiment insbesondere bei Dosierungen von 3,0 ug Kohlenhydrat wirksam sind. Bedingt durch die kleine Anzahl von pro Immunisation verwendeten Mäusen (2) und der natürlichen Unterschiedlichkeit in der Immunreaktion zwischen den einzelnen Mäusen kann dieses Experiment nicht dazu verwendet werden, die relativen Adjuvantieneffekte dieser Spitzen quantitativ zu bestimmen. Es liefert jedoch eine qualitative Bestimmung über das Vorhandensein von Adjuvantieneffekten. Es muß darauf hingewiesen werden, daß das Fehlen von sichtbaren Effekten bei QA-2, QA-3, QA-10, QA-13 und QA-14 keinen Adjuvantieneffekt bei unterschiedlichen Adjuvansdosierungen oder bei einem unterschiedlichen Adjuvans/Proteinverhältnis ausschließt.
Weitere Adjuvansuntersuchungen wurden mit QA-7, QA-17 und QA-18 bei verschiedenen Protein/Adjuvan sverhältni ssen durchgeführt. Allgemein wurde ein guter Adjuvanseffekt bei QA-7, QA- 17 und QA-18 beobachtet, wenn ein Protein/Adjuvansverhältnis (Proteingewicht/Kohlenhydratgewicht) von ungefähr 3:1 bis 9:1 verwendet wurde (Figur 12). QA-21 (in dieser Studie nur bei einem Protein:Kohlenhydrat-Gewichtsverhältnis von 6:1 untersucht) zeigte auch einen Adjuvanseffekt. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß das richtige Adjuvans:Protein-Verhältnis für eine optimale Immunreaktion eine Funktion sowohl vom besonderen Saponinadjuvans, als auch vom verwendeten besonderen Antigen ist. Die Adjuvansverknüpfung mit dem Antigen spielt eine wichtige Rolle im Aktionsmechanismus des Saponinadjuvanseffektes. Im Fall der Saponinbindung an Protein sind hydrophobe Interaktionen der vorherrschende Faktor. Folglich beeinflussen Unterschiede in der Hydrophobizität der HPLC-gereinigten Adjuvantien die Bindungskonstante der hydrophoben Proteine. Zusätzlich wird die Zahl der hydrophoben Bindungsplätze des Proteins die Fähigkeit, mit Saponinadjuvantien zu assoziieren, beeinflussen. Folglich ist es notwendig, die optimale Adjuvansdosierung für jedes individuelle Adjuvans und Antigen zu bestimmen. Eine solche Optimierung liegt im Bereich des durchschnittlichen Fachwissens.
HPLC-gereinigte Adjuvantien wurden auch mit Freund's Complete-Adjuvans verglichen, und es wurde festgestellt, daß sie in einem ähnlichen Niveau der Immunreaktion resultieren (Figur 12, Tafel b).

BEISPIEL 10

PRÄPARATION VON FELV REKOMBINIERENDEN GP70R-DELTA

PRÄPARATION DES EINSCHLUSSKÖRPERS

Rekombinierende E. coli Klone R16-38 wurden in mit 1% Glucose und 0,1% Kasaminosäuren ergänztem LB-Medium bei 32ºC bis zu einer optischen Dichte (560 nm) von 0,4-0.6 gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf 42ºC gebracht und weitere 2 Stunden inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 25 4.000g 30 Minuten gesammelt, mit 50 Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und schließlich in 200 ml 50 Tris-HCl, welcher 1 ml 0,1 M Phenylmethylsulfonylfluorid in Isopropanol (Endkonzentration = 0,5) und 0,4 ml von 5 mg/ml Aprotinin (Endkonzentration = 10,0 g/ml) zugesetzt waren, resuspendiert. Die Zellen wurden durch enyymatische Verdauung mit Lysozym (Endkonzentration = 0,5 mg/ml) in Gegenwart von 0,2% Tritin X-100 lysiert. Nach 30 minütigem Rühren wurden 2 ml MgCl&sub2; (0,5 M), 5 ml DNasel (1 mg/ml) und 1 ml 0, 1 M Phenylmethylsulfonylfluorid zugesetzt. Nach 30 minütigem Rühren wurden 40 ml EDTA (0,25 M, pH 7,5) und 4 ml Triton X-100 (10% Gew/Vol) zugesetzt. Das Präparat wurde 30 Minuten bei 4ºC und 10.000 x g zentrifugiert, und die Pellets wurden in 50 inl 50 Tris HCl, pH 7,5, resuspendiert. Die Pellets wurden mit niedrigen Geschwindigkeiten 15 Sekunden homogenisiert. Lysozym wurde bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml beigefügt, und 0,6 ml 10%iges Triton X-100 wurden zugesetzt. Nach 15 minütigem Rühren wurden 10 ml von MgCl&sub2; (0,5 M) und 1 inl DNase I (1 mg/ml) zugesetzt und das Rühren wurde weitere 15 Minuten fortgesetzt. Nach Einstellen des Volumens mit 50 Tris, pH 9,0 auf 300 ml, wurden 40 ml von 10% Triton X-100 und 51,2 ml von EDTA (0,25 M, pH 7,5) zugesetzt und das abschließende Volumen von 400 ml mit 50 Tris, pH 9,0, eingestellt. Nach 30 minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 x g 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und die Pellets in 400 inl 50 Tris-HCl, pH 7,5, welche 4 M Harnstoft, 50 EDTA und 1% Triton X-100 enthielt, resuspendiert. Nach 15 minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 x g und 4ºC 30 Minuten zentrifugiert, und die Pellets wurden in 400 ml, 0,1 M NaCl enthaltender, 50 Tris-HCl, pH 7,5 resuspendiert. Nach 15 minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 x g und 4ºC 30 Minuten zentrifugiert und die Pellets in 400 ml 50 Tris-HCl, pH 7,5, welche 6 M Harnstoff und 5 EDTA enthielt, resuspendiert. Nach 15 minütigem Rühren wurde die Suspension bei 10.000 x g und 4ºC 30 Minuten zentrifugiert. An diesem Punkt wurden die Pellets der Einschlußkörper entweder für zukünftige Verwendung eingefroren oder in 50 Tris-HCl, pH 9,5, welche 6 M Guanidin-HCL, 50 EDTA und 0,5% Beta-Merkaptoäthanol enthielt, solubilisiert. Das gp70R-delta Polypeptid wurde dann nach einem der Verfahren des untenstehenden Beispiels 11 gereinigt.

BEISPIEL 11

REINIGUNG VON FELV REKOMBINIERENDEN GP70R-DELTA VERFAHREN I

Das solubilisierte Protein aus Beispiel 8 wurde gegen 6 M Harnstoff, 50 Tris-Cl, pH 8,0, 5 EDTA und 1 Dithiothreitol (DTT) dialysiert. Ungefähr 120 mg des Proteins auf einer mit demselben Puffer äquilibrierten CM-TSK Säule (EM Science, 1,5 cm ID x 4 cm) aufgebracht. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl (0-1,0 M in 150 ml) in demselben Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und mit Elektrophorese auf 10% SDS-Polyacrylamidgele analysiert. Coomassiefärbung wurde verwendet, um das gp70R-delta Protein zu identifizieren. Die bei ungeflihr 0, 1 M NaCl eluierten Fraktionen 25-31 wurden gesammelt und zur Immunisierung verwendet.

VERFAHREN II

Um die Hydrophobizität von gp70R-delta zu verringern, wurden die Sulfhydrylgruppen mit Iodacetamid alkyliert, und die Lysinrückstände wurden mit Citraconsäureanhydrid N-alkyliert. Das gemäß Beispiel 8 zubereitete Protein wurde in 6 M Guaninidin-HCl in 50 mM Borat, pH 9,0, 0,5% Beta-Merkaptoethanol (Vol/Vol) solubilisiert. Iodacetamid wurde zu einem molaren Verhältnis von 1:1 (Iodacetamid: gesamte Sulfhydrylgruppen) zugesetzt. Die Alkylierung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur in der Dunkelheit durchgeführt. Die Alkylierung aller Sulfhydrylgruppen (in den Proteinen und Beta-Merkaptoethanol) wurde mit DTNB (Ellman's Reagens) überwacht, um eine komplette Alkylierung sicherzustellen. Die Proteinkonzentration wurde auf 2 mg/ml eingestellt.
Die Proteine wurden in der Dunkelheit durch Zugabe von Citraconsäureanhydrid citraconyliert (0,0022 ml pro mg Protein; ungefähr 50 molaren Uberschuß über den freien Lysinen). Das Präparat wurde mehrmals in der Dunkelheit gegen 50 mM Borat, pH 9,0, dialysiert. Die Vervollständigung der Acylierung der Protein-Lysingruppen wurde durch Reaktion mit Trinitrobenzolschwefelsäure (TNBS) bestimmt, welche Rückstände von freien Lysingruppen feststellt. TNBS (200 µl von 10 mM) wurde zu 200 µg alkyliertem, citraconyliertem, dialysiertem gp70R-delta in 1 ml 50 mM Natriumborat, pH 9,0, zugefügt. Die Mischung wurde für 2 Stunden in der Dunkelheit bei 40ºC inkubiert, die Reaktion mit 0,5 ml von 1 NHCl und 0,5 ml 1% SDS abgeschreckt und die Extinktion bei 340 nm gemessen. Die Konzentration der TNP-Lysine wurde unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 10.400 bestimmt.
Die Reinigung des alkylierten, citraconylierten gp70R-delta wurde bei pH 9,0 durchgeführt, um das Deblockieren der Lysingruppen zu verhindern. Harnstoff mit einer Endkonzentration von 4 M wurde dem modifizierten Protein zugesetzt. Das Protein wurde durch Ultrafiltration auf 3 mg/ml konzentriert und auf eine Sepharose 6B-Cl Säule (1,5 x 86 cm) aufgebracht. Das gp70R-delta Protein wurde bei einer Durchflußrate von 6,6 ml/h mit 4 M Harnstoff- 50 mM Natriumborat, pH 9,0, eluiert.
Die Fraktionen (5,3 ml/Anteil) wurden gesammelt, und das gp70R-delta wurde durch Proteinanalyse und SDS-Polyacrylamidelektrophorese in den Fraktionen 13-15 bestimmt.
Die Citraconylierung von gp70R-delta wurde durch Dialysieren von 5 ml alkylierten, citraconyliertem gp70R-delta (1,0 mg/ml) gegen 6 M Harnstoff in 50 mM Natriumzitrat, pH 5,5, 48 Stunden bei Raumtemperatur rückgängig gemacht. Das gp70R-delta wurde gegen 6 M Harnstoff in 100 mM Natriumbicarbonat, pH 8,0, 10 dialysiert und die Proteinkonzentration vor der Absorption von Aluminiumhydroxid auf 0,8 mg/ml eingestellt.

VERFAHREN III

Eine Änderung obiger Reinigung von alkyliertem, citraconyliertem gp70R-delta wurde entwickelt. Kurzgesagt, ist das alkylisierte, citraconylierte gp70R-delta wie oben beschrieben, modifiziert und gegen 50 mM Natriumborat, pH 9,0, dialysiert. Harnstoff wurde bis zu einer Endkonzentration von 8,0 M zugesetzt. Das Protein wurde durch Ultrafiltration mit einer PM-30 Membran konzentriert, um 2,5 mg Protein/ml zu liefern. Die Proteinlösung wurde auf einer Sephacryl 5-400 Säule (1,5 x 90 cm) in einem 50 mM Natriumboratpuffer, pH 9,0, welcher 8 M Harnstoff enthielt, aufgebracht und mit demselben Puffer eluiert. Die Fraktionen (2,9 ml/Fraktion) wurden gesammelt und die gp70R-delta enthaltenden Fraktionen 34-37 wurden zusammenfaßt. Einundzwanzig mg des Proteins dieser Fraktionen wurden zu einer Endkonzentration von 4 M Harnstoff mit 50 mM Natriumborat, pH 9,0, verdünnt und auf eine DEAE-TSK Säule (1,5 x 11 cm) aufgebracht. Das Protein wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0-0,5 M) in 50 mM 4M Harnstoff enthaltendem Natriumborat, pH 9,0, eluiert. Drei ml Fraktionen wurden gesammelt. Die gp70R-delta enthaltenden Anteile 89-95 wurden zusammengefaßt und 15 mg von gp70R-delta wurden rückgewonnen.

BEISPIEL 12

IMUNISIERUNG MIT ALUMINIUMHYDROXIDABSORBIERTEM GP70R-DELTA

Aluminiumhydroxid, von dem Adjuvanseffekte für viele Proteine gefunden worden waren und das abgekühlt in Impfstoffen verwendet wird, wurde als Träger für gp70R-delta verwendet. Nach dem Verfahren I im obenstehenden Beispiel 11 hergestelltes gp70R-delta absorbiert fest an 10% Aluminiumhydroxid in der Anwesenheit von 50 mM 6M Harnstoff enthaltendem Tris-Cl, pH 8,0. Ungefähr 3 µg gp70R-delta wurden pro 100 µg Aluminiumhydroxid absorbiert. Das vom Aluminiumhydroxid absorbierte gp70R-delta wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in PBS resuspendiert und zur Immunisierung von Tieren verwendet.
CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit an Al(OH)&sub3; absorbiertem gp70R-delta in einem Gesamtvolumen von 200 µl PBS in An- und Abwesenheit der HPLC-gereinigten Saponine QA-17 oder QA-18 oder einer Mischung von QA-17 und QA-18 immunisiert. Zwanzig bis fünfundzwanzig µg von gp70R-delta wurden pro Dosierung injiziert. Die HPLC-gereinigten Saponine QA-17 oder QA-18 oder eine Mischung von QA-17 und QA-18 wurden bei einer Trockengewichtsdosierung von 10 g verwendet. Mit jedem Ansatz wurden zwei Mäuse injiziert. Sechs Wochen nach der Erstinjektion wurde den Mäusen eine Verstärkerinjektion von gp70R-delta/Aluminiumhydroxid verabreicht. Die Mausseren wurden auf Reaktivität mit FEA, einer FeLV Untergruppe A, 2, 4 und 8 Wochen nach Immunisierung mittels ELISA Immunoanalyse analysiert. Vier Wochen im Anschluß an die Immunisierung wurde eine durch das rekombinierte gp70R-delta hervorgerufene Anti-FeLV-Reaktion beobachtet. Die HPLC-gereinigten Saponinadjuvantien QA-17 und QA-18 verstärkten diese Reaktion. Die Reaktion in Anwesenheit von QA-17, verglichen mit der Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvans war vier Wochen nach Immunisierung um zwei Größenordnungen stärker. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 13 gezeigt.
Anti-FEA Antikörper wurden mittels ELISA-Analyse bestimmt. FEA Viren (10 30 µg/ml in PBS) wurden an Immulon II Platten (100pg/Vertiefung) über Nacht bei 4ºC absorbiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, und nichtspezifische Antikörperbindung wurde durch Inkubation für 1 Stunde mit 10% normalem Ziegenserum in PBS (100µl/Vertiefiing) bei Raumtemperatur unterbunden. Die Platten wurden dann mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser gewaschen. Die Seren wurden in 10% normalem Ziegenserum in PBS verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur auf der Platte bei Serenverdünnungen von 10, 10², 10³ und 10&sup4; (100µl/Vertiefung) inkubiert. Nach dem Waschen der Platten mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser wurden sie 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100µl/Vertiefung von peroxydasekonjugiertem Ziegen-Anti-Maus IgG (Boehringer-Mannheim), 1/5000 verdünnt in PBS, inkubiert. Nach dem Waschen der Platten mit 0,05% Tween-20 in destilliertem Wasser wurde der Betrag der IgG-Bindung durch Peroxidasereaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin aus der auf einem Dynatech Mikrotiterplattenleser bestimmten Extinktion bei 450 nm bestimmt.

BEISPIEL 13

IMMUNISIERUNG MIT ALUMINIUMHYDROXIDABSORBIERTEM, ALKYLISIERTEM GP70R-DELTA

CD-1 Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden intradermal mit 15 kg/Dosierung von alkylisiertem, nach dem Verfahren II des Beispiels 11 (an Aluminumhydroxid absorbiert, wie im Beispiel 12 beschrieben) gereinigtem gp70R-delta in 200 µl PBS immunisiert. HPLC-gereinigte Adjuvantien QA-7, QA-17, QA-18 und Mischungen dieser drei Adjuvantien wurden bei Trockengewichtsdosierungen von 10 µg verwendet. Mit jedem Ansatz wurden drei Mäuse injiziert. Die Mausseren wurden mit ELISA zwei und vier Wochen nach Immunisierung wie im Beispiel 10 beschrieben, auf Reaktivität auf FEA analysiert. Wie bei der Immunisierung mit unverändertem gp70R-delta im Beispiel 10 gezeigt wurde, ruft die Immunisierung mit alkylisiertem gp70R-delta eine virale Anti-FeLV Reaktion vier Wochen nach Immunisierung hervor. Die HPLC-gereinigte Adjuvantien QA-7, QA- 17, QA- 18 verstärken alle die Immunreaktion, verglichen mit der Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvantien. QA-17 und Mischungen von QA-17 und QA-18 induzierten die stärksten Reaktionen, induzierten beinahe zwei Größenordnungen stärkere Endpunkttiter als die Immunisierung in Abwesenheit von Saponinadjuvantien. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 14 zusammengefaßt.

BEISPIEL 14

TOXIZITÄT VON QA-7, QA-17, QA-18, QA-19, QA-21,"QUIL-A"

Bei rohem Quillaja-Saponin erscheint ein Hauptsymptom der Toxizität als Nekrose der Leber. Gereinigte Saponine wurden Mäusen injiziert, um die Wirkungen auf die Leber zu bestimmen. Die Mäuse wurden intradermal mit jeweils 150 µg QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 und "Quil-A", dem rohen Saponinextrakt, das als Rohmaterial für die Reinigung der anderen Komponenten verwendet wurde, injiziert. Mit QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 injizierte Tiere erschienen anfangs leicht krank, schienen sich aber innerhalb weniger Stunden nach der Injektion voll zu erholen. "Quil-A" verursachte schwere Symptome, die über 48 Stunden andauerten. Alle Mäuse wurden nach 48 Stunden zur Post-mortem-Untersuchung der Leber getötet. "Quil-A" verursachte eine schwere Schädigung der Leber mit ersichtlich vielfaltigen Bereichen akuter Nekrose. QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 schienen die Leber nicht signifikant anzugreifen. QA-17 und QA-18 wurden auch in Kätzchen mit subcutaner Injektion von jeweils 100 ug bei 8 und 10 Wochen getestet, wobei klinisch oder in der chemischen Blutzusammensetzung keine Toxizität beobachtet werden konnte. Im Gegensatz dazu induzierte "Quil-A" eine pyrogene Reaktion, welche in den Kätzchen einige Stunden andauerte. Folglich erschienen die gereinigten Saponine sowohl in Mäusen und Kätzchen weniger toxisch als "Quil-A" zu sein, was andeutete, daß der Reinigungsprozess diese Saponine von einer oder mehreren, im Quillaia Rohextrakt vorkommenden toxischen Komponenten trennt. Eine dieser toxischen Komponenten wurde vorläufig als QA-19 identifiziert; Dosierungen von 50 µg oder mehr waren in Mäusen innerhalb weniger Tage nach der Injektion tödlich. Weitere Reinigung von QA-19 zeigte, daß es in zwei Spitzen, QA-19a und QA-19b getrennt werden konnte. QA-19a war in Mäusen bei Dosierungen von 100 ptg oder mehr tödlich, während QA-19b offensichtlich bis zu Dosierungen von 150 µg nicht tödlich war; folglich kann ein, eine erhöhte Toxizität in der Mischung von QA-19a und QA-19b hervorrufender synergistischer Effek: nicht ausgeschlossen werden. Eine vorläufige Klassifizierung anderer kleinerer, von "Quil-A" isolierter Spitzen deutete darauf hin, daß die anderen Fraktionen auch toxisch sein könnten. Folglich erlauben die Reinigungsverfahren die Trennung der adjuvansaktiven Saponine von ähnlichen, aber unterschiedlichen Zusammensetzungen, welche toxischer sind oder welche mit toxischen Verunreinigungen cochromatographieren.

(VERGLEICHENDES) BEISPIEL 15

QA-18H und QA-21H, welche wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurden, wurden auf Adjuvanseffekte mit BSA im direkten Vergleich mit dem nichthydrolysierten Originalprodukten QA-18 und QA-21, die wie in den Beispielen 3 10 und 4 beschrieben hergestelltt waren, getestet. QA-18 und QA-21 erhöhen die humorale Immunreaktion auf BSA in Mäusen zumindest um eine Größenordnung zwei Wochen nach Immunisierung. Die Hydrolyseprodukte QA-18H und QA-21H erhöhen jedoch die Reaktion bei der gleichen Gewichtsdosierung nicht signifikant (Figur 15). Folglich wird der optimale Adjuvanseffekt bei den intakten Saponinen beobachtet; die wesentliche für 15 eine Adjuvantienaktivität notwendige Struktur geht verloren oder wird geändert, wenn QA-18 und QA-21 zu QA-18H und QA-21H hydrolysiert werden.

Claims

1. Im wesentlichen reines Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria-Rohextrakt gewonnen werden kann, wobei das Saponin bei der Analyse des Extraktes durch Umkehrphasen-hplc auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit einer Korngröße von 5 µm, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser x 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute als Spitze erscheint, wobei das Saponin Immunadjuvansaktivität aufweist und als Adjuvans weniger toxisch ist als das Quillaja saponaria-Extrakt.

2. Im wesentlichen reines QA-7 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria-Rohextrakt gewonnen werden kann, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-hplc auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit einer Korngröße von 5 µm, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser x 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eine Retentionszeit von ungefähr 9-10 Minuten aufweist.

3. Im wesentlichen reines QA-7 Saponin nach Anspruch 2, welches Immunadjuvansaktivität aufweist und ungefähr 35% Kohlenhydrat bezogen auf Trockengewicht enthält, wie mittels Anthron analysiert wurde, ein UV-Adsorptionsmaximum von 205-210 nm, eine Mizellkonzentration von 0,06% (Gew./Vol.) in Wasser und 0,07% in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist und bei Konzentrationen von 200 µg/ml keine nachweisbare Hämolyse bei roten Blutkörperchen von Schafen bewirkt.

4. Im wesentlichen reines QA-7 Saponin nach Anspruch 3, wobei das Kohlenhydrat eine Zusammensetzung aufweist, welche aus den folgenden Monosacchariden besteht: terminale Rhamnose, terminale Xylose, terminale Glucose, terminale Galactose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose, 2,3-Fucose, 2,3-Glucuronsäure und Apiose.

5. Im wesentlichen reines QA-17 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria-Rohextrakt gewonnen werden kann, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-hplc auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit einer Korngröße von 5 µm, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser x 25 cm Lange in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eine Retentionszeit von ungefähr 35 Minuten aufweist.

6. Im wesentlichen reines QA-17 Saponin nach Anspruch 5, welches Immunadjuvansaktivität aufweist und ungefähr 29% Kohlenhydrat bezogen auf Trockengewicht enthält, wie mittels Anthron analysiert wurde, ein UV-Adsorptionsmaximum von 205-210 nm, eine kritische Mizellkonzentration von 0,06% (Gew./Vol.) in Wasser und 0,03% (Gew./Vol.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufweist und bei Konzentrationen von 25 µg/ml Hämolyse bei roten Blutkörperchen von Schafen bewirkt.

7. Im wesentlichen reines QA-17 Saponin nach Anspruch 6, wobei das Kohlenhydrat eine Zusammensetzung aufweist, welche aus den folgenden Monosacchariden besteht: terminale Rhamnose, terminale Xylose, terminale Galactose, terminale Glucose, 2-Arabinose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure sowie Apiose.

8. Im wesentlichen reines QA-21 Saponin, welches aus einem Quillaja saponaria-Rohextrakt gewonnen werden kann, wobei das Saponin bei Umkehrphasen-hplc auf einer Vydac C&sub4;-Säule mit einer Korngröße von 5 µm, 330 Å Poren, 4,6 mm Innendurchmesser x 25 cm Länge in einem Lösungsmittel aus 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42; Vol./Vol.) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eine Retentionszeit von ungefähr 51 Minuten aufweist.

9. Im wesentlichen reines QA-21 Saponin nach Anspruch 8, welches Immunadjuvansaktivität aufweist und ungefähr 22% Kohlenhydrat bezogen auf Trockengewicht enthält, wie mittels Anthron analysiert wurde, ein UV-Adsorptionsmaximum von 205-210 nm, eine kritische Mizellkonzentration von 0,03% (Gew./Vol.) in Wasser und 0,02% (Gew./Vol.) in phosphatgepufferter Kochsalz1ösung aufweist und bei Konzentrationen von 25 µg/ml oder darüber Hämolyse bei roten Blutkörperchen von Schafen bewirkt.

10. Im wesentlichen reines QA-21 Saponin nach Anspruch 9, wobei das Kohlenhydrat eine Zusammensetzung aufweist, welche aus den folgenden Monosacchariden besteht: terminale Rhamnose, terminale Arabinose, terminale Apiose, terminale Xylose, 4-Rhamnose, terminale Glucose, terminale Galactose, 2-Fucose, 3-Xylose, 3,4-Rhamnose und 2,3-Glucuronsäure.

11. Verwendung von im wesentlichen reinem Saponin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung eines Mittels zum Verstärken einer Immunreaktion auf ein Antigen in einem Individuum.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche zweckmäßig ist, um die Produktion von Antikörpern auf ein Antigen in einem Individuum zu bewirken, welche eine immunogen wirksame Menge eines Antigens und ein im wesentlichen reines Saponin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einer Menge enthält, die ausreicht, um die Immunreaktion des Individuums auf das Antigen zu verstärken.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Individuum ein Mensch oder ein Tier ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Antigen ein gp70 enthaltendes Protein ist.