NL9301690A - Verbindingen met adjuvans-activiteit. - Google Patents

Description

VERBINDINGEN HET ADJUVANS-ACTIVITEIT

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op verbindingen met adjuvans-activiteit, met name saponines. De uitvinding betreft verbindingen in zeer zuivere vorm, gehy-drolyseerde afgeleiden van deze zuivere verbindingen en gemodificeerde afgeleiden daarvan. De uitvinding betreft verder werkwijzen voor het vervaardigen van de verbindingen, het gebruik de verbindingen in ISCOM-matrices, ISCOMS, adjuvantia en vaccins en de ISCOM-matrices, ISCOMS, adjuvan-tia en vaccins, welke de verbindingen bevatten, als zodanig, en een werkwijze voor het beheersen van de immuunrespons alsmede de gerichte afgifte van geneesmiddelen. Daarnaast zijn de verbindingen te gebruiken voor de zorgvuldige en selectieve hemolyse van erythrocyten.

Saponines zijn stoffen die onder andere voorkomen in planten van bijvoorbeeld de genera Saponaria, Gvpsophilia en met name Quillaia. Hoewel de chemische structuur van deze saponines niet volledig opgehelderd is bevatten zij in elk geval gypsogenine of het daarvan afgeleide gypsoginezuur, respectievelijk Ouillaia-zuur. allen triterpenoïden, en een aantal suikerketens. Daarnaast komt er in vele gevallen een vetzuurrest voor, welke verbonden is met een suikerrest aan de triterpenoïde-structuur.

Van saponines is bekend dat zij adjuvans-activi-teit vertonen. Zij worden dan ook regelmatig gebruikt als adjuvantia in vaccins tegen bijvoorbeeld mond- en klauwzeer. Gevonden is dat de adjuvans-activiteit gekoppeld is aan bepaalde componenten uit het ruwe extract van planten, met name die van het genus Quillaia.

Er is eerder reeds aangetoond dat een component die verkregen wordt na het zuiveren van een gedialyseerd extract van de bast van Quillaia saponaria Molina op een ionenwisselaarskolom van het type DE-52, gevolgd door Sepha-dex G50 gelfiltratie, een fractie oplevert, welke QUIL A genoemd is. Dit QUIL A vertoont een sterke adjuvans-activiteit (Dalsgaard, K., Arch. ges. Virusforsch. 44, 243-254 (1974)). QUIL A zelf is echter nog steeds geen zuivere stof, zoals is gebleken na scheiding op "reverse phase"-HPLC (RP-HPLC). Het QUIL A blijkt te bestaan uit een groot aantal componenten. Ook het gebruik van een gedialyseerd, in methanol oplosbaar extract levert geen beter resultaat op en blijkt nog steeds zeer heterogeen te zijn, zelfs wanneer fracties daarvan verder gezuiverd worden (WO 88/09336).

Het nadeel van een dergelijke niet zuivere stof is dat zowel de activiteit als de bijwerkingen, zoals irritatie, allergie en dergelijke, van de stof niet voorspeld en beheerst kunnen worden. Elke QUIL A fractie uit elk extract zal een andere samenstelling hebben en voor gebruik getest moeten worden op bijvoorbeeld activiteit.

De behoefte bestaat derhalve aan het verkrijgen van de componenten uit het QUIL A of uit andere saponine-bevattende extracten of fracties daarvan, in een zeer zuivere vorm, teneinde de activiteit en dergelijke beter te kunnen beheersen. Dit is met name van belang wanneer men de saponines wenst te gebruiken als adjuvantia in vaccins voor humaan gebruik. Aan dergelijke adjuvantia worden strenge eisen met betrekking tot de zuiverheid gesteld.

Gevonden is nu dat verbindingen die geïsoleerd worden uit vers plantemateriaal, bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, in zeer zuivere vorm verkregen kunnen worden. De uitvinding verschaft derhalve verbindingen, welke verkregen zijn door het in fracties scheiden van een extract van vers plantemateriaal bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, dat afkomstig is van saponine-bevattende planten.

Het gegeven dat de verbindingen volgens de uitvinding zeer zuiver verkregen kunnen worden is waarschijnlijk te verklaren door het feit dat in vers plantemateriaal bestaande uit in hoofdzaak levende cellen nog geen oxidatie of afbraak van de daarin aanwezige verbindingen is opgetreden. Tot nu toe werd er van uitgegaan dat slechts het gebruik van de bast van 50 tot 100 jaar oude bomen voldoende saponines zou kunnen opleveren. Het gebruik van jong materiaal werd derhalve niet overwogen. Uit de bast van oude bomen blijken echter slechts zeer heterogene mengsels van saponines verkregen te kunnen worden. Daar komt nog bij dat in de huidige praktijk de bast, nadat deze van de bomen verwijderd is, lange tijd wordt blootgesteld aan de weersomstandigheden waardoor, zoals nu blijkt, de actieve verbindingen afgebroken kunnen worden of oxideren. Een bijkomend nadeel van het gebruik van de bast van oude bomen is dat er een tekort aan oude bomen dreigt te ontstaan (Hoffman, J., A.E., Flores Silvestre de Chile, p. 102, Ediciones Fundacion Claudio Goy (1991)).

In deze beschrijving worden met de term "saponi-nes" die verbindingen bedoeld, welke direct uit een plante-extract verkregen kunnen worden en geen daarop volgende hydrolyse- of modifiactiebehandeling ondergaan."Saponine-achtige verbindingen" zijn verbindingen, die wel aan een dergelijke hydrolyse of modificatie zijn onderworpen. Onder de algemene term "verbindingen" vallen zowel de saponines als de saponine-achtige verbindingen.

Wanneer in de tekst gesproken wordt over "vers plantemateriaal" bestaande uit in hoofdzaak levende cellen dan wordt bedoeld materiaal geïsoleerd uit delen van een plant die niet gedifferentieerd of kortgeleden gedifferentieerd zijn, zoals het cambium, jong hout en floëem, alsmede de wortels. Met "vers" wordt verder bedoeld dat in hoofdzaak direct na het oogsten, zonder het materiaal aan de weersomstandigheden bloot te stellen, wordt geëxtraheerd, zodat oxidatieve en afbraak-stimulerende omstandigheden zo min mogelijk plaats kunnen vinden.

De term "ISCOM-matrix" staat voor een matrix voor immuno-stimulerende complexen zoals beschreven in WO 90/031-84.

Met "ISCOMS" wordt bedoeld een ISCOM-matrix met daarin ingesloten tenminste één antigeen, zoals beschreven in US octrooi 4,578,269.

De bronnen waaruit de saponine-achtige verbindingen volgens de onderhavige uitvinding gewonnen kunnen worden zijn zeer divers. Een belangrijke voorwaarde is echter dat er gebruik gemaakt wordt van vers plantemateriaal bestaande uit in hoofdzaak levende cellen. Daarnaast is belangrijk dat het materiaal direkt na het oogsten daarvan verwerkt wordt.

Geschikte bronnen zijn bijvoorbeeld de stammen van tot 15 jaar oude bomen van de soort Ouillaia saponaria en de wortels van dergelijke boompjes. In principe, maar minder gewenst in verband met de schaarsheid van oudere bomen, zouden van oudere bomen ook de laag van levende cellen, bestaande uit groeiend hout, cambium en floëem, en de wortels, gebruikt kunnen worden. Verder zijn ook weefselkweeken en suspensie-celkweken van met name uit het cambium afkomstige cellen zeer geschikte bronnen, zoals beschreven in de Nederlandse octrooiaanvrage 93.01404, de inhoud waarvan hierin door middel van verwijzing wordt opgenomen, alsmede wortelculturen en dergelijke.

Na scheiding op een RP-HPLC kolom worden twee verschillende verbindingen gevonden, die QUADRI-1 en QUADRI-2 genoemd worden. Uit analytische RP-HPLC blijkt dat op deze wijze zeer zuivere stoffen van 99,99% zuiver materiaal te verkrijgen zijn.

De uitvinding betreft verder van de saponines afgeleide hydrolyseprodukten. Gevonden is dat door selectieve hydrolyse van de zuivere saponines de adjuvans-activiteit gevarieerd kan worden. Door middel van verschillende methoden van alkalische hydrolyse werden verschillende verbindingen gevonden. Op grond van de hydrofobiciteit van de produk-ten en uitgaande van de structuur zoals die voorgesteld is door Higuschi et al. (in Phytochemistry 26, 229-235 (1987)) en weergegeven wordt in figuur 12, wordt eerst de acylgroep met de arabino- en eventuele andere suikerrest afgesplitst ter verkrijging van produkt A. Uitgaande van QUADRI-1 re-sepctievelijk QUADRI-2 worden deze verbindingen gekenmerkt door hun relatief sterke hydrofiliciteit gekenmerkt door een retentietijd van ongeveer 7,968 minuten (in figuur 8; 8,645 in figuur 11), respectievelijk ongeveer 9,6 minuten (in figuur 9; 10,36 in figuur 11).

Deze verbindingen worden verder gekenmerkt door hun suikergehalte, zoals weergegeven in tabel 2. Vervolgens worden na intensievere hydrolyse ook de fucose mèt daaraan verbonden suikers afgesplitst, hetgeen leidt tot verbindingen QUADRI-1B en QUADRI-2B, welke identiek blijken te zijn en bij ongeveer 13,1 (figuur 9 en figuur 11) van de kolom komen (zie ook tabel 2).

Ook kunnen de verbindingen volgens de uitvinding, en dan met name de gehydrolyseerde afgeleiden daarvan dienen als basis voor gemodificeerde verbindingen. Zo is het bijvoorbeeld mogelijk een peptide aan de zuurgroep in positie 23 van produkt B, respectievelijk de fucose van produkt A te koppelen. De met het peptide gemodificeerde verbinding zal zelf of in combinatie met andere normale saponines of sapo-nine-achtige verbindingen, als adjuvans gebruikt kunnen worden en ook in de vorming van ISCOMS.

Een andere toepassingmogelijkheid van de verbinding volgens de uitvinding is de plaatsgerichte-afgifte van geneesmiddelen. Hiervoor zouden met name de gehydrolyseerde verbindingen nuttig kunnen zijn.

De saponines volgens de onderhavige uitvinding kunnen door middel van een op zichzelf bekende methode bereid worden. Een dergelijke methode is bijvoorbeeld beschreven door Dalsgaard (supra). Scheiding van het door middel van deze methode verkregen produkt (QUIL A) in fracties kan plaatsvinden met behulp van preparatieve HPLC zoals bijvoorbeeld RP-HPLC. Elke scheiding van een extract in zijn afzonderlijke componenten kan echter gebruikt worden in de bereiding van de verbindigen volgens de uitvinding.

De verbindingen volgens de uitvinding vertonen in meer of mindere mate adjuvans-activiteit. Zij kunnen alleen of in combinatie gebruikt worden in bijvoorbeeld vaccins.

Het is mogelijk om ISCOM-matrix te vervaardigen van verbindingen volgens de uitvinding of combinaties daarvan samen met bijvoorbeeld cholesterol en fosfatidylcholine. Het opnemen van één of meer antigenen in de matrix verschaft ISCOMS.

De onderhavige uitvinding wordt in deze beschrijving geïllustreerd aan de hand van saponines en saponine-achtige verbindingen uit Ouillaia saponaria. maar is daartoe niet beperkt.

Van een aantal ISCOMS is aangetoond dat zij naast de voor normale adjuvantia gebruikelijke MHC-klasse 2 res- pons, die leidt tot verhoogde T-helpercel concentratie, ook een tot nu toe unieke MHC-klasse 1 respons induceren. Verder is aangetoond dat de geïnduceerde T-helpercellen vooral van het type TH-1 zijn en dus bescherming geven, en in mindere mate of in het geheel niet van het type TH-2, welke leiden tot een overgevoeligheidsreactie.

QUADRI-l en QUADRI-2 bezitten op zichzelf en als onderdeel van ISCOMS een dergelijke adjuvans-functie en kunnen dus ook cytolytische T-lymfocyten (CTL's) induceren. De gehydrolyseerde verbindingen vertonen deze eigenschappen ook, maar niet in dezelfde mate. zij helpen mogelijk de antigenen op te lossen en lijken een lagere MHC-klasse 2 immuunrespons, te induceren.

Doordat in de studies leidend tot de uitvinding een veel duidelijker inzicht is verkregen in hoe de diverse componenten, die een onderdeel vormen van het ruwe extract, ontstaan, met name door partiële hydrolyse van QUADRI-l en QUADRI-2, kan veel beter begrepen worden waar de verschillen in adjuvans-activiteit vandaan komen. QUADRI-l en QUADRI-2 zijn omringd door veel meer suikerresten dan de door selectieve hydrolyse gegenereerde afgeleide produkten QUADRI-1A, -1B, -1D en QUADRI-2A, -2B, -2D, hetgeen onder andere invloed zal hebben op de hydrofobiciteit en de driedimensionale structuur. Hierdoor kan de presentatie van antigenen selectief worden beïnvloed.

Saponines kunnen tevens gebruikt worden voor de hemolyse van erythrocyten. Een bekende methode waarbij gebruik gemaakt wordt van hemolyse is het tellen van witte bloedcellen met behulp van een Coultercounter. De nauwkeurigheid van de telling wordt normaal gesproken sterk negatief beïnvloed door de aanwezigheid van de rode bloedcellen. Door de rode bloedcellen te lyseren wordt de storende achtergrond verwijderd. Saponines kunnen gebruikt worden om erythrocyten te lyseren. Gebleken is dat de bestaande sapo-ninepreparaten niet betrouwbaar genoeg zijn om deze methode van het tellen van witte bloedcellen te standardiseren.

Vanuit zowel de industrie als de wetgeving is er vraag naar een zuiver preparaat, waarmee deze witte bloedcelbepaling reproduceerbaar uitgevoerd kan worden. De saponines, en eventueel saponine-achtige verbindingen, volgens de uitvinding voldoen aan deze eis. Daarnaast blijkt dat verschillende soorten erythrocyten, zoals bijvoorbeeld normale erythro-cyten of sikkelcellen verschillend reageren op de saponine— preparaten volgens de uitvinding. Dat wil zeggen dat voor de hemolyse van de verschillende typen erythrocyten, verschillende concentraties van de saponines nodig zijn. De specificiteit van de zuivere saponines, respectievelijk het mengsel van QUADRI-l en QUADRI-2 vóór RP-HPLC daarvan, geeft geheel nieuwe toepassingsmogelijkheden op het gebied van de hemolyse.

Een ander toepassingsgebied van de verbindingen volgens de uitvinding is de plaatsgerichte afgifte van geneesmiddelen. Hierbij wordt in een ISCOM-matrix een hoeveelheid geneesmiddel opgenomen. Door middel van moleculen met een plaatsgerichte functie, zoals bijvoorbeeld antili-chamen, die bijvoorbeeld zijn opgenomen in de matrix, kunnen de ISCOMS naar de gewenste lokatie in het lichaam getransporteerd worden.

De uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van een aantal voorbeelden, welke echter niet de bedoeling hebben de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.

VOORBEELD 1

Zuivering en analyse van saponines volgens de uitvinding.

Uit plantecelmateriaal, dat vers geëxtraheerd is uit ongeveer 15 jaar oude Quillaia boompjes, wordt volgens de methode van Dalsgaard (supra) QUIL A gewonnnen. De Dals-gaard-methode bestaat in essentie uit een zuivering van een gedialyseerd extract op een ionenwisselaars-kolom van het type DE-52, gevolgd door Sephadex G50 gelfiltratie. Het is tevens mogelijk om in plaats van gelfiltratie ultrafiltratie toe te passen.

Het op deze wijze verkregen QUIL A wordt onderworpen aan een RP-HPLC (VYDAC®, C4-kolom, geëlueerd met 30%-45% acetonitril in een 0,15% waterige TFA-oplossing). Het HPLC- elutiepatroon vertoont twee hoofdpieken, welke respectievelijk QUADRI-1 EN QUADRI-2 worden genoemd (zie figuur 1).

Dezelfde procedure wordt uitgevoerd op plantecel-materiaal dat verkregen is door middel van weefselkweek of suspensiecelkweek. Figuur 2 toont het HPLC-elutiepatroon van QUIL A dat geïsoleerd is uit een suspensiecelkweek. Naast de twee pieken die kenmerkend zijn voor QUADRI-1 en QUADRI-2 zijn tevens een aantal pieken te onderscheiden, waarvan later wordt aangetoond dat het gedeacyleerde versies van QUADRÏ-2 zijn.

Ter vergelijking wordt in figuur 3 het HPLC-pa-troon van QUIL A uit oude bast getoond. De pijlen in figuur 3 geven de posities van QUADRI-1 en QUADRI-2 en van gedeacy-leerd QUADRI-2 aan. Uit deze figuur blijkt dat het materiaal uit de oude bast veel heterogener is dan het materiaal dat volgens de uitvinding uit jonge plantecellen wordt gewonnen.

Figuur 4 toont het RP-HPLC elutiepatroon van een verbinding die is beschreven in de octrooiaanvrage WO 90/03184, en daarin "B3" genoemd wordt. In WO 90/03184 wordt ervan uitgegaan dat "B3" een zuivere stof is. In figuur 4 is te zien dat dit duidelijk niet het geval is.

Deze figuur illustreert dat hoewel eerder werd aangenomen dat men uitging van zuivere componenten bij de bereiding van ISCOMS, nu blijkt dat zelfs deze "zuivere" componenten een zeer heterogeen karakter hebben. Hierdoor wordt opnieuw het belang onderstreept van een methode voor het winnen van saponine-achtige verbindingen die wel als "zuiver" aangemerkt kunnen worden.

In figuur 15 wordt ter vergelijking verder het HPLC-elutiepatroon van een component die bekend is onder de naam B4b weergegeven. Van B4b is bekend dat het een zeer hoog ISCOM-vormend vermogen heeft, maar een lage adjuvans-activiteit (WO 90/03184). In het HPLC-patroon ontbreken de pieken QUADRI-1 en QUADRI-2 en zijn juist de gedeacyleerde QUADRI-1A en QUADRI-2A aanwezig. Hieruit blijkt onder andere dat B4b bepaald geen zuivere stof is. Verder kan door het ontbreken van QUADRI-1 en QUADRI-2 nu verklaard worden waarom B4b wel ISCOMS geeft maar geen voor ISCOMS normale adjuvans-activiteit bezit.

De figuren 5 en 6 tonen RP-HPLC elutiepatronen voor de verbindingen QUADRI-1, respectievelijk QUADRI-2. Uit de figuren blijkt dat beide fracties voor meer dan 99,99% zuiver zijn.

In de tabellen 1 en 2 worden de samenstelling van de aanwezige suikers weergegeven, welke bepaald is volgens de methode van Kamerling, J.P. et al., Carbohydrates 175-263, (1989), A.M. Lawson (ed.), Clin. Biochem. 1, Mass Spectrometry, W. de Gruyter, New York. Voor QUADRI-1 werd 0,4 mg gebruikt met 250 nmol mannitol als Interne Standaard (IS). De resultaten staan in het bovenste deel van tabel 1. Van QUADRI-2 werd 0,3 mg gebruikt met 250 nmol IS. De resultaten staan in het onderste deel van tabel 2. Van QUADRI-1A werd 250 μΐ oplossing gebruikt met 20 nmol IS. De resultaten staan in het bovenste deel van tabel 2. Van QUADRI-1B werd eveneens 250 μΐ oplossing gebruikt met 20 nmol IS. De resultaten staan in het onderste deel van tabel 2.

Uit tabel 1 blijkt dat QUADRI-1 415,9 μg suikers per mg bevat. Dit komt overeen met 41,6% koolhydraten. QUADRI-2 is minder geglycosyleerd en bevat 359,6 μg per mg (35,9% koolhydraten).

* Voor deze suiker is geen referentie meegenomen. Er wordt vanuit gegaan dat de overblijvende piek apiose is.

** De hoeveelheid van deze suiker wordt in de moleculaire ratio op 1 gesteld.

TABEL 2

De betekenis van * en ** is zoals in tabel 1.

Uit tabel 2 blijkt dat het void volume na sterke hydrolyse zo goed als zuiver het suikergedeelte bevat, dat is afgesplitst van QUADRI-1A op plaats 23 van de triterpeno-ide-ring.

De UV-absorptiespectra van QUADRI-1 en QUADRI-2 (zie figuur 7 voor het spectrum van QUADRI-1) vertonen een duidelijke absorptiepiek bij 292 nm. In de octrooiaanvragen WO 88/09336, WO 93/05789 en WO 92/06710 worden eveneens UV-spectra getoond van uit oude bast geëxtraheerde mengsels van saponine-achtige verbindingen. Genoemde spectra vertonen echter alleen een piek bij ongeveer 210 nm. Verwacht wordt derhalve dat de verbindingen volgens de uitvinding in een bepaald opzicht duidelijk afwijken van de reeds in genoemde octrooiaanvragen beschreven verbindingen. Vermoedelijk wijst een en ander op een duidelijk meer onverzadigd karakter van het triterpenoïde van Ouillaia-zuur. dat geïsoleerd is uit vers materiaal. Het meer verzadigd zijn van het materiaal uit de oude bast wordt waarschijnlijk veroorzaakt door oxidatie van het Ouillaia-zuur gedurende de opslag van de bast.

VOORBEELD 2

Toxiciteit van QUADRI-1 en QUADRI-2

Aan groepen van steeds 6 muizen werd subcutaan 50, 100, 200, 400 of 800 βg QUADRI-1, respectievelijk QUADRI-2 toegediend. Zelfs de maximaal gebruikte dosis van 800 μg QUADRI-2 per muis van 20 g bleek voor geen der 6 proefdieren lethale gevolgen te hebben. Dit betekent dat de LD5o van QUADRI-2 groter is dan 40 mg/kg proefdier. In het geval van QUADRI-1 werd een LD50 van ongeveer 7,5 mg/kg gevonden. Als referentiemateriaal werd QUIL A® van Superfos gebruikt. De LD50 van dit preparaat bedroeg ongeveer 25 mg/kg. Hierbij moet echter opgemerkt worden dat de hoeveelheid effectieve stof in het geval van QUADRI-1 en QUADRI-2 veel hoger is dan in QUIL A®. QUIL A® bevat slechts 5% aan effectieve saponi-nes. Een dosis van 1 mg/kg QUADRI-1 komt derhalve overeen met 20 mg/kg QUIL A. Hieruit blijkt dat de toxiciteit van de zuivere QUADRI-1 en QUADRI-2 verbindingen veel lager ligt dan de toxiciteit van het commercieel verkrijgbaar QUIL A preparaat.

VOORBEELD 3

Hydrolyse van QUADRI-1 en QUADRI-2

Teneinde de structuur van QUADRI-1 en QUADRI-2 te kunnen bewijzen worden hydrolyseproeven gedaan met de zuivere stoffen QUADRI-1 en QUADRI-2. QUADRI-1 wordt opgelost in een alkalische NaOH-oplossing met een pH van 12 bij kamertemperatuur (zogeheten "milde hydrolyse"). Na 30 minuten wordt de hydrolyse gestopt en wordt het reactiemengsel geanalyseerd op RP-HPLC (VYDAC, C4-kolom, geëlueerd met een 0,15% trifluorazijnzuuroplossing in water, gecombineerd met een acetonitrilgradiënt van 30% tot 45%). Hierbij blijkt dat QUADRI-1 grotendeels is omgezet in een nieuwe verbinding, die gekenmerkt wordt door een retentietijd van ongeveer 8 minuten (zie figuur 8). Deze verbinding is het hydrolysepro-dukt QUADRI-1A. Vervolgens wordt 30% acetonitril toegevoegd aan een alkalische oplossing (pH 12) van QUADRI-1, welke oplossing gedurende 16 uur op 100°C wordt verhit (zogeheten "sterke hydrolyse"). Het elutiepatroon vertoont daarna naast de piek van het "void volume" twee andere pieken (zie figuur 10), waarvan de eerste, met een retentietijd van ongeveer 8,7 minuten, overeenkomt met de piek die ontstaan is na de milde hydrolyse (vergelijk figuur 8), en de tweede overeenkomt met QUADRI-1B.

Overeenkomstige experimenten worden uitgevoerd met QUADRI-2. Het produkt dat uit QUADRI-2 ontstaat na een milde hydrolyse wordt gekenmerkt door een retentietijd van ongeveer 9,6 minuten, terwijl na sterke hydrolyse het produkt QUADRI-2B dezelfde retentietijd vertoont als QUADRI-1B (resultaten niet getoond). Teneinde de verschillen in de elutietijden te compenseren worden de sterke alkalische hydrolysaten van QUADRI-1 en QUADRI-2 gemengd en op een kolom gebracht. Uit figuur 11 blijkt dat er slechts drie pieken te zien zijn. Deze pieken zijn: QUADRI-1A (8,645 minuten), QUADRI-2A (10,363 minuten) en QUADRI-1B en -2B samen (13,109 minuten). De gevonden resultaten zijn in overeenstemming met het feit dat QUADRI-1 één glucose meer bezit op een deel dat na milde hydrolyse nog niet, maar na sterke hydrolyse wel, wordt afgesplitst. De overblijvende produkten na sterke hydrolyse zijn daarom identiek, terwijl de produkten na milde hydrolyse van elkaar verschillen.

Van de hydrolyseprodukten van QUADRI-1 werd een suikeranalyse uitgevoerd. De resultaten hiervan zijn te zien in tabel 2 (boven).

Het feit dat deze verbindingen, die ook te vinden zijn in het QUIL A, dat geëxtraheerd is uit oude bast, gegenereerd kunnen worden uit twee verbindingen QUADRI-1 en QUADRI-2 was eerder onbekend.

VOORBEELD 4 ISCOM-vorming

Een oplossing van één of meer van de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding werd bereid door een aantal mg van de verbinding op te lossen in een overeenkomstig aantal ml water (dit is oplossing A).

Fosfatidylcholine werd in water met 20% van het detergens Mega-10® (Sigma) opgelost tot een concentratie van 10 mg/ml. Per ml werd daarin 10 mg cholesterol opgelost door bij 50°C te roeren. Dit is oplossing B.

Een antigeenoplossing werd verkregen door een bepaald aantal mg antigeen op te lossen in een overeenkomstig aantal ml water. Dit is oplossing C.

Voor de vorming van een ISCOM-matrix wordt per ml A 20 μΐ B toegevoegd. ISCOMS worden bereid uit 1 ml A, 1 ml C en 20 μΐ B. De mengsels worden gedurende 3 tot 4 uur op een tuimelinrichting geschud. Indien nodig wordt het Mega-10® verwijderd door dialyseren tegen fysiologische zoutoplossing (0,85% NaCl, 0,01 M fosfaatbuffer, pH 6,5-7,2).

Figuur 13 is een electronenmicrospcopische foto, welke de ISCOM-matrix-vormende eigenschappen van QUADRI-1 illustreert. Figuur 14 toont de ISCOM-matrices, die gevormd zijn met één van de twee hydrolyseprodukten, die verkregen zijn na milde hydrolyse van QUADRI-i (het produkt dat bij de sedimentatie experimenten uit figuur 19 een waarde van 2,405 vertoonde). De hydrolyseprodukten blijken kleinere ISCOM-matrices te vormen dan de uitgangsprodukten.

Met behulp van de "Zetamaster" van Malvern Instruments Ltd., Engeland, wordt de zogeheten Zetapotentiaal gemeten. De Zetapotentiaal geeft de stabiliteit van een deeltje in een oplossing weer. Met de ISCOM-matrices met verbindingen volgens de uitvinding in een fysiologische zoutoplossing (0,85% NaCl, 0,01 M fosfaatbuffer pH 7,2), wordt een waarde van -22 mV verkregen. Dit betekent dat een zeer stabiel micel (ISCOM) is verkregen.

Er worden ultracentrifuge-experimenten uitgevoerd, waarbij in een sucrose-gradient, op algemeen bekende wijze de sedimentatiesnelheden van de diverse ISCOM-matrices worden waargenomen (figuren 17 en 18) QUADRI-1 en QUADRI-2 vormen homogene ISCOM-matrices. De produkten die slechts een half uur alkalisch gehydrolyseerd zijn, zijn niet homogeen (zie figuren 8 en 10) en vertonen dan ook twee pieken in hun sedimentatiesnelheden (figuren 19 en 20). De absolute waarde van de diverse sedimentatiesnelheden geeft aan dat ISCOMS van zeer verschillende grootte kunnen worden gemaakt, hetgeen een ander middel is om de presentatie van antigenen beheerst te kunnen beïnvloeden. Dit biedt tevens de mogelijkheid om selectief in interactie te treden met diverse soorten cellen of celcompartimenten. Opmerkelijk is hierbij dat ook de met gehydrolyseerde saponines bereide ISCOM-matrices eenzelfde hoge stabiliteit bezitten, zoals gekarakteriseerd door hun Zetapotentiaal van -22 mV.

Doordat thans zeer zuivere saponines, en gehydrolyseerde en/of gemodificeerde afgeleiden daarvan beschikbaar zijn, wordt het mogelijk de immuunrespons te sturen. Afhankelijk van de keuze van de verbinding kan een breed spectrum van responsen, bijvoorbeeld variërend tussen een snelle, maar mogelijk minder brede en persistentie, tot een langzamere maar bredere en langdurigere bescherming mogelijk gemaakt worden. Ook kan de vorming van antilichamen, respec- tievelijk cytotoxische T-lymfocyten worden beïnvloed. De aparte verbindingen kunnen eveneens in combinatie met ISCOMS toegepast worden. Daarnaast kunnen de ISCOMS op zichzelf gebruikt worden.

Samenvattend kan gesteld worden dat de al dan niet gehydrolyseerde en/of gemodificeerde verbindingen volgens de uitvinding, zelfstandig gebruikt kunnen worden als adjuvans, of betrokken kunnen zijn bij de vorming van de ISCOM-matrix of ISCOMS. Daarnaast zijn de verbindingen geschikt voor gebruik in hemolyse en kunnen zij worden toegepast voor de plaatsgerichte afgifte van geneesmiddelen. In alle gevallen hebben de stoffen als voordeel dat zij te identificeren zijn als zuivere componenten en daarom voor gebruik in bijvoorbeeld humane vaccins waarschijnlijk als acceptabel adjuvans geregistreerd kunnen worden.

De hoge mate van zuiverheid zal verder leiden tot een lage toxiciteit en minder bijwerkingen (zoals allergie, irritatie en dergelijke). Dit is onder andere te danken aan het feit dat door de grotere zuiverheid een lagere concentratie gebruikt kan worden, maar eveneens doordat verontreinigingen die in de bestaande preparaten dergelijke reacties kunnen opwekken niet aanwezig zijn in de preparaten volgens de onderhavige uitvinding.

Claims (32)

1. Verbindingen met adjuvans-activiteit verkregen door het in zijn componenten scheiden van een extract van vers plantemateriaal, bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, dat afkomstig is van saponine-producerende planten.

2. Verbindingen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal afkomstig is van planten van de genera Quillaia. Saoonaria of Gvosoohilia.

3. Verbindingen volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal afkomstig is van Ouilla- 1¾......saponaria Molina. Gypsophilia paniculata. Gvpsophilia pacifica, Gvpsophilia arrostii. Gvpsophilia struthium of Saponaria officinalis.

4. Verbindingen volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal bestaat uit cambium-cellen of meristeemcellen.

5. Verbindingen volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal wordt gevormd door cellen uit een suspensiecelkweek.

6. Verbindingen volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal wordt gevormd door cellen uit een weefselkweek.

7. Verbindingen volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het plantecelmateriaal afkomstig is uit een wortelcultuur.

8. QUIL A, geïsoleerd uit vers plantemateriaal bestaande uit in hoofdzaak levende cellen.

9. QUADRI-1.

10. QUADRI-2.

11. Verbindingen volgens één der conclusies 1-10, met het kenmerk, dat zij tenminste ten dele gehydrolyseerde afgeleiden van het uitgangsprodukt zijn.

12. QUADRI-1A.

13. QUADRI-1B.

14. QUADRI-2A.

15. QUADRI-2B.

16. Verbindingen volgens één der conclusies 1-15, met het kenmerk, dat zij gemodificeerde afgeleiden van het uitgangsproduct zijn.

17. Werkwijze voor het bereiden van in hoofdzaak zuivere verbindingen met adjuvans-activiteit volgens één der conclusies 1-10, omvattende het aan een scheiding in fracties onderwerpen van een ruw extract van vers plantemateri-aal, bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, dat afkomstig is van saponine-producerende planten ter verkrijging van tenminste één gezuiverde component.

18. Werkwijze voor het bereiden van in hoofdzaak zuivere saponine-achtige verbindingen met adjuvans-activiteit volgens één der conclusies 11-15, omvattende het aan een scheiding in fracties onderwerpen van een ruw extract van vers plantecelmateriaal, bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, ter verkrijging van tenminste één gezuiverde component en het vervolgens tenminste ten dele hydrolyseren van de gezuiverde component(en).

19. Werkwijze voor het bereiden van in hoofdzaak zuivere saponine-achtige verbindingen met adjuvans-activiteit volgens conclusie 16, omvattende het aan een scheiding in fracties onderwerpen van een ruw extract van vers plantecelmateriaal, bestaande uit in hoofdzaak levende cellen, ter verkrijging van tenminste één gezuiverde component, het eventueel hydrolyseren van de gezuiverde component(en) en het vervolgens tenminste ten dele modificeren van daarvan.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat het modificeren bestaat uit het aan de verbinding koppelen van een antigeen.

21. Werkwijze volgens één der conclusies 17-20, met het kenmerk, dat de scheiding in fracties wordt uitgevoerd door middel van preparatieve HPLC.

22. ISCOM-matrix, omvattende tenminste één lipide, tenminste één detergens en tenminste één verbinding volgens één der conclusies 1-16, of combinaties daarvan.

23. ISCOMS, omvattende de ISCOM-matrix volgens conclusie 22 in combinatie met tenminste één antigeen.

24. Adjuvans, omvattende tenminste één van de verbindingen volgens één der conclusies 1-16 en/of een ISCOM-matrix volgens conclusie 22 en/of één of meer ISCOMS volgens conclusie 23.

25. Vaccin, omvattende een adjuvans volgens conclusie 24 en tenminste één vaccinerende stof.

26. Gebruik van verbindingen volgens één der conclusies 1-16 in een ISCOM-matrix.

27. Gebruik van verbindingen volgens één der conclusies 1-16 in ISCOMS.

28. Gebruik van verbindingen volgens één der conclusies 1-16 als een adjuvans.

29. Gebruik van verhingen volgens één der conclusies 1-16 in een vaccin.

30. Werkwijze voor het beheersen van de mate van versterking van en het type van de immuunrespons door het afhankelijk van de gewenste respons kiezen van een verbinding volgens één van de conclusies 1-16, al dan niet in combinatie met één of meer ISCOM-matrices volgens conclusie 22 en/of één of meer ISCOMS volgens conclusie 23.

31. Werkwijze voor de hemolyse van bijvoorbeeld rode bloedcellen door het aan de cellen toevoegen van tenminste één verbinding volgens één der conclusies 1-16.

32. Werkwijze voor het gericht op een bepaalde locatie in het lichaam afgeven van een farmaceutisch middel door het aan een patient toedienen yan een in een ISCOM-matrix volgens conclusie 22 opgenomen farmaceutisch middel waarbij in en/of op de ISCOM-matrix eventueel tevens een naar de bepaalde locatie in het lichaam gericht molecuul is opgenomen.