JPH01199593A

JPH01199593A - 抗ウイルス剤

Info

Publication number: JPH01199593A
Application number: JP63022998A
Authority: JP
Inventors: Shigeaki Muto; 武藤　成明; Minoru Ohara; 稔大原; Jiyunji Kadochi; 淳二角地; Chikao Yoshikumi; 吉汲　親雄; Masaaki Takahashi; 正明高橋
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1988-02-03
Filing date: 1988-02-03
Publication date: 1989-08-10
Anticipated expiration: 2011-02-21
Also published as: DE3881198D1; CA1339111C; JPH0816118B2; EP0331821B1; EP0331821A1; DE3881198T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業の利用分野］本発明は、カワラタケ属に属する担子菌由来の特定の蛋
白多糖体及び該蛋白多糖体を有効成分とする抗ウィルス
剤に係り、特に抗し１〜

【］ウィルス剤、就中抗エイズ
ウィルス剤に係る。更に詳しくは、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子
量が５０□０００〜３．０００．０００を示し、α−ナ
フ１〜−ル硫硫酸反応ゼインドール硫酸反応アンスロン
硫酸反応、フェノール硫酸反応、１ヘリブトファン硫酸
反応、ローリイフＡリン法及び塩酸加水分解後のニンヒ
ドリン反応において呈色反応を示し、ローリイフＡリン
法で定ｍした蛋白質部重量／フェノール硫酸法で定量し
た糖質部重量が４０／６０乃至７０／　３０であり、水
にと（プ、ピリジン、り［１０ホルム、ベンゼン、ヘギ
ザン、メタノールに不溶で、比旋光度［α］。が−１０
°乃至３０°を示し、赤外線吸収スペク１〜ルにおいて
８９０ｃｍ−’に特性吸収を示し、蛋白質部のアミノ酸
の７０％以上がアスパラギン酸、スレオニン、セリン、
グルタミン酸。グリシン、アラニン、バリン及びロイシンよりなり、糖
質部の７５重量％以上がグルコースとマンノースでその
比の値が２乃至４であることを特徴とする蛋白多糖体、
及び該蛋白多糖体（以下、本物質と略称する）を有効成
分として含有する抗ウィルス剤に関】る。［従来の技術］抗エイズウィルス剤どじですでに使用されているアジド
−３°−デオキシチミジン（ＡＺＴ）があげられるが、
この場合、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副作
用がみられる。更に抗ウィルス剤としてのワクチンが用
いられていたが抗エイズウィルス剤としては有効でない
。一方、担子菌類から得られる蛋白多糖体及び蛋白多糖体
の製造方法としては以上のものが提案されている。超遠心法による測定で分子ｆｉ　５０００〜３００００
０を示し、α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反
応、アンス［１ン硫酸反応、フェノール硫酸反応、トリ
プトファン硫酸反応について糖類の呈色反応を示し、ロ
ーリィフォリン法ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリ
ン反応についてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反
応をそれぞれ示し、プロ］〜ン核磁気共鳴スペクトル測
定による吸収位置が０．９±０．１　ｐｐｍ　、　　１
．２±０．１　ｐｐｍ　、　　２．０±Ｏ，ｉｐｐｍ。４．５±０．１１）ｌ）ｍ　、　　４．７±０．１　ｐ
ｐＨｌであり、３０〜４．４　ｐｐｍにブロードな吸収
を有するものであり、０５〜２．５　ｐｐｍを蛋白部分
のプロトン強度とし、２．５〜６．０　ｐｐｍを糖質部
分のプロトン強度とした場合の糖質部分／蛋白部分の割
合が５５／４５〜９５１５の範囲であり、４９〜６．０
　ｐｐｍのα−グルカンに基く吸収を示さないβ−グル
カンより糖質部分が構成されてｄ５す、蛋白部分はアス
パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロ
リン、グリシン、アラニン、シスデイン、バリン、メチ
オニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリブＩ
〜ファン、フェニルアラニン、リジン、ヒスヂヂン、ア
ルギニンより構成されていることを特徴とする蛋白多糖
体、及び担子菌の種菌を１１ｒ、　Ｉ＠養して培地表面
に発育した菌苔を生理的食塩水と共にホモジナイズして
生産培養の種菌とし、この種菌を静置又は深部培養して
菌糸体を生成せしめ、これを熱水、希アルカリ溶液のよ
うな水性溶媒を用いて抽出し、この抽出物から抽出残渣
を除去した後に濃縮し、これに硫安などによる塩析或は
限外ｅ過などの操作を施して低分子物質を除去し、Ｉｒ
ｉ製して濃縮液とし、か、」；うにして得られた濃縮液
に、硫安をその飽和度の２５％に相当する量添加して生
成でる沈澱を除去し、次に得られる液に、硫安をその飽
和度の４０％に相当する吊添加して生成する沈澱を採取
し、透析説塩後ＤＦＡＥセルロースカラムに吸着せしめ
、ついで１モルの塩化ナトリウム水溶液で溶出せしめで
得られる溶出液に、硫安をその飽和値の４０％に相当す
るけ添加し、生成した沈澱を採取し、透析脱塩すること
による該蛋白多糖体を得る方法（特公昭５５−２３２７
１）　；超遠心法による分子量測定で５０００乃至３０
００００の分子量を示し；α−ナフ１〜−ル硫酸反応、
インドール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、フェノール
硫酸反応およびトリプトファン硫酸反応で糖類の呈色反
応を示し：元素分析値が炭素４３．５−４５．３％、水
素５７〜６７％および残余が酸素であり；化皮光度［α
］。が７０〜１８０°を示し；赤外線吸収スペクトルに
おいて８４０ｃｍ”に特性吸収を示し；核磁気共鳴スペ
クトルの測定による吸収位置が３７±０．１　　ｐｐｍ
　　、　３．８−！Ｔ０．１　　ｐｐｍ　　、　　５．
０±０．ｌｐｐｍ。５４±０．１　ｐｐｍであり；水に可溶性でピリジン、
り［」ロボルムならびにヘキサンに不溶であって、Ｄ−
グルコースを主要な構成糖とすることを特徴とする多糖
体く特公昭５６−４６４８１）　：超遠心法による測定
で５０００〜３０００００の分子量を示し、α−プフ１
〜−ル硫酸反応、インドール硫酸反応、アンスロン硫酸
反応、フェノール硫酸反応おにびトリプトファン硫酸反
応について糖類の呈色反応を示し、ローリィフォリン法
ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペ
プチド結合とアミノ酸の呈色反応をそれぞれ示し、プロ
１〜ン核磁気共鳴スペクＩ〜ル測定による吸収位置が０
９±０．１　ｐｐｍ　、　　１．２１−０．１　ｐｐｍ
　、　　２．０±０．　ｌｐｐｍ。４５±０．１　ｐｐｍ、４１±０．１　ｐｐｍ、５０±
０．　ｌｐｐｍ。５４±０．１　ｐｐｍであり、３．０〜．４．４ｐｐｍ
にブロードな吸収を有づ−るものであり、０５・〜２．
５　ｐｐｍを蛋−〇　− 白部分のブ［１１−ン強度、２．５〜６．０　ｐｐｍを
糖質部分のプロ１〜ン強度とした場合の糖質部分／蛋白
部分の割合が５４＋；／４５〜９５１５の範囲であり、
４９〜６．０　ｐｐｍのα−グルカンに基く吸収と４．
４〜４９ｐｐｍのβ−グルカンに基く吸収の強度比によ
るα／βが５０１５０〜１０／９０の範囲であるような
糖質部分がβ−Ｄ−グルカンとα−Ｄ−グルカンから形
成されており、かつ蛋白部分がアスパラギン酸、スレオ
ニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ア
ラニン、システィン、バリン、メチオニン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、１〜リプトフ７ン、フェニル
アラニン、リジン、ヒスヂヂンおよびアルギニンから構
成されていることを特徴とする蛋白多糖体、及び担子菌
の種菌を前培養して培地表面に発育した菌苔を生理的食
塩水と共にホモジナイズして生産培養の種菌とし、この
種菌を静置又は深部培養して菌糸体を生成ゼしめ、これ
を熱水、希アルカリ溶液のような水性溶媒を用いて抽出
し、この抽出物から抽出残渣を除去した後に濃縮し、こ
れに硫安などにょる塩析或は限外濾過などの操作を施し
て低分子物質を除去し、ｆ７　’ＪＪして濃縮液どじ、
かようにして得られた濃縮液に硫安を４０％飽和せしめ
、生成する沈澱を除去し、次に硫安を６０％飽和せしめ
て生成する沈澱を採取し、透析脱塩後ＤＥＡＦセルロー
スカラムに吸着Ｕしめ、ついで１モルの塩化プトリウム
水溶液で溶出けじめ−で得られる溶出液に硫安を６０％
飽和せしめ、生成した沈澱を採取し、透析脱塩すること
による該蛋白多糖体を得る方法（特公昭５７−４０１り
９）　：カワラタケ属に属する菌の人口培養によって得た菌糸体
を、水又はこれに可溶性の少量の酸、塩基又は有機溶媒
を含む水系溶媒にて抽出することにより、その加水分解
物がモーリッシュ反応、アンスロン硫酸反応、トリプト
ファン硫酸反応、システィン硫酸反応、アミノグアニジ
ン硫酸反応、クロモトロープ酸硫酸反応、カルバゾール
・システィン硫酸反応、セリバッフ反応、ビアール反応
、アニリン塩酸反応、１〜レンス反応及びチオグリコー
ル酸硫酸反応については陽性、ニンヒドリン反応につい
ては弱陽性を示す特性を有する制癌性を有づる多糖類を
得る方法（特公昭５ｌ−３６３２２）；及びカワラタケ
属に属する担子菌を００１Ｎ乃至２Ｎのアルカリ水溶液
を用いて抽出し、得られる抽出液を限外濾過及び又は逆
滲透圧法により処理して、該抽出液中に含有される分子
量５０００以］・の低分子物を除去することを特徴とす
る含窒素多糖体の製造方法（特公昭５６−１４２７４）
。［発明が解決しようとする問題点］最近Ｂ型肝炎、成人工細胞白血病更にはＡＩＤＳと近年
法々にウィルス病が話題の焦点となって−１２＝いる。特に、ＡＩＤＳ（八ｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙＳｌ／ｎｄｒｏｍＱ）といわれる一連
の後天性免疫不全症候群は患者を死に至らしめる重篤な
病気として注目されている。この病気の原因はレトロウ
ィルスの一種であるＨ　Ｉ　Ｖ　（ｌｌｕｍａｎ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）がヒトのＴ
４リンパ球細胞に吸着することによって感染が始まり、
他のリンパ系細胞に次々に感染して免疫系を破壊するこ
とによって起こることが既に研究されている。ウィルス
病に対してはこれまでワクチンによる予防接種で対応し
、天然痘根絶をはじめ、黄熱、ポリオの制圧がなされて
ぎた。しかし、ＡＩＤＳなどのように持続感染や潜伏感染が問
題となる病気に対してはワクチンだけでは対抗できず、
またＨＩＶの膜の竹買上有効なワクチンの開発は難しい
と考えられており、安全で＝　　１３　− 優れた効果を示す抗エイズウィルス剤の開発が期待され
ている。そしてすでに抗エイズウィルス剤としてＡＺＴが使用さ
れているが、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副
作用がみられる。そこで副作用の少ない安全な抗エイズ
・フィルス剤の開発が待たれている。本発明者らは、前述の通りづ−でに免疫系に対してＢ　
ＲＭ　（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｒ）の働きをする多くの蛋白多糖体を見出
している。特にサルノコシカケ利に属するカワラタケ属
の担子菌より抽出された蛋白多糖体の中の一種であるク
レスチン（登録商標）は、抗腫瘍剤として既に市販され
てｄ３す、極めて低毒性で、且つ腸内菌叢撹乱などの心
配がなく、長期投与が可能である。また、変異原性やア
レルギー反応などにも影響を与えず、従って健康な人に
対する催奇形性や、アレルギー反応の危険もなく、極め
て安全な物質である。このＪ、うな４ノルノコシカケ科
に屈するカワラタケ属の担子にｊより抽出された蛋白多
糖体は、天然物質である担子菌から１ｑられるものであ
って、多数の蛋白多糖体から成る複利す化合物を含有し
ている！こめ、該抽出物の抗Ｊイス′作用［１−１１Ｖ
のヒ１〜山来すンパ系細胞への吸着阻害活性、及び＋」
Ｉ　Ｖの増殖過程に必須の酵素である１Ｔａｓｅ　（逆
転写酵素）Ｋ’ｒ　＋１阻害１の有効成分物質の性格に
ついては未だ充分に解明がなされていない。本発明習等は、この有効物質の解明について鋭意検詞を
重ねた結果、カワラタケ属に属する１！１子菌を培養し
Ｃ得られる菌糸体又は子実体を熱水又はアルカリ性水溶
液で抽出し、飽和硫安塩析後彎られる沈澱物を脱塩し、
再溶解し、飽和度２５％硫安で塩析し再沈澱した沈澱物
を透析により脱塩し、１ｑられた分画物をＤ［へＥイオ
ン交換セルロースカラムにて吸着させ、吸着画分を塩化
ツートリウム水溶液で溶出し、溶出液を透析、脱塩する
ことににって得られた本物質が抗ウィルス活性を有する
ことを見出し、この知見に基づいて本発明を成すに至っ
た。［問題点を解決する為の手段］本物質は、ゲル波過クロマ１〜グラフィーによる分子量
が５０．０００〜３，０００，０００を示し、α−ナフ
トールｉＪ　Ｆｌｔ反応、インドール硫酸反応、アンス
ロン硫酸反応、フェノール硫酸反応、トリプトファン硫
酸反応、ローリイフＡリン法及び塩酸加水分解後のニン
ヒドリン反応において呈色反応を示し、ローリイフオリ
ン法で定量した蛋白質部重量／フェノール硫酸法で定量
した糖質部重量が４０／　６０乃至７０／　３０であり
、水にとけ、ピリジン、クロロホルム、ベンゼン、ヘキ
サン、メタノールに不溶で、比旋光度［α］、が一１０
°乃至３０°を示し、赤外線吸収スペクトルにおいてｇ
９ｏｃｍ−１に特性吸収を示し、蛋白質部のアミノ酸の
７０％以上がアスパラギン酸、スレオニン、セリン、グ
ルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン及びロイシン
よりなり、糖質部の７５ｆｆｉ　１８％以上がグルコー
スとマンノースであり、該グルコース及びマンノースの
比の値が２乃至４であることを特徴とするものである。（１）本物質の調製カワラタケ属に属する担子菌を培養して得られる菌糸体
よ１〔は子実体を熱水またはアルカリ性水溶液によって
抽出し、飽和硫安塩析後彎られる沈澱物をｊ脱塩し、再
溶解し、（１）飽和度２５％の硫安で塩析し再沈澱した
沈澱物を透析により脱塩し、次に得られた分画物をＤＥ
ＡＥイオン交換セルロースカラムに吸着させ、吸着画分
について塩化ナトリウム水溶液で溶出し、溶出液を限外
濾過により脱塩する、又は（ｉｉ）Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅイオ
ン交換セルロ一スカラムで処理し、吸着画分について塩
化す１〜リウム水溶液で溶出しに溶出液を限外濾過によ
り脱塩し、次に飽和度２５％の硫安で塩析し、再沈澱し
た沈澱物を透析にまり脱塩することにより本物質を得る
。以下に本物質の物理的ならびに化学的性質について）ホ
ベる。（２）物理的ならびに化学的性質 ■　分子量ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が５０、００
０〜３．０００．０００で、平均分子量は１１０，００
０〜３００、０００である。 ■　呈色反応本物質を水に溶解させ呈色反応を行った試験結果につい
て下表に示す。第１表呈　　　色　　　反　　　応　　　呈　　色　　　結　
　果α　−ナフ　１〜−ル硫酸　　　　　紫　　色　　
　　糖　　質反応（Ｈｏｌｉｓｃｈ反応）インドール硫酸反応　　　褐　色　　糖　質アンスロン
硫酸反応　　　緑　色　　糖　質フェノール硫酸反応　
　　褐　色　　糖　質１−リブトファン硫酸反応　紫　
色　　糖　質１−］−リイフオリン法　　　青　色　ペ
プヂド結合チロシン、１− リブ１へファン。シスチン塩酸加水分解後の　　　　紫青色　α−アミノ酸ニンヒ
ドリン反応（６ＮＩＩＣＩ、　　１１０℃、　２０ｈｒ）以上の早
色試験結果より本物質が糖質および蛋白質を含有してい
ることが明らかである。 ■溶解性本物質は、水に溶解するがメタノール、ピリジン、クロ
ロホルム、ベンゼン、ヘキサノにはほとんど不溶である
。 ■　吐値本物質１ｇを１００ｄの水に溶解し、ｐｌ−１を測定し
たところ６．０〜１．５であり、はぼ中性である。 ■　比旋光度本物質の０１０％水溶液で旋光度を測定し化皮光度［α
］。を求めたところ一１０°〜→−３０°の範囲であり
、β−グリカンが主体であることが推定される。 ■　元素分析値本物質の元素分析を行ったところ、窒素値は５〜１０％
、炭素値は３５−５０％及び水素値は５へ・７％を示す
。＝　２０− ■　フェノール硫酸法で定量した糖質部とローリイフＡ
リン法で定量した蛋白質部は、糖質部重量／蛋白質部重
量比が６０／　４０〜３０／　７０で、好ましくは５４
／　４６〜．３５／６５である。（３）構造的特徴本物質は蛋白多糖体であり、ざらに分析を行い蛋白質部
の特徴、′ｌ！Ｊ質部の特徴について以下に示１゜ ■蛋白質部の特徴本物質の蛋白質部分のアミノ酸組成を常法に従い加水分
解した後、アミノ酸分析装置を用いて分析した結果を表
−２に示す。表−２アミノ酸の１　　　　千　吊（％）アスパラギン酸　　　　　１０〜１９スレオニン　　　　　　　４〜１０セ　　リ　　ン　　　　　　　　　　　　　　　　　３
〜１１グルタミン酸　　　　　　１０〜１８グリシン　　　　　　　　　６へ・９アラニン　　　　　　　　　６・〜・１３バ　リ　　ン
　　　　　　　　　　　　　　　　５〜１１０イシン　
　　　　　　　　６・〜８プロリン　　　　　　　ｔｒａｃｅへ８シスブン　　　
　　　　　　ｔｒａｃｅメチオニン　　　　　ｔｒａｃ
ｅ〜４イソロイシン　　　　　　３〜５チロシン　　　　　　ｔｒａｃｅ〜３フ１ニルアラニン　　　　３へ・６１ヘリブトフアン　　　　ｔｒａｃｅ〜２リジン　　　
　　　　　　１〜４ヒスデシン　　　　　ｔｒａｃｅ〜２アルギニン　　　　　　　１〜４（アンモニア）　　　　　　　１〜６上表−；す、本物質の有効成分の蛋白質部分はアミノ酸
１８種を含有し、量的には酸性アミノ酸、中性アミノ酸
が主で、塩基性アミノ酸は少量である。また、これ等アミノ酸のうちでアスパラギン酸、スレオ
ニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バ
リンならびにロイシンで７０％以上を占める。 ■糖質部の構成本物質の糖質部の構成糖に関しては試別１０ｍ３に３％
塩酸メタノールを加え１００℃で１６時間メタツリシス
を行った後、常法により１〜リメヂルシリル化を行って
ガスクロマド分析を行った結果によると、グルコース／
マンノースの比の値は２〜４で主構成糖を示し、糖質部
の７５％以上を占める。ガラクトース、キシロース、フ
コース、グルコサミンなどの糖も認められる。また、本
物質の糖質部の主要な構成糖の一種であるグルコースの
り、Ｌ区別を確認するため本物質の加水分解物よりグル
コースの結晶を分離して測定したところ、その融点は１
４３〜１４５℃であって該グルコースの結晶はＤ−グル
コースの標品との融点降下を示さなかったためＤ−グル
コースである。 ■糖質部における構成糖の結合的特徴グリコシドの結合位置の決定は次の様にして行った。過
ヨウ素酸酸化法、スミス分解法により得結合を確認し、
ハウオ−−ス法によるメチル化加水分解で構成比率を求
める。なお同定は次の様にして行う。メチル化物の加水
分解によって生成した糖はアルデイトールアセテート、
およびメチルグリコシトどしてガスクロマ１−グラフィ
ーを行って同定し、さらにカラム液体り１］マドグラフ
イーにより個々の加水分解物を単離しそれらを直接結晶
化させるか、あるいは結晶状誘導体に導くことによって
確認する。なおモル比はアルデイ１〜−ルアセデ−１〜
のガスクロマトグラフ上の面積比より求めたものである
。表　　−３メチル化糖の加水分解　　　結　合　　モル比２．３．
６−ｔ−ジ−０−メチル−Ｇ　→４　Ｇ１→　０〜１０
２、３．４−１−ツー０−メヂルーＧ　→６Ｇ１　　、
　　　ｏ〜１２．４．６−ト１ル０−メヂルーＧ　→３
Ｇ１→　０〜５上表より明らかなように、本物質の糖質
部はβ−１，４結合が主体となっているものと解される
が、この糖質部にはβ−１，３結合も存在し、さらに分
校が極めて多い構造を示す。即ち一般式（Ｉ）で示される構造が認められる。（ただしＧは単糖をｐは０−１０、ｑは０〜５、ｍはＯ
〜２、ｎは３又は４、ｐはＯ〜１を示す。）本物質の糖
質部と蛋白質部の結合はグルコサミンを介しての結合を
主に含む。即ちグルコサミンの０３　、Ｃ４、Ｃ６の炭
素に結合する水酸基のいずれかが糖鎖部分と結合し、Ｃ
１位の水酸基と蛋白質部分がＮ−グリコシド結合により
結合した構造である。＝　２６− ■赤外線スペクトル次に、本物質のＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペク１
〜ルは添付図面の第１図に示す如くである。第１図においで３６００〜３２００Ｃｍ−１のブロード
な吸収は種々の度合に水素結合したνＯｌ−１に由来す
るものど考えられる。この吸収は試料の糖質部の水酸基
を０−メチル化すると減少或いは消失することなどから
推定できる。１７００〜１６００ｃｍ−１の吸収は−　
Ｎ　Ｈ２の、１５３０　ｃｍ　　の吸収は−ＮＨのそれ
ぞれの変角振動と考えられ、いずれも試料中の蛋白質部
に起因するものと思われる。また１２００〜１００１０
０Ｏ’のブロードな吸収は糖質部のピラノース環Ｃ−０
−Ｃ結合の非対称伸縮振動によると考えられる。また８
９０ｃｍ−１に糖質部のβ−配向による時宜吸収が児ら
れるが、８４０Ｃｍ−１にみられるα−配向による特異
吸収は殆ど認められない。なお、上記赤外線吸収スペク
［・ルは、本物質に関しては、いずれも有意な差は認め
られない。 ■プロトン核磁気共鳴吸収（Ｎ、Ｍ、Ｒ）本物質につい
て、溶剤として重水を用い２，２ジメチル−２シラノペ
ンタン−３スルフオン酸ソーダ（１）、Ｓ、Ｓ）を内部
標準として　１００　ＭＨｚで測定する。第２図におい
て４．５　ｐｐｍの吸収は１位のメチンプロトンの内β
−（１−４）、β−（１−６）に関与するものであり、
４．７ｐｐｍの吸収は１位のメチンプロトンの内β−（
１−３）、β−（１−２）に関与するものの吸収である
ことが知られていることから、β−（１−４＞、β−（
１−６）／β−（１−３＞の比が測定できるが、分岐構
造をも含むが故に詳細な構造解明にはメチル化法にＪ：
らなければならない。又５．　Ｏｐｐｍの吸収はα−（
１→６）の、５．４　ｐｐｍの吸収はα−（１→４）、
α−（１→３）に基づく。本物質は、Ｄ、Ｓ、Ｓ、Ｗ準で０．９±０．１　ｐｐｍ
。１２±Ｏ，ｉ　　ｐｐｍ、　　２．０±０．１　　ｐｐ
ｍ、　　４．５±０．１　　ｐｐｍ　　。４．７±ｏ、ｉ　ｐｐｍに吸収を有し、４．９〜６．０
　ｐｐｍに吸収を示さず、３０〜４．４　ｐｐｍにブロ
ードな吸収を荷重るものである。０５・−２，５ｐｐｍ
は蛋白部分の側鎖プロ１〜ンに、２５〜４．７　ｐｐｍ
は糖質部分のプロ１〜ンに起因している。以上説明した如く、本物質はカワラタケ属の担子菌に由
来り−る蛋白多糖体より得られたα−グリカンを（Ｎ、
Ｍ、Ｒ，測定ににす）含まない新規なβ−糖ペブヂドで
ある。尚、核酸の存在は認められない。（４）急性ｌｊ性本物質は、いずれもその毒性が極めて低く且つ副作用も
はどんと生起しないなど、生体に対して非常に安全な物
質である。本物質の急性毒性値は、下記試験法により調べたもので
ある。マウスはＴ　ＣＲ−Ｊ　ＣＬ系、４−５週令、体重２１
〜２４９のものを、ラッ１〜は容量系、４−５ｉ令、体
重１００〜１５０ｑのものを用いた。本物質の投与経路
は、静脈内、皮下、腹こう内および＃￥［１の四経路の
投与を実施する。本物質を生理食塩水に溶解して投与し
、７日間にわたり、一般症状、死亡ならびに体重につい
て観察し、観察期間終了後に屠殺剖検する。表−４に示されるように、ラツ１へ、マウスとも投与可
能な最大投与量においてもまったく死亡例は認められず
、ＬＤ５０値の算定が事実上不可能な程に、本物質は生
体に対して極めて安全である。すなわち、本物質は急性毒性も極めて低く、安全な物質
である。＝　３０− 表−４（５）抗ウイルス活性試験一般にウィルスは、標的細胞に吸着し、ウィルスの核酸
が、細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインチグ
レー１〜される過程を経てウィルス−３１−＝が複製されることが知られている。また、特にレトロウ
ィルスについては、細胞のゲノムにインチグレートされ
る前に、ウィルス由来の核酸であるＲＮＡから、逆転写
酵素の作用によってＤＮＡに転写される過程が必要であ
る。本発明者等は、本物質がＨＩＶのヒト由来リンパ系細胞
への吸着およびそれに引き続く感染を阻害すること、お
よび、逆転写酵素活性を阻害することを見出した。すな
わち、ＨＩＶを５０１１９／ｍＡの濃度の本物質（実施
例１〜４の本物質）で０℃にて２時間処理した後ＨＴ　
Ｖを洗浄し、ＭＴ−４細胞に加えて、３日間培養後のＩ
」Ｉ　Ｖ抗原陽性細胞を測定する方法にて、本物質の効
果を検８４したところ、本物質による前処理により、い
ずれもｌ−Ｉ　Ｔ　Ｖ抗原陽性細胞がほとんど消失し、
ｌ−Ｉ　Ｉ　Ｖのに１〜由来リンパ系細胞に対する強い
吸着阻害効果が認められた。一方、本物質の逆転写酵素
活性に及ぼず影響をラット肝臓全メツセンジャーＲＮＡ
を鋳型として測定したところ、本物質５　ｎ１Ｉｒｔｌ
の濃度で強い逆転写酵素活性の阻害がみられた。本物質は抗ウィルス剤として用いる場合、任意の剤型に
することができる。又投与も各経路で行なわれる。経口（Ｑ与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒剤
、散剤、カプセル剤などは、それらの組成物中に製剤上
一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、潤滑剤、崩
壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、又
経日用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、振盪合
剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよく
、又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であっ
てもよい。さらに、このような液体製剤は普通用いられ
る添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。注射用の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存
剤、等張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投
与量ザンプル、又は多投４量容器中で提供される。なお
、上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性
ビヒクル中の乳液のような形態であってもよく、一方活
性成分は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質
不含の滅菌した水で再ＦＲ解さ一υる粉末であってもよ
い。本物質は人間及び動物に経口的または非経口的に投与さ
れる。経口的投与は舌下投与を包含する。非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈注射、点滴
などを含む。本発明の抗ウィルス剤の投与量は動物か人
間かにより、また年齢、個人差、病状などに影響される
ので、場合によっては下記範囲外の吊を投与する場合も
生ずるが、一般に人間を対象とする場合、本物質の経口
投与量は体重１　Ｋｇ、１日当り　ｏ、ｉ〜１ｏｏｏ４
、好ましくは　Ｉ〜１００ｍｇを１回から３回に分（〕
て投与する。１発明の効果］本物質の特徴はウィルスの感染を阻害する作用をもつこ
と、特に逆転写酵素をもつレトロウィルスの感染を阻害
覆ること、就中、ｌ−１１Ｖ感染によって引き起こされ
るＡＩＤＳに有効であることを示づどころにある。更に本物質が１−１１　Ｖのヒト由来リンパ系細胞への
吸着、それに引き続く感染を阻害Ｊ−ること、及び逆転
写酵素活性を阻害づる両件用を示すことば本物質の特徴
である。抗エイズウィルス剤どしてづでに使用されているＡ７Ｔ
の場合、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副作用
がみられるが、本物質は急性毒性も極めて低く、正常細
胞に対Ｊる副作用がほとんどみられず、安全な物質であ
り、ウィルス感染、特にし１〜ロウイルス感染を阻害す
る作用を示Ｊ”ことＪ、り抗ウィルス剤として有用であ
る。即ちライルス感染症、特にし１〜ロウイルス感染症
、就中ＡＩＤＳに有効である。更に本発明の薬剤は、抗
ウィルス剤として用いる場合Ａ７Ｔなどの他剤との併用
においても効力を減することがなく、これらのことから
他の薬剤との供用は有効な手段どして使用し得る。以下実施例を示して本発明を具体的に説明づるが本発明
はこれら実施例に限定されるものではない。実施例１〜４カワラタケ属に属するＣＭ　１０１株く微工研受託番号
ＰＮｏ、２４１２　、実施例１及び２）、０Ｍ１０２株
（同ＰＮｏ、２４１３、実施例３）、０Ｍ１０３株（同
ＰＮ。２４１４、実施例４）の各菌株を、グルコース５％、ペ
ア１〜ン０２％、Ｍ母エキス０．３％、Ｋ１１２ＰＯ４
０，１％、Ｈ（ＩＳＯ４・　７１１２０　０．１％から
成る培地組成３０誦入りの２００ｄ三角フラスコに接種
し、２５〜２７℃で１０日間静置培養し、培地表面に発
育してきた菌苔を生理食１ｎ水と共にホモシナイスして
種菌とした。次いで前記培地２００ｒＲｐ、ずつ入っている１、０１
培養瓶に前記種菌を接種し、２５〜２７℃で２５日間培
養し各菌糸体を得た。菌体収量はＣＭｌｏｌで４〜４．
３ｇ／瓶１本当り、０Ｍ１０２で２０〜２．５９及び０
Ｍ１０３で２７・〜３，２ｇであった。次に、上記各菌体１００ｇに対して３βの蒸留水を加え
、９８℃−３時間攪拌抽出をｆｊい抽出終了後、抽出液
と抽出残渣に分（プ抽出残渣は同様の抽出処理を更に繰
り返して抽出液を集め、遠心分離して抽出残渣を除いた
後濾液を濃縮した。本濾液を１００％硫安飽和溶液で沈澱せしめて沈澱物を
得、次いで沈澱物を水に再溶解してセルローズ膜を用い
て透析し、脱塩して得られた溶液を２５％硫安溶液で処
理して得た沈澱物を前記同様に透析脱塩後Ｄ「へＦ−イ
オン交換セルローズカラー　　　９７　　　＝ムに吸着けじめ、１モルの塩化す１〜リウム水溶液にて
溶出せしめた。限外ｅ過により脱塩した後、濃縮噴霧乾
燥して本物質を得た。なお、実施例２〜４のアルカリ抽
出法とは残渣の再抽出において１／ＩＯＮ苛性ソーダ液
を水の代りに用い且つ抽出終了後ｐＨを調節したことを
除りば前記と同一操作である。表−５においてＫＢｒ錠剤法で測定した本物質の赤外線
吸収スペクトルは第１図の如くであり、２６００〜３２
００ｃｍ−１のνＯＨの吸収、１７００〜１６００ｃｍ
−１のＮ］（２の変角振動、１５３０（：ＩＩＩ　　の
Ｎ　Ｈの変角振動、１２００〜１０００ｃｍ−１のブロ
ードな吸収はｃ−ｏ−Ｃ環の糖質部ピラノース環の振動
、８９０ｃｍ”は糖質部のβ配向による特異吸収は夫々
見られたが、８４０ｃｍ−１の吸収（α配向）は認めに
くかった。なお、赤外線吸収スペクトルは各試料とも大差ないため
実施例１を代表として示した。ＮＭＲ測定はＤＳＳを内部基準とし、溶剤として重水を
用いて測定した。尚、ＮＭＲスペク１〜ルは各試料とも
大差ないため実施例１を代表として示した。分子量はセファロースカラムを用いたゲル濾過クロマト
グラフィー測定により５０．０００〜３、０００．　Ｏ
Ｈで平均分子量は１１０．０００〜３００．０００であ
った。アミノ酸分析は常法に従い１０ｍｇの試料に６Ｎ塩酸４
ｄを加え、ドライアイスア廿トンで凍結後、減圧封管し
、１１０℃で２４時間加水分解後、乾燥して３０〜４０
ｍ１のｐＨ値２．２のクエン酸緩衝液に溶解しアミノ酸
分析装置を用いた。比旋光度は試料の０１０％水溶液、５　ｃｍのセルを用
いナトリウムのＤ線（５８９ｍμ）で旋光度を測定、旋
光度αから比旋光度［α］。を算出した。糖質の構成単糖は試料３　ｍｇを５　ｍｍのガラスアン
プルにとり、１０ｄの３％塩化水素メタノールを加え１
００°Ｃ１６時間メタツリシスを行った後、室へ、１に
て塩酸を炭酸銀にて中和濾過し、濾液を濃縮乾固したの
ち乾燥ピリジン０５ｄに溶解し、これに０．２　ｄのへ
キザメチルジシラザンと０．３ｄのトリメチルクロルシ
ランを加えて３０分間室温にて放置し、１〜リメヂルシ
リル化を行い、その終了後クロロホルムに溶解し、過剰
の試薬を水洗により除去し、脱水後、濾液を蒸発乾固し
た。これを四塩化炭素にどかしガスクロマ１〜グラフで
測定した。糖の結合様式の決定はハウオース法に従って行った。即
ち試料２ｇを１ＮＮａ叶溶液１０７にとかし、窒素気流
中で４０〜５０℃に保ち、激しく攪拌しながらジメヂル
硫酸２０７と３０％水酸化す１〜す【クム溶液４０ｄを
数時間かかって滴下−夜放Ｍ後、同量のメチル化試薬で
同様処理した。反応液を中和後流水透析し、透析内液を
減圧濃縮した後、上記メチル化を３回反復した。再び中
和透析した後減圧乾固しｌこ１．残留物をクロロポルｌ
＼−メタノール（１０：１）混液２０ｄにどかし、これ
に石油エーテル−エーテル（１：１）ａＮ液を加えてメ
チル化物を沈澱させた。次に、本メチル化物の約２０ｍ
ｇをＩＮ硫酸で１００°Ｃ１６ｈｒ加水分解し、加水分
解物を常法によりアルデイト−ルアセテートに導いてガ
スクロ７１〜グラフ」ニのピーク面積よりモル比を求め
た。 −［−記名分解物は標準品を用いてガスクロマミルグラ
フトで同定づ−ると共に、カラム液体クロマトグラフィ
ーを用いて各々の加水分解物を中離し、結晶化させるか
結晶状誘導体を導くことにより確認したものである。更に♀色反応、元素分析値、急性毒性りＬＤ５ｏ）、ｐ
Ｈ値、溶解性は常法により求めた。本文中に測定手順を
具体的に示したものについてはその手順に従って測定し
た。上述のようにして得られる本物質の性質、構造的特徴を
総括して表示する。本物質について、しＩ−ロウイルスが特異的に保持する
逆転写酵素の阻害度を以下の方法にＪ：り測定した。本物質の凍結乾燥品１００Ｎを滅菌蒸留水１０．．１２
に溶解したく濃度：、１０ｉ／ｄ＞。１成の２０ｍｇ　Ｄ、Ｔ、Ｔ、　　（ジヂオ、スレイト
−ル：シグマ社製）、５成の５倍濶度１’ｉ？索反応液
（２５０ｍＨＴｒｉＳ−ＨＣｆ）　　（＋）１１８．３
＞−２５０ｍ）ｌ　ＫＣｉ！　−４０ｍｇ　Ｈ（ＪＣＪ
Ｑ２）、１成の３ｄ　ＮＴＰ溶液（１ｍＨｄＡＴｐｉｍ
ＨＧＴＰ−１ｍＨｄＴＴＰ：シグマ社製）、２成の１０
０埒／ｄオリゴ（ｄＴ）１２〜１８（ＰＩ−ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社製）、１パのメツｌ＝ンジャーＲ，Ｎ
Δ（１富うッｌ〜肝臓由来：１ｐ９／μＱ）、０．５成
のＲＮａｓｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　　（１６ｕｎｉｔ
／７／Ｉ２：宝酒造社製）と１ｐ１の［α−”２Ｐ　３
．ｄＣ，ＴＰ　（約８００Ｃｉ　／ｍｍｏ　ｌ　。１０μＣｉ／、ｃ踵：アマシャ１ムジセパン礼製）を１
５誦容量のエツペンドルフヂューブに加え、３７℃ウォ
ーターバス中にｄ５いた。５分後、先に調製した１０ｐ！Ｉ／　ｄ濃度の本物質１
２．５ｇを反応デユープに添加し、更に１成の逆転写酵
素（７ユニツト／μｅ：宝酒造社製、Ｒｏｕｓａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ由来）を加え、最終反応液量
を２５ｐ１として、３７℃で反応させた。１時間後、５ρの反応液を２　ｃｍ　Ｘ　２　ｃｍのＤ
ＥＡＥ紙（東洋濾紙社製）にしみこませ、風乾後、濾紙
１まいあたりｉｏｙの０．５Ｈ−Ｎ　ａ　　ＨＰ　Ｏ４
水溶液に浸し振盪しながら、濾紙上のＤＮＡ合成に使用
されなかった［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを洗浄したくこの
操作を５分間おきに５回実施した）。その後１０威の液体シンチレーションカクテル（アマジ
ャムシレパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上
記１）　Ｅ　Ａ　Ｅ紙を入れ、シンチレーションカウン
ター（アロカ社製）にて１分間放射活性（ｃ、ｐ、ｍ、
）をカラン１〜した。逆転写酵素活性阻害率（％）は以下の式により求めた。ＣＯ：本物質非添加の放射活性Ｃ５二本物質添加の放射活性結果を表−５に示した。本物質によるトＩ　Ｉ　Ｖ　（ＡＩＤＳウィルス）のヒ
トリンパ球への吸着阻害は以下の方法により実施した（
尚、すべての操作は無菌条件下で（ｊなった）。ＨＩＶ浮遊液１ｄと本物質溶液（１００埒／ｄ）１ｄを
試験管に入れ、水中に静置した。２時間後試験管から１
ｍのウィルス浮遊液をとり、ヒトリンパ球由来細胞株Ｍ
　丁−４［Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５（Ｇ
ａｎｎ）、　２８．２１９−２２９　（１９８２）］に
多重感染度（Ｈ。０．１．）＃２でウィルスを吸着させた。遠心分離（毎
分２，０００回転、１０分間）後、上澄液をすて、沈澱
したＭＴ−４細胞を２０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１６
４０　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎ
Ｙ）中に細胞濃度２ｘ１０”／ｍｅになるように浮遊さ
せた。９６穴プレートに上記Ｍ　Ｔ−４１１１１胞浮遊液をｉ
　ｏｏｐｉずつ分注して、５％ＣＯ２，３７℃の条件下
で培養した。培養３口重に間接蛍光抗体法によりＨＩＶ
感染吸着と非吸着細胞を算出した。すなわち、ＭＴ−４細胞をメタノール処理により固定化
し、抗１−Ｉ　Ｉ　Ｖ感染思召血清と３７℃で反応させ
た。３０分後ＰＢＳで細胞を洗浄し、フルオレツセイン
イソヂオシアネート結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ（免疫グロ
ブリン）と３７℃で反応させた。蛍光顕微鏡下で５００個のＭＴ−４細胞を観察し、蛍光
陽性細胞をＨＩＶ吸着細胞として、蛍光陰性細胞をＨＩ
’Ｖ非吸着細胞として次式で算出した。ｐＨ６，６ＮＭＲ７ベクトル吸■Ｖ位麿（ｏｎｍ）７．２　　　　
　　７．４　　　　　　７．００．９±０．１有１．２±０．　１２．０±０．　１４．５±０．　１４．７±０．１５．０±０．１　　　　　ナシ５．４±０．４　　　　　ナシ３．０〜４．４有１６００ｃｍ”　有１５３０ｃｍ−１有１２００−１０００ｃｌＩ＋有８９０ｃｍ−１有８４０ｃｍ”　　　　　　ナシ糖　　　質（重量％）　　　　　　　　５２．５蛋白質
（重量％）　　　　　　４７．５−４了有　　　　　　　　有　　　　　　　　有ナシ　　ナシ
　　ナシナシ　　ナシ　　ナシ有　　　　　　　　有　　　　　　　　有有　　　　　
　　　有　　　　　　　　有ナシ　　ナシ　　ナシ４２．７　　４８．０　　５１．０５７．３　　５２．０　　４９．０アミノ酸アスパラギン酸　　　　　　　　１４．０スレオニン　
　　　　　　　８，０セ　　リ　　ン　　　　　　　　　　　　　　７．６グ
ルタミン酸　　　　　　　　　１２．７プロリン　　　
　　　ｔｒａｃｅグリシン　　　　　　７．３アラニン　　　　　１０．０システィン　　　　　　　　ｔｒａｃｅバ　　リ　　ン
　　　　　　　　　　　　　　８．５メチオニン　　　
　　　　　２．３イソロイシン　　　　　　　　　　４．８０イシン　　
　　　　６．５チロシン　　　　　　０．３フェニルアラニン　　　　　　　　４．４トリプトフア
ン　　　　　　　　　１．７リ　　ジ　　ン　　　　　
　　　　　　　　　３．０１５．５　　　　　１４．９
　　　　　１５．５７．０　　　　　　８．４　　　　
　　７．０６．５　　　　　　９．７　　　　　　７．
８１６．８　　　　　１５．５　　　　　１６．９２、
Ｏｔｒａｃｅ　　　　　　　１．　０７．１　　　　　
　８．５　　　　　　７．７１０．３　　　　　１０．
４　　　　　１１．０ｔ　ｒａｃｅ　　　　　　　　ｔ
　ｒａｃｅ　　　　　　　　ｔ　ｒａｃｅ６．９　　　
　　　７．８　　　・　　　　６．０１．６　　　　　
　１．６　　　　　　１．９４．１　　　　　　３．１
　　　　　　４．２６．９　　　　　　７．０　　　　
　　６．６１．１　　　　　　　ｔｒａｃｅ　　　　　
　　１．　５３．６　　　　　３．３　　　　　　３．
０１、０　　　　　　２．　Ｏｔｒａｃｅ２．２　　　
　　　２．０　　　　　　２．８ト　　　　　　　匝Ｖ− 唖趨　　　　　　＋十凝　　歓　　ζ　　ζ　　ミ　　ミ　　な　　＋　　＋
巨　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　＋訳に △ 十臣　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　十　　十
詔卵　　　　　　　　穴上比較例１クレスチンについて逆転写酵素活性阻害率、Ｉ」ＩＶ吸
着阻害率を実施例１〜４と同じ条件で測定してそれぞれ
１０％以下の値であった。実施例５圧力式自動充填機を用い、０号硬カプセルに実施例１の
物質を３３０１ｆｔｇ充填しカプセルを作成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた本物質の赤外線吸収スペク
Ｉ〜ル図を示し、第２図は同物質のＮＭＲスペクトル図
を示す。代理人弁理士　船　　山　　　武

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が５０
，０００〜３，０００，０００を示し、α−ナフトール
硫酸反応、インドール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、
フェノール硫酸反応、トリプトファン硫酸反応、ローリ
ィフォリン法及び塩酸加水分解後のニンヒドリン反応に
おいて呈色反応を示し、ローリィフォリン法で定量した
蛋白質部重量／フェノール硫酸法で定量した糖質部重量
が４０／６０乃至７０／３０であり、水にとけ、ピリジ
ン、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、メタノールに
不溶で、比旋光度［α］＾２＾５＿Ｄが−１０°乃至３
０°を示し、赤外線吸収スペクトルにおいて８９０ｃｍ
＾−＾１に特性吸収を示し、蛋白質部のアミノ酸の７０
％以上がアスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタ
ミン酸、グリシン、アラニン、バリン及びロイシンより
なり、糖質部の７５％重量以上がグルコースとマンノー
スでその比の値が２乃至４であることを特徴とする蛋白
多糖体。
（２）平均分子量が１１０，０００〜３００，０００で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の蛋
白多糖体。
（３）糖質部の構造が次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＧは単糖をｐは０〜１０、ｑは０〜５、ｍは０
〜２、ｎは３又は４、ｌは０〜１を示す。）で表わされ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白多
糖体。
（４）糖質部がグルコサミンを介して蛋白質部分と結合
していることを特徴とする特許第１項記載の蛋白多糖休
。
（５）カワラタケ属に属する担子菌の抽出物の飽和硫安
により沈澱物を脱塩し、再溶解し、硫安飽和度が２５％
で生成する沈澱を脱塩後、ＤＥＡＥ−イオン交換セルロ
ーズカラムに吸着せしめ、次いで塩化ナトリウム水溶液
で溶出し、脱塩して得られることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の蛋白多糖体。
（６）特許請求の範囲第１項記載の蛋白多糖体を有効成
分として含有することを特徴とする抗ウィルス剤。
（７）抗レトロウィルス剤であることを特徴とする特許
請求の範囲第６項記載の抗ウィルス剤。
（８）抗エイズウィルス剤であることを特徴とする特許
請求の範囲第７項記載の抗レトロウィルス剤。