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DE3787356T2 - Expression von höheren eukaryotischen genen in aspergillus. - Google Patents

Expression von höheren eukaryotischen genen in aspergillus.

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DE3787356T2
DE3787356T2 DE87901195T DE3787356T DE3787356T2 DE 3787356 T2 DE3787356 T2 DE 3787356T2 DE 87901195 T DE87901195 T DE 87901195T DE 3787356 T DE3787356 T DE 3787356T DE 3787356 T2 DE3787356 T2 DE 3787356T2
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aspergillus
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dna
higher eukaryotic
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DE87901195T
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Zymogenetics Inc
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Description

    Verweis auf verwandte Anmeldung
  • Diese Anmeldung ist eine teilweise Fortführung der US- Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 820,519, angemeldet am 17. Januar 1986, wobei die Anmeldung anhängig ist.
    • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Expression fremder Gene in fadenförmigen Pilzen und genauer die Expression höherer eukaryotischer Gene in Aspergillus ebenso wie besonders vorteilhafte Promotoren, die in der Lage sind, die Expression heterologer Gene darin zu steuern.
    • Stand der Technik
  • Es ist gezeigt worden, daß das Klonen und die Expression fremder Gene in Bakterien und Hefe ein brauchbares Mittel für die Herstellung einer Vielzahl nützlicher Proteine ist. Die Expression fremder Gene in diesen Mikroorganismen war abhängig von der Verwendung autonom replizierender extrachromosomaler Elemente, im allgemeinen als Plasmide bekannt. Jedoch haben diese Expressionssysteme zahlreiche Probleme bei der Vergrößerung auf den industriellen Maßstab gezeigt, einschließlich Problemen bei der Löslichkeit, Reinigung und Absonderung der Proteine.
  • Die Gattungen fadenförmiger Pilze, so wie Aspergillus und Penicillium haben eine lange Geschichte industrieller Verwendung bei der Herstellung von Enzymen und speziellen Chemikalien. Die Entwicklung dieser Organismen als industriell wichtigen Produzenten hatte bis nun auf klassischen Verfahren der Mutation vertraut, gefolgt von Überprüfungen, um geeignete stark produzierende Stränge zu erhalten.
  • Im Licht dieser Fermentationstechnologie würde es vorteilhaft sein, ein effizientes Symsten zum Exprimieren fremder Gene in fadenförmigen Pilzen zu entwickeln. Die industrielle Anwendung fadenförmiger Pilze könnte dann so ausgedehnt werden, daß sie Pharmazeutika, Enzyme und weitere Produkte umfaßt, die von diesen Pilzen nicht hergestellt oder nur ineffizient hergestellt werden.
  • Fadenförmige Pilze zeigen einige weitere potentielle Vorteile gegenüber Bakterien und Hefe. Zum Beispiel sind Arten fadenförmiger Pilze bekannt, die eine große Vielzahl von Substanzen absondern, ein Merkmal, welches die Reinigung jener Produkte vereinfacht. Weiterhin zeigen diese Organismen nicht die extreme Codonverwendungsbevorzugung von Hefe, was sie geeigneter für die Herstellung mancher fremder Proteine machen kann. Zusätzlich hat die Forschung nahegelegt, daß einige Arten auch in der Lage sind, zwischenliegende Sequenzen zu verarbeiten, die innerhalb der Gene höherer Eukaryoten vorliegen, in einer Art ähnlich der höherer Eukaryoten, was Bakterien und Hefe nicht tun können. Fadenförmige Pilze sind auch dafür bekannt, post-translationale Modifikationen von Proteinen zu bewirken, sowie Glykosylierung und Phosphorylierung in einer Weise ähnlich der höherer Eukaryoten, was für die Wirksamkeit der Proteine wichtig sein kann.
  • Transformationssysteme für fadenförmige Pilze sind von einer Anzahl von Autoren beschrieben worden. Im Falle der Gattung Aspergillus hängen diese Systeme von der chromosomalen Integration der geklonten DNA ab. Obwohl autonom replizierende extrachromosomale Elemente verwendet worden sind, um die Expression eines heterologen Gens in Neurospora zu erhalten (Lambowitz, US-Patent 4,486,533), fehlen den Aspergillus-Arten im allgemeinen extrachromosomale Plasmidelemente, und es wird vermutet, daß derartige Elemente in diesen Pilzen nicht adäquat wirken würden.
  • Berichte über die Transformation in fadenförmigen Pilzen sind im allgemeinen auf komplementierende Mutationen mit Wildtyp- DNA derselben Arten gerichtet worden. Yelton u. a. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 - 1473, 1984) transformierten einen trpC&supmin;-Strang von Aspergillus nidulans in trpC&spplus;, wobei ein Plasmid verwendet wurde, das das vollständige A. nidulans- TrC-Gen enthielt, und ähnlich wurde ein argB&supmin;-Strang in argB&spplus; transformiert. Tilburn u. a. (Gene 26: 205 - 221, 1983) transformierten A. nidulans, wobei sie das geklonte amdS-Gen benutzten. Yelton u. a. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 834 - 838, 1985) verwendeten eine A. nidulans-Cosmid-Bibliothek, um bestimmte Mutationen in einem A. nidulans-Strang zu komplementieren.
  • Mehrere Autoren haben auch Transformationen fadenförmiger Pilzarten mit DNA von nahe verwandten Pilzarten beschrieben. Balance u. a. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 112 : 284 - 289, 1983) transformierten ein A. nidulans- Pyrimidin-Auxotroph zur Prototrophie, indem das Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase-Gen von Neurospora crassa verwendet wurde. Kelly und Hynes (EMBO J. 4: 475 - 479, 1985) transformierten Wildtyp-Stränge von A. niger mit dem A. nidulans-amdS-Gen und gewannen die Transformanten zurück, die in der Lage waren, Acetamid als eine Stickstoffquelle zu verwenden. Buxton u. a. (Gene 37: 207, 1985) transformierten A. niger-argB&supmin;-Mutanten mit dem A. nidulans-argB&spplus;-Klon.
  • Es besteht jedoch in der Technik ein Bedürfnis nach einem wirksamen Verfahren zum Produzieren höherer eukaryotischer Proteine in einem System, das bereits bestehende industrielle Fermentationstechnologie verwenden kann. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und schafft weiterhin verwandte Vorteile.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren höherer eukaryotischer Gene in Aspergillus und offenbart weiterhin besonders vorteilhafte Promotoren, die in der Lage sind, die Expression eines heterologen Gens in Aspergillus und in anderen Gattungen fadenförmiger Pilze zu steuern.
  • Genauer gesagt weist das oben benannte Verfahren das Einführen eines rekombinanten Plasmides in einen Aspergillus-Wirt auf, das zur Integration in der chromosomalen DNA von Aspergillus in der Lage ist, wobei das Plasmid einen DNA-Aufbau enthält, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Asperaillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus- Gen-Transkriptions-Promotor enthält, der stromabwärts von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors gefolgt wird, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt ist. Anschließend wird der Aspergillus-Wirt in einem geeigneten Medium gezüchtet, und das Proteinprodukt des höheren eukaryotischen Genes wird aus dem Kulturmedium isoliert, in dem der Aspergillus-Wirt gezüchtet wird. Ein DNA-Aufbau und ein rekombinantes Plasmid wie oben beschrieben werden auch offenbart.
  • Zusätzlich wird auch eine Aspergillus-Kultur, transformiert mit einem DNA-Aufbau, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Gens in Aspergillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus-Gen-Transkriptions-Promotor enthält, der stromabwärts von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors gefolgt wird, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird, offenbart.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist der für den DNA-Aufbau, das Plasmid, die transformierte Kultur und das Verfahren, die oben beschrieben sind, genannte Promotor der einer DNA- Sequenz, die ein Alkohol-Dehydrogenase (ADH)-Enzym oder ein Triose-Phosphat-Isomerase (TPI)-Enzym codiert. Die DNA-Sequenz kann ein fadenförmiges Pilzgen sein, so wie ein A. nidulans- Gen oder ein A. niger-Gen. Besonders bevorzugte A. nidulans- Gene sind ADH3 oder tpiA, während besonders bevorzugte A. niger-Gene adhA oder tpiA sind.
  • Wie oben angemerkt, offenbart ein weiterer Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung einen isolierten Transkriptionspromotor, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der Promotor aus der Gruppe bestehend aus dem Aspergillus nidulans ADH3- Promotor, dem Aspergillus nidulans tpiA-Promotor, dem Aspergillus niger adhA-Promotor und dem Aspergillus niger tpiA-Promotor gewählt sind. Ein Verfahren zum Exprimieren heterologer Gene in Aspergillus, das diesen Promotor verwendet, ist auch offenbart.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
    • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 stellt die Nukleotidsequenz und die übersetzte Aminosäuresequenz eines Abschnittes des genomischen Klones von A. nidulans tpiA dar. Schräggestellte Striche (/) in der Nukleotidsequenz geben Exon-Intron-Grenzen an.
  • Fig. 2 erläutert das Subklonen des A. nidulans tpiA-Promotors und -Terminators.
  • Fig. 3 erläutert den Aufbau eines austauschbaren tpiA-Promotors.
  • Fig. 4 erläutert das Klonen des A. niger adhA-Gens.
  • Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz und die übersetzte Aminosäuresequenz des A. niger adhA-Gens. Schräggestellte Striche (/) geben die Exon-Intron-Grenzen an.
  • Fig. 6 erläutert den Aufbau eines austauschbaren A. niger adhA-Promotors.
  • Fig. 7 erläutert die Isolierung des A. niger tpiA-Gens.
  • Fig. 8 zeigt die Nukleotidsequenz und die übersetzte Aminosäuresequenz des A. niger tipA-Gens. Schräggestellte Striche geben Exon-Intron-Grenzen an.
  • Fig. 9 zeigt den Aufbau des Plasmides Zem99.
  • Fig. 10 zeigt den Aufbau des Plasmides Zem191.
  • Fig. 11 erläutert das Subklonen des A. nidulans ADH3-Promotors und -Terminators.
  • Fig. 12 zeigt die Nukleotidsequenz des A. nidulans ADH3-Promotorfragmentes von der PstI-Stelle bis zu der BamHI- und EcoRI-Stelle.
  • Fig. 13 zeigt den Aufbau des Expressionsvektors pM090B.
  • Fig. 14 zeigt partielle Restriktionskarten der Plasmide pM141, pM159 und pM192.
  • Fig. 15 zeigt den Aufbau des Expressionsvektors pM126.
  • Fig. 16 zeigt den Aufbau des Expressionsvektors pM129A.
  • Fig. 17a bis 17c zeigen den Aufbau von Vektoren, die eine Expressionseinheit enthalten, welche die A. niger-Glukoamylase-Prä-Pro-Sequenz und eine menschliche Plasminogen-Aktivator-cDNA aufweisen. AMG gibt Sequenzen an, die von dem Glukoamylasegen abgeleitet worden sind.
  • Fig. 18 zeigt den Aufbau des Expressionsvektors pM092A.
  • Fig. 19 zeigt partielle Restriktionskarten der Plasmide pDgGMII und pMcGM. Benutzte Symbole sind ori, die Adenovirus 5 0-1-Karten-Einheitssequenz; E, der SV40-Replikationsursprung und Enhancer; MLP, der Adenovirus 2-Hauptspätpromotor; L1-3, der Adenovirus 2-dreiteilige Leader; 5'ss und 3'ss, die 5'- und 3'-Spleißstellen; und pA, das SV40-frühe Polyadenylierungssignal.
    • Beste Art, die Erfindung auszuführen
  • Bevor die Erfindung dargelegt wird, kann es hilfreich für deren Verständnis sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke zu erläutern, die hiernach benutzt werden sollen.
  • Höheres eukaryotisches Gen: Ein Gen oder eine cDNA, aus einem anderen Organismus als einem Prokaryoten oder einem Pilz isoliert oder abgeleitet.
  • In der vorliegenden Erfindung können höhere eukaryotische Gene in einem Aspergillus-Wirt durch die Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken exprimiert werden. Die Gattung Aspergillus liegt ordnungssystematisch innerhalb der Klasse Ascomycetes. Diese Klassifikation basiert auf der Form der geschlechtlichen Fruchtkörper, z. B. wie direkt auf die Art Aspergillus nidulans angewandt. Jedoch sollte angemerkt werden, daß andere Arten in dieser Gattung eingeschlossen sind, die keinen bekannten sexuellen Reproduktionszyklus haben; z. B. Aspergillus niger und Aspergillus terreus. Diese Arten sind aufgrund ihrer vegetativen Morphologie eingeschlossen und aufgrund entwicklungsmäßiger Details und Form der reifen asexuellen Reproduktionsstrukturen, die Konidiophoren genannt werden, abgegrenzt (Thom und Raper, 1945 Manual of the Asperailli; Balli re Tindall & Cox, London). Bevorzugte Arten von Aspergillus umfassen A. nidulans und A. niger, obwohl es für den Fachmann offensichtlich sein wird, daß andere Arten von Aspergillus (erhältlich durch die ATCC oder das Fungal Genetics Stock Center, Arcata, CA), so wie A. terreus, in der vorliegenden Erfindung benutzt werden könnten. Weiterhin könnten andere Pilzgattungen, so wie Penicillium, die von Aspergilli durch Unterschiede in der Kondiophoren-Struktur abgegrenzt sind, auch verwendet werden, da Gattungen innerhalb der Klasse im allgemeinen nicht aufgrund biochemischer Unterschiede abgegrenzt sind.
  • Wie oben angemerkt umfassen höhere eukaryotische Gene cDNA- Klone, die von höheren eukaryotischen Genen abgeleitet sind. Beispielhaft beschreibt die vorliegende Erfindung die Expression von Proteinen, die durch ein Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA)-Gen, ein Immunoglobulin G (IgG)-Gen und durch einen Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden-Faktor (GM- CSF)-Gen codiert werden, obwohl es für den Fachmann offensichtlich ist, daß eine Vielfalt anderer höherer eukaryotischer Gene mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert werden können. Beispielsweise können Gene, die von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) Insulin, Superoxid-Dismutase und Erythropoietin ebenso wie Derivate von diesen und andere Proteine codieren, in der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
  • Das oben beschriebene höhere eukaryotische Gen ist innerhalb eines DNA-Aufbaus enthalten und unter Transkriptionssteuerung eines Promotors. Wie hierin verwendet kann ein Promotor auch regulatorische Sequenzen umfassen, die in dem flankierenden 5'-nichtcodierenden Bereich eines Genes gelegen sind. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Promotor der einer DNA-Sequenz, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert. ADH-Enzyme und TPI-Enzyme sind diejenigen, die bestimmte biochemische Reaktionen katalysieren. ADH katalysiert die Interkonversion von Äthanol und Azetaldehyd, während TPI die Interkonversion von Glyceraldehyd-3-Phosphat und Dihydroxy-Aceton-Phosphat katalysiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA-Sequenz ein Gen eines fadenförmigen Pilzes, so wie ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen.
  • Innerhalb A. nidulans gibt es drei Typen bekannter ADH-Gene, die alle in einer leicht unterschiedlichen Weise gesteuert sind. Es wird nun auf Tabelle 1 (unten) Bezug genommen, in der die geregelte Expression der drei ADH-Gene in Anwesenheit einer einzigen Kohlenstoffquelle, entweder Glukose oder Äthanol (EtOH) oder Glukose oder Äthanol zusammen, gezeigt ist.
    • Tabelle 1
  • Gen Glukose ETOH Glukose + ETOH alcA - + -
  • ADH2 + - -
  • ADH3 ± + +
  • * (-) = Aus; (+) = Ein; und (+) = Intermediat.
  • Bei der vorliegenden Erfindung ist ein besonders bevorzugtes A. nidulans-Gen ADH3, das in der Anwesenheit von Äthanol oder in Glukose und Äthanol stark exprimiert wird. Ein weiteres besonders bevorzugtes A. nidulans-Gen ist tpiA, das in Anwesenheit entweder von Glukose oder Äthanol stark exprimiert wird.
  • Innerhalb von A. niger ist ein ADH-Gen isoliert worden, das hierin als adhA bezeichnet wird. Auf dem Nukleotid-Level der cDNA hat adhA Ähnlichkeiten sowohl zu alcA und ADH3. Das regulatorische Muster von adhA ist wie in Tabelle 2 gezeigt.
    • Tabelle 2
  • Glukose ETOH Glukose + ETOH adhA + + +
  • * (-) = Aus; (+) = Ein.
  • Zusätzlich zu adhA ist ein weiteres besonders bevorzugtes A. niger-Gen tpiA, das in Anwesenheit entweder von Glukose oder Äthanol stark exprimiert wird.
  • Obwohl besonders bevorzugte ADH- und TPI-Promotoren hierin bestimmt worden sind, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, daß andere ADH- und TPI-Gene von anderen fadenförmigen Pilzen in der vorliegenden Erfindung benutzt werden könnten. Diese Gene können ein unterschiedliches regulatorisches Muster als oben dargestellt zeigen.
  • Promotoren und Terminatoren zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung können als die benachbarten 5'- bzw. 3'-nichtübersetzten und flankierenden Bereiche identifiziert werden. Im allgemeinen werden Sequenzen von ungefähr 1kb Länge ausreichend sein, um Promotor- und Terminatorfunktionen auszuüben.
  • Promotoren und Terminatoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können aus Aspergillus- Genen isoliert werden. Diese Gene können durch Hybridisierung ancDNA-Sonden identifiziert werden, die aufgrund ihrer Fähigkeit zum Komplementieren entsprechender Gendefekte in der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert werden, obwohl andere Verfahren der Genisolierung verwendet werden können. Im allgemeinen könnte irgendeine cDNA von Aspergillus, die einen Gendefekt in Saccharomyces cerevisiae komplementieren könnte, isoliert werden, in dem man das hierin beschriebene Komplementierungsverfahren verwendet. Geeignete Stränge von S. cerevisiae können von der ATCC oder dem Yeast Genetics Stock Center, Berkeley, CA, erhalten werden oder können durch herkömmliche Mutagenesetechniken präpariert werden. Wenn einmal der zweckmäßige cDNA-Klon identifiziert ist, kann er verwendet werden, um einen genomischen Klon, der das interessierende Gen enthält, und den 5'-flankierenden Bereich des Genes, das für das Promotorelement kennzeichnend ist, zu isolieren.
  • Stromabwärts des höheren eukaryotischen Genes in dem DNA-Aufbau der vorliegenden Erfindung befindet sich ein Terminator einschließlich eines Polyadenylierungssignals. Bevorzugte Terminatoren umfassen diejenigen einer DNA-Sequenz, die ein ADH- Enzym oder ein TPI-Enzym codieren. ADH-Enzyme und TPI-Enzyme sind diejenigen Enzyme mit einer katalytischen Aktivität wie oben beschrieben. In bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA-Sequenz ein Gen eines fadenförmigen Pilzes, so wie ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen. Im allgemeinen können geeignete Terminatoren aus Genen erhalten werden, die wie oben für die Promotoren beschrieben isoliert worden sind.
  • Der DNA-Aufbau, welcher einen Transkriptionspromotor enthält, der stromabwärts von einem höheren eukaryotischen Gen gefolgt ist, wobei das Gen von einem Terminator wie oben beschrieben gefolgt wird, ist in einem rekombinanten Plasmid enthalten, das zur Integration in die chromosomale DNA von Aspergillus in der Lage ist.
  • Um auf effiziente Weise Transformanten zurückzugewinnen, wird eine wählbare Markierung als eine Komponente der transformierenden DNA eingeschlossen. Die wählbare Markierung kann ein integraler Teil des Plasmides sein, das das zu exprimierende höhere eukaryotische Gen enthält, oder kann ein Teil eines separaten DNA-Aufbaus sein und in den Wirt durch Kotransformation eingefügt sein.
  • Eine Forderung für die effiziente Produktion von höheren eukaryotischen Proteinen ist ein stabiler Transformant, d. h. einer in dem die transformierende DNA innerhalb des Genomes gehalten wird und nicht während des Züchtens oder der Fortpflanzung verloren wird. Aspergillus-Arten, ebenso wie einige weitere Arten fadenförmiger Pilze nehmen extrachromosomale Plasmide weder auf noch halten sie sie. Um daher Stabilität eines Transformanten zu erreichen, muß die transformierende DNA in das Wirtschromosom integriert werden. Um eine solche Integration effizient zu erreichen, wird ein Segment der DNA der Wirtsart als eine Komponente der transformierenden DNA eingeschlossen. Dieses Segment schafft die Homologie um zu erlauben, daß Rekombinationsereignisse zwischen dem Chromosomen und der transformierenden DNA auftreten, wobei diese für den Integrationsprozeß notwendig sind. Selbst bei der Abwesenheit eines derartigen homologen Segmentes der DNA, kann die Integration der transformierenden DNA in das Chromosom auftreten, jedoch mit wesentlich geringeren Häufigkeiten.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Homologie zwischen der transformierenden DNA und dem Wirtschromosom durch die wählbare Markierung geschaffen werden, z. B. argB oder amdS, die Promotor- und Terminator-Fragmente in der Expressionseinheit oder durch eine cDNA, die von einem Gen eines fadenförmigen Pilzes abgeleitet ist.
  • Es sollen die Beispiele, die folgen, zusammengefaßt werden, wobei Beispiel 1 den Aufbau einer Aspergillus nidulans-cDNA- Bibliothek und die Isolation des A. nidulans tpiA-Promotors und -Terminators beschreibt. Beispiel 2 beschreibt den Aufbau von A. niger-cDNA- und genomischen Bibliotheken und die Isolierung von DNA-Sequenzen, die den tpiA und adhA-Genen entsprechen. Der adhA-Promotor wurde von einem der Klone isoliert. Beispiel 3 beschreibt den Aufbau von Expressionsvektoren, die eine menschliche t-PA-cDNA aufweisen. Eingeschlossen in den Vektoren ist eine sekretorische Signalsequenz, entweder die t-PA- Prä-Pro-Sequenz oder die A. niger-Glukoamylse-Prä-Pro-Sequenz. Beispiel 4 beschreibt den Aufbau eines Expressionsvektors, der eine cDNA aufweist, welche die schwere Kette menschlichen Immunoglobulins codiert. Beispiel 5 beschreibt das Klonen einer menschlichen cDNA, die Granulozyt-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor codiert. Diese cDNA wurde dann beim Aufbau eines Aspergillus-Expressionsvektors verwendet. Beispiel 6 beschreibt die Expression von t-PA, GM-CSF und IgG in Aspergillus.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung geboten.
    • BEISPIELE
  • Aspergillus-Kulturmedien wurden wie folgt formuliert:
    • MINIMALES MEDIUM
  • Pro Liter: Dextrose 5,0 g
  • Salzlösung (unten) 50,0 ml
  • Spurenelemente (unten) 1,0 ml
  • ± Agar (Difco) 12,5 g
  • Auf pH-Wert 6,5 einstellen, 15 Minuten autoklavieren.
    • VOLLSTÄNDIGES MEDIUM
  • Pro Liter Dextrose 5,0 g
  • Pepton 2,0 g
  • Hefeextrakt 1,0 g
  • Kasein-Hydrolysat 1,0 g
  • Salzlösung (unten) 50,0 ml
  • Spurenelemente (unten) 1,0 ml
  • Vitaminlösung (unten) 1,0 ml
  • Nukleinsäurelösung (unten) 3,0 ml
  • CM-Zusätze (unten) 10,0 ml
  • ± Agar (Difco) 15,0 Gramm
    • SALZLÖSUNG
  • Pro Liter: NaNO&sub3; 120,0 g
  • KCl 10,4 g
  • MgSO&sub4; 10,4 g
  • KH&sub2;PO&sub4; 30,4 g
    • SORBITOLMEDIUM
  • Minimales Medium mit dem Zusatz von 1,2 M Sorbitol.
    • SPURENELEMENTLÖSUNG
  • Pro Liter: (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4H&sub2;O 1,1 g
  • H&sub3;BO&sub3; 11,0 g
  • CoCl&sub2;·6H&sub2;O 1,6 g
  • CuSO&sub4; 1,6 g
  • Na&sub2;EDTA 50,0 g
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O 5,0 g
  • MnCi&sub2;·4H&sub2;O 5,0 g
  • ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 22,0 g
  • Die Komponenten nacheinander lösen, kochen, abkühlen, pH-Wert auf 6,5 mit KOH einstellen.
    • VITAMINLÖSUNG
  • Pro Liter: Pyridoxin-HCl 1,0 g
  • Thiamin-HCl 1,5 g
  • p-Aminobenzoesäure 0,8 g
  • Nikotinsäure 2,5 g
  • Riboflavin 2,5 g
  • Cholin-HCl 20,0 g
  • Biotin (500 ug/ml) 50,0 ml
    • NUKLEINSÄURELÖSUNG
  • Hefenukleinsäuren, Natriumsalz 100,0 g
  • 2N HCl 1,0 Liter
  • Auf 100ºC 20 Minuten lang erhitzen, pH-Wert auf 6,2 einstellen.
    • CM-ZUSÄTZE
  • Pro Liter: Adenin 7,5 g
  • L-Methionin 5,0 g
  • L-Lysin-HCI 36,5 g
  • Riboflavin 0,5 g
    • BEISPIEL 1 - Isolierung des A. nidulans tpiA-Promotors und Terminators A. Klonen von A. nidulans tpiA-cDNA
  • Fünf ug Poly(A)&spplus;-mRNA von A. nidulans wurden für den Aufbau eines cDNA-Pools in Plasmid pYcDE8 benutzt, wie von McKnight u. a. beschrieben (EMBO J. 4 : 2093 - 2099, 1985). 80000 Ampicillin-resistente E. coli-Kolonien wurden gewonnen und Plasmid-DNA wurde präpariert und durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt.
  • S. cerevisiae-Strang-Δtpi29 (ein Tpi&supmin;-Derivat des Stranges E2- 7B [ATCC# 20689], hergestellt durch Aufbrechen des TPI1-Gens gemäß dem Verfahren von Rothstein [Meth. in Enzymology 101: 202 - 210, 1983] unter Verwendung des S. cerevisiae LEU2-Gens, eingefügt in das TPI1-Gen [Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 419 - 434, 1982] (wie in der ebenfalls anhängigen gemeinschaftlich übertragenen U.S.-Anmeldung mit laufender Nr. 734, 119, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingefügt ist, beschrieben), wurde mit der cDNA-Bibliothek transformiert und die Zellen auf Dextrose-Sorbitol- Minimalmedium plattiert, dem Tryptophan fehlte, um nach Transformanten auszusuchen, die Triose-Phosphat-Isomerase produzieren. Insgesamt 46 solcher Tpi&spplus;-Kolonien wurden erhalten. Plasmid-DNA wurde aus zwölf dieser Transformanten präpariert (BRL Focus 6 : 11, 1984), und jede Plasmidprobe wurde benutzt, um E. coli MC1061 auf Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Bei der folgenden Analyse von Plasmid-DNA wurde gefunden, daß sechs der ursprünglichen zwölf Plasmide eine gemeinsame cDNA-Einfügung der Größe von ungefähr 1150 bp haben. Plasmid-DNA von einem Transformanten wurde mit EcoRI und BamHI digeriert und das tpiA-cDNA-Fragment wurde in mit EcoRI + BamHI digeriertem puC19 subgeklont (Norrander u. a., Gene 26 : 101 - 1096, 1983).
    • B. Klonen von A. nidulans tpiA-Gen
  • Das EcoRI + BamHI-cDNA-Fragment wurde Nick-translatiert und verwendet, um eine A. nidulans-genomische DNA-Bibliothek im Bakteriophagen λ zu sondieren (McKnight u. a., ebd.). Phagen- DNA wurde von positiven Plaques präpariert (Maniatis u. a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen digeriert und mit der markierten cDNA sondiert.
  • Eine 20 kb lange EcoRI-Einfügung aus einem positiven λ-Klon wurde an die EcoRI-Stelle von pUC19 eingefügt, um das Plamid pM099 zu konstruieren. E. coli JM83, transformiert mit pM099, ist bei der ATCC unter der Annahmenummer 53430 hinterlegt worden. Ein .4kb langes HindIII-Fragment vom pM099 wurde in die HindIII-Stelle von pUC19 subgeklont, um das Plasmid pM100 aufzubauen (Fig. 2). Auf ähnliche Weise wurde in 900 bp langes SstI-Fragment verwendet, um die Plasmide pM101 und pM102 aufzubauen.
  • Das 4 kb lange HindIII-Fragment und das 900 bp lange SstI- Fragment wurden auch in M13mp18 eingefügt und sequenziert. Der M13-Klon, der die 900 bp lange Einfügung enthielt, wurde mit S4 bezeichnet (Fig. 2). Die tpiA-cDNA wurde auch sequenziert. Fig. 1 zeigt die Sequenz eines Abschnitts des genomischen Klons vom tpiA, der den codierenden Bereich aufweist. Das 5'- Ende der tpiA-cDNA ist am Nukleotid 232 und die Polyadenylierungsstelle liegt bei den Nukleotiden 1647 - 1648.
    • C. Aufbau des A. nidulans tpiA-Promotorfragmentes
  • Der Aufbau eines austauschbaren tpiA-Promotorfragmentes umfaßte das Plazieren von BamHI und EcoRI-Stellen benachbart dem und stromaufwärts vom natürlichen Initiator ATG des tpiA- Gens. Das Plasmid pM100 wurde vollständig mit BGlII digeriert und partiell mit SphI digeriert. Ein .2kb- langes Fragment, das den Promotor und den 5'-nichtcodierenden Bereich aufwies, wurde in mit SphI + BamHI digeriertes pUC19 subgeklont, um das Plasmid pM107 aufzubauen (Fig. 2). Es wird Bezug auf Fig. 3 genommen; ein 273 bp langes AccI-Fragment wurde vom pM107 präpariert, durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I stumpfendig gemacht und an die mit Phosphatase behandelte SmaI-Stelle von M13mp19 eingefügt. Die Ausrichtung der Einfügungen wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt, und ein Phagen- Klon mit der Einfügung in der gewünschten Orientierung wurde mit pM137 bezeichnet. Um die Promotorsequenz zu modifizieren wurde die pM137-Matrizen-DNA mit Oligonukleotid ZC761 (5' TTG AGT GTC TAG TTG TGT AT3') verheftet, und die DNA wurde durch das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in Anwesenheit von Nukleotid-Triphosphaten synthetisiert. Die Reaktionsmischung wurde denaturiert, mit New England Biolabs M13- Reverse-Sequenzierungsprimer (5'AAC AGC TAT GAC CAT G 3') verheftet, und der zweite Strang der DNA wurde durch das Klenow- Fragment in Anwesenheit aller vier Nukleotid-Triphosphate synthetisiert. Ein DNA-Fragment von ungefähr 190 bp Länge, das ein stumpf es Ende entsprechend der Position von Oligonukleotid ZC761 enthielt, wurde durch PstI-Verdauung und Gelreinigung präpariert. Phosphorylierte BamHI-Verbinder (5' CGG ATC CG 3', erhalten von PL Biochemicals) wurden an das stumpfe Ende des DNA-Fragmentes gebunden. Die Reaktionsmischung wurde mit ClaI und BamHI digeriert, und das sich ergebende ClaI-BamHI- Fragment wurde gelgereinigt und in mit ClaI + BamHI digeriertes pIC19R eingefügt, um pM149 zu erzeugen. Das Plasmid pM107 wurde mit HindIII und SstI digeriert und das 2 kb lange DNA- Fragment wurde gelgereinigt und in mit HindIII + SstI digeriertes pIC19R eingefügt, um pM148 zu erzeugen. Das Promotorfragment wurde durch Ligation des 1,5 kb langen PstI-ClaI- Fragmentes von pM148 mit dem ClaI-BamHI-Fragment von pM149 in dem 2,7 kb langen PstI-BamHI-Fragment von pM076 regeneriert (Beispiel 3A). Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM150 bezeichnet (Fig. 3). Es wurde gezeigt, daß der BamHI-Verbinder vier Nukleotide stromaufwärts der Initiator-ATG von tpiA gelegen war.
    • D. Klonen des A. nidulans tpiA-Terminatorfragmentes
  • Es wird Bezug auf Fig. 2 genommen, wobei die 3'-nichtcodierenden und Polyadenylierungssequenzen von dem M13-Klon S4 durch Hybridisierung mit dem Oligonukleotid ZC607 (5'CTG GCA AAA GCT TAC AGG CGG GC3') und nachfolgende Verdauung mit HindIII isoliert wurden, um ein Fragment mit einer internen HindIII-Stelle zu erhalten. Die Reaktionsmischung wurde dann mit dem Amersham-Oligonukleotid N4511 (5'GTA AAA CGA CGG CCA GT3') verheftet, und die DNA wurde durch das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in der Anwesenheit von Nukleotid- Triphosphaten synthetisiert. Die Reaktionsmischung wurde mit SstI digeriert und mit T&sub4;-Polymerase stumpfendig gemacht. Das sich ergebende stumpfendige 422 bp lange Fragment, das 3'- nichtcodierende und angrenzende stromabwärtige DNA enthält, wurde an die mit Phosphatase behandelte HincII-Stelle von pUC19 gebunden. Die Ligationsmischung wurde in E. coli JM83 transformiert, Ampicillin-resistente Kolonien wurden erhalten und weiße Kolonien wurden für die Plasmidextraktion und Analyse ausgewählt. Das Plasmid pMLP100 (Fig. 2) enthält ein 442 bp langes Fragment, in dem die stumpfendige HindIII-Stelle angrenzend an die XbaI-Stelle von pUC19 liegt, und die stumpfendige SstI-Stel1e liegt angrenzend an die PstI-Stelle von pUC19. Das Plasmid pMLP101 enthält dasselbe 442 bp lange Fragment in der entgegengesetzten Orientierung.
    • BEISPIEL 2 - Isolierung von A. niger tpiA und adhA-Genen A. Klonen von A. niger tpiA und adhA-cDNAs
  • Ein Bodenisolat von Aspergillus niger (bezeichnet als WM32) wurde als die mRNA-Quelle beim Aufbau eines A. niger-cDNA- Pools verwendet. Die A. niger-Sporen wurden in Kolben inokuliert, die 400 ml minimales Medium enthielten, welches 0,5% (Gew./Vol.) Glukose enthielt und bei Schütteln über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die Pilzfäden wurden durch Filtration durch Mull wiedergewonnen, mit sterilem Wasser gründlich gewaschen und in frisches minimales Medium inokuliert, dem Glukose fehlte, jedoch 1,0% (Vol./Vol.) Äthanol enthielt und bei Schütteln 4 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet. Die Pilzfäden wurden durch Filtration durch Mull zurückgewonnen, mit sterilem Wasser gewaschen, trockengepreßt und in einem Mörser und Mörserkeule in flüssigem Stickstoff gemahlen.
  • Die pulverisierten Pilzfäden wurden zu 10 ml einer Lösung gegeben, die 200 mM Tris mit pH-Wert 8,5, 250 mM NaCl, 50 mM EGTA, 4,8% (Gew./Vol.) Para-Aminosalicylat, 0,08% (Gew./Vol.) Triisopropyl-Naphthalensulfonat, dem 5 ml Phenol zugegeben waren (gesättigt mit 10 mM Tris mit pH-Wert 7,5, l mM EDTA) und 5 ml Chloroform enthielt. Die Suspension wurde verwirbelt, zentrifugiert, und der lösliche Überstand wurde auf Eis in 3 ml Phenol gelagert, während die Berührungsfläche mit 2 ml der oben beschriebenen Lösung durch Erhitzen auf 65 ºC für 10 Minuten reextrahiert wurde. Die löslichen Überstände wurden kombiniert und dreimal mit 50% (Vol./Vol.) Phenol, 49 % (Vol./Vol.) Chloroform und 1% (Vol./Vol.) Isoamylalkohol, zuvor gesättigt mit 10 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 1/10 Volumenteilen von 3 M NaOAC mit pH-Wert 5,23 und 2 Volumenteilen 100%igen Äthanols ausgefällt und bei -80ºC 1 1/2 Stunden lang gelagert. Die Nukleinsäure wurde in Kugelform gebracht, mit 75 %igem Äthanol gewaschen, getrocknet, und in destilliertem sterilem Wasser resuspendiert. Poly(A)&spplus;-RNA wurde in zwei Zyklen des Bindens an und des Lösens von Oligo(dT)-Zellulose gereinigt.
  • Ein cDNA-Pool im Plasmid pYcDE8 wurde auf 6 ug der A. niger- Poly(A)&spplus;-RNA präpariert. Ungefähr 60000 Transformanten von E. coli MC1061 (beispielsweise McKnight u. a., ebd.) wurden erhalten.
  • Die Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch CsCl-Gradientenzentrifugieren gereinigt. Der S. cerevisiae-Strang 500-11 (Adh&supmin;) wurde mit dem A. niger-cDNA-Pool transformiert, auf Sorbitol- Dextrosemedium, dem Tryptophan fehlte, gelegt und bei 30ºC bebrütet. Nach zwei Tagen Züchten wurde jede Platte mit 50 ug Antimyzin A in Agar und bei 30ºC bebrütet. Adh&spplus;-Kolonien wurden dann auf Dextrosemedium, dem Tryptophan fehlte, getupft.
  • Der S. cerevisiae-Strang Δtpi29 wurde auch mit dem A. nigercDNA-Pool transformiert, und die Zellen wurden auf Sorbitoldextrosemedium gelegt, dem Tryptophan fehlte, und bei 30ºC bebrütet. Tpi&spplus;-Kolonien wurden dann auch Dextrosemedium getupft, dem Tryptophan fehlte. Die Plasmid-DNA wurde von den Adh&spplus;Trp&spplus;- und den Tpi&spplus;-Hefezellen wie oben beschrieben extrahiert. E. coli-RR1 wurde mit den Hefe-Plasmid-DNAs transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien erhalten. Die Plasmid-DNA wurde von den E. coli-Transformanten extrahiert, mit EcoRI und BamHI extrahiert und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Zehn unabhängige Adh&spplus;-Hefe-Kolonien enthielten jede eine augenscheinlich identische cDNA-Einfügung von ungefähr 1,5 kb Länge. Fünf unabhängige tpi&spplus;-Hefe-Kolonien enthielten jede eine augenscheinlich identische cDNA-Einfügung von ungefähr 1,1 kb Länge. Die intakten adhA- und tpiA-cDNAs wurden durch EcoRI- und XmaI-Verdauung wiedergewonnen und in die EcoRI- und XmaI-Stellen von pUC19 subgeklont. Die A. niger adhA-cDNA in pUC19 wurde mit pM098 bezeichnet. Die A. niger tipA-cDNA in pUC19 wurde mit pM095 bezeichnet. Der E. coli- Strang JM83, der mit dem Plasmid pM098 transformiert wurde, ist bei der ATCC unter der Annahmenummer 53428 hinterlegt worden.
    • B. Isolierung des A. niger adhA-Gens
  • Eine genomische Bibliothek von Aspergillus niger wurde im Bakteriophagen λ präpariert. Fünf 400 ml-Kulturen des A. niger- Stranges WM32 wurden über Nacht in minimalem Medium bei 37ºC unter starkem Schütteln gezüchtet. Die Myzelien wurden durch Filtration geerntet, mit kaltem Wasser gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser mit Stößel zu einem feinen Pulver gemahlen. Die pulverisierten Myzelien wurden in 50 ml Puffer (50mM EDTA, 1% SDS, 20 mM Tris mit pH-Wert 7,5) suspendiert und bei 65ºC 30 Minuten lang bebrütet. Die Suspension wurde durch 15 Minuten langes Zentrifugieren in einer in einem Ständer oben gehaltenen Zentrifuge niedergeschlagen. Der Überstand wurde in Dialyseröhren überführt und in PEG4000- Pulver eingelegt, um das Volumen zu reduzieren. Cäsiumchlorid wurde dem konzentrierten Überstand zugegeben, und die DNA wurde durch Ultrazentrifugieren gebändert. Die DNA wurde aus dem Gradienten entfernt, und das Ethidiumbromid wurde mit Isoamylalkohol extrahiert. Anschließend an die Dialyse gegen TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris mit pH-Wert 7), um Salze zu entfernen, wurde die DNA mit Äthanol ausgefällt, in Kugelform gebracht, in 70%igem Äthanol gewaschen, getrocknet und in TE resuspendiert.
  • Die DNA wurde partiell mit dem Restriktionsenzym Mbo I digeriert, und Fraktionen wurden auf einem Sukrosegradienten separiert. DNA in dem Größenbereich von 15 - 20 Kilobasen wurde gereinigt. Diese DNA wurde an mit BamHI digerierten gereinigten Armen des EMBL3-Stranges des Bakteriophagen λ gebunden (Vektorklonsystem) und in Teilchen gepackt und an den E. coli- Strang P3292 adsorbiert, wie vom Zulieferer angegeben. Adsorbierte Zellen wurden auf NZY-Aminagarosemedium gelegt, und der gesamte Phage wurde als Plattenlysat im TM-Puffer (10 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 10 mM MgSO&sub4;) eingesammelt. Das Lysat wurde mit CHCl&sub3; behandelt, zentrifugiert und die obere Phase zur Lagerung entfernt.
  • Eine getiterte Probe der Phagenbibliothek wurde an den E. coli-Strang LE392 adsorbiert und auf NZY-Aminagarosemedium gelegt. Plaque-Abhebungen an Nitrozellulosefiltern wurden mit nick-translatierter A. niger adhA-cDNA (Beispiel 2A) sondiert. Positive Plaquen wurden aufgenommen und durch zwei Umläufe der Plaque-Reinigung vor der Analyse gereinigt. Zwei positive Klone, bezeichnet mit λP3 und λQ5, wurden für die Analyse ausgewählt.
  • Es wird Bezug auf Fig. 4 genommen, bei der Abschnitte der Einfügungen aus λP3 und λQ5 dann subgeklont und sequenziert wurden. λP3 wurde mit BamHI digeriert, und ein 3,8 kb langes Fragment, das das meiste des adhA-Genes enthielt, wurde in pUC19 subgeklont. Dem sich ergebenden Subklon, bezeichnet mit pAZ1011, fehlte der Promotor und ein Teil des 5'-Endes des Gens. λ5 wurde mit Sph I digeriert und ein 1,8 kb langes Fragment, das den Promotor und das 5'-Ende des Gens enthielt, wurde in pUC19 subgeklont, um pAZ1013 aufzubauen. Der Klon pAZ1011 wurde mit PstI und BamHI digeriert, und ein 3,0 kb langes Fragment wurde isoliert. pAZ1013 wurde mit SphI und pstI digeriert, und ein 1,5 kb langes Fragment wurde isoliert. Diese beiden Fragmente wurden mit pUC19 gemischt, das mit SphI und BamHI digeriert worden war, in einer Dreifachbindung, um pAZ1010 zu erzeugen, welches das vollständige adhA-Gen von A. niger (Fig. 4) enthielt. Sowohl das 3,0 als auch das 1,5 kb lange Fragment wurden auch an mit Sph I + BamHI digeriertes M13mp18 und M13mp19 in Dreifachbindungen für die nachfolgende Nukleotidsequenzanalyse gebunden. Die Sequenz des A. niger adhA-Gens ist in Fig. 5 gezeigt.
    • C. Präparation des Asperaillus niger adhA-Promotors
  • Der Aufbau eines austauschbaren A. niger adhA-Promotorfragmentes umfaßte das Plazieren von BglII- und EcoRI-Stellen angrenzend an den und stromaufwärts vom natürlichen Initiator ATG des adhA-Genes und ist in Fig. 6 dargestellt. Ein 424 bp langes BamHI-HindIII-Fragment aus pAZ1013 (mit der genomischen adhA-Sequenz von A. niger) wurde in mit BamHI + HindIII digeriertes M13mp18 gebunden, um pM163T aufzubauen. E. coli RZ1032-Zellen wurden auf LB-Tetracyclin (15 ug/ml)-Platten gestrichen und übernacht bei 37ºC gezüchtet. Geeignete Zellen von RZ1032 wurden hergestellt und auf Infizierbarkeit mit der pM163T-Matrix und M13mp11 als Kontrolle getestet.
  • Phagenpräparationen wurden dann von den transfizierten RZ1032- Zellen gemacht. Vier Plaques wurden ausgewählt, und jede wurde zu einem ml YT gegeben. Die Proben wurden verwirbelt, und die Zellen wurden durch Erwärmen bei 60ºC über fünf Minuten abgetötet. Große Kulturen wurden präpariert, indem 100 ml YT + 0,25 ug/ml Uridin in 1-Liter-Kolben mit 5 ml mid-log RZ1032- Zellen und 100 ul der Phagenproben inokuliert wurden. Diese Kulturen wurden 16 Stunden lang bei 37ºC mit Schütteln bebrütet. Die Kulturen wurden dann rotiert, und die Überstände wurden gesammelt. Die sich ergebenden Phagenpräparationen wurden mit pM179-1 bis pM179-4 bezeichnet.
  • Phagentitervergleiche von ung&supmin; (RZ1032) und ung&spplus; (JM101) E. coli-Wirten wurden bei den vier Phagen Präparationen durchgeführt. Der Phagentiter wurde auf jeder Kultur bestimmt, in dem JM101 und RZ1032 mit einer bekannten Menge an Phagen von den Überständen infiziert wurden. Phagen, die Urazil in der DNA enthalten, haben normale biologische Aktivität in ung&supmin; (RZ1032)-Wirten, jedoch eine mehr als 10&sup5;fach geringere Überlebensfähigkeit in ung&spplus; (JM101)-Wirten. Alle Kulturen hatten Urazil-haltige DNA, und Matrizenpräparationen wurden von allen vier Kulturen gemacht.
  • Das Oligonukleotid ZC935 (5' CCA GTG CCA AGC TTG AAT TCA GAT CTA TTG GCA GCT TGG G 3') wurde nach dem Verfahren von Eghtedarzadeh und Henikoff (Nuc. Acids Res.14 : 1986) aufgebaut und als ein mutagener Primer benutzt. Dieses Oligonukleotid wurde mit Kinase behandelt und an die pM179-1-Matrix geheftet. Die DNA wurde durch das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in Anwesenheit von Nukleotid-Triphosphaten synthetisiert. Die sich ergebende Mischung wurde in E. coli JM101 (ung&spplus;) transfiziert, um eine Selektion gegen den Urazil-haltigen Matrizenstrang zu erlauben. Dies bewirkt, daß ein hoher Prozentsatz neu mutierter (synthetisierter) Stränge transfiziert wird. Eine Kontrolltransfektion von pM179-1- Matrix (Urazil-haltige DNA) gab keine Plaques. Sechs Plaques wurden dann aufgenommen, Phagen wurden verwendet, um E. coli JM101 zu infizieren, und infizierte Zellen wurden in 1 · YT gezüchtet und Matrizen-DNA wurde präpariert. Die Matrizen wurden sequenziert und es wurde gefunden, daß vier die richtig mutierte Sequenz aufwiesen. Diese wurden mit pM180 bezeichnet. Die replikative Form (RF) der DNA von pM180 wurde präpariert und BamHI + EcoRI geschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf einem Acrylamidgel elektrophoriert, und das 258 bp lange Fragment wurde isoliert. Dieses 258 bp lange Fragment wurde in mit BamHI + EcoRI digeriertem pUC19 gebunden, und die Mischung wurde in E. coli JM83 transformiert. Das sich ergebende Plasmid wurde als pM184 bezeichnet. Das 5'-adhA- Promotorfragment wurde vom pAZ1013 als ein 0,8 kb langes PstI- BamHI-Fragment isoliert und mit einem 2,9 kb langen PstI- BamHI-Fragment von pM184 gebunden, was zu dem Plasmid pM185 führte. Die Plasmid-DNA wurde präpariert und durch Restriktionsenzymverdauung auf die korrekte Orientierung der Einfügung überprüft. Ein Plasmid, das den rekonstruierten adhA-Promotor enthielt, wurde mit pM185-4 bezeichnet.
    • D. Isolierung des A. niger tpiA-Genes
  • Das A. niger tpiA-Gen wurde von der λ-Bibliothek geklont, die in Beispiel 2B beschrieben worden ist, indem nick-translatierte A. niger tpiA-cDNA als die Hypridisierungssonde verwendet wurde. Ein positiver Klon, bezeichnet mit λRI, wurde mit EcoRI digeriert, und ein 8 kb langes Fragment wurde isoliert und in mit EcoRI digeriertem pUC19 subgeklont. Das sich ergebende Plasmid, bezeichnet mit pAZ1019, wurde anschließend mit SpH I und Kpn I digeriert, und ein 1,0 kb langes Fragment, das den Promotor und das 5'-Ende des Genes enthielt, wurde isoliert. pAz1019 wurde auch mit Kpn I und Bgl II digeriert, und ein 1,5 kb langes Fragment, das das 3'-Ende des Genes enthielt, einschließlich des Terminators, wurde isoliert. Diese beiden Fragmente wurden mit mit SpH I + BamHI digeriertem pUC19 in einer Dreifachbindung gemischt, um das Plasmid pAZ1020 (Fig. 7) zu erzeugen. Das rekonstruierte Gen wurde aus dem pAZ1020 als ein 2,5 kb langes EcoRI HindIII-Fragment herausgeschnitten und wurde in mit EcoRI + HindIII digeriertem M13mp18 und M13mp19 für die Nukleotidsequenzanalyse gebunden. Die Sequenz des tpiA-Genes ist in Fig. 8 gezeigt.
    • BEISPIEL - Aufbau von t-PA-Expressionsvektoren für Aspergillus A. Aufbau von pM090
  • Über die Sequenz eines menschlichen t-PA-cDNA-Klones ist berichtet worden (Pennica u. a., Nature 301 : 214 - 221, 1983). Die Sequenz codiert ein Prä-Pro-Peptid aus 32 - 35 Aminosäuren, gefolgt von einem 527 - 530 Aminosäuren langen reifen Protein.
  • Ein cDNA-Klon, der die Codierungssequenz für reifes t-PA aufweist, wurde aufgebaut, wobei als Startmaterial mRNA aus der Bowes-Melanom-Zellinie verwendet wurde (Rijken und Collen J Biol. Chem. 256 : 7035 - 7041, 1981). Diese cDNA wurde dann benutzt, um das Plasmid pDR1296 aufzubauen. Der mit pDR1296 transformierte herichia coli-Strang JM83 ist bei der American Type Culture Collection unter der Annahmenummer 53347 hinterlegt worden.
  • Da die Prä-Pro-Sequenz in dem cDNA-Klon pDR1296 nicht vorlag, wurde sie aus synthetisierten Oligonukleotiden aufgebaut und anschließend mit der cDNA verbunden. Schnittstellen für BamHI und NcoI liegen unmittelbar 5' am ersten Codon (ATG) der Prä- Pro-Sequenz, und eine BglII (Sau3A, XhoII)-Stelle ist an dem 3'-Ende gelegen. Der natürlich auftretenden Prä-Pro-Sequenz fehlt eine passende Restriktionsstelle nahe der Mitte; jedoch kann die Sequenz GGAGCA (die für die Aminosäuren -20 und -19, Gly-Ala, codiert) in GGCGCC geändert werden, um HaeIII und NarI-Stellen zu schaffen, ohne die Aminosäuresequenz zu ändern.
  • Um die Prä-Pro-Sequenz aufzubauen, wurden die folgenden OligonukieQtide synthetisiert, wobei ein Applied Biosystems Model 380-A-DNA-Synthetisierer verwendet wurde:
  • ZC131: 5'GGA TCC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG3'
  • ZC132: 5'TGG CGC CAC ACA GCA GCA GCA CAC AGC AGAG3'
  • ZC133: 5'GGC GCC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CATG3'
  • ZC134: 5'AGA TCT GGC TCC TCT TCT GAA TCG GGC ATG GAT TTC CT3'
  • Nachfolgend an die Reinigung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf denaturierenden Gelen, wurden die Oligomere ZC131 und ZC132 aneinander geheftet, um eine Überlappung von zwölf Basenpaaren zu erzeugen (Abschnitt 1). Die Oligomere ZC133 und ZC134 wurden auf ähnliche Weise aneinander geheftet (Abschnitt 2).
  • Die Oligomere wurden in Pol I-Puffer (Bethesda Research Labs) gemischt, auf 65ºC für fünf Minuten erhitzt und langsam vier Stunden lang auf Zimmertemperatur gekühlt, um aneinander zu heften. Zehn Einheiten DNA-Polymerase I wurden hinzugefügt, und die Reaktion lief zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur. Die Mischungen wurden auf einer 8%igen Polyacrylamid-Harnstoff-Sequenzierungsgel bei 1000 Volt 2 1/2 Stunden elektrophoriert, um die Reaktionsprodukte nach Größen zu fraktionieren. Die Fragmente richtiger Größe (diejenigen, in denen die Polymerasereaktion vollständig abgelaufen ist) wurden vom Gel abgeschnitten und extrahiert.
  • Nach dem Anheften wurde der Abschnitt 1 mit BamHI und NarI geschnitten und in mit BamHI + NarI geschnittenem pUC8 geklont (Vieira und Messing, Gene 12 : 259 - 268, 1982; und Messing, Methods in Enzymology 101:20 - 77, 1983). Abschnitt 2 wurde erneut angeheftet und mit NarI und BglII geschnitten und in mit BamHI + NarI geschnittenes pUC8 geklont. Die Kolonien wurden mit geeigneten markierten Oligonukleotiden überprüft. Plasmide, die durch Koloniehybridisierung als positiv identifiziert worden wäre, wurden sequenziert, um zu verifizieren, daß die korrekte Sequenz geklont worden ist.
  • Abschnitt 1 wurde dann von einer BamHI + NarI-Doppelverdauung des geeigneten pUC-Klones gereinigt. Abschnitt 2 wurde von einer NarI + XhoII-Verdauung gereinigt. Die zwei Fragmente wurden an der NarI-Stelle verbunden und in mit BamHI geschnittenem pUC8 geklont.
  • Die t-PA-Sequenz von pDR1296 wurde dann auf die folgende Weise an die synthetisierte Signalsequenz gebunden (Fig. 9). Das Plasmid pIC19R (Marsh u. a., Gene A3 : 481 - 486, 1984) wurde mit Sma und HindIII digeriert. Der ori-Bereich des SV40 von der Kartenposition 270 (PvuII) bis zur Position 5171 (HindIII) wurde dann an das linearisierte pIC19R gebunden, um das Plasmid Zem67 zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde dann mit BglII geschnitten, und der Terminatorbereich des menschlichen Wachstumshormon-Genes (de Noto u. a., Nuc. Acids Res. 9 : 3719 - 3730, 1981) wurde als ein BgIII-BamHI-Fragment eingefügt, um das Plasmid Zem86 zu erzeugen. Die synthetisierte t-PA-Prä- Pro-Sequenz wurde durch Verdauung mit Sau3A aus dem pUC8-Vektor entfernt. Dieses Fragment wurde in mit BglII digeriertem Zem86 eingefügt, um das Plasmid Zem88 zu erzeugen. Das Plasmid pDR1296 wurde mit BglII und BamHI digeriert und das t-PA-cDNA- Fragment wurde isoliert und in mit BglII geschnittenes Zem88 eingefügt. Das sich ergebende Plasmid wurde als Zem94 bezeichnet.
  • Der Vektor Zem99, der den MT-1-Promotor, die vollständige t- PA-codierende Sequenz und den hGH-Terminator aufwies, wurde dann in der folgenden Weise aufgebaut (Fig. 9). Ein KpnI- BamHI-Fragment, das den MT-1-Promotor aufwies, wurde aus MThGH111 isoliert (Palmiter u. a., Science 2A2 : 809 - 814, 1983) und in pUC18 eingefügt, um Zem93 aufzubauen. Das Plasmid MThGHII2 (Palmiter u. a., ebd.) wurde mit BglII digeriert und wieder gebunden, um die hGH-codierende Sequenz zu eliminieren. Der MT-1-Promotor und hGH-Terminator wurden dann als ein EcoRI-Fragment isoliert und in pUC13 eingefügt, um Zem4 auf zubauen. Zem93 wurde dann durch Verdauung mit BamHI und SalI linearisiert. Zem4 wurde mit BglII und SalI digeriert, und der hGH-Terminator wurde gereinigt. Die t-PA-Prä-Pro-Sequenz wurde von-dem pUC8-Vektor als ein BamHI-XhoII-Fragment entfernt. Die drei DNA-Fragmente wurden dann verbunden und ein Plasmid mit der Struktur von Zem97 (Fig. 9) wurde ausgewählt. Das t-PA- Fragment von Zem94 wurde durch partielle Verdaung mit XhoII isoliert und in mit BglII geschnittenes Zem97 eingefügt. Der sich ergebende Vektor ist Zem99.
  • Die Sequenz gerade stromaufwärts des ATG-StartCodons der t-PA- Sequenz in Zem94 wurde durch stellenspezifische Mutagenese geändert, was zu der Positionierung von HindIII- und BamHI- Stellen angrenzend an das ATG führte (Fig. 10). Die sich ergebende Nukleotidsequenz enthält ein Adenin in der -3-Position, welche das am üblichsten auftretende Nukleotid in dieser Position in Aspergillus ist. Einzelsträngige M13-Matrizen-DNA wurde präpariert, indem ein 800 bp langes HindIII-EcoRI-Fragment von Zem94 mit Polylinker-, Prä-Pro- und einem Abschnitt der reifen t-PA-Sequenzen in M13mp19 eingeführt wurde. Stellenspezifische Mutagenese wurde im wesentlichen wie von Zoller u. a. beschrieben durchgeführt (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983), wobei das Oligonukleotid ZC444 (5'CAT CCA TGG TGG ATC CAA GCT TGG C3') als mutagener Primer verwendet wurde. Das Oligonukleotid ZC87 wurde als zweiter Primer verwendet. Die mutierten Einführungen wurden durch das Dedioxy-Verfahren sequenziert, und ein Klon, in dem die Polylinker-Sequenzen gelöscht worden waren und die BamHI-Stelle an dem 5'-Ende der Prä-Pro-Sequenz wieder eingerichtet worden ist, wurde ausgewählt. Dieser Phagenklon wurde mit BamHI und EcoRI digeriert und die t-PA-Sequenz in mit BamHI + EcoRI digeriertes pUC19H geklont (Marsh u. a., ebd.), um das Plasmid Zem177 zu erzeugen. Das Zem177 wurde mit BgIII digeriert, und das BglII-BamHI- Fragment aus Zem99 mit dem Großteil des cDNA-Moleküls und dem vollständigen hGH-Terminator-Fragment wurde eingefügt. Das sich ergebende Plasmid wurde mit Zem183 bezeichnet. Die SV40- Enhancer-Sequenz wurde in mit 5mal digeriertem pIC19H als ein stumpfes.NcoI-PvuII-Fragment eingefügt, um Zem138 aufzubauen. Der SV40-Enhancer wurde dann aus Zem138 als ein HindIII-Fragment entfernt und an das BamHI-HindIII-Fragment von Zem183 und das-mit BamHI + HindIII geschnittene Zem93 gebunden. Das sich ergebende Plasmid wurde als Zem191 (Fig. 10) bezeichnet.
  • Es wird Bezug auf Fig. 11 genommen, wobei der ADH3-Promotor und -Terminator aus einem 3,4 kb langen PstI-genomischen DNA- Fragment von Aspergillus nidulans subgeklont, das das ADH3-Gen enthielt, welches in die PstI-Stelle von puC19 eingefügt wurde, um pM020 aufzubauen (McKnight, u. a., EMBO J. 4 : 2093 - 2099, 1985). Stellenspezifische Mutagenese wurde verwendet, um die Sequenz an der Initiator-ATG zu ändern, so daß sie BamHI- und EcoRI-Stellen aufweist, und einen Teil des Polylinkers zu löschen. Das 233 bp lange HindIII-BglII-Fragment von pM020 wurde in die HindIII-BamHI-Stellen von M13mp19 gebunden und mit pM026 bezeichnet. Einzelsträngige M13-DNA von pM026 wurde an das mit Kinase behandelte mutagene Oligonukleotid ZC341 (5'AGT GAA TTC GGA TCC TTG GGA TGA GAG3') und den Oligonukleotid-Primer ZC87 (&sup5;,TCC CAG TCA CGA CGT³,) geheftet und durch das große Fragment von E. coli PolI erweitert. Die Reaktionsmischung wurde in geeignetes E. coli JM101 transfiziert, und die resultierenden Plaques wurden auf Hybridisierung auf ³²P- Kinase-markiertes ZC341 getestet. Positive Plaques wurden aufgenommen und mit pM073 bezeichnet, und der M13-Phage wurde in coli JM101 fortgepflanzt. Die DNA in replikativer Form (RF) von M13 wurde präpariert, und ein 100 bp langes HindIII-EcoRI- Fragment wurde herausgeschnitten, gelgereinigt, angebunden an das 1,0 kb lange Fragment PstI-HindIII von pM020 und an mit PstI + EcoRI digeriertes pUC19. Das sich ergebende Plasmid, bezeichnet mit pM076, enthält den ADH3-Promotor und den 5'- nichtcodierenden Bereich mit BamHI- und EcoRI-Stellen, die an der Stelle des ADH3-Initiator-ATG-Codons gelegen sind. Die Sequenz des modifizierten Promotorfragmentes ist in Fig. 12 gezeigt. Der stromabwärtige Abschnitt von pM020, welcher ein 1 kb langes NarI-PstI-Fragment aufweist, wurde an die AccI-PstI- Stellen von pUC19 gebunden und mit pM056 bezeichnet. Dieses Fragment umfaßt die zwischenliegende Sequenz B, den 3'- nichtcodierenden Bereich und die Polyadenylierungsstelle von
  • Das XbaI-PstI-Fragment von pM056 wurde beim Aufbau von pM090 benutzt (Fig. 13). Der verwendete Vektor basierte auf dem Plasmid pBR329 (Covarrubias und Bolivar, Gene 17: 79 - 88, 1982), das durch Umwandlung der PvuII-Stelle in eine XbaI- Stelle durch Linkeraddition geändert wurde und pM044 bezeichnet wurde. Ein 3,4 kb langes Xbal-Fragment, das das argB&spplus;-Gen von A. nidulans umfaßt (Berse u. a., Gene 25 : 107 - 117, 1983) wurde in die XbaI-Stelle von pM044 eingefügt und das sich ergebende Plasmid mit pM048 bezeichnet. Das BamHI-XbaI-Fragment von Zem99, das die cDNA für menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) enthält, das PstI-BamHI-Fragment von pM076 und das XbaI-PstI-Fragment von pM056 wurden in einer vierteiligen Ligation mit dem mit Phosphatase behandelten, mit PstI digerierten pM048 verbunden. Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM090 bezeichnet. E. coli-Transformanten, die pM090 enthielten, wurden auf Resistenz gegen Tetracyclin ausgewählt und auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin geprüft. Das zusammengesetzte PstI-Fragment, das die Expressionseinheit enthielt, konnte in einer von zwei Orientierungen in den Vektor eingesetzt sein. Die pM090-E. coli-Transformanten wurden im Hinblick auf die Orientierung gekennzeichnet und pM090B wurde für die Transformation von A. nidulans gewählt.
    • B. Aufbau von zusätzlichen t-PA-Expressionsvektoren
  • Das BamHI-XbaI-Fragment von Zem99, das die cDNA für menschlichen t-PA enthält, wurde in die BamHI- und XbaI-Stellen von pUC19 eingefügt, und das sich ergebende Plasmid wurde als pM091 bezeichnet. Das BamHI-XbaI-Fragment von pM091 wird dann beim Aufbau der Vektoren pM141, pM159 und pM192, gezeigt in Fig. 14, verwendet.
  • Das PstI-BamHI-ADH3-Promotorfragment von pM076, die BamHI- XbaI-t-PA-cDNA von pM091 und das XbaI-PstI-tpiA-Terminatorfragment von pMLB100 wurden in einer vierteiligen Ligation an mit Phosphatase behandeltes, mit PstI digeriertes pM048 gebunden. Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM141 bezeichnet. E. coli RR1 wurde mit pM141 transformiert. Die Transformanten wurden auf der Grundlage des Widerstandes gegen Tetracyclin ausgewählt und wurden auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin überprüft.
  • Das PstI-BamHI-tpiA-Promotorfragment von pM150, die BamHI- XbaI-t-PA-cDNA von pM091 und das XbaI-PstI-tpiA-Terminatorfragment von pMLP100 wurden in einer vierteiligen Ligation an mit Phosphatase behandeltem, mit PstI digeriertem pM048 gebunden. Das sich ergebende Plasmid wurde pM159 bezeichnet. E. coli JM83 wurde mit pM159 transformiert, und die Transformanten wurden auf Resistenz gegen Tetracyclin ausgewählt und wurden auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin überprüft. Die Ausrichtung des zusammengesetzten PstI-Fragmentes, das die Expressionseinheit in pM159 enthielt, wurde dann bestimmt.
  • Das BamHI-XbaI-t-PA-Fragment von pM091, das PstI-BglII-adhA- Promotorfragment von pM185-4 und das tpiA-Terminatorfragment von pMLP100 werden in einer vierteiligen Ligation mit mit Phosphatase behandeltem, mit PstI digeriertem pM048 gebunden. Das sich ergebende Plasmid wird pM192 bezeichnet. E. coli JM83-Zellen, die pM192 enthalten, werden auf der Grundlage des Widerstandes gegen Tetracyclin ausgewählt und auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin überprüft. Die Ausrichtung des zusammengesetzten PstI-Fragmentes, das die Expressionseinheit enthält, wird durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt.
  • Zwei zusätzliche t-PA-Expressionsvektoren zur Verwendung in Aspergillus-Arten, so wie A. niger, wurden aufgebaut. Der Expressionsvektor pM126 enthält zwei Kopien der t-PA-Expressionseinheit hintereinander, zusammen mit der A. niger adhA- cDNA, die die chromosomale Integration fördert. Da eine wählbar Markierung fehlt, muß mP126 in Wirtszellen mit einem Plasmid, das eine wählbare Markierung trägt, so wie pM125, das das A. nidulans amdS-Gen enthält, kotransformiert werden. Der Expressionsvektor pM129 enthält die t-PA-Expressionseinheit, die A. niger tpiA-cDNA und das A. nidulans amdS-Gen.
  • pM048 wurde mit XbaI und EcoRI digeriert, und der 4,0 kb lange pBR329-Abschnitt wurde zurückgewonnen. Die A. niger adhA-cDNA von pM098 wurde durch XbaI- und EcoRI-Verdauung herausgeschnitten, an das XbaI-EcoRI-pBR329-Fragment von pM048 gebunden und mit pM121 (Fig. 15) bezeichnet.
  • pM121 wurde partiell mit PstI digeriert, mit Phosphatase behandelt und an das PstI-BamHI-ADH3-Promotorfragment von pM076, die BamHI-XbaI-menschliche t-PA-cDNA von Zem191 und das XbaI-PstI-ADH3-Terminatorfragment von Pm056 gebunden. Die Ligationsmischung wurde in E. coli RR1 transformiert, und gegen Tetracyclin resistente Kolonien wurden erhalten. Die Transformanten wurden auf die Ansprechbarkeit auf Ampicillin getestet, die Plasmide wurden dann extrahiert und extensiv durch Restriktionsenzymverdauung analysiert. Das Plasmid pM126 enthält zwei Kopien der Expressionseinheit, die aus dem ADH3- Promotor, der t-PA-cDNA und dem ADH3-Terminator in hintereinander liegender Ausrichtung in pM121 enthält (Fig. 15).
  • Die A. niger tpiA-cDNA aus pM095 wurde durch EcoRI-Verdauung und partielle SalI-Verdauung herausgeschnitten und an das EcoRI-SalI-Fragment, das das A. nidulans amdS-Gen aus pSR2 enthält (Hynes u. a., Mol. Cell. Biol. 3 : 1430 - 1439, 1983) gebunden und das sich ergebende Fragment wurde an die EcoRI- Stelle von pUC19 gebunden und mit pM125 (Fig. 16) bezeichnet.
  • Das Plasmid pM044 wurde mit PstI digeriert, mit Phosphatase behandelt und an das pM076 PstI-BamHI-Fragment, die Zem191 BamHI-XbaI-t-PA-cDNA und das pM056 XbaI-PstI-Fragment gebunden. Das sich ergebende Plasmid, pM127 (Fig. 16), enthält die ADH3-Promotor --t-PA-cDNA --ADH3-Terminator-Expressionseinheit, gibt jedoch keine Resistenz gegen Chloramphenizol wegen des Xbal-Verbinder, der an der PvuII-Stelle in pM044 eingefügt ist. Das Plasmid pM127 wurde geändert, um Resistenz gegen Chloramphenizol zu liefern, durch Verdauung mit PvuI und partieller Verdauung mit EcoRV, Rückgewinnung des 6,3 kb langen Fragmentes und Ligation an das 1,7 kb lange PvuI-EcoRV-Fragment von pBR329. Die Ligationsreaktionsmischung wurde in E. coli RR1 transformiert, gegen Chloramphenizol resistente Transformanten wurden erhalten, die Plasmide extrahiert, gekennzeichnet und pM128 (Fig. 16) bezeichnet. Das Plasmid pM128 wurde partiell mit EcoRI digeriert, und das lineare (.8 kb) Fragment wurde isoliert und an das 6 kb lange EcoRI-Fragment von pM125 (Fig. 16) gebunden, welches das A. nidulans amdS-Gen und die A. niger tpiA-cDNA enthält. Die Ligationsmischung wurde in E. coli RR1 transformiert. Gegen Tetracyclin resistente Transformanten wurden erhalten, auf Ansprechbarkeit auf Chloramphenizol getestet, und die Plasmid-DNAs wurden extrahiert und durch Restriktionsenzymverdauung gekennzeichnet. Das Plasmid, das das pM125 EcoRI-Fragment an der pBR329 EcoRI-Stelle von pM128 in der in Fig. 9 gezeigten Ausrichtung enthält, wurde mit pM129A bezeichnet. E. coli RR1, die mit pM129A transformiert wurde, ist bei der ATCC unter der Annahmenummer 53429 hinterlegt worden.
    • C. Aufbau von Expressionsvektoren, die die A. niqer-Glucoamylase-Gen-Prä-Pro-Sequenz enthalten
  • Das Plasmid pCAMG91, das das in PBR322 eingefügte genomische DNA-Fragment der A. niger-Glukoamylase enthält (Boel u. a., EMBO J 3: 1581 - 1585, 1984) wurde mit EcoRI und SstI digeriert, und das 431 bp lange Fragment wurde isoliert und in mit EcoRI + SstI digeriertes pUC19 eingefügt. Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM072 bezeichnet. Das EcoRI-SstI-Fragment von pM072, das den Promotor und die Prä-Pro-Sequenz aufweist, wurde mit AluI digeriert, und das 258 bp lange AluI-SstI-Fragment wurde isoliert. Das Alul-SstI-Fragment wurde mit BssHII digeriert, mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in Anwesenheit von Nukleotid-Triphosphaten stumpfendig gemacht, und das sich ergebende 103 bp lange Fragment wurde isoliert und in die EcoRV-Stelle von pIC19H eingefügt, um pM075-1 aufzubauen. Das HindIII-BamHI-Fragment von pM075-1, das den gesamten Glukoamylase-Prä-Pro-Bereich enthielt, wurde mit dem 725 bp langen BamHI-EcoRI-t-PA-Fragment von pM091 in mit HindIII + EcoRI digeriertem M13mp19 gebunden, um pM189 aufzubauen.
  • Um unerwünschte 5'-t-PA-Sequenzen durch Schleifenbildung auszuschalten, wurden E. coli RZ1032-Zellen mit pM189 transfiziert, und Matrizen-DNA wurde präpariert und an das mit Kinase behandelte Oligonukleotid ZC993 (5'AGA TCA CTT GGT AAG AGC GCT TGG AAA TCA C3') geheftet. Die DNA wurde durch das Klenow- Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in Anwesenheit von Nukleotid-Triphosphaten synthetisiert. Diese Mischung wurde in E. coli JM101 transfiziert, und der gewünschte Aufbau wurde erhalten und mit pM190 bezeichnet (Fig. 17a). Das 440 bp lange BglII-NarI-Fragment von pM190 wurde in einer Dreifachligation mit dem 1,4 kb langen NarI-Xbal-t-PA-Fragment von pM091 und YEp13 verbunden, das mit BglII und XbaI geschnitten worden ist. Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM191 bezeichnet. Das BglII-XbaI-Fragment von pM191, das PstI-BamHI- ADH3-Promotorfragment von pM076 und das XbaI-PstI-tpiA-Terminatorfragment von pMLP100 werden in einer vierteiligen Ligation mit mit Phosphatase behandeltem, mit PstI digeriertem pM048 verbunden. Das sich ergebende Plasmid wird mit pM193 (Fig. 17b) bezeichnet.
  • Das BglII-XbaI-Fragment von pM191, das PstI-BamHI-tpiA-Promotorfragment von pM150 und das XbaI-PstI-tpiA-Terminatorfragment von pMLP100 werden in einer vierteiligen Ligation mit mit Phosphatase behandeltem, mit PstI digeriertem pM048 verbunden. Das sich ergebende Plasmid wird mit pM194 bezeichnet (Fig. 17c). Das BglII-XbaI-Fragment von pM191, das PstI-BglII-ftAd- Promotorfragment von pM185-4 und das tpiA-Terminatorfragment von pMLP100 werden in einer vierteiligen Ligation mit mit Phosphatase behandeltem, mit PstI digeriertem pM048 verbunden. Das sich ergebende Plasmid wird pM195 bezeichnet (Fig. 17c). E. coli JM83 wird mit pM193, pM194 und pM195 transformiert, und die Transformanten werden auf der Grundlage der Resistenz gegen Tetracyclin ausgewählt und auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin überprüft. Die Ausrichtungen der zusammengesetzten PstI-Fragmente, die die Expressionseinheiten aufweisen, werden durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt.
    • BEISPIEL 4 - Aufbau eines IgG-Expressionsvektors für A. nidulans
  • Eine cDNA, die eine schwere Kette des menschlichen Immunoglobulins (IgG) codiert, wurde aus einer cDNA-Bibliothek erhalten, aufgebaut aus RNA, die Poly A der menschlichen Leber enthält, wie von Chandra u. a. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1845 - 1848, 1983) beschrieben. Die cDNA-Präparation wurde durch einen Alkalin-Succrosegradienten niedergeschlagen (Monahan, J.J., Harris, S.E., Woo, S.L.C. und O'Malley, B.W. (1976) Biochemistry 15 : 223 - 233), und nur Fraktionen, die cDNA-Arten mit mehr als 1500 Nukleotiden enthielten, wurden gesammelt. Nachdem man die cDNA enzymatisch doppelsträngig gemacht hat und sie mit S1-Nuklease behandelt hat, wurden die restlichen gestapelten Enden in der cDNA-Präparation aufgefüllt, in dem man das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase in Anwesenheit aller vier Desoxyribonukleosid-Triphosphate verwendet (Maniatis u. a., ebd., S. 97 - 149). Die stumpfendige cDNA wurde mit EcoRI-Methylase behandelt, vor der Ligation mit phosphorylierten EcoRI-Verbindern unter Verwendung von T&sub4;-DNA- Ligase (Maniatis u. a., ebd.). Die gebundene DNA-Präparation wurde erschöpfend mit EcoRI digeriert, und doppelsträngige DNAs mit mehr als 1500 Basenpaaren Länge wurden durch Sucrosedichtegradientenzentrifugation unter nicht-denaturierenden Bedingungen erhalten, was auch alle überschüssigen EcoRI-Verbinder entfernte (Maniatis, u. a., ebd.). Der Expressionsphagenvektor Lambda gt11 und die E. coli Wirtsstränge Y1088 und Y1090 (Young, R. und Davis, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 : 1194, 1983) verwendet. Native Lambda gt11-DNA wurde in Konkatamere gebunden, vollständig mit EcoRI digeriert, und die 5'-Ende-Phosphate wurden durch Behandlung mit bakterieller Alkalinphosphatase entfernt. Die gesammelte cDNA der menschlichen Leber wurde mit Lambda gt11-DNA gebunden und in vitro gepackt, wie in Young R. und Davis R. ebd. beschrieben. Ungefähr 14 Millionen Phagenplaques wurden in dieser Bibliothek erzeugt. Mehr als 90% von diesen sind Rekombinanten, die-menschliche DNA-Einfügungen enthalten, wie durch ihren Mangel an Beta-Galaktosidase-Aktivität und Kennzeichnung von 20 zufällig ausgewählten cDNA-Klonen durch EcoRI-Verdauung, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, nahegelegt. Diese Phagenteilchen wurden gesammelt, gereinigt, indem isopyknische CsCI-Gradienten verwendet wurden, und in TM-Puffer gelagert.
  • Die cDNA-Bibliothek der menschlichen Leber wurde dann überprüft, in dem Protein A, im wesentlichen wie von Young u. a. beschrieben (Science 222: 778 - 782, 1983) mit einem pH-Wert von 8,5 verwendet wurde. Ein Klon mit gebundenem Protein A wurde ausgewählt, und die cDNA-Einfügung wurde durch Verdauung mit EcoRI und 5mal entfernt. Dieses Fragment wurde in mit EcoRI + HincII digeriertem pUC13 eingefügt, um das Plasmid pUC835 zu erzeugen. Das Sequenzieren der Einfügung in pUC835 identifizierte es als eine Immunoglobulin codierende Sequenz.
  • Es wird Bezug auf Fig. 18 genommen, wobei das 1,1 kb lange PstI-EcoRI-Fragment von pM076 an die EcoRI-BamHI menschliche IgG-cDNA von pUC835 und das BamHI-PstI-Fragment von pM056 an der PstI-Stelle von pM048 gebunden wurde und mit pM092 bezeichnet wurde. E. coli-Zellen, die pM092 enthielten, wurden auf Widerstand gegen Tetracyclin ausgewählt und auf Ansprechbarkeit auf Ampicillin überprüft. Die Ausrichtung des PstI- Fragmentes in pM092 wurde bestimmt, und ein mit pM092A bezeichnetes Plasmid wurde für die Transformation von A. nidulans ausgewählt.
    • BEISPIEL 5 - Aufbau eines GM-CSF-Expressionsvektors für A. nidulans
  • Ein genomischer Klon von menschlichem GM-CSF wurde erhalten, wie von Kaushansky u. a. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 3101 - 3105, 1986). Kurz gesagt wurde eine einmal verstärkte λ Charon 4A-Phagenbibliothek von menschlicher genomischer DNA überprüft, in dem eine 70 Basen lange Oligonukleotidsonde verwendet wurde, die von den Aminosäuresequenzen von Mäuse- und menschlicher GM-CSF (hGM-CSF) abgeleitet ist. Positive Klone wurden Plaque-gereinigt und durch Restriktionsanalyse und Plaque-Hybridisierung analysiert. Es wurde gefunden, daß drei Klone auf zusätzliche Sonden für die 5'- und 3'-Enden von menschlicher GM-CSF-cDNA hybridisieren (Wong u. a., Science 221 : 810 - 815, 1985). Es wurde gefunden, daß diese Klone identisch sind, und sie wurden mit λ hGm-CSF bezeichnet.
  • Der GM-CSF genomische Klon wurde dann in den Säugetierzellen- Expressionsvektor bD3 subgeklont und verwendet, um kultivierte COS-Zellen zu transfizieren. Messenger-RNA wurde von den transfizierten Zellen isoliert und verwendet, um eine cDNA- Bibliothek zu präparieren. pD3 ist ein SV40-ori-basierender Plasmidvektor, der die Expression von exogenen genomischen und cDNA-Fragmenten unter der Steuerung des Adenovirus-Hauptspätpromotors erlaubt. pD3 umfaßt auch eine Adenovirus-dreiteilige Leadersequenz, einen SV40-Enhancer, das Polyadenylisierungssignal, das von dem Adenovirus abgeleitet ist, und eine eindeutige BclI-Klonstelle in dem Vektor pML-1 (Lusky und Botchan, Nature 293 : 79 - 81, 1981).
  • Um den Expressionsvektor zu präparieren, wurde das 2,6 kb lange BstEII/EcoRI-Fragment von λ hGM-CSF, das nur den Bereich der TATA-Box bis zu den Polyadenylierungssignalen enthält, in die BclI-Stelle von pD3 subgeklont und verwendet, um COS- Zellen zu transfizieren (Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Die Drei-Tage-COS-Zellen wurden auf biologisch aktive hGM-CSF durch standardmäßige menschliche Knochenmarkkultur geprüft (Kaushansky u. a., ebd.). Der Expressionsvektor, bezeichnet mit pDgGMII (Fig. 19), steuerte die Produktion von 1,9 - 2,9 · 10&sup4; U/ml hGM-CSF.
  • Poly A-enthaltende RNA wurde aus transfizierter RNA von COS- Zellen durch Chromatographie über Oligo-d(T)-Zellulose präpariert. Fünf ug der Poly (A) + RNA wurden verwendet, um 2,5 ug des ersten Stranges der cDNA durch reverse Transkriptase zu präparieren, in dem das Starten mittels Oligo dT verwendet wurde. RNAse H und DNA-Polymerase wurden verwendet, um den zweiten Strang der cDNA zu synthetisieren. Nachdem das cDNA- Molekül mit T&sub4;-DNA-Polymerase stumpf gemacht worden ist, wurden 2 ug doppelsträngiger cDNA an eine gleiche Menge von EcoRI-Verbindern gebunden. Die Reaktionspartner wurden mit EcoRI digeriert und die cDNA von Verbindermonumeren durch Gelfiltrationschromatographie abgetrennt. 560 ng der cDNA wurden vom Leervolumen der Säule zurückgewonnen. Die cDNA wurde an eine äquimolare Menge von λ gt11 gebunden, der durch Verdauung mit EcoRI präpariert und mit Kälberalkalinphosphatase behandelt worden war. Die DNA in der Ligationsmischung wurde gepackt, in dem ein λ-Packungsextrakt verwendet wurde.
  • Von den 5 · 10&sup5; Rekombinanten, die aus 37 ng der cDNA präpariert worden waren, wurden 3 · 10&sup5; überprüft, in dem eine genomische Sonde von hGM-CSF verwendet wurde. Insgesamt hybridisierten 248 Plaques stark mit einer Nick-translatierten genomischen Sonde unter sehr strengen Waschbedingungen, was nahelegt, daß ungefähr 0,1% der Klone cDNA für hGM-CSF enthielten.
  • Sechs cDNA-Klone wurden Plaque-gereinigt und in pUC13 subgeklont. Alle Klone enthielten ein einzelnes offenes Leseraster und paßten auf die genomische Sequenz und die zuvor veröffentlichte cDNA-Sequenz für menschliches GM-CSF. Das Plasmid wurde mit pUCcGM bezeichnet. Die cDNA-Klone wurden auch in M13mp18 und M13mp19 für die Sequenzierung subgeklont.
  • Ein Aspergillus-Expressionsvektor, der die hGM-CSF-cDNA enthielt, wurde dann aufgebaut. Das Plasmid pM048 wurde mit EcoRI digeriert, die kohäsiven Enden wurden stumpf gemacht, in dem T&sub4;-DNA-Polymerase verwendet wurde, und das Plasmid wurde wieder in Kreisform gebracht und verwendet, um E. coli RR1 zu transformieren. Die Plasmid-DNA wurde von den Transformanten isoliert und auf die Abwesenheit der EcoRI-Stelle überprüft. Plasmide, denen die Stelle fehlte, wurden mit pM048-RI bezeichnet. Der ADH3-Promotor wurde von pM076 als ein PstI- EcoRI-Fragment entfernt, und der ADH3-Terminator wurde von pM056 als ein EcoRI-PstI-Fragment entfernt. Das Plasmid pM048- RI wurde mit PstI geschnitten, an die Promotor- und Terminatorfragmente in einer Dreifachligation gebunden und in E. coli RR1 transformiert. Das sich ergebende Plasmid wurde mit pM132 bezeichnet.
  • Die cDNA der GM-CSF wurde dann in die EcoRI-Stelle von pM132 eingefügt. Ein 548 bp langes SstI/NcoI-cDNA-Fragment wurde von pUCcGM isoliert. Die Fragmentenden wurden abgestumpft und EcoRI-Verbinder wurden zugefügt. Dieses Fragment wurde dann an mit EcoRI geschnittenes, mit Phosphatase behandeltes pM132 gebunden. Die gebundene DNA wurde in E. coli RR1 transformiert, und die Transformanten wurden auf LB + Tetrazyklin ausgewählt. Minipräparationen (Birnboim und Doly, Nuc. Acids Res. 7 : 1513, 1979) der Plasmid-DNA wurden mit EcoRI digeriert, um die Anwesenheit der GM-CSF-Einfügung zu verifizieren, und mit PstI, um ihre Ausrichtung zu bestimmen. Das Plasmid pMcGM (Fig. 19) enthielt die cDNA-Einfügung in der korrekten Ausrichtung relativ zu dem Promotor und dem Terminator. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Gradientenzentrifugation für die Verwendung in der Transformation von Aspergillus präpariert.
    • BEISPIEL 6 - Expression von t-PA, IgG und GM-CSF in Asperqillus A. Transformation
  • Aspergillus nidulans wurde mit Plasmid-DNA durch eine Modifikation der Prozedur von Yelton u. a. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. li: 1740 - 1747, 1984) transformiert. Ungefähr 10&sup7; Sporen von fünf Tage alten Kulturen von Aspergillus nidulans- Strang CZ6-1-10 (pabaA1, yA2; argB; wobei paba = Auxotrophie auf p-Aminobenzoesäure, y = Gelbfarbe der Konidiospore, arg = Auxotrophie auf Arginin) oder Strang CZ24-3-25 (pabaA1; argB, areA1; fwA1; wobei are die Forderung nach Ammonium angibt und Fw die beige Sporenfarbe angibt. Ammonium wird mit einer Endkonzentration von 5 Mm als Tartratsalz zur Verfügung gestellt.) wurden in 400 ml Aspergillus -Minimalmedium, das mit 10mM Para-Aminobenzoesäure (paba) und 100 mM Arginin versetzt worden ist inokuliert, und wurden bei 37ºC in einem Schüttelwasserbad 18 Stunden lang gezüchtet. Die Kultur wurde durch-vier Schichten sterilen Mulls gefiltert, die Zellen mit 0,6 M MgSO&sub4; gewaschen, und 1 g der Zellen wurde in 5 ml osmotischen Mediums (OM) (Yelton u. a., ebd.) in einem 100 ml- Kolben resuspendiert. In den Kolben wurden β-Glukuronidase, Filter-sterilisiertes Novozym 234 und BSA gefüllt, und die Suspension bei 30ºC mit langsamem Schütteln bebrütet. Nach 90 Minuten wurde die Protoplastsuspension in ein 30 ml-Corexrohr überführt. Der Kolben wurde mit 5 ml OM gewaschen und die Waschlösung in das Rohr gegeben. Die Mischung in dem Rohr wurde vorsichtig mit 10 ml ST-Puffer (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris, pH-Wert 7,5) überlegt und das Rohr 15 Minuten mit 7000 Upm in einem Sorvall HB4-Rotor zentrifugiert. Die Protoplasten wurden aus der Zwischenschicht gesammelt. Der SF wurde entfernt, die Kügelchen resuspendiert und frischer ST in dem Rohr überlagert. Das Rohr wurde zentrifugiert und die Protoplasten wurden gesammelt und mit denen aus der ersten Zwischenschicht gesammelt. Die gesammelten Protoplasten wurden durch Resuspension in 15 ml STC-Puffer (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) gesammelt und 15 Minuten bei 800 Upm in einem Sorvall HB4-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Protoplasten dreimal in 30 ml STC gewaschen. Das endgültige Kügelchen wurde in 300 ul STC suspendiert.
  • Plasmid-DNA, präpariert aus E. coli, das mit dem geeigneten Expressionsvektor transformiert worden ist, wurde zweimal mit Phenol extrahiert, mit RNaseA behandelt, mit Äthanol ausgefällt und 25 ul STC resuspendiert.
  • Typischerweise wurden fünfundzwanzig ul Plasmid-DNA zu 10&sup7; Protoplasten in 100 ul STC hinzugefügt. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und 25 Minuten bei 37ºC bebrütet. 60% PEG 6000 wurden dann in aufeinanderfolgenden Teilmengen von 0,2 ml, 0,2 ml und 0.8 ml hinzugefügt, wobei nach jedem Zusatz vorsichtig gemischt wurde und die Lösung zusätzliche 20 Minuten bei 37 C bebrütet. Zehn ml STC wurden hinzugefügt, die Lösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten mit 8000 Upm in einem HB4-Rotor zentrifugiert. Das Kügelchen wurde in 1 ml vollständigen Mediums resuspendiert und die Lösung bei 37ºC auf einer Walze ungefähr 2 Stunden lang bebrütet.
  • Einhundert ul-Teilmengen der Protoplastsuspension wurden zu 3,5 ml geeignet vervollständigtem Sorbitol-Agarmedium von 49 C hinzugefügt, dem Arginin fehlte, um auf Arginin-prototrophe Kolonien auszuwählen. Diese Lösung wurde auf dasselbe Medium übergelegt und die Platten bei 37ºC drei Tage lang bebrütet.
    • B. Auswahl von Transformanten und Expression von t-PA
  • Große, gute Sporen bildende Kolonien wurden zu Proben zusammengefaßt, in dem eine kleine Anzahl von Sporen von einer Platte durch Verwendung einer feinen Glasnadel entfernt wurden. Die Nadel wurde in einem Tropfen von 0,2%igem Tween 80 in der Mitte einer Minimal- + paba-Agarplatte gewaschen und die Suspension über die Oberfläche der Platte versprüht. Die Platten wurden drei Tage bei 37ºC bebrütet, und die Reinigungsprozedur wurde wiederholt.
  • Die DNA wurde dann von den Transformanten extrahiert. Sporen der zweimal gereinigten Transformanten wurden dicht über minimales Agar gesprüht, das paba enthielt, und bei 37ºC fünf Tage lang bebrütet. Die Sporen wurden geerntet, indem die Platten mit 0,02%igem Tween 80 (10 ml/pro 2 Platten) gewaschen wurden. Ungefähr 2 ml der Sporensuspension wurden zu 40 ml minimalen Mediums, das paba enthielt, hinzugefügt, und die Mischung wurde 18 Stunden lang bei 37ºC in einem Schüttelwasserbad bebrütet. Das Myzel wurde durch Filtern der Kultur durch Mull geerntet, mit kaltem Wasser gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren und zu einem feinen Pulver in einem Mörser mit Mörserkeule gemahlen. Dieses wurde in 5 ml Extraktionspuffer (0,2% SDS, 50 mM EDTA, 1 ul/ml Diethylpyrokarbonat) dispergiert und die Mischung bei 65 C 30 Minuten lang bebrütet. Das Lysat wurde zentrifugiert, 300 ul 5 M KOAc wurden zum Überstand hinzugefügt, und die Mischung wurde-für 1 Stunde auf Eis gelegt. Die gekühlte Lösung wurde 30 Minuten lang mit 23.000 Upm in einem Beckman VTi60-Rotor zentrifugiert, und der sich ergebende Überstand wurde mit einem gleichen Volumen von Isopropanol gemischt. Die Lösung wurde mit 12.000 Upm 15 Minuten lang in einem Sorvall 5534- Rotor zentrifugiert und das Kügelchen in 5 ml TER (10 mM Tris mit pH-Wert 7,6, 1 mM EDTA, 10 ug/ml RNaseA) resuspendiert. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol wurde die DNA mit Isopropanol ausgefällt. Das endgültige Kügelchen wurde in 30 ul TER resuspendiert.
  • Die genomische DNA aus zehn unabhängigen A. nidulans argB&spplus;- Transformanten, abgeleitet von pM090B, wurde mit BamHI und XbaI digeriert, Southern-Blotting wurde durchgeführt und sie wurde an die Nick-translatierte BamHI-XbaI-tPA-cDNA hybridisiert. Die positiven Transformanten, die eine intakte tPA-cDNA enthalten, wurden mit 90B-2, 90B-5, 90B-6 und 90B-9 bezeichnet. Die genomische DNA aus 90B-2 und 90B-9 wurden mit BamHI und PstI digeriert, Southern-Blotting wurde durchgeführt, und sie wurden an das Nick-translatierte PstI-Fragment von pM020 hybridisiert.
  • Frische Sporen von 90B-2 und 90B-9 wurden jeweils in 10 ml 0,02%igem Tween 80 von 2 Agarplatten geerntet, die jede Minimal-Sorbito-Medium enthielten. Die vier Sporensuspensionen wurden jeweils durch sterilen Mull gefiltert und je 1,7 ml (10&sup7; - 108 Sporen) wurden in 200 ml flüssigen Expressionsmedium der folgenden Zusammensetzung inokuliert: 1% (Vol./Vol.) Äthanol, 0,1% (Gew./Vol.) Glukose, 100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 50 mM NaPO&sub4; mit pH-Wert 7,0, 11 mM KH&sub2;PO&sub4;, 7 mM KCl, 2,1 mM MgSO&sub4;, 1 mM Para-Aminobenzoat und verschiedene Spurenelemente. Die Suspensionen wurden mit Schütteln (mit ungefähr 400 Upm) bei 37ºC 24 Stunden lang gezüchtet. Die sich ergebenden Kulturen wurden dann durch vier Schichten sterilen Mulls gefiltert, und die flüssigen Medien wurden in 250 ml Flaschen auf Eis überführt und bei -80ºC gelagert. Die gefilterten Hyphen wurden mit 300 ml sterilen destillierten H&sub2;O gewaschen, trockengepreßt und in einem Mörser und Mörserkeule in flüssigem Stickstoff gemahlen. Ungefähr die Hälfte der gepulverten gefrorenen Hyphen wurden in ein 15 ml-Corexrohr auf Trockeneis überführt und bei -80ºC gelagert.
  • RNA wurde von den pulverisierten Hyphen wie zuvor beschrieben extrahiert. Die RNA-Konzentrationen wurden durch Spektrometrie bestimmt und durch Zusatz von Wasser eingestellt, um etwa gleiche RNA-Konzentrationen von 7 ug/ul zu geben. Zwanzig Mikrogramm gesamter RNA jeweils von 90B-2 und 90B-9 wurden durch Glyoxal und DM50 denaturiert, es wurde Northern Blotting durchgeführt, und sie wurden an die nick-translatierte tPA- cDNA oder die nick-translatierte ADH3-cDNA hybridisiert. Die Ergebnisse zeigten an, daß tPA-mRNA in 90B-2 und 90B-9 in einer Konzentration ähnlich der ADH3-mRNA vorlag.
    • C. Proben auf t-PA
  • Die mengenmäßige Untersuchung von Plasminogen-Aktivator in A. nidulans-Extrakt ebenso wie im Kulturfiltrat wurde durchgeführt, in dem die Techniken der Enzym-gekoppelten Immunoprobe (ELISA) und der Fibrinplattenprobe (Fibrinolyseprobe) verwendet wurden.
    • ELISA
  • Für die ELISA wurden Mikrotiter-Plattendellen mit einem monoklonalen Antikörper in Puffer A (10 ul/Delle; 6 ug/ml in 0,1 M nAHCO&sub3;, pH-Wert 9,6) überzogen. Die Platten konnten 1 Stunde lang bei 30ºC stehen und wurden dann dreimal mit Puffer B (0,05% Tween 20, 0,05% NaN&sub3;, in Phosphat-gepufferter Salzlösung) gewaschen. 150 ul Puffer C (0,05% Tween 20, 0,05% NaN&sub3;, 1% BSA in Phosphat-gepufferter Salzlösung) wurden zu jeder Delle hinzugefügt, und die Platten wurden 2 Stunden lang bei 35ºC bebrütet, um nicht spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden dann dreimal mit Puffer B gewaschen. Testproben wurden präpariert, indem man das zu testende Material im Puffer C verdünnte. 10 ul der Probe wurden pro Delle hinzugefügt, und die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37ºC bebrütet. Die Dellen wurden entlüftet und dreimal mit Puffer B gewaschen. 100 ul einer Lösung aus Anti-t-PA-Antikörper vom Kaninchen (Verdünnung 1 : 1000) im Puffer C wurden zu jeder Delle hinzugefügt, und die Platten wurden sechzig Minuten bei 37ºC bebrütet. Nach drei Waschungen mit Puffer B wurden 100 ul von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt an Peroxidase (Tago; Verdünnung 1 : 1000) in Puffer C zugefügt und die Platten wurden sechzig Minuten lang bei 37ºC bebrütet. Die Platten wurden dreimal mit Puffer B gewaschen und mit 100 ul einer Lösung bebrütet, die o-Phenylen-Diamin- Dihydrochlorid (0,4 mg/ml) und H&sub2;O&sub2; (0,03%) in 0,1 M Natriumzitrat mit pH-Wert 5,0 enthält, bebrütet. Nach fünf Minuten wurde die Reaktion durch Zusatz von 100 ul 1 M H&sub2;SO&sub2; zu jeder Delle gestoppt, und die Farbentwicklung wurde bei 492 nm aufgezeichnet, wobei ein ELISA-Plattenleser verwendet wurde. Bowes-Melanom-Zellen-t-PA wurde verwendet, um einen Standardgraph im Bereich von 0,2 - 26 ng/ml zu entwickeln.
    • Fibrinolyseprobe
  • Für diese Probe wurden die Fibrinplatten wie unten beschrieben präpariert. 10 ml einer Rinder-Fibrinogenlösung (3,0 mg/ml in 0,036 M Natriumazetat mit pH-Wert 8,4, 0,036 M Natriumbarbital, 0,145 M NaCl, 10&supmin;&sup4; M CaCl&sub2;, 0,02% NaN3) wurden zu 10 ml einer 1,5%igen Lösung von Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in demselben Puffer bei 40ºC hinzugefügt. Zu dieser Lösung wurden 10 ul Rinderthrombin (500 u/ml) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf ein gelgebundenes Agarose-Trägerblatt (Marine Colloids) gegossen und konnte kühlen und ein Fibrinnetzwerk in der Agarose bilden. Dann wurden Dellen in die Agarose geschnitten. In die Dellen wurden 10 ul eines BSA-Puffers (0,1% Rinderserum-Albumin in Phosphatgepufferter Salzlösung) hinzugefügt, die jeweils 1 ug, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0 ng Bowes-Melanom-t-PA-Standard enthielten, plus 10 ul BSA-Puffer oder 10 ul ungelöster oder gelöster Testproben. Die Platten wurden bei 37ºC 16 - 18 Stunden lang bebrütet, und aus dem Durchmesser des klaren Halo oder Bereich um die Delle wurde die Menge an biologisch aktivem Plasminogenaktivator abgeschätzt.
    • Pfropfprobe zum Überprüfen von Aspergillus-Kolonien
  • Inokulierte Mediumplatten wurden bei 30ºC 18 - 20 Stunden lang bebrütet. Diese Platten wurden überlegt entweder mit Nitrozellulosefiltern (wenn Antikörperfärbung durchgeführt werden sollte) oder Whatman-Filterpapier und bei 30ºC für zusätzliche 24 Stunden bebrütet. Die Filter wurden dann entfernt und von jeder nicht-sporenbildenden Kolonie wurde ein Pfropf konstanten Volumens entfernt und in eine Delle plaziert, die in einer Fibrinolyse-Prüfplatte ausgebildet ist. Die Delle wurde dann mit Agaroselösung gefüllt, und die Platte wurde bei 37ºC bebrütet. Positive Kolonien wurden durch das Aufklaren der Fibrinplatte um die Pfröpfe erfaßt.
    • Kolonie-Blot-Immunoprobe auf t-PA
  • Arg&spplus;-Transformanten wurden auf an Arginin mangelnde Medien getupft und gezüchtet, bis kleine fadenförmige Kolonien vorlagen. Nitrozellulosefilter wurden auf die Platten gelegt und die Bebrütung wurde für einen weiteren Tag fortgesetzt. Die Filter wurden dann entfernt und 30 Minuten lang in 20% Methanol, 25 mM Tris mit pH-Wert 8,3, 19 mM Glyzin gewaschen, dann in Puffer A (50 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 5% (Gew./Vol.) Trockenmagermilch) gewaschen. Die Filter wurden dann mehrere Stunden lang in Puffer A bebrütet, das Kaninchen-Antiserum gegen menschliches t-PA enthielt, in Puffer A gewaschen und mit Anti-Kaninchen-Antikörper von der Ziege, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase oder an mit Biotin behandelte Meerrettich-Peroxidase. Für Antikörper, die an Meerrettich-Peroxidase konjugiert worden waren, wurden die Filter in Puffer B (50 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% (Gew./Vol.) NP-40, 1 M NaCl, 0,25% (Gew./Vol.) Gelatine, 0,4% (Gew./Vol.) Sarkosyl) gewaschen, dann auf Meerrettich-Peroxidase-Entwicklerpuffer (17% (Vol . /Vol.) Methanol, 43 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 120 mM NaCl, 0,05% (Gew./Vol.) Meerrettich-Farbreagenz, 0 ,001- % (Vol./Vol.) Hydrogenperoxid) überführt. Für Antikörper, die an mit Biotin behandelter Meerrettich-Peroxidase konjugiert worden sind, wurden die Filter in Puffer A gewaschen, mit Puffer A, der Avidin und mit Biotin behandelte Meerrettich-Peroxidase enthielt, bebrütet, in Puffer B gewaschen, dann in Meerrettich-Peroxidase-Entwicklerpuffer gelegt. Kolonien, die positiv für t-PA waren, wurden durch die blaue Färbung der gebundenen Meerrettich-Peroxidase identifiziert.
  • Der A. nidulans-Transformant 90B-9 sonderte aktives tPA in das Kulturmedium in einem Wert von ungefähr 0,1 mg pro Liter ab. Die Aktivität des abgesonderten tPA-Proteins wurde spezifisch durch einen Kaninchen-polyklonalen Antikörper gegen IgG, eingesetzt gegen menschliches tPA, gehemmt.
    • D. Expression von GM-CSF
  • Die pMcGM Plasmid-DNA wurde verwendet, um den Aspergillus nidulans-Strang CZ6-1-10 wie oben beschrieben zu transformieren. DNA wurde aus den Transformanten präpariert, mit EcoRI und PstI digeriert und durch Southern Blotting auf die Anwesenheit der cDNA und intakten Expressionseinheit analysiert.
  • Die gesamte RNA wurde aus 5 pMcGM-Transformanten isoliert und auf die Anwesenheit von GM-CSF und ADH3-mRNA durch Northern Blot-Hybridisierung analysiert (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • USA 77 : 5201, 1980). GM-CSF-mRNA war relativ reichlich in einem Transformanten (bezeichnet mit #10) vorhanden und mit einem geringen Wert in den anderen vier (#11, #13, #14, #6) erfaßbar. Die Äthanol-Regulierung der GM-CSF- und ADH3-mRNA- Werte wurde auch durch Northern Blot-Hybridisierung der Gesamt-RNA-Proben analysiert, die aus Kulturen isoliert wurden, die in der Anwesenheit von Glukose oder Äthanol gezüchtet waren. GM-CSF-mRNA vom Transformanten #10 war mit einem geringen Wert in Glukose und reichlich in Äthanol erfaßbar, während die ADH3-mRNA in keiner Kultur erfaßbar war. GM-CSF-mRNA vom Transformanten #14 war mit einem geringen Wert in Glukose und Äthanol erfaßbar, während die ADH3-mRNA in Glukose erfaßbar und reichlich in Äthanol vorhanden war.
  • Um auch die Produktion von GM-CSF zu prüfen, wurden Kulturen von Aspergillus-Transformanten (#6, #10 und #14) 8 - 10 Stunden lang in Expressionsmedium bei 37ºC gezüchtet, damit die Sporen keimen konnten. Äthanol wurde zu 1% (Vol./Vol.) hinzugefügt, und die Kulturen wurden zusätzliche 12 - 15 Stunden bei 37ºC unter Schütteln bebrütet. Das Medium wurde durch Filtration entfernt, auf Eis gelegt, dann mit mehreren Wechseln von PBS bei 4ºC 2 Tage lang dialysiert. Proben des dialysierten Mediums wurden nacheinander in PBS verdünnt und geprüft, in dem frische extrahierte Knochenmarkzellen verwendet wurden (Kaushansky u. a., ebd.). Alle drei getesteten Transformanten gaben positive Proben bei ungefähr 10 ug GM-CSF pro Liter Kulturmedium.
    • E. Expression von IgG
  • Ähnliche Experimente wurden mit pN092 durchgeführt, dem Plasmid, das die IgG-cDNA enthält. Die genomische DNA von zehn unabhängigen A. nidulans argB&spplus;-Transformanten, die von pM092A abgeleitet war, wurde mit XbaI digeriert, Southern Blotting wurde durchgeführt, und sie wurde an die nick-translatierte EcoRI-BamHI-IgG-cDNA hybridisiert. Die vier positiven Transformanten wurden mit 92A-2, 92A-4, 92A-9 und 92A-10 bezeichnet. Die genomische DNA von 92A-2 und 92A-10 wurde mit PstI und EcoRI digeriert, Southern Blotting wurde durchgeführt, und sie wurde an das nick-translatierte PstI-Fragment von pM020 hybridisiert.
  • Frische Sporen der Transformanten 92A-2 und 92A-10 wurden wie zuvor beschrieben geerntet und in frisches Medium inokuliert. Die Kulturen wurden gezüchtet und geerntet, und die RNA wurde extrahiert. Hybridisierungsexperimente verfizierten die Anwesenheit von IgG-mRNA in dem Transformanten 92A-10.
  • Aus dem Vorangegangenen wird es deutlich werden, daß, obwohl bestimmte Ausführungsformen der Erfindung hierin aus Zwecken der Darstellung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Gedanken und Umfang der Erfindung abzuweichen. Dem-entsprechend soll die Erfindung außer durch die beigefügten Ansprüche nicht beschränkt sein.

Claims (23)

1. DNA-Aufbau, in der Lage dazu, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus-Gen-Transkriptionspromotor enthält, stromabwärts gefolgt von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird.
2. DNA-Aufbau nach Anspruch 1, bei dem der Promotor derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
3. DNA-Aufbau nach Anspruch 2, bei dem die DNA-Sequenz ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen ist.
4. DNA-Aufbau nach Anspruch 1, bei dem der Terminator derjenige einer DNA-Sequenz-ist die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
5. DNA-Aufbau nach Anspruch 1, bei dem das höhere eukaryotische Gen ein Gen ist, das für t-PA, IgG oder GM-CSF codiert.
6. Rekombinantes Plasmid, zur Integration in die chromosomale DNA von Aspergillus in der Lage, wobei das Plasmid einen DNA-Aufbau enthält, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus-Gen-Transkriptionspromotor enthält, stromabwärts gefolgt von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird.
7. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, das weiterhin eine DNA-Sequenz aufweist, die im wesentlichen homolog zu einem Abschnitt der chromosomalen DNA ist, wobei die DNA- Sequenz die Integration des Plasmides in die chromosomale DNA erleichtert.
8. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, bei dem der Promotor derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
9. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 8, bei dem die DNA- Sequenz ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen ist.
10. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, bei dem der Terminator derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
11. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, bei dem das höhere eukaryotische Gen ein Gen ist, das für t-PA, IgG oder GM-CSF codiert.
12. Aspergillus-Kultur, transformiert mit einem DNA-Aufbau, der in der Lage dazu ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus-Gen-Transkriptionspromotor enthält, stromabwärts gefolgt von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird.
13. Transformierte Kultur nach Anspruch 12, wobei der Promotor derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
14. Transformierte Kultur nach Anspruch 13, wobei die DNA- Sequenz ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen ist.
15. Transformierte Kultur nach Anspruch 12, wobei der Terminator derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
16. Transformierte Kultur nach Anspruch 12, wobei das höhere eukaryotische Gen ein Gen ist, das für t-PA, IgG oder GM-CSF codiert.
17. Verfahren zum Exprimieren höherer eukaryotischer Gene in Aspergillus, umfassend:
das Einführen eines rekombinanten Plasmides in einen Aspergillus-Wirt, das zur Integration in die chromosomale DNA von Asnergillus in der Lage ist, wobei das Plasmid einen DNA- Aufbau enthält, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der DNA-Aufbau einen Aspergillus-Gen-Transkriptionspromotor enthält, stromabwärts gefolgt von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird;
das Züchten des Aspergillus-Wirtes in einem geeigneten Medium; und
das Isolieren des Proteinproduktes des höheren eukaryotischen Genes von dem Aspergillus-Wirt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Promotor derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die DNA-Sequenz ein A. nidulans-Gen oder ein A. niger-Gen ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Terminator derjenige einer DNA-Sequenz ist, die ein ADH-Enzym oder ein TPI-Enzym codiert.
21. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das höhere ukaryotische Gen ein Gen ist, das für t-PA, IgG oder GM-CSF codiert.
22. Isolierter Transkriptionspromotor, in der Lage dazu, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der Promotor aus der Gruppe bestehend aus dem Aspergillus nidulans-ADH3-Promotor, dem Aspergillus nidulans-tpiA-Promotor, dem Aspergillus niger-adhA-Promotor und dem Aspergillus niger-tpiA-Promotor ausgewählt ist.
23. Verfahren zum Exprimieren höherer eukaryotischer Gene in Aspergillus, umfassend:
das Einführen eines rekombinanten Plasmides in einen Aspergillus-Wirt, das zur Integration in die chromosomale DNA von Aspergillus in der Lage ist, wobei das Plasmid einen DNA- Aufbau mit einem Promotor enthält, der in der Lage ist, die Expression eines höheren eukaryotischen Genes in Aspergillus zu steuern, wobei der Promotor der eines Aspergillus-Genes ist, das ein Protein codiert, das aus der Gruppe bestehend aus ADH- und TPI-Enzymen ausgewählt ist, wobei der Promotor stromabwärts von einem höheren eukaryotischen Gen unter Transkriptionssteuerung des Promotors gefolgt wird, wobei das Gen stromabwärts von einem Aspergillus-Gen-Terminator gefolgt wird;
das Züchten des Aspergillus-Wirtes in einem geeigneten Medium; und
das Isolieren des Proteinproduktes des heterologen Genes von dem Aspergillus-Wirt.
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