DE3687651T2

DE3687651T2 - Analoge des gewebespezifischen plasminogenaktivators.

Info

Publication number: DE3687651T2
Application number: DE8686309704T
Authority: DE
Inventors: Keith R Marotti; Edward F Rehberg; Nicole Y Theriault
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1986-12-12
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2006-12-13
Also published as: EP0231624A1; FI97809C; DE3687651D1; NO873517L; EP0231624B1; DK431887A; GR3007280T3; NO176921B; NO873517D0; EP0289508A1; KR880700856A; AU600463B2; FI882922A; DK431887D0; KR950000303B1; JPH05344892A; FI97809B; FI882922A0; NO176921C; ATE85081T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft humane Gewebe-Plasminogenaktivator(TPA)-Analoga. Die Analoga sind TPA-ähnliche Moleküle, die die nativen Domäne-Regionen entweder neugeordnet, deletiert, addiert oder in einer Kombination davon erhalten haben. Die Analoga sind die Expressionsprodukte von ebenfalls hier beschriebener rekombinanter Desoxyribonukleinsäure (DNA). Zusätzlich beschreibt die vorliegende Erfindung Replikations- und Expressionsplasmide, die die vorstehend beschriebenen TPA-codierenden DNA-Sequenzen enthalten, und geeignete Wirts-Mikroorganismen, die zur Expression der TPA-Analoga nach Transformation mit einem geeigneten Plasmid in der Lage sind.

Hintergrund

TPA hat einen therapeutischen Wert in der Behandlung von Blutgerinnsel, indem es zur Auflösung der Gerinnsel bei deren Bildung beiträgt. Thrombolyse ist das Verfahren zur Auflösung von Fibringerinnseln. Zu diesem Zweck wird die Serin-Protease, Plasmin, aus ihrem inaktiven Zymogen, Plasminogen, gebildet. Die Aktivierung von Plasminogen wird durch proteolytische Spaltung mittels einer mit Plasminogenaktivatoren bezeichneten Klasse von Serin-Proteasen erreicht. Diese Aktivatoren liegen in den meisten Körperflüssigkeiten vor und initiieren die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin. Dies setzt eine Kaskade in Gang, wodurch eine kleine Menge eines Plasminogenaktivators die Aktivierung einer großen Menge von Plasminogen iniziieren kann. In vivo aktiviert der Plasminogenaktivator Plasminogen zu Plasmin, das dann wirkt, um das Fibringerinnsel abzubauen. Der Plasminogenaktivator, der für die Gerinnsel-Lyse physiologisch wichtig ist, ist TPA.
TPA ist eine Serin-Protease mit einem Molekulargewicht von etwa 66000 Dalton, das durch die vaskulären Endothelialzellen gebildet wird. Es ist glykosyliert und sein einziges bekanntes Proteinsubstrat ist Plasminogen. TPA hat 5 Domänen, die Fibronektin-Finger-Domäne (F), die Wachstumsfaktor-Domäne (G), die Kringel-1-Domäne (K1), die Kringel-2-Domäne (K2) und die aktive Stellen-Domäne (A) mit der aktiven Stelle. Ein oder mehr dieser Domänen sind für die einmalige Fibrin-Bindungsaktivität von TPA verantwortlich.
Zusätzlich zu seiner Fibrin-Affinität wird die TPA-Aktivierung von Plasminogen durch das Vorliegen von Fibrin verstärkt. Andere Gerinnsel-auflösende Stoffe, wie Urokinase oder Streptokinase, haben keine Spezifität für das Fibringerinnsel. Die Halbwertszeit von TPA wird jedoch auf 2-3 Minuten geschätzt, was es zur Verwendung als therapeutisches Mittel ungünstig oder sogar unpraktisch macht (vgl. Collen et al, Science 220 (1983), 1181-1183).
Die Enzym-Kinetiken von TPA wurden untersucht, (vgl. R&ijlig;ken et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 2920-2925). Die Bindungs- und fibrolytische Aktivität von humanem TPA für humane Blutgerinnsel gegenüber Blutgerinnseln anderer Tiere ist bekannt (vgl. Korninger et al., Thrombos. Haemostas. 46 (2) (1981), 561-565). Die strukturelle Beziehung zwischen Domänen mit der fibrinolytischen Aktivität und Affinität wurde ebenfalls beschrieben (vgl. Banyai et al., FEBS Lett. 163 (1) (1983), 37-41; Ny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 5355-5360).
Die Expression von TPA durch transformierte Bakterien und Hefe ist ebenfalls bekannt. Die Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) von humanem TPA wurde 1982 zuerst isoliert (vgl. Opdenakker et al., Eur. J. Biol. (1982), 269-274). Bakterien wurden zur Expression von TPA transformiert (vgl. Pennica et al., Nature 301 (1983), 214-221. Verfahren zur Transformation von Hefe zur Expression von humanem TPA sind in der EP-A-0143081 beschrieben. Die EP-A-0207589 beschreibt FK1K2A.

Zusammenfassung der Erfindung

Neue TPA-ähnliche Proteine sind FK2A, FGK2A oder FK2K2A und haben ein Molekulargewicht von weniger als 90000 Dalton. Solche Proteine haben eine verbesserte Halbwertszeit und Fibrin-Affinität.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten für die neuen Proteine codierende DNA-Sequenzen einmalige Restriktionsstellen in den Zwischendomäne-Regionen von TPA, die sich zu geeigneter Trennung und Neuordnung der Domänen eignen. Beispiele von nicht-nativen Endonuklease-Restriktionsstellen, die in den die Domäne-Regionen codierenden Nukleotidsequenzen nicht vorliegen, sind hinsichtlich der nativen Anordnung folgende: eine XbaI-Stelle zwischen den Nukleotidbasen 187 und 198, eine HpaI- oder SphI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 328 und 342, eine EcoRV-, ClaI- oder SmaI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 442 und 462, eine BamHI- oder HpaI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 709 und 726 und eine MstI-, SphI- oder XmaIII-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 973 und 997.
Vorzugsweise erlauben die Nukleotidsequenzen upstream und downstream der das TPA-ähnliche Protein codierenden Sequenz, daß die DNA in Zellen eines geeigneten Wirts stabil gehalten werden kann. Mehr bevorzugt ist die DNA derart, daß die Zellen das TPA-ähnliche Protein exprimieren können.
Geeignete Wirts-Mikroorganismen, die zur stabilen Aufrechterhaltung der Expressions- und Replikations-Plasmide (Vektoren) und zur Expression des TPA-ähnlichen Proteins geeignet sind, werden hier ebenfalls beschrieben. Beispielsweise umfassen geeignete Wirte für Expressions- und Nicht-Expressionsvektoren, die für TPA-ähnliche Proteine codierende DNA-Sequenzen enthalten, Hefe Escherichia-Spezies, Zellkulturen und Insekten, wie Bombyx mori oder Spodoptera frugiperda. Die bevorzugte Wirtszelle ist eine Ovarienzelle des Chinesischen Hamsters (CHO).

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von molekulargenetischen Manipulationen, die über eine Vielzahl bekannter Wege erreicht werden können. Zwei Prototyp-Gene mit einmaligen Endonuklease-Restriktionsstellen zwischen den TPA-Domänen wurden gemäß des Budapester Vertrages hinterlegt. Die Wirts-Mikroorganismen sind die E. coli Stämme mit den mit pTPA-B1,2,3,4 (a) bzw. pTPA-B1,2,3,4 bezeichneten und in den Diagrammen 10 bzw. 11 beschriebenen Plasmiden. Die Hinterlegung von pTPA-B1,2,3,4 (a) erfolgte am Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA am 29. August 1986 und bekam die Hinterlegungsnummer NRRL B-18106. Die Hinterlegung von pTPA-B1,2,3,4 erfolgte am Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA am 28. November 1986 und bekam die Hinterlegungsnummer NRRL B-18142.
Die hinterlegten Plasmide sind günstige Ausgangsmaterialien. Verschiedene, nachstehend angegebene Verfahren, liegen zur Herstellung der TPA-Analoga aus alternativen Ausgangsmaterialien vor, diesen folgen spezielle Beispiele bevorzugter Verfahren.
Zusammenfassend können die notwendigen genetischen Manipulationen als das Erhalten einer TPA-cDNA, als Synthese von Oligonukleotid-Blöcken, die die codierende Sequenz der verschiedenen TPA-Domänen mit ausgewählten Restriktionsstellen in den Zwischendomäne-Regionen enthalten, als Klonierung und Replikation der Domänen in E. coli und die Expression des gewünschten TPA-Analogons beschrieben werden.

A. Tabellen

Tabelle 1 erläutert die spezifischen Sequenz- und Basennummerierungs-Stellen für synthetische TPA-DNA im Vergleich zu der nativen cDNA. Die nativen Domänen liegen sämtlich in ihrer natürlichen Reihenfolge in Tabelle 1 vor. Tabelle 2 vergleicht die Aminosäuresequenz des nativen TPAs mit jener eines TPA-Analogons, das sämtliche natürliche Domänen in normaler Reihenfolge aufweist (vgl. Diagramm 11). In beiden Tabellen geben die oberen Sequenzen die native Sequenz der Nukleotide bzw. Aminosäuren wieder, während die unteren Sequenzen das modifizierte TPA aufzeigen. Die Tabelle 3 weist die zur synthetischen Erstellung der TPA-Analoga verwendeten Oligonukleotide auf. Tabelle 4 vergleicht das native TPA-Protein mit dem in Diagramm 11 beschriebenen, die native Reihenfolge von TPA-Domänen aufweisenden Analogon, indem die in den Domäne-Regionen enthaltenen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen aufgezeigt werden. Die Zwischendomäne-Regionen sind jene Aminosäuren, die zwischen den in Tabelle 4 (vgl. Definitionen) beschriebenen Domänen liegen. Die in der vorliegenden Anmeldung numerierten Verweise auf Nukleotide oder Aminosäuren beziehen sich auf diese Tabellen.

B. Allgemeine Verfahren

Im allgemeinen können die Nomenklatur und die allgemeinen, in dieser Anmeldung verwendeten Labor-Verfahren aus Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982 entnommen werden. Das Manual wird nachstehend mit Maniatis bezeichnet.
Sämtliche E. coli Stämme werden in "Luria broth" (LB) mit Glucose, Difco's Antibiotic Medium #2 und mit Glucose und Säure-hydrolysierten Casein-Aminosäuren ergänztem M9-Medium kultiviert. Stämme mit Antibiotikaresistenz werden unter den in Maniatis beschriebenen Konzentrationsangaben kultiviert. Transformationen werden nach dem Verfahren von Morrison, D.A., J. of Bact., 132 (1977), 349-351 oder nach dem Verfahren von Clark-Curtiss, J.E. und Curtiss, R. Methods in Enzymology, 101 (1983), 347-362, Herausgeber Wu, R., Grossman, L. und Moldave, K, Academic Press, New York, durchgeführt.
Alle Enzyme wurden gemäß der Hersteller-Information verwendet. Colony-Hybridisierung wurde wie allgemein durch Grunstein, M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 72, Band 72 (1975), 3961-3965 beschrieben, durchgeführt, jedoch zur Bereitstellung des folgenden Verfahrens modifiziert: Nitrocellulosefilter wurden gemacht, die Kolonien der vorstehend hergestellten Zellen enthalten. Die Filter werden dann mit der Kolonieseite nach oben auf ein Bett von Whatman 3 MM Papier der Dicke 3-8 gelegt, das in eine denaturierenden 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH Lösung getaucht ist. Das
Denaturierungsmittel darf 1,5 bis 2 Minuten aufwärts in die Kolonien diffundieren, danach werden die Filter 1-3 Minuten auf ein zweites Bett von 3 MM Papieren gegeben, das in eine neutralisierende, 0,5 M Tris HCl, pH 7,4, 2 · SSC (1 · SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,1) und 25 mM EDTA enthaltende Lösung getaucht ist. Die Filter werden dann gründlich Luft-getrocknet und unter Vakuum 2-4 Stunden bei 80ºC eingebacken.
Zur Hybridisierung mit Oligonukleotidproben werden Bedingungen verwendet, wie vorstehend durch Geoddel, D.V. et al,. Nature, Band 290, (1981) 20-26 beschrieben.
Nach der Hybridisierung wird die Probe enthaltende Lösung entfernt und aufbewahrt und die Filter werden in 0,1% SDS, 0,2 · SSC insgesamt 3 Stunden mit 5-maligem Wechsel von jeweils 400 ml gewaschen. Die Filter werden gründlich luft-getrocknet, gezählt und einer Autoradiographie unterworfen, indem ein Kodak X-OMAT AR® Film und Dupont Cronex Lightning Plus®-Verstärkerfolien 16 Stunden bei -70ºC verwendet werden.
Zur Sequenzierung von Plasmiden werden Minipräparationen von Plasmid-DNA nach dem Verfahren von Holmes., D.S. et al., Analyt. Biochem., Band 114 (1981), 193 durchgeführt. Eine Dideoxy-Sequenzierung wird gemäß dem Verfahren von Sanger, F. et al., "Cloning in single stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing", J. Mol. Biol. 143 (1977), 161-178 durchgeführt. Die Dideoxy-enthaltenden Reaktionsgemische werden durch 2-minütiges Erhitzen auf 90ºC und Abkühlen auf Eis zur Elektrophorese vorbereitet. 2 bis 3 ul pro Spur werden auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Sequenzierungsgel gegeben, das nach dem Verfahren von Sanger und Coulson "The use of thin acrylamid gels for DNA sequencing", FEBS Lett. 87 (1978) 107-110 hergestellt worden ist, und nach dem gleichen Verfahren laufengelassen. Die Gele werden bei Raumtemperatur 2-4 Tage exponiert und die Filme (Kodak XAR-5®) gemäß den Hersteller-Empfehlungen entwickelt.
Nukleotidgrößen werden entweder in Kilobasen (kb) oder Basenpaaren (bp) angegeben. Diese sind von einer Agarose-Gelelektrophorese erhaltene Schätzungen.

C. TPA cDNA

TPA cDNA war eine geeignete Quelle für den Teil der Nukleinsäuresequenz mit der aktiven Stelle. Deshalb war es nicht notwendig, die aktive Stelle chemisch zu synthetisieren. cDNA ist von einer Vielzahl von Quellen erhältlich. Es wurde berichtet, daß Teile der TPA cDNA von mRNA präpariert worden ist, die aus große TPA-Mengen produzierenden Zellkulturen, insbesondere von Bowes- Melanomzellen isoliert worden war (vgl. Edlund et al., "Isolation of cDNA Sequences doding for a Part of Human Tissue Plasminogen Activator", Band 80 (Januar 1983), 349-352; Gronow et al., "Production of Human Plasminogen Activators by Cell Culture", Trends in Biotechnology, Band 1, Nummer 1 (1983) 26-29; Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Aktivator cDNA in E. coli" Nature, Band 301 (20. Januar 1983) 214-221.
Genentech. Inc. reichte speziell am 4. Mai 1983 die europäische Patentanmeldung Nr. 0093619 ein, die sich auf die Prioritätsanmeldungen mit den US-Seriennummern 374860, 398003 und 483052 und den entsprechenden Anmeldedaten vom 5. Mai 1982, 14. Juli 1982 und 7. April 1983 stützte und nachstehend als Genenetech-Anmeldung bezeichnet wird. Die Genentech-Anmeldung beschreibt den E. coli-Stamm K12-294 mit der ATCC Nummer 31446, der ein transformierter Stamm mit einer rekombinanten, TPA-codierenden DNA ist. Zusätzlich wird in der Genentech-Anmeldung der mit einer rDNA transformierte E. coli-Stamm K12-W3110 mit der ATCC Nummer 27325 beschrieben, von dem TPA-Extrakte für einen Test auf fibrinolytische Aktivität präpariert werden. Somit umfaßt die Offenbarung eine hierin verwendbare rekombinante DNA. Ähnlich liefert die Offenbarung der Genenetech-Anmeldung DHFR&spplus; CHO-KI (ATCC CL 61) Zellen, die zur Amplifizierung und Expression von TPA transformiert worden sind. Somit beschreibt die Hinterlegung ATCC CL 61 wiederum rekombinante DNA-Nukleotide, die für hier verwendbares TPA codieren.
Die vorliegende Offenbarung der Präparation 2 liefert einem Fachmann ein von mehreren im Stand der Technik bekannten Isolierungsverfahren, die für Bowes-Melanomzellen zum Erhalt der rekombinanten, TPA-codierenden DNA anwendbar sind. Die Bowes-Melanomzellen sind allgemein erhältlich.

D. Synthetisierung der TPA-Domänen

Wie vorstehend angegeben, wurden Teile der DNA-Sequenzen des TPA-Analogons von einer cDNA präpariert; die meisten Sequenzen und sogar die gesamte Sequenz könnte jedoch auch synthetisch hergestellt werden. Kosten und Angemessenheit sind die Kontroll-Parameter, in der Entscheidung, wie eine Sequenz eines bestimmten TPA-Analogons hergestellt werden soll. Durch die Auswahl von in den TPA-Domänen des gewünschten Analogons nicht gefundenen Restriktionsstellen und durch Insertion dieser Restriktionsstellen in die Zwischen-Domäneregionen des TPA vermeidet man die Spaltung eines gewünschten Teils der TPA DNA-Sequenz und ermöglicht die leichte Entfernung und Insertion einer jeden einzelnen Domäne.
Durch chemische Synthese eines Teils des TPA-Gens kann man durch ein Base bei Base-Verfahren entscheiden, welche Nukleotide verwendet werden müssen. Die folgenden Vorteile ergeben sich aus diesem Verfahren: (1) die Minimierung einer Sekundärstruktur in dem Transkriptionsprodukt, (2) die Minimierung zu sich selbst komplementären AC-GC Regionen und (3) das Setzen einmaliger Restriktionsstellen an gewünschten Orten entlang der cDNA-Sequenz.
Oligonukleotide werden chemisch nachdem zuerst durch Beaucage, S.L. und Caruthers, M.H. Tetrahydron Letts. 22(20), (1981) 1859-1862 beschriebenen Festphasen-Phosphoramidit-Triesther-Verfahren synthetisiert, indem ein automatisches Synthesegerät, wie in Needham-VanDevanter, D.R. et al., Nucleic Acids Res., 12 (1984), 6159-6168 beschrieben, verwendet wird. Die Reinigung von Oligonukleotiden wurde entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustauscher HPLC, wie in Pearson, J.D. und Regnier, F.E., J.Chrom., 255 (1983), 137-149 beschrieben, durchgeführt.
Oligodesoxynukleotide werden chemisch in Längen von weniger als 40 Nukleotiden synthetisiert. Jedes Fragment wird so entworfen, daß es zu seinem komplementären Strang komplementär ist, und jedes doppelsträngige Segment enthält überhängende Enden zur Optimierung der Legierung. Die folgenden Kriterien werden in der Teilung der DNA für die Synthese der Fragmente berücksichtigt: (1) die Länge der Oligonukleotid-Fragmente sollte weniger als 40 Basen für eine leichte chemische Synthese und Reinigung sein. (2) Ein Minimum von 6 "überhängenden" Basen von den komplementären "Deck-" und "Grund-" Oligonukleotid-Fragmenten scheint eine optimale Ausrichtung und Legierung der Segmente zu erlauben. Regionen von 4 oder mehr Basen, die sich entweder mit der primären oder der komplementären Sequenz verbinden können, sollten vermieden werden
Die Sequenz der synthetischen Oligonukleotide kann unter Verwendung des chemischen Sequenzierungsverfahrens von Maxam, A. M und Gilbert, W., Grossman, L. und Moldave, D., Herausgeber Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65 (1980), 499-560 nachgewiesen werden. Andererseits kann die Sequenz nach der Assemblierung der Oligonukleotid-Fragmente zu der doppelsträngigen DNA-Sequenz bestätigt werden, indem das vorstehend genannte Verfahren von Maxam und Gilbert oder das Kettenabbruchverfahren zur Sequenzierung doppelsträngiger Templates verwendet wird vgl. Wallace, R. B., et al., Gene, 16 (1981), 21-26.
87 getrennte Oligonukleotide (Tabelle 3) wurden synthetisiert. Nach der spezifischen, hier beschriebenen Assemblierungsstrategie wurden die ersten 1099 Basenpaare synthetisiert, die für den 5-Teil des TPA-Analogons mit den ausgewählten, in Diagramm (11) gezeigten Restriktionsstellen codieren. Dieses synthetische Oligonukleotid wird dann über die EcoRI-Stelle an der Position 1287 an den 3'-Teil der die aktive Stelle enthaltenden TPA cDNA gebunden.
Zur Assemblierung der Oligonukleotid-Fragmente zu der doppelsträngigen DNA kann man alle 87 Fragmente für die Annealing- und Legierungsreaktion zusammenmischen. Für eine wirksamere Legierung ist es besser, die Oligonukleotide in vier Blöcke zu teilen. Nach Legierung und Reinigung eines jeden Blockes können die vier Blöcke dann einer Annealing- und Legierungsreaktion unterzogen werden, wodurch das Endprodukt erhalten wird. Die Reinigung der assemblierten Blöcke und des Endprodukts kann durch eine Acrylamid-Gelelektrophorese, wie in Maniatis beschrieben, durchgeführt werden. Zur Durchführung der Annealing- und Legierungs-Reaktion können ebenfalls die allgemeinen in Maniatis beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Es kann nötig sein, ein Initiationscodon für die synthetischen TPA-Gene bereitzustellen. Hinsichtlich des E. coli-Systems ist das für F-met codierende Initiationscodon ATG notwendig. Das Initiationscodon kann in das synthetische Gen eingebracht werden oder durch das gewünschte Expressionsplasmid bereitgestellt werden. Zusätzlich zu einem Initiationscodon ist es für E. coli günstig, eine Sequenz in das synthetische Gen von TPA einzubringen, die den passenden Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Region und dem Initiationscodon liefert.
Eine geeignete Auswahl der Sequenz wird das Auftreten einer die Transkription und Translation beeinflussenden Sekundärstruktur minimieren, eine maximale Codonverwendung umfassen (vgl. Grosjean H. und Fiers, W., Gene, 18 (1982), 199-209) und die statistischen, in der Sequenz um die ribosomale Bindungsstelle gefundenen Basen berücksichtigen (vgl. Cold, L. et al., Ann. Rev. Microbiol., 35 (1981) 365-403). Die spezifische Sequenz für die vorliegende Erfindung wird hier durch ihre aktuelle Sequenz beschrieben. Es versteht sich jedoch von selbst, daß alternative Sequenzen zur Optimierung von TPA-Analoga in verschiedenen Wirtszellen verwendet werden können.

E. Klonierung der cDNA und von synthetischen Teilen des TPA-Gens

Verfahren, die zur Klonierung der cDNA und der synthetischen Teile von TPA zur Replikation der rekombinanten, für Teile von TPA codierenden Fragmente verwendet werden, sind im Stand der Technik bekannt. Maniatis enthält Verfahren, die zur Durchführung aller nachfolgend beschriebenen Klonierungen ausreichend sind. Alle Klonierungen wurden in transformierten E. coli durchgeführt, wobei ein gut charakterisierter, verwendbarer Stamm herangezogen wurde. Der Stamm HB101 ist bevorzugt, wenn nichts anderes angegeben ist. Klonierungsvektoren, die zur Transformation von E. coli geeignet sind, umschließen pBR322 und pKC7.

F. Insertion von einmaligen Restriktionsstellen in die TPA codierende DNA

Die spezifischen, für die Zwischen-Domäne-Regionen von TPA ausgewählten Restriktionsstellen sind in den Diagrammen 10 und 11 angegeben. Dies sind nicht die einzigen Restriktionsstellen, die erfindungsgemäß verwendet werden können. Restriktionsstellen werden auf der Basis ihres einmaligen Vorkommens in der TPA cDNA ausgewählt. Stellen sind bevorzugt, die zu minimalen Aminosäure-Austauschen in den Zwischen-Domäne-Regionen führen, und jene sind besonders bevorzugt, die zu keinen Aminosäure-Austauschen führen (vgl. Tabelle 1 und 2). Mehrfachstellen mit unterschiedlichem Leserahmen innerhalb einer Zwischen-Domäne sind hilfreich, zu sichern, daß die Domänen nach Legierung mit anderen Domänen zu Expressionszwecken in Phase vorliegen. Doppelte Restriktionsstellen können durch einfache Spaltung der Stelle und Legierung nach Herstellung von stumpfen Enden eliminiert werden. Die Einführung einer einmaligen Stelle kann durch chemische Synthese, allgemein erhältliche Linker oder durch Punktmutation erzielt werden.
Die native TPA cDNA enthält keine Stellen, die durch die folgenden Endonuklease-Restriktionsenzyme erkannte werden, zusätzlich zu jenen Stellen, die in die 2 Prototyp-cDNAs von TPA, wie in den Diagrammen 10 und 11 gezeigt, eingebaut worden sind:

G. Expression von TPA-Analoga in E. coli

Zur Erzielung hoher Expressionsmengen eines klonierten Gens (z. B. des modifizierten TPA-Gens), in einem prokaryotischen System, ist es wesentlich, Expressionsvektoren zu konstruieren, die mindestens-einen starken Promotor für die mRNA Transkription, eine ribosomale Bindungsstelle für die Translationsinititation und einen Transkriptions-Terminator enthalten. Da die Akkumulation großer Mengen eines Genprodukts oft das Zellwachstum inhibieren und manchmal den Zelltod bedingen, muß der zur Steuerung der Synthese des Produkts ausgewählte Promotor derart regulierbar sein, daß Zellwachstum bis zu einer hohen Dichte möglich ist, bevor der Promotor induziert wird. Beispiele regulatorischer, zu diesem Zweck verwendbarer Regionen sind die Promotor- und Operatorregion des E. coli Tryptophan-Biosynthesewegs, wie durch Yanofski, C., Kelley, R. L. und Horn, V., J. Bakteriol., 158 (1984) 1018-1024 beschrieben, und der linke Promotor des Phagen Lambda (PL), wie durch Herskowitz, I. und Hagen, D., Annu. Rev. Genet., 14 (1980), 399-445 beschrieben. Das in E. coli-produzierte TPA weist keine geeignete Faltung aufgrund der großen Menge an Cysteinresten auf. Das E. coli-produzierte TPA muß zunächst denaturiert und dann renaturiert werden. Dies kann durch Lösung des E.
coli-produzierten TPAs in Guanidin-HCl und anschließender Reduktion sämtlicher Cystein-Reste mit β-Mercaptoethanol erfolgen. Das Protein wird dann entweder durch langsame Dialyse oder durch Gelfiltration renaturiert, vgl. US-Patent Nr. 4511503.

H. Expression von TPA-Analoga in Hefe

Die Expression von heterologen Proteinen in Hefe ist bekannt. Methods in Yeast Genetics, Sherman, F. et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ist eine anerkannte Arbeit, die die verschiedenen zur Produktion von TPA-Analoga in Hefe geeigneten Verfahren beschreibt.
Zur Erzielung einer hohen Expressionsmenge eines Gens in Hefe ist es wesentlich, das Gen an ein starkes Promotorsystem wie bei Prokaryoten zu binden, und ebenfalls wirksame Transkriptions-Terminations/Polyadenylierungssequenzen von einem Hefe-Gen bereitzustellen. Beispiele geeigneter Promotoren umfassen GAL1,10 (vgl. Johnston, M. und Davis, R. W., Mol. und Cell. Biol. 4 (1984), 1440-1448) ADH2 (vgl. Russell, D. et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 2674-2682), PHO5 (EMBOJ.6 (1982), 675-680) und MF 1. Ein Plasmid in hoher Kopienzahl mit einem Selektionsmarker, wie Ura-3, Tryp-1 und His-3, ist ebenfalls wünschenswert.
Werden Zellen auf Glucose kultiviert, werden die Promotoren GAL und ADH2 reprimiert, wodurch die Zellen zu einer hohen Dichte heranwachsen können. Während der GAL-Promotor durch Überführung der Zellen in ein Galaktose-Medium angeschalten werden kann, wird ADH2 angeschalten, nachdem die gesamte Glucose von den Zellen aufgebraucht worden ist. Der PHO5-Promotor kann angeschalten oder abgeschalten werden, indem die Phosphat-Konzentration in dem Medium manipuliert wird. Der MFα1-Promotor in einem Wirt des α-Vermehrungstyps ist die gesamte Zeit über angeschalten, nicht jedoch in diploiden Zellen oder Zellen des α-Vermehrungstyps. Er kann jedoch reguliert werden, indem die Temperatur in Wirten, die eine ts-Mutation in einem der SIR-Locci haben, erhöht oder erniedrigt wird. Der Effekt einer solchen Mutation bei 35ºC in einer Zelle des α-Typs führt dazu, daß das normalerweise abgeschaltete, für einen α-Vermehrungstyp codierende Gen angeschaltet wird. Die Erniedrigung der Wachstumstemperatur auf 27ºC kehrt den ganzen Prozeß um und schaltet den α-Vermehrungstyp ab und den MFα1-Promotor an (vgl. Herskowitz, I. und Oshima, Y. (1982) "The molecular biology of the yeast saccharomyces" (Herausgeber: Strathern, J. N., Jones, W. E. und Broach, J. R., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209).
Die Polyadenylierungssequenzen werden durch die 3'-Endsequenzen eines der hochexprimierten Gene, wie ADH1, MFα1 oder TPI bereitgestellt (vgl. Alber, T. und Kawasaki, G., J. of Mol. & Appl. Genet. 1 (1982), 419-434).
Eine Zahl von Hefe-Expressionsplasmiden, wie YEp6, YEp13 und YEp24, können als Vektoren verwendet werden. Ein interessantes Gen, wie TPA, kann mit jedem der vorstehend genannten Promotoren fusioniert werden und dann in Plasmide zur Expression in verschiedenen Hefe-Wirten inseriert werden. Die vorstehend angesprochenen Plasmide wurden vollständig in der Literatur beschrieben (vgl. Botstein, et al., Gene, 8 (1979), 17-24; Broach, et al., Gene, 8 (1979), 121-133).
Obwohl die vorstehend beschriebenen Plasmide verwendet werden können und zur Expression fremder Gene in Hefe verwendet wurden, werden hier Vektoren beschrieben, die eine bemerkenswerte Flexibilität hinsichtlich der Insertion und/oder Excision von verschiedenen Komponenten der Expressionsvektoren erlauben. Eines dieser Beispiele ist der in Diagramm 18 gezeigt Vektor pα1-ADHt.
Zwei Verfahren werden zur Transformation von Hefezellen verwendet. In einem Fall werden Hefezellen zunächst unter Verwendung von Zymolyase, Lyticase oder Glusulase in Protoplasten überführt, anschließend werden DNA und Polyethylenglykol (PEG) zugegeben. Die PEG-behandelten Protoplasten werden dann in einem 3%-Agarmedium unter selektiven Bedingungen regeneriert. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in den Arbeiten von Beggs, J. D., Nature (London) 275 (1978), 104-109 und Hinnen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929-1933 gegeben. Das zweite Verfahren umfaßt nicht die Entfernung der Zellwand. Statt dessen werden die Zellen mit Lithiumchlorid oder Acetat und PEG behandelt und auf Selektionsplatten gebracht (vgl. Ito, H. et al., J. Bact., 153 (1983), 163-168).
TPA-Analoga können isoliert werden, indem die Zellen lysiert und die Lysate Standardprotein-Isolierungstechniken unterzogen werden. TPA-Analoga können unter Verwendung von Western-Blot-Techniken oder Radioimmunotests nachgewiesen werden.

I. Expression in Zellkulturen

Die TPA-Analogon codierende DNA kann in verschiedene Expressionsvektoren zur Transformation von Wirts-Zellkulturen inseriert werden. Sämtliche Vektoren enthalten Gen-Sequenzen zur Initiation der Transkription und Translation der TPA-Analoga, welche mit der zu transformierenden Wirtszelle kompatibel sind. Ist die Wirtszelle eine höhere tierische Zelle, z. B. eine Säugetierzelle, kann die natürlich vorliegende Transkriptions- und Translationsgen-Sequenz des TPA-Gens verwendet werden oder die natürlich vorliegende Gen-Sequenz kann zusammen mit einer heterologen Promotor-Sequenz eingesetzt werden. Zusätzlich enthalten die Vektoren vorzugsweise einen Marker, um eine phänotypische Ausbildung zur Selektion der transformierten Wirtszelle bereitzustellen. Weiterhin kann ein Replikationsvektor ein Replikon enthalten.
Beispiele von Zellkulturen, die sich zur Produktion von TPA-Analoga eignen, sind Zellen von Insekten oder Säugetieren. Säugetier-Zellsysteme liegen oft in Form von Zell-Monolayern vor, obwohl Suspensionen von Säugetierzellen auch verwendet werden können. Beispiele von Säugetierzellinien umfassen VERO und HeLa Zellen, Ovarien-Zellinien von Chinesischem Hamster (CHO), WI38, BHK, COS-7 oder MDCK-Zellinien. Insektenzellinien umfassen beispielsweise Spodoptera frugiperda (Fall-Heerwurm) und Bombyx mori (Seidenwurm).
Wie vorstehend ausgeführt, enthält der Vektor z. B. ein Plasmid, das zur Transformation der Wirtszelle verwendet wird, vorzugsweise Gen-Sequenzen zur Initiation der Transkription und Translation der TPA-Gen-Sequenz. Diese Sequenzen werden als Expressions-Kontrollsequenzen bezeichnet. Ist die Wirtszelle eine Insekten- oder Säugetierzelle, werden geeignete Expressions-Kontrollsequenzen z. B. von dem SV40-Promotor (vgl. Science, 222 (1983), 524-527), dem CMV IE-Promotor (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 659-663) oder dem Metallothionein Promotor (vgl. Nature, 296 (1982), 39-42) erhalten. Wie vorstehend ausgeführt, kann man, wenn die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, die Expressions-Kontrollsequenzen für das TPA-Gen verwenden, bevorzugt ist es jedoch, das TPA-Analogon mit einer heterologen Transkriptions-Initiationsstelle zu kombinieren. Das Plasmid oder das replizierende oder integrierende DNA-Material, das die Expressions-Kontrollsequenzen enthält, wird mit Restriktionsenzymen gespalten und auf eine notwendige oder wünschenswerte Größe eingestellt und mit der für TPA-Analoga codierenden cDNA in üblicher Weise ligiert.
Wie bei Hefe müssen auch bei Verwendung höherer tierischer Wirtszellen Polyadenylierungs- oder Terminationssequenzen von bekannten Säugetier-Genen in den Vektor eingebaut werden. Ein Beispiel einer Terminationssequenz ist die Polyadenylierungssequenz von dem Rinder-Wachstumshormon-Gen.
Zusätzlich können zur Replikationskontrolle in der Wirtszelle Gen-Sequenzen in den Vektor eingebaut werden, wie jene, die in Vektoren vom Rinder-Papilloma-Virus-Typ gefunden werden. (vgl. Saveria-Campo, M., "Bovine papilloma virus DNA: a eukaryotic cloning vektor", DNA Cloning, Band II, Praktische Einführung, Herausgeber, Glover, D. M., IRL Press, Arlington, Virginia (1985), 213-238).
Die Wirtszellen sind kompetent oder werden zur Transformation mittels verschiedener Verfahren kompetent gemacht. Es gibt mehrere, bekannte Verfahren zur Einführung von DNA in tierische Zellen. Diese umfassen: Calciumphosphat-Präzipitation, Fusion der Empfängerzellen mit die DNA enthaltenden bakteriellen Protoplasten, Behandlung der Empfängerzellen mit die DNA enthaltenden Liposomen und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen.
Die transformierten Zellen werden nach bekannten Verfahren kulitiviert (vgl. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R. J., Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977)), und die exprimierten TPA-Analoga werden von dem Zellmedium in jenen Systemen, wo das Protein von der Wirtszelle sekretiert wird, oder von der Zellsuspension nach dem Aufbrechen des Wirtszell-Systems durch z. B. bekannte mechanische oder enzymatische Mittel, geerntet.

J. Bewertung der TPA-Analoga

TPA und seine Analoga können auf zwei Wegen bewertet werden. Die relative Fähigkeit zur Spaltung von Plasminogen in Plasmin oder die relative Fähigkeit von Inhibitoren zur Produktionsverminderung von Plasmin können bewertet werden. Die folgenden Details beschreiben das Vorgehen für beide Bewertungen.
Amidolytischer Test: Die funktionelle Aktivität der TPA-Analoga wird bestimmt, indem der gekoppelte durch Verhe&ijlig;en, J. H. et al., beschriebene amidolytische Test verwendet wird, der ein einfacher, sensitiver, für Messungen in Plasma geeigneter, spektrophotometrischer Test auf äußeren (Gewebetyp) Plasminogenaktivator ist. (vgl. Thromb. Haemostas., 48, (1982), 266-269). Im Kurzen werden Proben, die die TPA-Analoga enthalten, mit Plasminogen und CNBr-verdauten Fibrinogen-Fragmenten gemischt. Das so gebildete Plasmin spaltet dann ein von außen zugegebenes chromogenes Substrat, 5-2251 (H-D-Valyl-L-Leucyl-L-Lysin-p- Nitroaniliddihydrochlorid; KABI, Stockholm, Schweden), wodurch ein farbiges Produkt erhalten wird, das spektrophotometrisch gemessen wird. Die Wirkung von Protease-Inhibitoren auf die Aktivität der TPA-Analoga wird bestimmt, indem eine Modifikation dieses durch Verhe&ijlig;en, J. H., et al., "Evidence for the occurence of a fast-acting inhibitor for tissue-type plasminogen activator in human plasma", Thromb. Haemostas., 51 (1984), 392-395 beschriebenen Tests verwendet wird. Der hinzugegebene Inhibitor bindet an das TPA, wodurch ein irreversibler Komplex entsteht und das TPA von der Aktivierung von Plasminogen abgehalten wird. Beispielsweise wird ein gereinigtes, natives TPA mit zunehmenden Mengen einer einen Inhibitor-enthaltenden Probe inhibiert und die restliche TPA-Aktivität wird, wie oben angegeben, gemessen. Eine Standardkurve wird dann entwickelt, in dem die restliche TPA-Aktivität als Funktion der Menge der hinzugegebenen, Inhibitor-enthaltenden Probe graphisch festgehalten wird. Auf diese Weise werden die TPA-Analoga mit dem Inhibitor titriert. Die erhaltenen Kurven werden mit jener des TPA-Standards verglichen. Der Gehalt an Ähnlichkeit zwischen den Kurven gibt direkt die Inhibitions-Empfänglichkeit des einzelnen Analogons wieder.
Fibrin-Autographie: Die Molekulargewichte der TPA-Analoga werden abgeschätzt, indem die die Analoga enthaltenden Proben einer Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen werden und dann das Acrylamid-Gel auf einen Plasminogen-enthaltenden Fibrin-Indikatorfilm gelegt wird. Da die Analoga-Proteine von dem Acrylamid-Gel in den Indikatorfilm diffundieren, wandeln sie das Plasminogen in Plasmin um, wodurch eine klare Fibrinolyse-Zone in dem ansonsten trüben Fibrin-Indikator ausgebildet wird. Das Auftreten dieser Zonen weist auf das Vorliegen eines aktiven TPA-Analogons an einer entsprechenden Stelle in dem Acrylamid-Gel hin. Diese Technik wird auch zur Messung der Wechselwirkung zwischen TPA-Analoga und Protease-Inhibitoren verwendet. Wie vorstehend angesprochen, führt diese Wechselwirkung zur Bildung eines Enzym-Inhibitor-Komplexes, der ein höheres Molekulargewicht als das Analogon selbst hat. Nach einer SDS-PAGE zeigt der Komplex eine restliche TPA-Aktivität, die in dem Fibrin-Indikatorfilm sichtbar gemacht werden kann. Die Einzelheiten dieser Technik wurden ursprünglich durch Granelli-Piperno, A. und Reich, E. "A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids", J. Exp. Med., 148 (1978), 223-234, beschrieben.

Bestimmung des Antigens von TPA-Analoga

Sandwich-ELISA (S-ELISA): Das Antigen der TPA-Analoga wird immunologisch durch zwei verschiedene S-ELISAs bestimmt. Der erste verwendet polyklonale Ziegen-Antikörper, die für humanes Uterus-TPA spezifisch sind. Der zweite verwendet einen monoklonalen Maus-Antikörper. Dieser monoklonale Antikörper ist spezifisch gegen ein Epitop gerichtet, das für die Aktivität von TPA benötigt wird. Die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für die Domäne mit der aktiven Stelle von TPA ist, stellt einen wirksamen Weg zur Bestimmung des Antigens eines TPA-Analogons dar, dessen Primärstruktur in einer Domäne anders als der aktiven Stelle verändert worden ist. Dieser Test ist ähnlich zu jenem, der von Korninger, C., et al., "Sandwich-ELISA for TPA antigen empolying a monoclonal antibody", Thromb. Res., 41 (1986), 527-535 beschrieben worden ist. Die Sensitivitätsgrenze für beide Tests liegt bei etwa 1 ng TPA pro ml.
Western-Immunblot-Technik: Die Fähigkeit der TPA-Analoga zur Komplexbildung mit Inhibitoren kann auch bestimmt werden, indem SDS-Page und Western-Immunblot-Techniken verwendet werden, wie ursprünglich durch Towbin, H., et al., "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets": Verfahren und Anwendungen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-4354 beschrieben. Im Kurzen werden das TPA-Analogon mit dem Inhibitor zusammengebracht, das Gemisch einer SDS-PAGE unterzogen und die Proteine elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Papier übertragen. Nicht-komplexiertes, freies TPA und TPA im Komplex mit dem Inhibitor werden nachgewiesen, indem gereinigtes, für TPA spezifisches, polyklonales Ziegen-IgG gerichtetes und ein gegen das Ziegen IgG Kaninchen-Antiserum verwendet werden. Die TPA-enthaltenden Komplexe werden dann sichtbar gemacht, indem I¹²&sup5;-markiertes Protein A verwendet und eine Autoradiographie durchgeführt werden.

Definitionen

Der Ausdruck "Zellkultur" betrifft das Kultivieren von Zellen, die von einer vielzelligen Pflanze oder einem vielzelligen Tier stammen, wobei das Kultivieren den Zellen erlaubt, ihre Lebensfähigkeit außerhalb der ursprünglichen Pflanze oder des ursprünglichen Tieres beizubehalten.
Der Ausdruck "Domäne" betrifft einen einzelnen, zusammenhängenden Teil einer Aminosäuresequenz, der einer speziellen Funktion zugeordnet werden kann. Bezüglich TPA haben die vorstehend genannten Literaturstellen die Domäne-Regionen definiert und Tabelle 4 offenbart hier die ungefähre Lage der Mittelpunkte der Zwischendomäne-Regionen, die zwischen den Domänen liegen.
Der Ausdruck "downstream" identifiziert Sequenzen, die weiter in Richtung der Expression liegen; z. B. die codierende Region liegt downstream des Initiationscodons.
Der Ausdruck "Zwischen-Domäne" betrifft die Regionen einer Protein-Aminosäuresequenz, die zwischen den Domänen liegen. In dieser Anmeldung sind die Zwischen-Domäne-Regionen mehr oder weniger 5 Aminosäurereste von den in Tabelle 4 angegebenen Mittelpunkten entfernt. Somit liegt die Zwischendomäne-Region der Finger- und der Wachstumsfaktor-Domäne zwischen den Aminosäuren 44-55 und umfaßt sie auch, die Zwischen-Domäne zwischen der Wachstumsfaktor- und der Kringel 1-Domäne zwischen den Aminosäuren 86-97 und umfaßt sie auch, die Zwischen-Domäne zwischen der Kringel 1-Domäne und der Kringel 2-Domäne zwischen den Aminosäuren 169-189 und umfaßt sie auch und die Zwischen-Domäne zwischen der Kringel 2-Domäne und der Domäne mit der aktiven Stelle zwischen den Aminosäuren 257-268 und umfaßt sie auch.
Der Ausdruck "stabil gehalten" betrifft das stabile Vorliegen eines Plasmids in einem transformierten Wirt, in dem das Plasmid als autonom-replizierender Körper oder als integrierter Teil des Wirtsgenom vorliegt.
Der Ausdruck "Mikroorganismus" umfaßt einzellige prokaryotische und eukaryotische Organismen, wie Bakterien, Actinomyceten und Hefe.
Der Ausdruck "nicht-native Endonuklease-Restriktionsstellen" betrifft Endonuklease-Restriktionsstellen, die an der entsprechenden Stelle der nativen cDNA Sequenz nicht gefunden werden. Diese umfassen einmalige und nicht-einmalige Stellen.
Der Ausdruck "Operon" ist eine vollständige Einheit der Genexpression und -regulation die Strukturgene und Regulatorgene umfaßt, und der Kontrollregulation, die Strukturgene und Regulatorgene umfaßt, und der Kontrollelemente in der DNA, die durch das Regulator-Genprodukt erkannt werden.
Der Ausdruck "Plasmid" betrifft eine autonome, selbst-replizierende extrachromosomale DNA und umfaßt Expressions- und Nicht-Expressions-Typen. Wird ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine Zellkultur als Wirt beschrieben, der ein Expressionsplasmid enthält, umfaßt der Ausdruck "Expressionsplasmid" extrachromosomale, zirkuläre DNA und DNA, die in das Wirtschromosom, bzw. in die Wirtschromosomen eingebaut ist.
Der Ausdruck "Promotor" ist eine Region der DNA, die in der Bindung der RNA-Polymerase zur Initiation der Transkription involviert ist.
Der Ausdruck "DNA-Sequenz" betrifft ein einzel- oder doppelsträngiges DNA-Molekül, das die Nukleotidbasen Adenosin, Thymidin, Cytosin und Guanosin umfaßt.
Der Ausdruck "geeigneter Wirt" betrifft eine Zellkultur oder einen Mikroorganismus, der für ein rekombinantes Plasmid empfänglich ist und die Replikation des in sein Genom einzubauenden oder zu exprimierenden Plasmids erlaubt.
Der Ausdruck "upstream" identifiziert Sequenzen, die in der entgegengesetzten Richtung der Expression verlaufen, z. B. ist der bakterielle Promotor upstream von der Transkriptionseinheit und das Initiationscodon upstream von der codierenden Region.
Ausdrucksformen, die in den Diagrammen 1-27 zur Darstellung von Plasmiden und Fragmenten verwendet werden, sind, obwohl sie für diese Anmeldung einmalig sind, als Synonyme zu den üblichen Darstellungsformen von Plasmiden und ihren Fragmenten zu verstehen. Anders als die übliche zirkulären Figuren bedeuten die EinzelLinien-Figuren in den Diagrammen zirkuläre und lineare doppelsträngige DNA mit von links nach rechts (5' → 3') auftretender Initiation oder Transkription. Sternchen (*) weisen auf Nukleotidbrücken zur Vervollständigung der zirkulären Form der Plasmide hin. Fragmente weisen keine Sternchen-Markierungen auf, da sie lineare Stücke doppelsträngiger DNA sind.
Endonuklease-Restricktionsstellen sind oberhalb der Linie angegeben. Gen-Marker sind unterhalb der Linie angegeben. Striche, die unterhalb der das Plasmid oder die Fragmente angebenden Diagramme vorliegen, werden zur Angabe der Zahl der Basenpaare zwischen zwei Punkten auf der DNA verwendet. Der relative Platz zwischen Markern gibt nicht den wirklichen Abstand wieder, sondern ist nur als Hinweis auf ihre relativen Positionen auf der gezeigten DNA-Sequenz zu verstehen.

Präparationen

Präparation 1: Vektor pSK4 (Diagramme 1-3)

Plasmid pSK4 ist ein Expressionsvektor, der zur Expression heterologer Proteine in E. coli fähig ist. Er hat einen starken, regulierbaren Promotor für die Transkription und eine starke ribosomale Bindungsstelle für die Translations-Initiation. Speziell verwendet pSK4 den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle (RBS) des Tryptophan (trp) Operons. Eine einmalige ClaI-Stelle unmittelbar downstream der RBS ist für die Insertion gewünschter Gene, wie TPA, verfügbar (Diagramm 3).
Zur Herstellung von pSK4 ist es notwendig, das neue pTRZ1 (Diagramm 1) mit dem bekannten pKC7 (Diagramm 2) zu rekombinieren (vgl. Rao, R. N. und Rogers, S. G., Gene, 7 (1979), 79-82). Plasmid pTRZ1 enthält einen Teil des Tryp-Operons, der die Promoter/Operator-Region, die ribosomale Bindungsstelle und die trpLE-Fusion ΔLE1413 wie auch die Strukturgene für die Galactosidase (lacz) und die Lactose-Permease (lacY) enthält. Plasmid pKC7 ist ein Derivat von pBR322 und weist die Resistenzen Ampicillin und Kanamycin sowie viele Restriktions-Endonukleasestellen auf.
Das rekombinante Plasmid von pTRZ1 und pKC7 ist pSK3, das den tryp-Promotor, RBS und LE innerhalb pKC7 enthält. Plasmid pSK3 wird dann zur Eliminierung der Fusionspeptid-Sequenz tryp-Le modifiziert, wobei der allgemeine Expressionsvektor pSK4 erhalten wird.

(1) Konstruktion von pTRZ1 (Diagramm 1)

Plasmid pTRZ1 ist ein Klon der bekannten Plasmide pMC1403 und pVV1. Plasmid pMC1403 liefert das lacZ-Gen von pTRZ1 minus der 8 N-terminalen Aminosäuren und wird vollständig durch Casadaban, M. J. et al., J. Bacteriol., 143 (1980), 971-980 beschrieben. Plasmid pMC1403 hat drei einmalige Restriktionsenzymstellen. Es wird mit EcoRI gespalten, mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und die Enden werden mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-PolymeraseI stumpfendig gemacht. Plasmid pVV1 liefert die tryp-Promotor- und Operator-Sequenz und ist vollständig durch Nichols, B. P. und Yanofsky, C., "Methods in Enzymology", Herausgeber: Grossman, L. und Moldave, K., 101 (1983), 155-164, Academic Press, N.Y. beschrieben. Plasmid pVV1 enthält das trp-Operon mit einer 952 Basenpaar-Deletion (ΔLE1413) wodurch die trp-Leadersequenz mit dem trpE-Gen fusioniert wird, wodurch trpLe erhalten wird. Plasmid pVV1 wird mit PvuII und BglII gespalten, wodurch das Fragment 2 (323 bp) erhalten wird, das durch präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert wird. Die BglII-Stelle wird durch Klenow-Enzym aufgefüllt. Das Fragment 2 wird dann mit pMCl403 zu pTRZ1 ligiert.

(2) Konstruktion von pSK3

Die Strukturgene LacY und LacZ von pTRZ1 sind zur Konstruktion von pSK4 nicht notwendig und ihre Deletion führt zu einem kleineren Plasmid mit mehr einmaligen Klonierungsstellen. Zusätzlich vermeidet die Deletion von LacY die nachteiligen Effekte einer Überproduktion eines Membran-gebundenen Proteins. Wie in Diagramm 2 gezeigt, werden die trp-Sequenzen (Fragment 3) von pTRZ1 durch eine EcoRI/BamHI-Spaltung herausgeschnitten, mit alkalischer Phosphatase zur Minimierung einer Reinsertion behandelt und dann in die EcoRI/BamHI-Region, Fragment 4, von pKC7 inseriert, das als Folge der Spaltung nicht länger eine Kanamycin-Resistenz aufweist. Die Klone mit einer Ampicillin-Resistenz (AmpR) und einer Kanamycin-Sensitivität (KanS) werden einem Screening auf Restriktionsfragmente unterzogen, die für die Insertion der trp-Promotor/Operator-Sequenz erwartet werden. Dieses Plasmid wird pSK3 genannt und seine Gegenstücke sind wie in Diagramm 2 beschrieben.

(3) Konstruktion von pSK4

Der trp-Promotor von pSK3 weist nach wie vor das trpLE-Peptid auf, das zur Konstruktion eines direkten Expressionsvektors unnötig ist. Das trpLE-Segment wird durch das folgende Verfahren herausgeschnitten. Wie in Diagramm 3 gezeigt, wird das die trp-Sequenzen enthaltende EcoRI/BamHI-Fragment 5 aus pSK3 herausgeschnitten und durch Elektroelution aus Polyacrylamid-Gelen gereinigt. Wie gezeigt, enthält dieses Fragment 3 TaqI-Stellen, eine von ihnen in der Promotor/Operator-Region (TaqI'') und eine davon zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Start der trpLE-Translation (TaqI'''). Das Fragment wird partiell durch TaqI gespalten und die gesamte Sammlung der Fragmente wird in einer Legierungs-Reaktion mit pBR322 verwendet, das vorher mit EcoRI und ClaI gespalten worden ist.
TaqI erkennt T↓CGA (Pfeile weisen auf den Punkt der Strangspaltung), während ClaI AT↓CGAT erkennt. Da diese zwei Enzyme kompatible, kohesive Enden produzieren und die 5'-Base der TaqI'''-Stelle zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und trpLE ein A ist (J. of Bact., 133, 1457-1466), führt die Legierung dieses TaqI-Endes mit dem ClaI-Ende zu der ClaI-Stelle. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieses Klonierungsschema auf einzelne TaqI-Spaltungen selektiert und auch garantiert, daß die Transkription von dem Promotor in Uhrzeigerrichtung erfolgt. Klone mit einem 278bp EcoRI/ClaI-Insert und einem für den trp-Promotor charakteristischen Restriktionsmuster werden ausgewählt und sind die Äquivalente von pSK4. Die Klone eignen sich zur Expression von Protein-Sequenzen, die zu einer Translationsinitiation bei Insertion an der ClaI-Stelle fähig sind.

Präparation 2: Isolierung einer vollständigen cDNA, die für humanen Gewebe-Plasminogenaktivator codiert

A. Materialien und Methoden

(1) Wachstum von Bowes-Melanomzellen

Bowes stellt eine etablierte Zellinie dar, die von einem humanen, spontanen Melanom stammt und ein Geschenk von Dr. Daniel Rifkin der New York University School of Medicine ist. Die Zellen werden in mit 10% fötalem Kälberserum (Gibco) und 50 ug/ml Gentamycin (Sigma) ergänztem Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) in feuchter Atmosphäre bei 37ºC unter Verwendung von 95% Luft/5% CO&sub2; kultiviert. Zur RNA-Präparation werden die Zellen bis zur Konfluenz in Falcon 150 cm²-Flaschen kultiviert.

(2) TPA mRNA-Präparation

RNA von Bowes-Melanomzellen wird im wesentlichen, wie durch Lizardi, et al., Anal. Biochem., Band 98 (1979), 116-122 beschrieben, isoliert.
PolyA&spplus; RNA wird angereichert, indem RNA auf eine Oligodeoxythymidin-Cellulose (ODT-Cellulose-Collaborativ Research)-Säule gegeben wird, wie durch Aviv, H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 69 (1972), 1408-1412 beschrieben ist. Eine typische Ausbeute aus 10 bis 150 cm²-Flaschen, die zweimal an getrennten ODT-Säulen selektiert worden sind, beträgt etwa 50 ug polyA&spplus; mRNA.
Die polyA&spplus; mRNA wird durch Zentrifugation über einen 15-30% linearen Succrose-Gradienten fraktioniert. PolyA+ mRNA (ca. 300 ug) die in 200-400 ul sterilem H&sub2;O gelöst ist, wird auf einen Gradienten gegeben und in einem Beckman SW41 Ti Rotor 18 Stunden bei 35000 rpm zentrifugiert, danach werden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt, indem das Buchler Auto Densi-Flow Model IIC, das mit einer Gilson Micro Fraktioniervorrichtung (Modell FC80-K) verbunden ist, zur Entnahme von oben nach unten verwendet wird. Aliquote jeder Fraktion werden in Xenopus Oocyten injiziert und Translationsprodukte auf Plasminogenaktivator-Aktivität getestet, indem das Casein-Agarplatten-Verfahren verwendet wird, das zu jenen durch Miskin, R. et al., Nuc. Acids Res., Band 9, 3355-3363 beschriebenen Verfahren analog ist. Die TPA-Aktivität geht von einer mRNA aus, die bei etwa 19s wandert.
Der Gewebe-Plasminogenaktivator TPA wird speziell durch Beobachtung der Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin, einer nicht-spezifischen Protease, die Casein spaltet, bestimmt. Der Test wird folgendermaßen durchgeführt: 0,5 ml 8% gekochtes Casein werden mit 1 ml 2 · MBS gemischt und auf 50ºC erhitzt. 3% Agarose wird geschmolzen und auf 50ºC abgekühlt. 0,5 ml der 3% Agarose werden dem Casein/MBS zugegeben und durch Pipettierung gemischt. 100 ul 1 mg/ml Human-Plasminogen werden unter Mischen zugegeben (Endkonzentration 50 ug/ml) und das Material wird in eine Plastikpetrischale eines Durchmessers von 3,5 cm gegossen. Die Agaroselösung wird auf Raumtemperatur (etwa 30 Minuten) abgekühlt. In der Agarose werden Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm mittels eines Biorad-Gelschneide-Ausstanzer herausgeschnitten. Die Löcher werden vor der Verwendung gemacht und mit MBS gefüllt. Eine von zwei Oocyten, denen mindestens 6 Stunden vor dem Test TPA-RNA injiziert worden ist, wird einem jeden Loch zugegeben. Eine Inkubation erfolgt in einer feuchten Schale für 12-24 Stunden. Klare Zonen von Kasein-Hydrolyse werden rasch beobachtet.
Fraktionen, die für TPA mRNA angereichtert worden sind, werden durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol und einer einstündigen Inkubation auf Trockeneis präzipitiert. Präzipitate werden durch Zentrifugation bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Tisch-Mikrozentrifuge gesammelt, dann in sterilem, destillierten H&sub2;O gelöst, vereinigt und erneut präzipitiert. Diese t-Pa angereicherte polyA&spplus; mRNA wird zur Herstellung einer cDNA für eine Klonierung verwendet.

(3) cDNA-Synthese

Sämtliche Reaktionen werden auf Eis durchgeführt.

(A) Erste Strang-Synthese unter Verwendung von OdT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; Primer

10 ug angereicherte, PolyA und selektierte Bowes mRNA (in ul H&sub2;O) werden 10 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart von 10 mM MeHgOH (Alfa) zur Unterstützung der Nicht-Ausbildung einer Sekundärstruktur inkubiert. Danach werden die folgenden Komponenten zugegeben: β-Mercaptoethanol bis 28 mM, RNasin (Biotec Inc) 1 Einheit/ul Endreaktionsvolumen, 75 mM Tris-Base, pH 8,3, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 ug Oligodeoxythymidin (OdT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Collaborative Research), 100 uCi α³²p-dCTP (Amersham), dGTP, dTTP und dATP bis 500 um jeweils, dCTP bis 250 um (sämtliche Nukleotide von P. L. Biochemicals, gelöst bis zu 20 mM in 10 mM Tris-Base, pH 8 und neutralisiert mit 1,0 M NaOH) und reverse Transkriptase (Life Sciences Inc.) 1 Einheit/ug eingebrachter RNA in einem Endreaktionsvolumen von 50 ul. Die Reaktion wird 60 Minuten bei 42ºC inkubiert.
(B) Synthese des ersten Stranges unter Verwendung von spezifischen 15-mer Oligonukleotiden als Primer (vgl. Panabieres, F. et al., Gene, Band 19 (1982), 321-326 für im allgemeinen analoge Durchführungen).
Der Erhalt eines kompletten, TPA-codierenden cDNA-Strangs von einer mRNA, die am 3'-PolyA-Schwanz mit einem Primer versehen wurde, ist nicht immer unter Verwendung obigen Verfahrens möglich. Durch Anbringung eines Primers mit einer Sequenz upstream des PolyA-Schwanzes ist es wahrscheinlicher, eine Sequenz einer 5'TPA-codierenden cDNA zu erhalten, die mit einer unvollständigen, an der PolyA-Schwanz-Sequenz initiierten cDNA verbunden werden kann.
Drei Pentadecamere werden zur Verwendung als Proben oder Primer für eine cDNA-Synthese verwendet. Ihre Sequenzen sind:
Komplementär zum 3' TPA Positionen:
Sie werden synthetisiert und nach den früher beschriebenen Verfahren gereinigt.
25 ug PolyA und selektierte RNA werden mit 1 ug Primer (5- bis 10-facher picomolarer Überschuß des Primers gegenüber dem Template) und 1,5 mM EDTA in 58 ul bei 90ºC inkubiert. Das Gemisch wird langsam auf Raumtemperatur gebracht, indem es in ein 5 ml, ursprünglich auf 90ºC hochgeheiztes Wasserbad, eingetaucht wird. Nach der Annealing-Reaktion des Pentadecamers und des RNA-Templates werden die folgenden Reagenzien zugegeben: Dithiothreitol (DTT) bis 2 mM, RNasin bis 1 Einheit/ul Endreaktionsvolumen, 100 mM Tris-Base, pH 8,3, 11 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 100 uCi α³²P-dCTP, 500 um jeweils von dGTP, dTTP und dATP, 250 um dCTP, reverse Transkriptase (Life Sciences, Inc.) bis 1 Einheit/ug RNA. Es folgt eine dreistündig Inkubation bei 20ºC und an diesem Punkt wird eine gleiche Menge zusätzlicher reverser Transkriptase zugegeben und die Reaktion wird 30 Minuten bei 50ºC fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Phenolextraktion beendet und das RNA-Template wird durch alkalische Hydrolyse, wie vollständig in Maniatis beschrieben, entfernt.

(C) Syntheses des zweiten Stranges

Der zweite Strang wird in einer Reaktion synthetisiert, die aus 40 mM KPO&sub4;(K-Phosphat), pH 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 500 um jeweils von dGTP, dTTP, dATP, 250 um dCTP, 100 uCi ³H-dCTP (Amersham) und 1 Einheit ug eingebrachter RNA an DNA-Polymerase-Klenow-Fragment (BRL) in einem Endvolumen von 100 ul besteht. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei 15ºC inkubiert und durch Überwachung des Einbaues von ³H-dCTP verfolgt. Die Reaktion wird durch eine Phenolextraktion beendet und eine doppelsträngige cDNA wird, wie vorstehend für die Synthese des ersten Strandes beschrieben, präzipitiert außer, daß NH&sub4;Ac bis zu 2,5 M (eher als NaCl bis zu 0,3 M) für die erste Ethanolpräzipitation zugegeben wird.
S&sub1; wird zur Entfernung von Haarnadel-Strukturen verwendet. Die S&sub1;-Reaktionen werden entsprechend Maniatis durchgeführt. Eine erfolgreiche Eliminierung von Haarnadel-Strukturen wird durch eine Zunahme von TCA-löslichen Impulsen bestimmt. Die Reaktion wird durch eine Phenolextraktion beendet, bei der die Präzipitationen weggelassen werden. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt und direkt auf Succrose-Gradienten gegeben, die mit jenen identisch sind, die zur Fraktionierung der PolyA&spplus; mRNA verwendet wurden. Fraktionen werden gesammelt und durch Lösung von 5 ul Alliquote in 10 ml Aquafluor-Scintillationsflüssigkeit (New England Nuclear) und durch Messung von ³²P und ³H bestimmt. cDNA von relevanten Fraktionen wird durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol und einer 30minütigen Inkubation auf Eis präzipitiert. Die Präzipitate werden durch 15minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Mikrofuge pelletiert. Pellets werden in sterilem 0,3 M NaCl vereinigt und erneut präzipitiert. Die Präzipitate werden pelletiert und getrocknet.

(D) Versehen der cDNA mit einem Schwanz und Durchführung einer Annealing-Reaktion mit einer Vektor-DNA

Homopolymer-Abschnitte von dCTP werden gemäß der Verfahren in Maniatis enzymatisch an die 3'-Termini der cDNA-Moleküle angeheftet. Idealerweise sollten 10-30 Reste von dCTP zur Maximierung der Klonierungseffizienz angeheftet werden.
Vektor-DNA (Herstellung durch vollständige Spaltung von pBR322 mit PstI und Hinzufügung von Homopolymer-Abschnitten von dGTP-Resten) ist allgemein erhältlich bei New England Nuclear. Die Vektor-DNA kann auch gemäß der in Maniatis beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Durchführung einer Annealing-Reaktion zwischen der cDNA und der Vektor-DNA wird ebenfalls durch Maniatis beschrieben. Im Kurzen wird die mit einem Schwanz versehene cDNA mit einem Vektor in einem 1:1 Mol-Verhältnis in einem 10 mM Tris, pH 7,4, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA enthaltendem 50 ul Reaktionsgemisch gemischt. End-DNA-Konzentrationen variierten zwischen 20-60 ug/ml. Eine Annealing-Reaktion wird durch folgendes erreicht: (1) durch Einhalten eines bestimmten Systems von Inkubationen bei 65º/10', 42º/60', 37º/2 h und dann einer 2stündigen Inkubation bei Raumtemperatur oder (2) durch Inkubation bei 65º/10', Abschalten des Wasserbades und langsames Equilibrieren auf Raumtemperatur über Nacht.

(E) Klonierung und Sequenz-Bestimmung der vollständigen TPA cDNA (Diagramme 4-5)

Die cDNA-enthaltenden Vektoren werden in E. coli eingeführt, indem bereits beschriebene Transformations-Verfahren verwendet werden. Die Bakterien werden in situ Screenig-Verfahren unterzogen, indem die früher beschriebenen Hybridisierungsverfahren verwendet werden.
Die hier beschriebene Kolonie-Hybridisierung verwendet die ebenfalls beschriebenen Pentadecamere als Proben. Zur Verwendung als Hybridisierungsprobe wird 1 ug eines 15-mer in einem 50 ul Reaktionsvolumen phosphoryliert, das aus 70 mM Tris-Base (pH 7,6), 100 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiotreithol und 50 uCi γ³²dATP (P. L. Biochemicals) und 1 Einheit T&sub4; Polynukleotidkinase (New England Biolabs) besteht. Es folgt eine 60minütige Inkubation bei 37ºC. Auf diese Weise kann das 15-mer mit einer spezifischen Aktivität von 1·10&sup8; cpm pro ug markiert werden.
Klone mit komplementären Sequenzen zu den Proben werden für ein zweites Screening-Verfahren ausgewählt, bei dem eine PstI-Restriktionsanalyse der Klone zur Bestimmung durchgeführt wird, ob die Spaltungsprodukte mit der PstI-Restriktionskarte übereinstimmen, die von der in Tabelle I oder Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli", Nature, Band 301 (20. Januar 1983), 214-221 gegebenen Sequenz erhalten werden kann. Die gewünschten Klone haben einen großen Teil des 3'-Teils der TPA cDNA. Eine Spaltung führt zu vier Fragmenten: dem ursprünglichen pBR322 Vektor, einem 1150 bp-Fragment, einem 80 bp-Fragment und einem 78 bp Fragment. Diese Ergebnisse legen ein Insert von etwa 1300 bp des 3'-Endes des Gens (Nukleotide 1250-2550) nahe. Zur Bestätigung dieser Annahme wird der Klon einer Doppelverdauung mit PstI und DdeI unterzogen. Das letztere Enzym sollte das 1150 bp Fragment in ein 926 bp Fragment und ein 229 bp Fragment spalten, während die 78 bp oder 80 bp Fragmente intakt bleiben sollten. Die Ergebnisse einer solchen Doppelspaltung sollten den Schluß unterstützen, daß der Klon in der Tat das 3'-Ende des TPA-Gens repräsentiert.
Als letzter Beweis wird eine Minipräparation der DNA von dem Klon isoliert und durch das Dideoxy-Kettenabbruchverfahren sequenziert. Minipräparationen der Plasmid-DNA werden, wie in dem Teil über allgemeine Verfahren beschrieben, hergestellt. Eine Dideoxy-Sequenzierung wird durchgeführt, wie in dem Teil über allgemeine Verfahren beschrieben, wobei ein Pentadecamer #1 als Primer in einem 20:1 molaren Überschuß gegenüber dem Template verwendet wird. Die von diesem mit pTPAH bezeichneten Klon erhaltenen Sequenzdaten sind mit jenen Sequenzdaten identisch, die durch Pennica et al., Nature, Band 301 (1983), 214-221 für humanen Gewebe-Plasminogenaktivator (Diagramm 4) präsentiert worden sind.
Nachfolgend wird auf die Isolierung des 5'-Endes des Gens abgezielt. Hierfür wird eine cDNA von zweifach-selektierter PolyA und mRNA synthetisiert, indem von dem Pentadecamer 1 eher als von dem OdT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; ausgehend eine Primer-Extension durchgeführt wird. Der Vorteil dieses Vorgehens ist zweifach. Erstens, da das Priming spezifisch für TPA ist, sollte ein höherer Prozentsatz der hergestellten cDNA spezifische TPA-Sequenzen repräsentieren. Zweitens erfolgt das Priming etwa 800 Basenpaare 5' von dem PolyA Schwanz, der Stelle, die von OdT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; zum Priming der Synthese des ersten Stranges benutzt wird. Dies stellt fast sicher, daß die von diesem Vorgehen erhaltene cDNA Transkripte umfaßt, die weiter 5' hinausragen als pTPAH.
Die Transformationseffizienz mit der über diesen Primer erhaltenen TPA cDNA liegt bei 2,5·10&sup5; Transformanten pro ug cDNA. Zwei Genbanken mit insgesamt 25000 Transformanten wurden erhalten. Das Konzept von "gene-walking" wird verwendet, um absichtlich das Screening-Verfahren zu beeinträchtigen. Das 5'-terminale 80 bp PstI-Fragment von pTPAH wird aus einem Gel isoliert und als Probe für die 28000 Kolonien verwendet, die von den durch Primer-Extension erhaltenen Genbanken stammen. Damit wird speziell auf Klone, die 5' zumindest so weit reichen wie pTPAH, und als Ergebnis des Primer-Extensions-Vorgehens auf Klone selektiert, die zusätzliche 5'-Sequenzen enthalten.
Das Screening-Verfahren durch in situ Hybridisierung führt zu einer Anzahl von Positiven. Das längste TPA-Insert wird in einem zweiten Screening-Verfahren mit PstI und DdeI nachgewiesen. In diesem Verfahren umfaßt der mit pTPA 80-1 bezeichnete Klon ein Insert, das die Nukleotide 550-1600 (Diagramm 4) umspannt.
Die Restriktionsdaten ermöglichen es, ganz genau die Position (+/- - 10%) des 3'-Terminus zu bestimmen. Beginnt das Priming bei Nukleotid 1759 und hat pTPA 80-1 ein 3'-Ende bei etwa der Position 1600 ist ein Verlust von etwa 160 Basenpaaren an einem Punkt während der Klonierung eingetreten. Die S&sub1; Endonuklease ist der wahrscheinlichste Grund eines solchen Verlustes.
Die Orientierungen von pTPAH und pTPA 80-1 werden bestimmt. Die Plasmide pTPAH und pTPA 80-1 werden mit SacI und PvuI gespalten, wodurch die Fragmente 7 (1251 bp) bzw. 8 (5,1 kb) erhalten werden, die aus einem Gel isoliert werden. Die Fragmente werden mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt und unter Verwendung von T4 Polymerase ligiert, wodurch pTPA 3' cDNA (6,3 kb) erhalten wird, die die Positionen 550-2230 Basen der TPA cDNA enthält. Das neue Konstrukt wird durch eine PstI Spaltung bestätigt.
Da pTPA 80-1 das längste TPA-Insert unter den Positiven darstellt, die in den Banken der ersten Primer-Extension nachgewiesen wurden, wird ein zweites Oligonukleotid, das zu der codierenden Sequenz der Aminosäurereste 233-237 (Nukleotide 886-900, 15-mer #2) komplementär ist, zur Herstellung einer weiteren cDNA Genbank zur Vervollständigung des 5'-Endes verwendet. Dieser spezielle Bereich des Gens ist so gewählt, daß, wenn S&sub1; sogar mehr als 200 bp von dem 3'-Ende des Transkripts entfernt, ein ausreichendes Überlappen mit der pTPA 3' cDNA vorliegen sollte, das die Assemblierung der Fragmente erlaubt.
Die cDNA, die die 5'-Basen enthält, wurde mit PstI-gespaltenem pBR322 ligiert und zur Transformation von E. coli, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Die Transformationseffizienz mit dieser cDNA lag im Bereich von 3,6·10&sup4; Transformanten/ug cDNA. Kolonien dieser Genbank wurden einem Screening-Verfahren mit einem Oligonukleotid unterzogen, das zu der codierenden Sequenz der Nukleotide 645-660 (15-mer #3) komplementär ist, und auf zweifellos Positive wird selektiert. Ein zweites Screening-Verfahren wird durch PstI- und BglII-Spaltung durchgeführt und ein mit pTPA 5'cDNA bezeichneter Klon weist die übrigen 5'-Sequenzen 1-750 auf. Wiederum werden die Effekte von S&sub1; auf die Insertlänge mit der pTPA 5' cDNA deutlich. Während das Priming bei Nukleotid 868 stattfindet reicht die pTPA 5' cDNA nur etwa bis zu Nukleotid 750, die vorliegende Arbeit weist auf einen Verlust von etwa 136 bp hin.
Mit der auf zwei Klonen (pTPA3'cDNA und pTPA5'cDNA) verfügbaren Gesamt-TPA-Sequenz verbleibt noch die Aufgabe der Zusammensetzung. Die Strategie ist in Diagramm 5 gezeigt.
Plasmid pTPA5'cDNA wird mit TaqI gespalten, wodurch Fragment 9 (2194 bp) erhalten wird. Eine TaqI-Stelle innerhalb der Sequenz von pTPA5'cDNA (Position 634) ist stark Enzym-resistent. Fragment 9 wird mit BglII und HgaI gespalten, wodurch Fragment 10 (405 kb) mit den Basen 188 bis 593 der TPA cDNA erhalten wird, die den reifen Teil des Proteins repräsentiert.
Der Mittelteil der TPA cDNA wird erhalten, indem pTPA3'cDNA zunächst mit PuvII und EcoRI gespalten und Fragment 11 (1748 bp) isoliert werden. Fragment 11 wird dann mit HgaI gespalten, wodurch Fragment 12 (209 bp) mit den Basen 594-802 erhalten wird.
Zum Erhalt des 3'-Teils der cDNA wird pTPA3'cDNA mit PvuI gespalten und das 6,3 kb Fragment isoliert, mit T4 Polymerase behandelt und partiell mit EcoRI gespalten, wodurch Fragment 13 (1871 bp) mit den Basen 802-2230 erhalten wird.
Die Legierung der 3 Teile der cDNA umfaßt die Verwendung von pKC7, das allgemein erhältlich und vollständig beschrieben ist (vgl. Rao, R. N., und Rogers, S. G., Plasmid pKC7: "A vector containing ten restriction sites suitable for cloning DNA segments", Gene 7 (1979), 79-82). Plasmid pKC7 wird mit BglII und SmaI gespalten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt, wodurch Fragment 14 (4,8 kb) erhalten wird, das aus einem Gel isoliert wird.'
Die Fragmente 10, 12, 13 und 14 werden in einem einzelnen Legierungs-Gemisch ligiert. Ein bemerkenswerter Aspekt dieser Strategie liegt darin, daß das interne Fragment nicht mit alkalischer Phosphatase behandelt werden muß.
Typischerweise führen Legierungen mit vielen Teilen (≥ 4 Fragmente) nur mit sehr geringer Effizienz zu der gewünschten Konstruktion, da eine Concatemerbindung der Fragmente eintritt. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase in der geeigneten Weise minimiert dieses Problem, wodurch ein dramatischer Anstieg in der Effizienz eines korrekten Zusammensetzens vieler Teile erhalten wird. In der Zusammensetzung der TPA-Fragmente wurde der Vorteil des einmaligen Weges ausgenutzt, auf dem die Restriktionsendonuklease HgaI DNA schneidet. Die Erkennungs-(Bindungs-)sequenz des Enzyms ist GACGC, das Enzym schneidet jedoch an einem Punkt außerhalb der Erkennungssequenz. Als Folge davon können mit HgaI gespaltene Fragmente nur mit ihren ursprünglich angrenzenden Fragmenten ligiert werden. Eine Selbst-Legierung, die durch den HgaI-Überhang gefördert würde, kann nicht eintreten. Die Legierung von 4 TPA-Teilen enthält zwei Fragmente mit einem HgaI-Ende. Dies führt zusätzlich zu der Behandlung des Vektors mit alkalischer Phosphatase (zur Minimierung des Selbst-Schlusses) zu den meisten der Transformanten, die das TPA-Gen korrekt zusammengesetzt enthalten. Die korrekte Zusammensetzung wird durch Restriktions-Spaltungen überprüft. Das Plasmid, das die komplette cDNA-Sequenz für TPA enthält, wird mit pTPA cDNA (7,4 kb) bezeichnet.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung von synthetischen Oligonukleotiden

87 getrennte Oligonukleotide (Tabelle 3) wurden gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren synthetisiert. Nach der beschriebenen Strategie werden die 1084 Basenpaare der synthetischen DNA zwischen der BglII-Stelle an der Position 187 und der EcoRI-Stelle an der Position 1287 in pTPA-B1,2,3 (Diagramm 9) zusammengesetzt. Die spezifischen Restrikionsstellen, die zur Insertion in die Zwischendomäne-Regionen ausgewählt werden, sind in den Diagrammen 10 und 11 aufgeführt. Jeder Block wird mit einem geeigneten Klonierungsvektor zur Replikation in E. coli und zur Überprüfung der Sequenz rekombiniert. Sämtliche Legierungs- und Klonierungsverfahren werden wie in Maniatis et al beschrieben durchgeführt. Alle klonierten Sequenzen werden unter Verwendung der Sanger-Dideoxysequenzierungstechnik zur Überprüfung der Sequenz sequenziert.
Block 1: Die Oligonukleotide P1-P4 und P8-P11 werden einem Annealing- und Klonierungs-Verfahren unterzogen, wodurch ein doppelsträngiges Segment ausgebildet wird, das mit einem zweiten Segment ligiert wird, welches die Oligonukleotide P5-P7 und P12-P14 umfaßt. Der erhaltenen Block 1 enthält die für die Finger-Domäne codierende Sequenz. Block 1 wird zwischen der BglII- und SphI-Stelle von dem in Präparation 1 beschriebenen pSK4 kloniert.
Block 2: Die Oligonukleotide P15-P18 und P19-P23, die die für die Wachstumsfaktor-Domäne codierende Sequenz enthalten, werden zusammen in einem einzelnen Annealing- und Legierungsschritt ligiert, wodurch Block 2 gebildet wird, der zwischen der SphI- und ClaI-Stelle von pBR322 kloniert wird.
Block 3: Die Oligonukleotide P24-P28 und P34-P38 werden einem Annealing- und Legierungsschritt unterzogen, wodurch ein doppelsträngiges Segment gebildet wird, das mit einem zweiten die Oligonukleotide P29-P33 und P39-P43 umfassenden Segment ligiert wird. Der erhaltene Block 3 enthält die für die Kringle 1-Domäne codierende Sequenz. Block 3 wird zwischen der ClaI- und BamHI-Stelle von pBR322 kloniert.
Block 4: Die Oligonukleotide P44-P47 und P67-P70; P48-P51 und P71-P74; P52, P53, P92, P93 und P75, P76, P94, P95; P57-P61 und P80-P84; und P62-P66 und P85-P89 werden jeweils Annealing-Schritten in fünf getrennten Röhrchen unterzogen, wodurch doppelsträngige Segmente ausgebildet werden, die dann zusammengefaßt und zur Ausbildung von Block 4 ligiert werden. Block 4 enthält die für die Kringle 2-Domäne codierende DNA-Sequenz. Block 4 wird zwischen der BamHI- und EcoRI-Stelle von pBR322 kloniert.

Beispiel 2: Zusammensetzung der Blöcke 1-4 mit der aktiven Stelle der TPAcDNA (Diagramme 6-11)

Das folgende Beispiel liefert eine Zusammenfassung der Schritte, die zur Zusammensetzung der verschiedenen synthetischen Blöcke von Beispiel 1 in ein zur Codierung eines biologisch-aktiven TPA fähigen Gens notwendig sind. Zwei Prototyp Gene werden beschrieben. Plasmid pTPA-B1,2,3,4 (a) hat ein TPA-codierendes Gen, das keine künstlich eingeführten Endonukleasestellen zwischen der Kringle 2-Domäne und der aktiven Stelle aufweist. Plasmid pTPA-B,1,2,3,4 hat ein TPA-codierendes Gen, das künstlich eingeführte Endonuklease-Restrikionsstellen zwischen der Kringle 2-Domäne und der aktiven Stelle aufweist.

A. Konstruktion von pTPA-B1 (Diagramm 6)

Plasmid pSK4 wird mit ClaI und SphI gespalten und das große 4,1 kb Fragment 15 isoliert und mit dem Block 1-Fragment unter Verwendung eines ClaI/XbaI-Linkers ligiert. Das Legierungsgemisch wird zur Transformation von Hb101 verwendet, wobei das durch Maniatis beschriebene calciumchlorid-Transformationsverfahren angewandt wird. Die Transformanten werden beim Screening-Verfahren mit Nick-translatierten-Block 1-Fragmenten unterzogen, wobei das durch Maniatis et al. beschriebene Nick-Translationsverfahren verwendet wird. Transformanten, die mit der Probe hybridisieren, werden dann unter Verwendung der Sanger-DideoxySequenzierungstechnik sequenziert, um die korrekte Sequenz und Orientierung festzustellen. Dieser neue Transformant wird mit pTPA-B1 (4,25 kb) bezeichnet.

B. Konstruktion von pTPA-B1.2 (Diagramm 7)

Plasmid pTPA-B1 wird mit EcoRI und SphI gespalten und Fragment 16 (450 bp) isoliert. Plasmid pBR322 wird mit EcoRI und ClaI gespalten und das große Fragment 17 (4,35 kb) aus einem Gel isoliert. Die Fragmente 16 und 17 werden dann mit dem synthetischen SphI/ClaI-Block 2 ligiert. Das Legierungsgemisch wird zur Transformation von HB101 verwendet und die Transformanten werden einem Screening-Verfahren mit Nick-translatiertem Block 2 unterzogen. Transformanten, die mit der Probe hybridisieren werden zum Nachweis sequenziert, daß sie Block 2 in richtiger Orientierung enthalten. Diese Konstruktion wird mit pTPA-B1,2 (4,8 kb) bezeichnet.

C. Konstruktion von pTPA-B1,2(a) (Diagramm (8)

Plasmid pTPA-B1,2(a) enthält HindIII und BglII-Restriktionsstellen upstream der Finger- und Wachstumsfaktor-Domänen. Plasmid pTPA-B1,2 wird mit XbaI und EcoRI gespalten und das große 4,5 kb Fragment 18 aus einem Gel isoliert und mit einem eine HindIII- und eine BglII-Stelle enthaltenden Oligonukleotid-Linker ligiert. Das Legierungsgemisch wird zur Transformation von HB101 verwendet und die Transformanten werden einem Screening-Verfahren hinsichtlich des Vorliegens von HindIII/BglII-Stellen unterzogen. Die neue Konstruktion wird mit pTPA-B1, 2(a) (4,5 kb) bezeichnet.

D. Konstruktion von pTPA-B1,2,3 (Diagramm 9)

Plasmid pTPA-B1,2(a) wird mit ClaI und BamHI gespalten und das große 4,0 kb Fragment 19 isoliert. Dieses Fragment wird mit der synthetischen, Block 3 (270 bp) enthaltenden ClaI/BamHI-Kringle 1-Region ligiert und zur Transformation von HB101 verwendet. Die Transformanten werden einem Screening-Verfahren mit Nick-translatiertem Block 3 unterzogen. Transformanten, die mit Block 3 hybridisieren, werden zum Nachweis der Sequenz und Orientierung sequenziert. Diese neue Konstruktion wird mit pTPA-B1,2,3 (4,3 kb) bezeichnet.

E. Konstruktion von pTPA-B1,2,3,4a (Diagramm 10)

Dieses Plasmid enthält ein vollständiges Prototyp-TPA-Gen, das für ein TPA-Analogon mit enzymatischer Aktivität codiert. In diesem Gen gibt es keine Veränderungen in der Zwischen- Domäne-Region zwischen Kringle 2 und der aktiven Stelle. Die Konstruktion von pTPA-B1,2,3,4a (4,2 kb) benötigt mehrere Schritte. Plasmid pTPA cDNA (Diagramm 5) wird mit ScaI gespalten und Fragment 20 (6,0 kb), das für das 3'-Ende des TPA-Gens codiert, aus einem Gel isoliert. Plasmid pTPA-B1,2,3 (Diagramm 9) wird mit ScaI und BamHI gespalten, wodurch das die Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringle 1-Domänen enthaltende Fragment 21 (1100 bp) erhalten wird. Ein drittes Fragment 4a (230 bp) wird durch Spaltung von Block 4 mit BamHI und ScaI erhalten. Die drei Fragmente werden unter Verwendung von T4 Ligase ligiert, wodurch pTPA-B1,2,3,4a erhalten wird. Das TPA-Gen wird unter Verwendung von HindIII und AatII aus pBR322 herausgeschnitten und ein 2,2 kb Fragment erhalten, das in pUC-19 subkloniert wird. Plasmid pUC-19 ist von einer Vielzahl von Quellen allgemein erhältlich und enthält eine Auswahl von Restriktionsstellen in der DNA-Sequenz, was die Manipulation an einer TPA-Domäne weniger beschwerlich macht.

F. Konstruktion von pTPA-B1,2,3,4 (Diagramm 11)

Dieses Plasmid enthält ein vollständiges Prototyp-TPA-Gen, das für ein enzymatisch aktives TPA-Analogon codiert. In diesem Analogon liegen sämtliche vier Domänen und die aktive Stelle zusammen mit einmaligen Restriktionsstellen vor, die in allen Zwischen-Domäne-Regionen, einschließlich der Region zwischen Kringle 2 und der aktiven Stelle synthetisch eingefügt worden sind. Das Plasmid wird konstruiert, indem zunächst pTPA-B1,2,3,4a mit EcoRI und BamHI gespalten und das große, die Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringle 1-Domänen enthaltende 3,7 kb Fragment isoliert werden. Der synthetisch geschaffene Block 4 wird von seinem Klon durch Spaltung mit BamHI und partieller Spaltung mit EcoRI erhalten, wobei er intakt ist und 560 kb aufweist. Die zwei Fragmente werden unter Verwendung von T4 Ligase zu pTPA-B1,2,3,4 ligiert.
Die Plasmide pTPA-B1,2,3,4a und pTPA-B1,2,3,4 können zur Konstruktion einer Vielzahl von synthetischen TPA-Analoga verwendet werden.

Beispiel 3: Konstruktion von TPA-Analoga

A. Konstruktion von pFK2A (Deletion von Wachstumsfaktor- und Kringle 1-Domäne)

Plasmid pTPA-B1,2,3,4 wird mit HpaI gespalten. Das große 6,5 kb Fragment wird isoliert und zu pFK2A religiert. Das Plasmid wird zur Transformation von HB101 oder einem anderen geeigneten Wirt verwendet und hinsichtlich korrekter Orientierung und Sequenz einem Screening-Verfahren unterzogen.

B. Konstruktion von pFK2A (Diagramm 12), (Deletion von Wachstumsfaktor und Kringle 1 und Duplikation von Kringle 2)

Plasmid pTPA-B1,2,3,4 (Diagramm 11) wird mit HpaI gespalten, wodurch Fragment 22 (6,5 kb) erhalten wird, das isoliert wird. Eine zweite Probe von pTPA-B1,2,3,4 wird mit HpaI und MstI gespalten und das erhaltene, die Kringle 2-Domäne enthaltende 560 bp Fragment 23 isoliert. Das HpaI-gespaltene FK2A Fragment wird stumpfendig gemacht und mit dem HpaI/MstI-Fragment legiert, wodurch pFK2K2A (6,5 kb) erhalten wird. Plasmid pFK2K2A wird dann zur Transformation von HB101 verwendet und einem Screening-Verfahren hinsichtlich korrekter Orientierung und korrekter Sequenz unterzogen.

C. Expression des Plasmids pTPAExp1 in E. coli (Diagramm 13)

Eine Expression von TPA-Analoga kann in E. coli erreicht werden, indem das in Diagramm 7 gezeigte Expressionsplasmid pTPA-B1,2, das in Diagramm 6 gezeigte pTPA-B1 oder ihre Äquivalente verwendet werden. Jedes der Analoga kann zwischen den der XbaI und BamHI-Stellen zur Expression vorliegen. Zur Expression von pFK2K2A in E. coli werden pTPA-B1,2 (Diagramm 7) und pFK2K2A (Diagramm 12) mit XbaI und BamHI gespalten und die Fragmente 24 (4,2 kb) und 25 (2,0 kb) aus einem Gel isoliert. Die Fragmente 24 und 25 werden zu dem Expressionsplasmid pTPAExp1 (6,2 kb) ligiert.
Plasmid pTPAExp1 enthält einen Trp-Promotor und Operator und die Expression ist constitutiv. Die Kultivierung von E. coli erfolgt nach Maniatis (vorstehend angegeben). Die E. coli Kulturen produzieren kein aktives TPA. Das in E. coli produzierte TPA muß wieder in den aktiven Zustand gefaltet werden. Durch bekannte Cystein-Umbindungsverfahren kann aktives TPA erhalten werden (vgl. US-Patent Nr. 4511502).

Beispiel 4: Expression in Eukaryoten

A. Expression von humanem TPA in Hefe

Dieses Beispiel erläutert die Konstruktion des Hefe-Expressionsplasmids pα1-FK2K2A, das einen MFα1-Promotor und prä-pro-Sequenzen aufweist. Kulturbedingungen und bevorzugte Wirtsstämme zur Expression von TPA-Analoga in Hefe werden ebenfalls bereitgestellt.

(1) Konstruktion des Hefe-Expressionsvektors pα1-ADHt

Plasmid pα1-ADHt ist ein Hefe-Expressionsvektor, der für viele Zwecke verwendet werden kann. Restriktionsstellen wurden an günstigen Punkten in seine Struktur eingefügt und die Kontrolle unter dem MFα1-Promotor ist im allgemeinen mit hohen Expressionsmengen compatibel. Die folgenden Schritte beschreiben die Konstruktion von pα1-ADHt (Diagramme 14-18).

a. Konstruktion von pYRep3'B (Diagramm 14=

Plasmid pYRep3'B wird konstruiert, indem die RepIII- und Replikationsursprungs-Sequenzen des 2 u Plasmids in die SmaI-Stelle des URA3-Gens von pYIP31 inseriert werden, wodurch eine günstige Kassette geschaffen wird. Beide Plasmide, 2 u und pYIP31, sind allgemein erhältlich und in der Literatur vollständig beschrieben. Das 2 u Plasmid wurde vollständig durch Broach, J. R., "Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae (Life cycle and inheritance)", 445-470 und die RepIII-Region in Cell 34 (1983), 95-104 und Cell 35, (1983), 487-493 beschrieben. Plasmid pYIP31 wurde in Gene 18, (1979), 17-24 beschrieben.
Plasmid pYIP31 wird zunächst mit SmaI gespalten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt, wodurch Fragment 26 (5,4 kb) erhalten wird, das dann isoliert wird. Das Hefe-2 u-Plasmid wird mit PstI und XbaI gespalten, mit Klenow aufgefüllt und Fragment 27 (1,3 kb) isoliert. Die Fragmente 26 und 27 werden unter Verwendung von T4 Ligase zu pYRep3'B (6,7 kb) ligiert.

b. Konstruktion von pADHt (Diagramm 15-16)

Plasmid pADHt (3,86 kb) ist hilfreich, da es nützliche Restriktionsstellen zur Zusammensetzung eines Hefe-Expressionsvektors liefert.
Das Ausgangsplasmid zur Konstruktion von pADHt ist pGG400 (4,0 kb). Plasmid pGG400 wurde aus den Plasmiden pBR322 und pML21 konstruiert, die allgemein erhältlich sind (vgl. J. Bacter., 126 (1976), 447-453). Speziell wird das für eine Tetracyclin-Resistenz codierende Gen von pBR322 durch einen Teil von pML21 ersetzt, der für eine Kanamycin-Resistenz codiert. Plasmid pBR322 wird zunächst mit EcoRI und PvuI gespalten und der EcoRI-Überhang mit Klenow-Enzym aufgefüllt, anschließend wird Fragment 28 (2,3 kb) aus einem Agarose-Gel isoliert. Plasmid pML21 wird mit PvuII gespalten, wodurch das das Gen für eine Kanamycin-Resistenz tragende Fragment 29 (1,7 kb) erhalten wird. Die Legierung einer PvuII-Stelle mit einer aufgefüllten EcoRI-Stelle führt nach Legierung zu einer Wiederherstellung der EcoRI-Stelle. Die Legierung der Fragmente 28 und 29 führt zu pGG400, das zur Konstruktion von pADHt (Diagramm 15) verwendet wird.
Plasmid pADHt wird konstruiert, indem pGG400 mit PvuII und XhoI gespalten und mit Klenow-Enzym behandelt wird, wodurch Fragment 30 (3,5 kb) erhalten wird, das dann isoliert wird. Das 3'-Ende der Hefe-Alkoholdehydrogenase I (ADHI) wird aus pADHBC erhalten, indem dieses zunächst mit HincII und BamHI gespalten, mit T4 Polymerase behandelt und Fragment 31 (0,36 kb) isoliert werden. Plasmid pADHBC ist allgemein erhältlich und vollständig in J. Biol. Chem. 257 (1982), 3018-3025 beschrieben. Die Fragmente 30 und 31 werden ligiert, wodurch pADHt unter anderem erhalten wird, und zur Transformation von E. coli verwendet. Jene Transformanten, die pADHt tragen, haben BamHI- und XhoI-Stellen in ihren Plasmiden rekonstituiert. Diese Transformanten werden selektiert und die Echtheit des klonierten ADHI 3'-Endes wird durch Restriktionsenzymanalyse und durch Sequenzierung (Diagramm 16) bestätigt.

c. Konstruktion von pADHt-RepIII (Diagramm 17)

Plasmid pADHt-RepIII (6,2 kb) ist eine Konstruktion von pADHt und pYRep31B, worin die URA3-RepIII-Ursprungskassette in pADHt eingesetzt wird, um die Expression und Replikation in Hefe zu ermöglichen. Das Plasmid pADHt-RepIII eignet sich zur Konstruktion von Expressionsvektoren in Hefe, da die EcoRI-HindIII- oder EcoRI-SmaI-Fragmente durch ein gewünschtes DNA-Fragment ersetzt werden können, das geeignete Hefe-Promotoren trägt, oder es kann zur Bereitstellung eines SalI-XhoI-Fragments verwendet werden, das einen Replikationsursprung, einen Selektionsmarker und das 3'-Ende des Hefe-URA3'-Gens trägt.
Plasmid pADHt wird modifiziert, indem es mit BamHI gespalten wird, die Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt werden und ein 8-mer SalI Linker in die aufgefüllte BamHI-Stelle inseriert wird. Plasmid pADHt (modifiziert) wird mit SphI gespalten und die Enden werden mit T4 Polymerase aufgefüllt, wodurch Fragment 32 (3,8 kb) erhalten wird. Plasmid pYRep31B wird mit HindIII gespalten und Fragment 33 (2,4 kb) isoliert, das das 3'-Ende von URA3 und die 2 u RepIII-Region enthält, die als Verstärkung der Stabilität und des Replikationsursprungs gehalten wird. Die Fragmente 32 und 33 werden ligiert und die E. coli Transformanten, die Plasmide mit einer Orientierung des URA3-Gens enthalten, welche eine Transkription im Uhrzeigersinn erlaubt, werden einem Screening-Verfahren zum Erhalt von pADHt-RepIII unterzogen.

d. Konstruktion von pα1-ADHt (Diagramm 18)

Die Konstruktion von pα1-ADHt (6,5 kb) ist vollständig, indem das EcoRI-HindIII-Fragment von pADHt-RepIII durch das EcoRI-HindIII-Fragment von pα1 ersetzt wird, das den Promotor und die prä-pro-Sequenz des MF 2-Gens enthält.
Plasmid pα1 ist vollständig beschrieben (vgl. Singh, A. et al., Nucleic Acid Research, 11 (1983), 4049-4063 und Kurjan, J. et al., Cell, 30 (1983), 933-943). Plasmid pADHt-RepIII wird zunächst mit EcoRI und HindIII gespalten, wodurch Fragment 34 (5,3 kb) erhalten wird, das dann isoliert wird. Das Plasmid MFα1 wird ebenfalls mit EcoRI und HindIII gespalten, wodurch das Fragment 35 (1,2 kb) erhalten wird, das dann isoliert wird. Die Fragmente 34 und 35 werden dann unter Verwendung von T4 Ligase zu pα1-ADHt ligiert.

(2= Konstruktion von pα1-FK2K2A, Insertion der TPA-Analogon-cDNA in einen Hefe-Expressionsvektor (Diagramm 19)

Der bevorzugte Expressionsvektor zur Produktion von TPA-Analoga in Hefe wird mit pX1-FK2K2A bezeichnet und hat einen MFα1-Promotor. Plasmid pFK2K2A (Diagramm 12) wird mit BglII gespalten, wodurch Fragment 36 (2,0 kb) erhalten wird, das dann aus einem Gel isoliert wird. Plasmid pα-ADHt wird mit HindIII und XhoI gespalten, wodurch Fragment 37 (5,6 kb) erhalten wird, und liefert die Transkriptions-, die Polyadenylierungs- und die Translationsstellen. Das hier beschriebenen System endet downstream des reifen TPA-Proteins und das erhaltene Produkt weist einige zusätzliche Aminosäuren eines Hefe-Ursprungs auf. Zur Terminierung der Translation an einem genauen Ende des TPA-Gens kann man ein Terminationscodon einführen.
Zur Sicherstellung, daß das Analogon in Phase mit dem Leserahmen der MFα prä-pro-Sequenzen ist, werden die 5'- und 3'-Enden der Analoga nicht verändert. Die BglII-Stelle an dem 5'-Ende kann manipuliert werden, entweder durch Insertion eines weiteren Linkers oder durch eine Kombination aus Klenow (Pol I) und Mungobohnen-Nuklease, wodurch eine HindIII-Stelle geschaffen wird, währenddessen der Leserahmen in Phase mit den MFα1 prä-pro-Sequenzen gehalten wird. Hierfür wird die BglII-Stelle von Fragment 37 partiell unter Verwendung von Klenow mit Adenosin und Guanosin aufgefüllt. Die partiell aufgefüllte Stelle wird dann mit Mungobohnen-Nuklease stumpfendig gemacht und mit der HindIII-Stelle von pα1-ADHt ligiert. Die Fragmente 36 und 37 (mit dem partiell aufgefüllten Ende) werden zu pFK2K2A (7,6 kb) ligiert. Weitere TPA-Analoga-Gene können ebenfalls stumpfendig in den Expressionsvektor inseriert werden, so lange der Leserahmen in Phase mit den Hefe-Sequenzen gehalten wird.

(3) Hefe-Expression eines TPA-Analogons von dem Plasmid pα1-FK2K2A

Der Hefestamm YNN227 (αura3-52 trp1-289) wird mit pα1-FK2K2A transformiert. Die Transformanten werden in Glucose-Minimalmedium (2% Glucose, 0,7% Hefe-Stickstoffbase, 1% Gasaminosäuren, 40 ug/ml Adenin, 50 ug/ml Tryptophan) 10 Stunden kultiviert. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen werden durch Schütteln mit Glaskugeln lysiert. TPA-Mengen werden durch Verwendung von Western-Blot-Techniken oder Radioimmunotests oder dem Casein-Enzym-Test in Agar, wie vorstehend für Xenopus-Oocyten beschrieben, nachgewiesen.
TPA kann aus Hefezellen isoliert werden, indem die Zellen zunächst mit 0,5 mm Glaskugeln lysiert, anschließend gereinigt und auf eine Affinitätssäule gegeben werden. Standard-Proteinreinigungsverfahren können zu weiterer Reinigung angewandt werden.

B. Expression von TPA-Analoga in Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (Diagramme 20-22)

Das folgende Beispiel erläutert das bevorzugte Verfahren zur Expression von pFK2K2A in Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Zusammenfassend wird hier der Shuttle-Vektor pSVCOW7 beschrieben, der in CHO und E. coli Zellen repliziert, wobei Ampicillin-Resistenz- bzw. Dihydrofolat-Reduktase-Gene als Marker in E. coli bzw. CHO Zellen verwendet werden. Das Plasmid pSVCOW7 stellt ferner die Polyadenylierungssequenz von Rinder-Wachstumshormon bereit, die zur Expression in CHO Zellen notwendig ist. Plasmid pSVCOW7 wird zunächst gespalten und ein viraler Promotor und das TPA-Analogon werden inseriert. Transformations-Kulturbedingungen und Extraktionsverfahren für in CHO Zellen exprimiertes TPA werden ebenfalls nachstehend beschrieben.

(1) Konstruktion von pSVCOW7 (Diagramm 20)

Das Ausgangsplasmid pSV2dhfr (erhältlich von der American Type Culture Collection oder herstellbar nach dem Verfahren von Subramani, S. et al., "Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 2 (September 1981), 854-864) wird mit BamHI und EcoRI gespalten, wodurch Fragment 38 (5,0 kb) erhalten wird, das das Ampicillin-Resistenz-Gen, den SV40 Replikationsursprung und das dhfr-Gen enthält. Der zweite Teil von pSVCOW7 wird aus dem Plasmid pλGH2R2 erhalten, das mit den gleichen Restriktionsendonukleasen, wie pSV2dhfr gespalten wird, wodurch Fragment 39 erhalten wird, das das 3'-Ende des genomischen Rinder-Wachstumshormon-Gens, nämlich BGH gDNA enthält. Plasmid pλGH2R2 ist allgemein von einem E. coli HB101 Wirt erhältlich, der bei Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois (NRRL B-15154) hinterlegt ist. Die Fragmente 38 und 39 werden zu pSVCOW7 (7,1 kb) ligiert.

(2) Konstruktion von pTPA-cDNA, BamHI (Diagramm 21)

Zur bequemen Insertion eines TPA-Analogons in pSVCOW7 ist es notwendig, eine günstige BamHI-Stelle innerhalb der Leader-Sequenz von TPA zu inserieren, die upstream der reifen Proteinsequenz liegt. Hierfür wird pTPA5'cDNA (Diagramm 5) mit HgaI gespalten und Fragment 40 (517 bp), das die Basen 78 bis 593 enthält, mit Klenow-Enzym stumpfendig gemacht. Die stumpfen Enden werden mit einem 10-mer BamHI Linker ligiert und Fragment 40 wird mit NarI gespalten, wodurch Fragment 41 mit den Basen 68 bis 521 der TPA cDNA erhalten wird.
Plasmid pTPA cDNA (Diagramm 5) wird mit NarI und BglII gespalten und Fragment 42 (1644 bp), das den 3'-Teil der TPAcDNA enthält, wird aus einem Gel isoliert. Die Fragmente 41 und 42 werden mit Fragment 43 (4,3 kb) ligiert, das aus einer BamHI- und BglII-Spaltung von pKC7 stammt, wodurch pTPA cDNA, BamHI (6,5 kb) erhalten wird.

(3) Konstruktion von pTPA-IE-PA (Diagramm 22)

Plasmid pTPA-IE-PA, das eine modifizierte TPA cDNA mit der nativen Anordnung von TPA-Domänen enthält, kann durch CHO Zellen exprimiert werden oder eignet sich zur Konstruktion von alternativen TPA-Analoga-enthaltenden Expressionsplasmiden. Die Zusammensetzung von pTPA-IE-PA wird in zwei Schritten erreicht. Erstens wird die TPA cDNA von pTPA-cDNA in pSVCOW7 inseriert und dann wird der "immediate early" Promotor zur Transkriptions-Initiation des TPA-Analogons inseriert.
Schritt 1: Plasmid pSVCOW7 wird mit EcoRI und PvuII gespalten, wodurch Fragment 44 (600 bp) erhalten wird, das die Polyadenylierungssequenz von Rinder-Wachstumshormon von der PvuII-Stelle in dem 3'-Haupt-Exon des BGH-Gens bis zu der EcoRI-Stelle downstream des 3'-Endes enthält. Hinsichtlich einer vollständigen Diskussion der BGH-Polyadenylierungssequenzen wird auf die folgenden Literaturstellen verwiesen: (1) Europäische Patentanmeldung 0112012, veröffentlicht am 27. Juni 1984, worin die Identifizierung und Charakterisierung von BGH-genomischer DNA beschrieben wird; (2) Woychik, R. P., et al., "Requirement for the 3' Flanking Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (Juli 1984), 3944-3948 und Higgs, D. R., et al., Nature, 306 (24. November 1983), 398-400 und darin zitierte Literaturstellen.
Eine zweite Probe von pSVCOW7 wird mit EcoRI und BamHI gespalten, wodurch Fragment 45 erhalten wird. Fragment 45 kann andererseits von dem EcoRI/BamHI-Fragment aus dem Stamm-Plasmid pSV2dhfr stammen, das bei Bethesda Research Laboratories erhältlich ist. Fragment 45 enthält den Replikationsursprung von pBR322 und ein in E. coli exprimiertes Ampicillin-Resistenz-Gen, das die Selektion auf das Plasmid in E. coli erlaubt. Das Fragment enthält ebenfalls die Maus-Dihydrofolatreduktase-cDNA in einer Konstruktion, die die Expression in Säugetierzellen erlaubt (vgl. Subramani, et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 854-864).
Die TPA cDNA wird von Fragment 46 (1,9 kb) erhalten, das durch Spaltung von pTPA-cDNA, BamHI mit BamHI und BalI erhalten wird. Fragment 46 enthält die gesamte codierende Region der TPA cDNA. Die BamHI-Schnittstelle liegt in der cDNA, die für die 5'-nicht-translatierten Sequenzen der mRNA codiert, und die BalI-Schnittstelle liegt in der cDNA, die für die 3'-nicht-translatierte Region der cDNA codiert.
Die Fragmente 44, 45 und 46 werden zu pTPA-PA (8,4 kb) ligiert, das ein Replikationsvektor ist, der sich als Shuttle-Vektor zwischen E. coli und CHO Zellen eignet. Plasmid pTPA-PA wird zur Transformation von E. coli verwendet.
Schritt 2: Hier wird pTPA-PA in das Expressionsplasmid pTPA-IE-PA umgewandelt, indem der "immediate early gene"-Promotor von humanem Cytomegalovirus (CMV I.E. Promotor) inseriert wird. Der CMV IE-Promotor wird durch eine PstI-Spaltung des CMV-Genoms erhalten. Die Restriktionskarten der Region des humanen Cytomegalovirus-Genoms, die das "major immediate early gene" (CMV IE) enthält, wurden im einzelnen beschrieben (vgl. Stinski, et al., J. Virol. 46 (1983), 1-14; Stenberg, et al., J. Virol. 49 (1984), 190-199; Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 659-663).
Diese Literaturstellen beschreiben ein 2,0 kb PstI-Fragment, das unter seinen Sequenzen den Promotor für das "major immediate early gene" enthält. Der CMV IE-Promotor kann ferner durch eine Isolations-Spaltung dieses 2,0 kb PstI-Fragments mit Sau3AI erhalten werden, wodurch ein gewünschtes 760 bp Fragment unter den Produkten erhalten wird. Dieses 760 bp Fragment kann von den anderen Produkten durch seine Größe und das Vorliegen einer SacI-Spaltungsstelle und einer BalI-Spaltungsstelle innerhalb des Fragments unterschieden werden. Aufgrund seiner bequemen Identifizierung ist die Verwendung dieses Sau3AI-Fragments das bevorzugte Verfahren zur Verwendung des CMV IE-Promotors, wie vorstehend beschrieben.
Das in Schritt 1 konstruierte Plasmid pTPA-PA wird mit BamHI gespalten und ein Sau3AI-Fragment, das den CMV "immediate early" Promotor enthält, wird in die BamHI-Stelle inseriert.
Plasmide mit dem CMV Promotor-Fragment in einer solchen Orientierung, daß die Transkription von dem Promotor zur Synthese einer mRNA für TPA führt, werden durch Spaltung der Plasmide mit SacI identifiziert. Das erhaltene Plasmid wird mit pTPA-SE-PA bezeichnet und hat den CMV IE-Promotor an dem 5'-Ende der TPA cDNA und das BGH-Polyadenylierungssignal an seinem 3'-Ende.

(4) Konstruktion von pTPA-IE-FK2K2A (Diagramm 23)

Die Konstruktion von pTPA-IE-FK2K2A ist ein zwei-Schritte-Verfahren. Schritt 1 umfaßt die Herstellung von pTPA-FK2K2A, das das gewünschte TPA-Analogon, die Polyadenylierungssignal-Sequenz von BGH und die Selektionsmarker und Replika von pSVCOW7 enthält, und Schritt 2 umfaßt die Insertion des vorstehend diskutierten CMV IE-Promotors. Während das nachstehende Beispiel die Insertion des TPA-Analogons FK2K2A beschreibt, können weitere Analoga unter Verwendung der gleichen Enzyme und Verfahren inseriert werden.
Schritt 1: Plasmid pTPA-IE-PA (Diagramm 22) wird mit BamHI und BglII gespalten, wodurch Fragment 47 erhalten wird; das die TPA-Leadersequenz-Basen 1-188 enthält. Die Polyadenylierungssignalsequenz von BGH wird erhalten, indem pSVCOW7 (Diagramm 20) mit EcoRI und PvuII gespalten wird, wodurch Fragment 48 (600 bp) erhalten wird. Die TPA-Analogon-Sequenz wird erhalten, indem pFK2K2A (Diagramm 12) mit BglII und BalI gespalten wird, wodurch Fragment 49 (2,0 kb) erhalten wird. Eine zweite Probe von pSVCOW7 wird mit EcoRI und BamHI gespalten, wodurch Fragment 50 (5,8 kb) erhalten wird, das die Marker und Replika von pSVCOW7 enthält. Die vier Fragmente werden aus einem Gel isoliert und unter Verwendung von T4 Ligase zu pTPA-FK2K2A (8,3 kb) ligiert.
Schritt 2: Plasmid pTPA-FK2K2A wird mit BamHI gespalten und die Sau3A gespaltene CMV-IE-Promotorsequenz inseriert, wodurch TPA-IE-FK2K2A erhalten wird, das in E. coli bis zur Transfektion von CHO Zellen gehalten wird.

(5) Transfektion und Kultivierung von CHO Zellen

Plasmid pTPA-IE-FK2K2A wird zur Transfektion von an einem Mangel der Dihydrofolatreduktase (DHFR) leidenden Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) verwendet, indem das Calciumphosphat-Verfahren zur Transfektion der DNA in die Zellen eingesetzt wird, welches im einzelnen durch Graham, et al., ("Introduction of Macromolecules into Viable Mammmalian Cells", Alan R. Liss Inc., N. Y. (1980), 3-25) beschrieben ist. Die verwendete Zellinie ist die Mutante DXB-11, die ursprünglich von Chasin, L. der Columbia University erhältlich ist und vollständig beschrieben ist (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980), 4216-4220). Die vorstehenden Transfektions-Verfahren bauen auf der Tatsache auf, daß Zellen, die die transfizierten Plasmide aufgenommen haben, nicht länger einen dhfr-Mangel aufweisen und in "Dulbecco's modified Eagle's medium" plus Prolin kultiviert werden können.
Von den mit pTPA-IE-FK2K2A transfizierten Zellen werden Klone isoliert, die bei Wachstum in einem Monolayer für zwei Tage mindestens 10 ng pro Million Zellen synthetisieren. Von Zellen mit pIETPA-IPA-dhfr werden Klone isoliert, die mindestens 100 ng TPA pro Million Zellen synthetisieren. Eine Expression eines TPA-Analogon kann durch einen Radioimmuntest oder durch Western-Blot-Techniken nachgewiesen werden.
TPA-Analoga werden gemäß dem Verfahren von R&ijlig;ken und Collen gereinigt (vgl. Journal of Biological Chemistry 256 (1979), 7035-7041). Die rekombinanten TPA-Analoga enthaltenden CHO Zellen wachsen in serumfreiem Medium. Das Kulturmedium wird nach 72 Stunden geerntet und auf eine Zink-Chelat-Agarose-Säule gegeben, die mit 1,0 M NaCl und 0,1% Tween 80 enthaltendem 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5 equilibriert worden ist. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen und die TPA-Analoga durch einen linearen Gradienten von 0 bis 0,03% Imidazol in dem gleichen Puffer eluiert. Die Fraktionen, die TPA-Analoga enthalten, werden vereinigt, und auf eine Concanavalin A-Agarosesaule gegeben, die mit 1,0 M NaCl und 0,01% Tween 80 enthaltendem 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 equilibriert worden ist. Nach Waschung der Säule mit dem gleichen Puffer werden die TPA-Analoga durch einen linearen Gradienten des Equilibrierungspuffers zu einem 0,01% Tween® 80, 0,4 M D-Methylmannosid und 2 M Kaliumcyanat enthaltendem 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 eluiert. Die Fraktionen, die eine TPA-Aktivität enthalten, werden vereinigt und festes KSCN wird zugegeben, wodurch die KSCN-Konzentration bis auf 1,6 M erhöht wird. Die Fraktionen werden etwa 10fach konzentriert und auf eine Sephadex G-150 Säule gegeben, die mit 1,6 M KSCN und 0,01% Tween® enthaltendem 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 equilibriert worden ist. Die Fraktionen, die eine TPA-Aktivität enthalten, werden vereinigt, gegen 0,15 M NaCl und 0,01% Tween 80 dialysiert und bei -80ºC gelagert.

C. Expression in Spodoptera frugiperda

Das folgende Beispiel betrifft die TPA-Expression in Insekten-Zellkulturen. Sämtliche Verfahren werden detailliert beschrieben (vgl. Summers, M. D. und Smith, G. E., "A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", veröffentlicht durch das College of Agriculture, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986). Das Ausgangsplasmid, pAc373 (7,1 kb) ist ein allgemeiner Bakulovirus-Expressionsvektor mit einer einmaligen BamHI-Stelle unmittelbar downstream des Polyhedron-Promotors von Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Das Polyhedron-Protein ist ein Matrix-Protein, das für virale Infektion und Replikation in vitro nicht wesentlich ist. Das Plasmid ist bei Professor Max Summers vom Department of Entomology, Texas, A & M University, College Station, Texas 77843 erhältlich und vollständig beschrieben (vgl. Molecular and Cell. Biology 3 (12) (1983), 2156-2165.

(1) Konstruktion von pAcTPA (Diagramm 24)

Das Ausgangsplasmid pAc373 wird zur Aufnahme der TPA-Analoga modifiziert, indem in die einmalige BamHI-Stelle eine BglII-Stelle inseriert wird, die ebenfalls einmalig ist. Plasmid pAc373 wird zunächst mit BamHI gespalten und dann mit Mungobohnen-Nuklease zur Schaffung von stumpfen Enden behandelt. BglII-Linker werden dann mit den Enden ligiert und die Enden werden zu pAc373, BglII religiert. Plasmid pTPA cDNA, BamHI von Diagramm 21 wird vollständig mit BamHI gespalten und partiell mit BglII gespalten, wodurch das für eine intakte TPA cDNA codierende Fragment 51 (1,95 kb) erhalten wird. Fragment 51 wird aus einem Gel isoliert und in die BglII-Stelle von pAc373, BglII inseriert, wodurch pAcTPA erhalten wird, das zur Expression von nativem TPA in S. frugiperda fähig ist.

(2) Konstruktion von pAcFK2K2A (Diagramm 25)

Für dieses Expressionsplasmid wird das TPA-Analogon FK2K2A aus pFK2K2A (Diagramm 12) unter Verwendung von BglII herausgeschnitten und die das TPA-Analogon codierende cDNA als Fragment 53 (2,0 kb) aus einem Gel isoliert. Plasmid pAcTPA (Diagramm 24) wird mit BglII gespalten, wodurch Fragment 52 (7,15 kb) erhalten wird. Die Fragmente 52 und 53 werden zu pAcFK2K2A (9,15 kb) ligiert, das in E. coli bis zur Transfektion von S. frugiperda gehalten wird.

(3) Transfektion und Kultivierung von S. frugiperda

Die TPA-Analoga werden mit nativer ACNPV DNA durch Cotransfektion in S. frugiperda rekombiniert. S. frugiperda (SF9; ATCC CRL 1711) wird in Grace Medium (Gibbco Lab. Livonia, MI 48150) mit 10% fötalem Kälberserum und mit Difco Lactalbumin Hydrolysat und Yeastolat ergänzt, kultiviert. Die Zellen werden mit AcNPV DNA und pAcTPAFK2K2A mit 1 u/ml bzw. 2 u/ml cotransfiziert. Resultierende Viruspartikel werden erhalten, indem das Medium gesammelt und zelluläres Material durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt werden. Das virus-enthaltende Medium wird dann zur Infektion von S. frugiperda verwendet. Nachfolgende Infektion von S. frugiperda unter Verwendung dieser viralen Partikel, die sowohl native virale DNA, als auch DNA umfassen, die mit der für das FK2K2A-Analogon codierenden cDNA rekombiniert ist, führt in einigen Zellen zur Expression des TPA-Analogons an Stelle des Polyhydron-Proteins. Ein Nachweis der infizierten Zellkolonien, die TPA-Analoga produzieren, wird durch Überschichtung eines Monolayers von S. frugiperda erreicht, der vorher 1 Stunde mit Serienverdünnungen des Virus-enthaltenden Mediums (10&supmin;¹-10&supmin;&sup6;) infiziert worden ist. Die Zellen werden dann mit 0,7% niedrigschmelzendem Agar enthaltendem Grace-Medium überschichtet, das 6 mg/ml Fibrinogen und 0,5 Einheiten Thrombin aufweist. Jene Zellen, die aktives TPA produzieren bilden klare Höfe um die Infektionsorte aus.

Beispiel 5:

FK2A wurde aus CHO Zellen isoliert und auf Aktivität und Antigenität getestet. Hinsichtlich einer Standard-TPA-Präparation sind die einzelnen Aktivitäten von gereinigter nativer, rekombinanter DNA und von FK2A 49000 und 4,2 ± 0,06 l/ml. Unter Verwendung des polyklonalen Ziegen-Antikörpers gegen vorstehend beschriebenes TPA betrugen die einzelnen Antigen-Messungen 912000 und 97 ± 28 ng/ml.
FK2A bildet mit einem Plasminogenaktivator-Inhibitor von Blutplättchen (Thrombin-induziertes-Blutplättchen-"Releasat") Komplexe aus. Das Molekulargewicht von FK2A beträgt etwa 40000 Dalton. Das Molekulargewicht des Enzym-Inhibitorkomplexes beträgt etwa 85000 Dalton.
TPA eignet sich therapeutisch zur Lösung von Thrombosen (vgl. The Lancet (7. November 1981), 1018-1020; Science 220 (1983), 1181; N. Eng. J. Med. 310 (1984), 609). Die Verabreichung von TPA-Analoga an Patienten mit Coronar-Thrombosen kann über intracoronare bzw. intravenöse Wege gemäß den allgemeinen, in diesen Literaturstellen beschriebenen Verfahren erfolgen. Tabelle 1
Paarungen - 2526; Falschpaarungen - 15; Einzelsträngig - 12 Länge - 2553; Paarungen/Länge - 99,0% Tabelle 2
Paarungen - 556; Fehlpaarungen - 7; Einzelstrangig - 3 Länge - 566; Parungen/Länge - 98,2% Tabelle 3 TPA OLIGONUKLEOTIDE BLOCK 1 - FINGER-DOMÄNE BLOCK 2 - WACHSTUMSFAKTOR DOMÄNE BLOCK 3 - KRINGLE 1 - DÖMÄNE BLOCK 4 - KRINGLE 2 - DOMÄNE
Tabelle 4 TPA-Domänen Domänen Native TPA Finger Serin Lysin Nukleotide Wachstumsfaktor Threonin Kringle Cystein Glutaminsäure Aktive Stelle TPA ANALOG A (Diagramm 11) Valin Alanin Prolin

Diagramm 1: Konstruktion von pTRZ1

(a) pMG1403 wird mit EcoRI, Klenow-Enzym und bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, wodurch Fragment 1 erhalten wird. Fragment 1
(b) pVV1 wird mit PvuII mit BglII und Klenow-Enyzm behandelt und anschließend wird Fragment 2 (323 bp), das den trp-Promotor und einen Teil von trp Le enthält, gereinigt. Fragment 2
(c) Fragmente 1 und 2 werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch pTRZ1 (10 kb) erhalten wird
AmpR = Ampicillin-Resistenz
LacZ, LacY, LacA = Gene in dem Laktose-Operon
Ptrp = Trp-Promotor/Operator
trpLE = Fusion von trpL und trpE

Diagramm 2: Konstruktion von pSK3 (4,3 kb)

(a) pTRZ1 (10 kb) wird mit BamHI und EcoRI und alkalischer Phosphatase behandelt, wodurch das Fragment 3 (350 bp) erhalten wird. Fragment 3
(b) pKC7 (5,8 kb) wird mit BamHI und EcoRI behandelt, wodurch Fragment 4 (4,0 kb) erhalten wird. Fragment 4
(c) Fragmente 3 und 4 werden zu pSK3 (4,3 kb) ligiert.
D = Trp-Promotor/Operator
E = TrpL-ribosomale Bindungsstelle
F = trpLE und Restriktionsstellen
AmpR = Ampicillin-Resistenz

Diagramm 3: Konstruktion von pSK4

(a) pSK3 wird mit EcoRI und BamHI zur Isolierung von Fragment 5 (322 bp) geschnitten. Fragment 5
(b) Eine partielle TaqI-Spaltung führt zu dem 278 bp Fragment 6 (EcoRI-TaqI''') und anderen Fragmenten.
(c) Fragment 6 wird in mit EcoRI und ClaI gespaltenem pBR322 kloniert, wodurch pSK4 (4,6 kb) erhalten wird.
D = Trp Promotor/Operator
E = Shine-Dalgarno Region

Diagramm 4: Konstruktion von pTPA 3' cDNA

(a) Plasmid pTPAH (5,7 kb) wird erhalten, indem pBR322 mit PstI gespalten, mit einem Schwanz versehen und die die Positionen 1250 bis 2530 aufweisende 3'-Region der TPA cDNA inseriert werden.
(b) Plasmid pTPA80-1 (5,4 kb) wird erhalten, indem pBR322 mit PstI gespalten, mit einem Schwanz versehen und die die Positionen 550-1600 aufweisende cDNA von TPA inseriert werden.
(c) Die Plasmide pTPAH und pTPA80-1 werden mit SacI und PvuI gespalten und die Fragmente 7 (1251 bp) bzw. 8 (5,1 kb) aus einem Gel isoliert. Die Fragmente werden mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt und mit T4 zu pTPA 3'cDNA (6,3 kb) ligiert, die die Basen 550-2530 der TPA cDNA aufweist.
TetR = Tetracyclin-Resistenz
P = 550-802 Basenpositionen der TPAcDNA
A = 803-2530 Basenpositionen der TPAcDNA
N = Nicht-translierte 3'-Region der TPAcDNA

Diagramm 5: Konstruktion von pTPAcDNA

(a) Plasmid pTPA 5' cDNA wird erhalten, indem pBR322 mit PstI gespalten, mit einem Schwanz versehen und die 5'-Region der TPA cDNA mit den Positionen 1-750 inseriert wird.
(b) Plasmid pTPA 5' wird mit TaqI zum Erhalt von Fragment 9 (2194 bp) gespalten, das aus einem Gel isoliert und mit BglII und HgaI zum Erhalt von Fragment 10 (405 bp) gespalten wird, das die Basen 1-8 bis 593 der TPAcDNA (reifes TPA-Protein enthält. Fragment 10
(c) Plasmid pTPA 3' cDNA (Diagramm 4) wird mit PvuII und EcoRI gespalten und Fragment 11 (1748 bp) aus einem Gel isoliert. Fragment 11 wird mit HgaI zum Erhalt von Fragment 12 (209 bp) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird und die Basen 594 bis 802 enthält. Fragment 11

Diagramm 5 (Fortsetzung)

(d) Plasmid pTPA 3' cDNA wird mit PvuI gespalten, das lineare 6,3 kb Fragment durch Behandlung mit T4 Polymerase stumpfendig gemacht und dann partiell mit EcoRI zum Erhalt von Fragment 13 (1871 kb) gespalten, das die Basen 802 bis 2530 plus 123 bp von pBR322 enthält Fragment 13
(e) Plasmid pKC7 wird mit BglII und SmaI gespalten, mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt und Fragment 14 (4,8 kb) aus einem Gel isoliert. Fragment 14
(f) Die Fragmente 10, 12, 13 und 14 werden vereinigt und unter Verwendung von T4-Ligase zu TPAcDNA (7,4 kb) ligiert, die die reife TPA cDNA enthält.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
T = 5'Teil der TPA cDNA
P = Mittelteil der TPA cDNA
A = 3'Teil der TPA cDNA
N = Nicht-translatierter Teil der TPA cDNA

Diagramm 6: Konstruktion von pTPA-B1

(a) Plasmid pSK4 wird mit ClaI und SphI zum Erhalt von Fragment 15 (4,1 kb) gespalten, das isoliert und mit Block 1 ligiert wird, der die Finger-Domäne über einen ATG enthaltenden ClaI/XbaI-Linker enthält. Fragment 15 Block Linker
(b) Fragment 15 und Block 1 werden über den Linker zu pTPA-B1 (4,25 kb) ligiert.
D = Trp Promotor/Operator
E = TrpL ribosomale Bindungsstelle
F = Finger-Domäne
AmpR = Ampicillin-Resistenz
ATG = Initiationscodon

Diagramm 7: Konstruktion von pTPA-B1,2

(a) Plasmid pTPA-B1 wird mit EcoRI und SphI zum Erhalt von Fragment 16 (450 pb) und die Wachstumsfaktor-Domäne enthaltenden Block 2 (100 bp) gespalten, und beide werden aus dem entsprechenden Klon unter Verwendung von EcoRI und SphI isoliert. Fragment 16 Block
(b) Fragment 16 und Block 2 werden mit Fragment 17 (4,35 kb) ligiert, das von einer EcoRI/ClaI-Spaltung von pBR322 stammt, wodurch pTPA-B1,2 (4,8 kb) erhalten wird. Fragment 17
P/O = Trp Promotor/Operator
RbS = Trp ribosomale Bindungsstelle
ATG = Initiationscodon
F = Finger-Domäne
G = Wachstumsfaktor-Domäne
AmpR = Ampicillin-Resistenz
Ori = Replikationsursprung von pBR322

Diagramm 8: Konstruktion von pTPA-B1,2(a)

(a) Plasmid pTPA-B1,2 wird mit XbaI und EcoRI zum Erhalt von Fragment 18 (4,5 kb) gespalten, das isoliert und mit einem eine HindIII-Stelle und eine BglII-Stelle enthaltenden Linker ligiert wird, wodurch pTPA-B1,2(a) (4,5 kb) erhalten wird. Fragment 18
F = Finger
G = Wachstumsfaktorregion
AmpR = Ampicillin-Resistenz

Diagramm 9: Konstruktion von pTPA-B1,2,3

Plasmid pTPA-B1,2(a) wird mit ClaI/BamHI gespalten und Fragment 19 (4,0 kb) isoliert und mit Block 3 (270 bp) ligiert, der Kringel 1 und eine ClaI-Stelle upstream und eine BamHI-Stelle downstream enthält, wodurch pTPA3 (4,3 kb) erhalten wird. Fragment 19
F = Finger-Domäne
G = Wachstumsfaktor-Domäne
K = Kringle 1
AmpR = Ampicillin-Resistenz

Diagramm 10: Konstruktion von pTPA-B1,2,3,4(a)

(a) Plasmid pTPAcDNA (Diagramm 5) wird mit ScaI gespalten und Fragment 20 (6,0 kb) aus einem Gel isoliert, das den 3'-Teil des TPA-Gens enthält. Fragment 20
(b) Plasmid pTPA-B1,2,3 (Diagramm 9) wird mit ScaI und BamHI gespalten und Fragment 21 (1100 bp) aus einem Gel isoliert. Fragment 21
(c) Aus Block 4 enthaltendem Klon wird ein BamHI/ScaI Fragment 4a (230 bp) isoliert, das die Kringle 2-Region enthält. Fragment 4a
(d) Die Fragmente 20, 21 und 4a werden ligiert, wodurch pTPA-B1,2,3,4a erhalten wird.
(e) Plasmid pTPA-B1,2,3,4a wird mit HindIII und AatII gespalten und das 2,2 kb Prototyp-TPA-Gen in mit HindIII und AatII gleich gespaltenem pUC19 subkloniert, wodurch pTPA-B1,2,3,4a (4,2 kb) erhalten wird. Plasmid pTPA-B1,2,3,4a ist von den Symbolen her ähnlich zu pTPA-B1,2,3 weist jedoch eine viel günstigere Anordnung von Restriktionsstellen auf.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
F = Finger-Domäne
G = Wachstumsfaktor-Domäne
K = Kringle 1-Domäne
k = Kringle 2-Domäne
a = Aktive Stelle
N = Nicht-transalatierter Teil der TPA cDNA

Diagramm 11: Konstruktion von pTPA-B1,2,3,4

(a) Plasmid pTPA-B1,2,3,4a wird mit EcoRI und BamHI gespalten. Das große Fragment (3,7 kb) wird mit Block 4 (560 bp) ligiert, der von dem geeigneten, ebenfalls mit EcoRI (partielle Spaltung) und BamHI gespaltenen Klon erhalten wurde, wodurch pTPA-B1,2,3,4 erhalten wird.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
F = Finger-Domäne
G = Wachstumsfaktor-Domäne
K = Kringle 1-Domäne
k = Kringle 2-Domäne
A = 3' Teil von TPA cDNA
N = Nicht-translatierter Teil der TPA cDNA

Diagramm 12: Konstruktion von pFK2K2A

(a) Plasmid pTPA-B1,2,3,4a wird mit HpaI zum Erhalt von Fragment 22 (6,5 kb) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 22
(b) Plasmid pTPA-B1,2,3,4 wird mit HpaI und MstI zum Erhalt von Fragment 23 (506 bp) gespalten, das Kringle 2 enthält.
(c) Die Fragmente 22 und 23 werden miteinander ligiert, wodurch pFK2K2A (7,1 kb) erhalten wird.
Ori = Replikationsursprung
AmpR = Ampicillin-Resistenz
k = Kringle 2-Domäne
F = Finger-Domäne
A = Aktive Stelle
N = Nicht-codierende 3' Sequenz

Diagramm 13: Konstruktion von pTPAExp1

(a) Plasmid pTPA-B1,2 (Diagramm 7) wird mit XbaI und BamHI gespalten und Fragment 24 (4,2 kb) aus einem Gel isoliert. Fragment 24
(b) Plasmid pFK2K2A (Diagramm 12) wird mit XbaI und BglII zum Erhalt von Fragment 25 (2,0 kb) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 25
(c) Die Fragmente 24 und 25 werden zu pTPAExp 1 (6,2 kb) ligiert; BamHI und BglII sind komplementär, werden jedoch nicht wieder erhalten.
trpP/O = Tryptophan-Promotor/Operator
RBS = ribosomale Bindungsstelle
k = Kringle 2
F = Finger-Domäne
A = Aktive Stelle
N = Nicht-codierende 3' Sequenz
AmpR = Ampicillin-Resistenz
ATG = Initiationscodon

Diagramm 14: Konstruktion von pyRep3'B

(a) Plasmid pYIP31 wird mit SmaI gespalten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase zum Erhalt von Fragment 26 behandelt. Fragment 26
(b) Das 2 ul Plasmid von Hefe wird mit PstI und XbaI gespalten und mit Klenow-Enzym behandelt. Das erhaltene Fragment 27 (1,3 kb) wird isoliert. Fragment 27
(c) Die Fragmente 26 und 27 werden zu pyRep3'B (6,7 kb) ligiert.
u = URA3
R = Sequenz zwischen RepIII und Replikationsursprung

Diagramm 15: Konstruktion von Plasmid pGG400

(a) Plasmid pBR322 wird mit EcoRI und PvuII gespalten und die Enden werden mit Klenow-Enzym zum Erhalt von Fragment 28 (2,3 kb) aufgefüllt. Fragment 28
(b) Plasmid pML21 wird mit PvuII zum Erhalt von Fragment 29 (1,7 kb) gespalten. Fragment 29
(c) Die Fragmente 28 und 29 werden unter Verwendung von T4 zu pGG400 (4,0 kb) ligiert.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
KmR = Kanamycin-Resistenz

Diagramm 16: Konstruktion von pADHt

(a) Plasmid pGG400 wird mit XhoI und PvuII gespalten, mit Klenow-Enzym behandelt und das erhaltene Fragment 30 (3,5 kb) isoliert. Fragment 30
(b) Plasmid pADHBC wird mit HincII und BamHI gespalten, die Enden werden mit T4-Ligase aufgefüllt und das erhaltene Fragment 31 (0,36 kb) wird isoliert. Fragment 31
(c) Die Fragmente 30 und 31 werden unter Verwendung von T4-Ligase zum Erhalt von pADHt (3,86 kb) ligiert.
AmpR = Amicillin-Resistenz
KmR = Kanamycin-Resistenz
H = ADHt 3' Ende

Diagramm 17: Konstruktion von Plasmid pADHt-RepIII

(a) Plasmid pADHt wird modifiziert, indem es mit BamHI gespalten, die BamHI-Stelle aufgefüllt und mit einem 8-mer SalI-Linker legiert wird.
(b) Plasmid pADHt (modifiziert) wird mit SphI gespalten und die Enden werden mit T4 Ligase zum Erhalt von Fragment 32 (3,8 kb) aufgefüllt.
(c) Plasmid pyRep31B (Diagramm 16) wird mit HindIII gespalten und die Enden werden mit T4 Ligase zum Erhalt von Fragment 33 (2,4 kb) aufgefüllt.
(d) Die Fragmente 32 und 33 werden unter Verwendung von T4 Ligase zu pADHt-RepIII (6,2 kb) ligiert.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
H = ADHt 3'-Ende
u = URA3
R = RepIII und Replikationsursprung

Diagramm 18: Konstruktion von pα1-ADHt

(a) Plasmid pADHt-RepIII (Diagramm 15) wird mit EcoRI und HindIII gespalten und Fragment 34 (5,3 kb) isoliert. Fragment 34
(b) Plasmid pα1 wird mit EcoRI und HindIII gespalten, wodurch das MFα1 Gen-enthaltende Fragment 35 mit 1,2 kb erhalten wird. Fragment 35
(c) Die Fragmente 34 und 35 werden unter Verwendung von T4 Ligase zu pα1-ADHt (6,5 kb) ligiert.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
H = ADHt 3' Ende
u = URA3
R = RepIII und Replikationsursprung
MF 1 = Promotor und Signalsequenz für MFα1-Gen

Diagramm 19: Konstruktion von pα1-FK2K2A

(a) Plasmid pFK2K2A (Diagramm 12) wird mit BglII zum Erhalt von Fragment 36 (2,0 kb) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 36
(b) Plasmid pα1-ADHt wird mit HindIII und XhoI gespalten; die Enden werden partiell mit Klenow-Enzym in Gegenwart der Basen Adenosin und Guanosin aufgefüllt und mit Mungobohnen-Nuklease zum Erhalt von Fragment 37 (5,6 kb) behandelt, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 37
(c) Die Fragmente 36 und 37 werden zu pα1-FK2K2A (7,6 kb) ligiert.
MFα1 = Promotor und Signalsequenz für MF 1-Gen
F = Finger
k = Kringle 2-Region
a = Aktive Stelle
N = Nicht-transalatierte 3' Sequenz
H = ADHt-3'-Ende
u = URA3
R = RepIII und Replikationsursprung

Diagramm 20: Konstruktion von pSVCOW7

(a) Plasmid pSV2dhfr wird mit BamHI und EcoRI zum Erhalt von Fragment 38 (5,0 kb) gespalten. Fragment 38
(b) Plasmid pλGH2R2 wird mit BamHI und EcoRI zum Erhalt von Fragment 39 (2,1 kb) gespalten. Fragment 39
(c) Die Fragmente 38 und 39 werden zu pSVCOW7 (7,1 kb) ligiert.
A = Rinder-Wachstumshormon-PolyA Schwanz
G = Genomisches Rinder-Wachstumshormon
I = Intron
dhfr = Dihydrofolatreduktase
SV40 = SV40 Promotor und Replikationsursprung
AmpR = Ampicillin-Resistenz

Diagramm 21: Konstruktion von pTPA cDNA' BamHI

(a) Plasmid pTPA5'cDNA (Diagramm 5, Teil a) wird mit Hga gespalten und Fragment 40 (517 bp) durch Behandlung mit Klenow stumpfendig gemacht und mit einem 10-mer BamHI-Linker ligiert. Fragment 40 wird mit NarI zum Erhalt von Fragment 41 (440 bp) gespalten, das die Basen 78 bis 518 der TPA cDNA enthält. Fragment 40
(b) Plasmid pTPAcDNA (Diagramm 5) wird mit NarI und BglII gespalten und Fragment 42 (1644 bp), das den 3'Teil der TPAcDNA enthält, aus einem Gel isoliert. Fragment 42
(c) Plasmid pKC7 wird mit BamHI und BglII zum Erhalt von Fragment 43 (4,3 kb) gespalten, das aus einem Gel isoliert und mit den Fragmenten 41 und 42 zu pTPA cDNA, BamHI (6,5 kb) ligiert wird.
L = Leadersequenz
T = 5' Teil der TPAcDNA
P = Mittelteil der TPAcDAN
A = 3'-Teil der TPAcDNA
N = Nicht-translatierter 3' Teil der TPAcDNA

Diagramm 22: Konstruktion von PTPA-IE-PA

(a) Plasmid pSVCOW7 wird mit EcoRI und PvuII zum Erhalt von Fragment 44 (600 bp) gespalten, das die Polyadenylierungssequenz von Rinder-Wachstumshormon enthält und aus einem Gel isoliert wird. Fragment 44
(b) Plasmid pSVCOW7 (Diagramm 20) wird mit EcoRI und BamHI zum Erhalt von Fragment 45 (5,8 kb) gespalten. Fragment 45
(c) Plasmid pTPAcDNA, BamHI (Diagramm 21) wird mit BamHI und Ball zum Erhalt von Fragment 46 (2,0 kb) gespalten. Fragment 46
(d) Die Fragmente 44, 45 und 46 werden zu pTPA-PA (8,4 kb) ligiert.

Diagramm 22 (Fortsetzung)

Plasmid pTPA-PA wird mit BamHI gespalten und der von einer PstI und Sau3AI Spaltung des CMV-Genoms erhaltene CMV-IE Promotor (760 bp) inseriert, wodurch pTPA-IE-PA erhalten wird.
AmpR = Ampicillin-Resistenz
Ori = pBR322-Replikationsursprung
SV40/ori = Simian Virus-Replikationsursprung
Mo/dhfr = Maus-Dihydrofolatreduktase-Marker
CMV/Prom = Cytomegalovirus-Promotor
L = TPA-Leadersequenz
T = 5'-Region der TPA cDNA
A = 3'-Region der TPA cDNA
N = Nicht-translatierte 3' Region der TPA cDNA
a = Polyadenylierungssignalsequenz

Diagramm 23: Konstruktion von pTPA-IE-FK2K2A

(a) pTPA-IE-PA (Diagramm 22) wird mit BamHI und BglII zum Erhalt von Fragment 47 (120 bp) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 47
(b) Plasmid pSVCOW7 wird mit EcoRI und PvuII zum Erhalt von Fragment 48 (600 bp) gespalten, das die Polyadenylierungssequenz von Rinder-Wachstumshormon enthält und aus einem Gel isoliert wird. Fragment 48
(c) Plasmid pFK2K2A (Diagramm 12) wird mit BglII und BalI zum Erhalt von Fragment 49 (1,7 kb) gespalten, das aus einem Gel isoliert wird. Fragment 49
(d) Plasmid pSVCOW7 (Diagramm 20) wird mit EcoRI und BamHI zum Erhalt von Fragment 50 gespalten. Fragment 50

Diagramm 23 (Fortsetzung)

(e) Die Fragmente 47, 48, 49 und 50 werden unter Verwendung von T4 Ligase zu pTPAFK2K2A (8,3 kb) ligiert.
(f) Plasmid pTPAFK2K2A wird mit BamHI gespalten und der von einer PstI und Sau3AI Spaltung des CMV Genoms erhaltene CMV-IE Promotor (760 bp) inseriert, wodurch pTPA-IE-FK2K2A erhalten wird.

Diagramm 24: Konstruktion von pAcTPA

(a) Plasmid pAc373 (7,1 kb) wird mit BamHI gespalten und mit Mungbohnen-Nuklease zur Schaffung von stumpfen Enden behandelt, an die BglII-Linker angebunden werden. Die Enden werden wieder verbunden, wodurch pAc373, BglII erhalten wird.
(b) Plasmid pTPAcDNA, BamHI (Diagramm 21) wird mit BamHI und partiell mit BglII gespalten, wodurch Fragment 51 (1,95 kb) erhalten wird, das eine intakte TPAcDNA enthält. Fragment 51
(c) Fragment 51 wird inseriert und mit der BglII Stelle von pAc373, BglII ligiert, wodurch pAcTPA (9,05 kb) erhalten wird.
L = Leadersequenz
T = 5' Teil der TPAcDNA
P = Mittelteil der TPAcDNA
A = 3' Teil der TPAcDNA
N = Nicht-translatierter 3'-Teil der TPAcDNA
AmpR = Ampicillin-Resistenz
Poly - Polyhedrin-Protein-Gen

Diagramm 25: Konstruktion von pAcFK2K2A

(a) pAcTPA (Diagramm 24) wird mit BglII zum Erhalt von Fragment 52 (7,15 kb) gespalten. Fragment 52
(b) Plasmid pFK2K2A (Diagramm 12) wird mit BglII gespalten und die analoge cDNA als Fragment 53 (2,0 kb) aus einem Gel isoliert. Fragment 53
(c) Die Fragmente 52 und 53 werden zu pAcFK2K2A (9,15 kb) ligiert.
L = Leadersequenz
F = Finger-Domäne
k = Kringle 2-Domäne
A = Domäne mit aktiver Stelle
N = Nicht-translatierter Teil der TPAcDNA
AmpR = Ampicillin-Resistenz.

Claims

1. TPA-ähnliches Protein mit einem Molekulargewicht von weniger als 90000 Dalton und, das im Vergleich mit TPA, dessen nativer Aufbau FGK1K2A ist, den Aufbau FK2A, FK2K2A oder FGK2A hat, worin F die Finger-Domäne ist, G die Wachtstumsfaktor-Domäne ist, K1 und K2 die Kringle 1- und 2-Domänen sind und A eine aktive Stelle ist.

2. Protein nach Anspruch 1 mit dem Aufbau FK2A.

3. DNA, codierend für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 und enthaltend in den die Zwischendomänen-Bereiche codierenden Nukleotidsequenzen nicht-native Endonuklease- Restriktionsstellen, die in den die Domänen-Bereiche codierenden Nukleotidsequenzen nicht vorliegen.

4. DNA nach Anspruch 3, enthaltend eine XbaI-Stelle zwischen den Nukleotidbasen 187 und 198 der nativen Anordnung.

5. DNA nach Anspruch 3 oder 4, enthaltend eine HpaI- oder SphI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 328 und 342 der nativen Anordnung.

6. DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5, enthaltend eine EcoRV-, ClaI- oder SmaI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 442 und 462 der nativen Anordnung.

7. DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 6, enthaltend eine BamHI- oder HpaI-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 709 und 726 der nativen Anordnung.

8. DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 7, enthaltend eine MstHI-, SphI- oder XmaIII-Stelle oder eine Kombination davon zwischen den Nukleotidbasen 973 und 997 der nativen Anordnung.

9. DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 8, worin die Nukleotidsequenzen upstream and downstream der das TPA-ähnliche Protein codierenden Sequenz die DNA befähigen, durch Zellen eines geeigneten Wirts aufrechterhalten zu werden.

10. DNA nach Anspruch 9 mit der Fähigkeit, die Zellen das TPA-ähnliche Protein exprimieren zu lassen.

11. DNA nach Anspruch 9 oder 10, worin der Wirt Hefe, eine eukaryotische oder Escherichia Spezies ist.

12. DNA nach Anspruch 11, worin die Zellen Eierstockzellen von Chinesischem Hamster sind.

13. DNA nach Anspruch 10, worin der Wirt ein Insekt ist.

14. DNA nach Anspruch 13, worin das Insekt Bombyx mori oder Spodoptera frugiperda ist.

15. Zellen, enthaltend DNA nach Anspruch 10, in denen das Protein exprimiert werden kann, nämlich Zellen von E.coli, Hefe, einem Insekt oder einem Säugetier.