DE3752278T2

DE3752278T2 - Verfahren für elektrochemische Messungen

Info

Publication number: DE3752278T2
Application number: DE3752278T
Authority: DE
Inventors: Brian Jeffrey Birch; Ian William Burns
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1986-07-23
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1999-12-30
Anticipated expiration: 2007-07-24
Also published as: EP0470649A2; ES2033854T3; GR3005757T3; EP0255291B1; ATE180892T1; ATE77697T1; DE3779967T2; GB8618022D0; EP0470649B1; EP0255291A1; ES2131501T3; DE3779967D1; EP0470649A3; DE3752278D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen elektrochemischer Messungen, im speziellen aber nicht ausschließlich für die Ausführung mikrochemischer Tests bei kleinen flüssigen Proben von biologischem, z. B. klinischem Ursprung.

Hintergrund der Erfindung

F. Schlapfer et al. (Clin. Chim. Acta, 1974, S. 283-289) hat elektrochemische Messungen der Glukosekonzentration unter Verwendung von Glukoseoxidase und löslichen Elektronentransfersubstanzen, wie Ferricyanid, p-Benzochinon, 2,6-Dichlorphenolindophenol, Pyocyanin, Thionin oder Methylenblau, beschrieben, die mit amperometrischen Edelmetallelektroden in Wechselwirkung standen.
Diese Vorrichtungen führten nicht zu Glucomeßvorrichtungen, die einfach und bequem in einer Umgebung zu verwenden sind, die fernab liegt von dem ausgebildeten Personal analytischer Laboratorien.
Seit 1974 wurde eine Vielzahl weiterer Elektrodenvorrichtungen für die chemische/immunochemische Analyse vorgeschlagen, darunter Elektroden, die immobilisierte Redoxmediatoren sowie Enzyme tragen, z. B. EP 0 078 636, 0 125 136 und 0 125 139 (Genetics International) und 0 142 301 (Se rono). Die EP O 177 743 (Shimadzu) beschreibt Enzymelektroden von einigermaßen komplexer Konstruktion, die geeignet sind, um zur Messung einer Anzahl von Enzymsubstraten durch Amperometrie, unter Verwendung von Elektrontransfermediatoren, verwendet zu werden.
Die EP 0 125 137 offenbart ein Elektrodensensorsystem zur Überwachung von Bestandteilen in einer flüssigen Mischung unter Verwendung eines sondenartigen Sensors, der typischerweise eine Elektrodenoberfläche umfaßt, die einen üblicherweise unlöslichen Elektronentransfermediator aufweist, der selbst mit einem Enzym beschichtet ist, wobei der Elektronentransfermediator die Rolle übernimmt, Ladung zwischen dem Enzym und der Elektrode zu übertragen. Das System wird typischerweise dazu verwendet, Glukosekonzentrationen unter Verwendung amperometrischer Techniken zu bestimmen.
Die Veröffentlichung in "Analytical Chemistry", Band 56, Nr. 2, Februar 1984, Seiten 148 bis 152 offenbart eine Enzymelektrode, die eine Dünnschichtplatinelektrode in Verbindung mit dem Enzym Glukoseoxidase oder Flavinadenindinukleotid verwendet und verweist auf die Möglichkeit, die Tiefe der Reaktionskammer zu reduzieren, um die Leistung zu optimieren.
Die US 4,059,406 offenbart einen elektrochemischen Detektor, der eine Dünnschichtflußzelle mit einer Sensorelektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode aufweist. Eine zu überwachende Lösung wird der Zelle durch eine Mantel- Strömungs-Vorrichtung zugegeben und eine periodisch wechselnde Spannung wird an der Sensorelektrode angelegt, so daß ein Reaktionsprodukt auf der Elektrode abgelagert wird und dann anschließend entfernt wird. Typische Anwendungen für den Detektor beinhalten das kontinuierliche Überwachen von elek troaktiven Spurenmaterialien in Wasser, die anodische Ablösevoltametrie bei kontinuierlichem Fluß und organische elektroanalytische Chemie.
Diese Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren bereitzustellen, das eine schnelle, bequeme und genaue Messung von verschiedenen Bestandteilen flüssiger Proben, im speziellen von biologischem Ursprung, z. B. klinische Proben aus Blut, Serum oder Urin, zu ermöglichen.
In diesem Zusammenhang beschreiben wir eine Meßvorrichtung von einfacher Konstruktion, die als Wegwerfprodukt verwendet werden kann.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren unter Verwendung von elektrochemischen Zellen zur bequemen Analyse flüssiger Proben zur Verfügung zu stellen, ohne daß komplexe Elektrodenstrukturen, die immobilisierte Komponenten beinhalten, benötigt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Messung oder zum Nachweis eines Bestandteils einer wäßrigen flüssigen Probe zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
Einführen einer Probe, die den interessierenden Bestandteil möglicherweise enthält, in eine Reaktionszelle, wobei die Reaktionszelle eine kapillarförmige Füllvorrichtung umfaßt und mindestens zwei Elektroden, die eine Impendanz aufweisen, die sie für coulometrische, amperometrische oder voltametrische Verfahren geeignet macht, so daß die Probe eine Flüssigkeitsschicht mit einer Dicke von weniger als etwa 0,2 mm in einer Reaktionszone bildet, die eine der Elektroden überschichtet,
Umsetzen des Bestandteils, falls vorhanden, direkt oder indirekt mit einem Redoxreagenz, das von einer der Elektroden verkörpert wird, um die Ablagerung eines Derivates des Bestandteils auf der Elektrode zu bewirken, gekennzeichnet durch
Überwachen des Stromflusses beim anschließenden Ablösen des Derivats, um eine Anzeige der Gegenwart oder der Menge des interessierenden Bestandteils durch Coulometrie, Voltametrie oder Amperometrie bereitzustellen.
Das Ergebnis, das mit der Menge der zu messenden Substanz in Beziehung steht, kann unter anderem als ein Kennwert der Konzentration der Substanz in einer flüssigen Probe verwendbar sein.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen schließen sich "Redoxreagenz" und ähnliche Begriffe und "Elektronentransferreagenz" und entsprechende Begriffe gegenseitig ein.
Die Erfindung kann in einer Vorrichtung zum Ausführen eines elektrochemischen Nachweises oder einer elektrochemischen Messung eines Bestandteiles einer wäßrigen flüssigen Probe ausgeführt werden, wobei die Vorrichtung umfaßt:
eine Reaktionszelle, die mindestens zwei Elektroden umfaßt, wobei die Elektroden eine Impendanz aufweisen, die sie für coulometrische, amperometrische oder voltametrische Verfahren geeignet macht und sie in einer Reaktionszone oder an grenzend daran lokalisiert sind, wobei die Reaktionszone geeignet ist, eine wäßrige flüssige Probe, die die interessierende Komponente möglicherweise enthält, aufzunehmen und wobei die Elektroden und die Reaktionszone so angeordnet sind, daß Flüssigkeit in der Zone mit den Elektroden in Kontakt steht und eine Schicht mit einer Dicke von weniger als etwa 0,2 mm bildet, die eine der Elektroden überschichtet,
und wobei die Zelle ein Redoxreagenz umfaßt, das von einer der Elektroden verkörpert wird, so daß ein Derivat des Bestandteils beim Anlegen eines geeigneten elektrischen Potentials auf einer der Elektroden abgelagert wird und Mittel zum Überwachen des Stroms beim anschließenden Ablösen des Derivats, um ein Anzeichen für die Gegenwart oder die Menge des interessierenden Bestandteils durch Coulometrie, Voltametrie oder Amperometrie bereitzustellen.
Es ist besonders bevorzugt, bei der Verwendung dieses Verfahrens eine Zelle bereitzustellen, die das flüssige Reagenz dazu zwingt, sich mit der Elektrode zu einer hinreichend dünnen Schicht umzusetzen, die die Elektrode überschichtet, um eine Durchführung der Messung in einer kurzen Zeit zu ermöglichen. Eine geeignete Dicke für die flüssige Schicht ist z. B. in der Größenordnung von etwa 0,02 bis 0,2 mm, z. B. etwa 0,1 mm. Kapillarförmige Füllzellen mit einer Konfiguration, wie sie in EP 0 170 375 (Unilever) beschrieben sind, gehören zu den Zellen, die in dieser Hinsicht geeignet sind. In bestimmten zweckmäßigen Vorrichtungen innerhalb des Bereichs dieser Erfindung kann die Zelle ein definiertes Reaktionsvolumen der Probe oder der Reaktionsflüssigkeit auf einen Raum definierter Breite zwischen einer Zellwand und einer Elektrode mit definierter Fläche beschränken. Flüssigkeit außerhalb des Volumens kann, nach innen diffundieren, aber z. B. nur mit einer nicht nennenswerten Geschwindigkeit im Vergleich zu der Zeit, die zur Reaktion der Flüssigkeit in dem definierten Volumen benötigt wird. In anderen zweckmäßigen Ausführungsformen kann die Zelle ein Volumen für die Flüssigkeit definieren, um Material zur Umsetzung an der Elektrode bereitzustellen.
In einem Test, der unter Verwendung der Vorrichtung und des Verfahrens, die hier detaillierter beschrieben sind, ausgeführt werden kann, umfaßt der zu messende Bestandteil ein elektrochemisch reduzierbares, Metallion und wird durch anodische Ablösung gemessen.
Die Form der Reaktionszelle, in der die Reaktion ausgeführt wird, kann wesentlich zur einfachen Ausführbarkeit des Testverfahrens beitragen. Es wird bevorzugt, eine angepaßte Form der kapillarförmigen Füllzellen zu verwenden, die mit Elektroden ausgestattet sind, wie in der EP 0 170 375 (Unilever) beschrieben (s. den Oberbegriff des Anspruchs 1), die Elektroden geeigneter Impendanz enthalten, die an einer oder an mehreren Wänden als dünne Filme getragen werden.
Eine solche Zelle, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung angepaßt ist, kann geeigneterweise z. B. drei Elektroden umfassen, (a) eine Arbeitselektrode, z. B. aus Gold oder einem anderen Edelmetall, Kohlenstoff oder Graphit in beliebiger günstiger Form, z. B. wachsimprägnierter Graphit, (b) eine Gegenelektrode, ausgewählt aus einem ähnlichen Bereich von Materialien, wie sie für Elektrode (a) angegeben wurden und möglicherweise aus dem gleichen Material wie Elektrode (a) selbst und (c) eine Referenzelektrode, z. B. eine Silber/Chlorid-Elektrode, oder eine pH-Elektrode.
Die Auswahl an Elektrodenmaterialien kann für viele Zwecke vorzugsweise unter Gold-, Silber- und Kohlenstoffilmelektroden vorgenommen werden. Beispiele für bevorzugte Verwendungen: Goldelektroden sind sehr geeignet für Voltametrie von Spurenmengen an Quecksilber sowie Goldelektroden in Kombination mit einer dünnen Quecksilberschicht, z. B. hergestellt durch vorhergehende elektrochemische Abscheidung von einer Menge an Quecksilbersalz, sind sehr geeignet für die Analyse von Schwermetallen oder organischen Materialien, wie Drogen, z. B. Morphium. Kohlenstoffelektroden sind sehr geeignet z. B. für die Elektroanalyse von oxidierbaren organischen Gruppen, wie Aminen, oder reduzierbaren organischen Gruppen, wie Nitrobenzolen. Das Ziel besteht darin, Elektroden mit hinreichend geringer Impendanz für amperometrische oder voltametrische Verwendung in einer Weise bereitzustellen, die selbst gut bekannt ist.
Eine bevorzugte Anordnung beinhaltet die Verwendung einer Zelle, die ein Paar an Goldelektroden umfaßt. In diesem Fall kann eine Goldelektrode als Gegenelektrode sowie als Referenzelektrode dienen.
In einer zweckmäßigen Form sind beide oder alle Elektroden als Film in einer kapillarförmigen Füllzelle enthalten, die zwischen zwei parallelen flachen Platten ausgebildet ist, die durch etwa 0,1 mm Zelldicke voneinander getrennt sind, mit etwa 0,1 mm dicken Spuren an Versiegelungsmaterial, die die übrigen Seiten der Zelle bilden, abgesehen von einer Öffnung für den Zugang von Flüssigkeiten.
Es kann zweckmäßig sein, eine solche Zelle durch Verwendung von gegenüberliegenden Platten aus z. B. Keramik, Kunststoff oder Glas zu bilden. Wenn eine solche Zelle, wie es be vorzugt ist, unter Verwendung von Keramik hergestellt wird, kann ein geeignetes Substrat z. B. ein 96% Aluminiumoxidsubstrat (Kyocera A4476 - Handelsmarke) sein, und ein bevorzugtes Material für die darauf zu bildenden Elektroden ist Gold, aufgebracht als Golddruckpaste (Engelhard T 4474 - Handelsmarke), das in einem Hochtemperaturoxidationsofen gemäß der herkömmlichen Verfahren für die Verwendung dieses Materials aufgebracht wird. Dies führt im Kontext dieser Erfindung zu einer Goldschicht mit einer darüber geschichteten dünnen Oxidschicht, die geeignet ist, eine hochgradig reproduzierbare Elektrode darzustellen. Wann immer erwünscht, kann ein Teil der Metallschicht durch überschichtende dielektrische Schichten abgedeckt werden, gebildet z. B. aus einer dielektrischen Drucktinte (DuPont 5704 - Handelsmarke), die auf das Substrat gemäß der üblichen Art der Verwendung dieses Materials aufgebracht wird.
Wenn man Reaktionen der oben beschriebenen Art in einer Zelle, wie oben beschrieben, ablaufen läßt, findet man, daß eine Arbeitselektrode leicht im wesentlichen das gesamte elektroaktive Material in den Teil der Flüssigkeit, der die Arbeitselektrode überschichtet, abreichern kann, bevor eine wesentliche laterale Diffusion stattgefunden hat.
Dementsprechend ist es bevorzugt, Zellen von solchen Abmessungen zu verwenden, daß diese Situation vorherrscht: d. h., daß die Zeit, die benötigt wird für eine laterale Diffusion einer wesentlichen Menge an reaktivem Material aus der Region außerhalb derjenigen, die die Arbeitselektrode überschichtet, zu der Region, die die Arbeitselektrode überschichtet, sehr viel länger ist als die Zeit, die benötigt wird für die Diffusion der Bestandteile in der Zelle durch die Dicke der Zelle und für die Abreicherung durch eine Elek trode aus dem Material, das mit demjenigen aus der Region der Zelle, die diese Elektrode überschichtet, reagieren kann.
Ein Vorteil, der aus der Verwendung der Erfindung in dieser Weise erwächst, besteht darin, daß die Kalibrierung der Messungen besonders einfach und einheitlich sein kann, wie zwischen den Proben der Vorrichtung, wie sie hier beschrieben ist.
Weitere Details der Erfindung sind unten im Zusammenhang mit dem folgenden erläuternden Beispiel angegeben.

Beispiel

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Spurenmetallanalyse durch anodische Ablösungsvoltametrie verwendet werden. In dieser Anordnung kann es zweckmäßig sein, ein Edelmetall oder (vorzugsweise) eine Kohlenstoffarbeitselektrode, einen pH-Puffer und einen Überschuß an Quecksilbernitrat zu verwenden. In einem Kalibrierungstest kann die Testflüssigkeit in der Zelle z. B. 1 Mikrogramm/ml von sowohl Cadmium, Blei- als auch Kupferionen und 20 Mikrogramm/ml an Quecksilberionen in einem Acetatpuffer mit 0,1M und pH 4,8 enthalten. Die Meßmethode ist wie folgt. Nach Einführung des Reagenzes in eine kapillarförmige Füllzelle, die mit Elektroden, wie oben beschrieben, ausgestattet ist, kann (a) zunächst ein hohes negatives Potential (-1,0 V) für eine präzise standardisierte Zeit, in diesem Beispiel wurden 30 Sekunden gewählt, an die Arbeitselektrode angelegt werden, um Hg-Metall auf dieser abzuscheiden, um einen dünnen Quecksilberfilm zu bilden, der als Amalgam jegliche Spuren von Metallen, die sich zusammen mit Quecksilber abscheiden können, beinhaltet. Wenn eine kapillarförmige Füllzelle verwendet wird, kann eine vollständige Abscheidung erreicht werden und eine Standardisierung der Zeit kann unnötig werden.
Danach wird (b) ein auf positive Werte gerichteter Potentialanstieg auf die Arbeitselektrode angewendet (z. B. von - 1,0 V bis +0,1 V unter Verwendung einer differenziellen Pulstechnik bei einer Gesamtabtastrate von 10 mV pro Sekunde mit +50 mV Pulshöhe unter Verwendung eines PAR 264 Polarographen (Handelsmarke) von Princeton Applied Research). Die Messung des resultierenden Stroms wird vorgenommen, um das Auftreten jeglicher Peaks zu bestimmen. Alle auftretenden Peaks zeigen die Gegenwart eines Metalls an, identifizierbar prinzipiell anhand des Potentials, bei dem der Peak beobachtet wird, in einer Menge, die der Fläche unter oder der Höhe des Strompeaks entspricht.
Die Reagenzien können getrocknet werden und desoxidierende Reagenzien, wie Ascorbinsäure und/oder Natriumsulfit, können einbezogen werden. Alternativ kann eine wechselstrompolarographische Technik angewendet werden, ohne die Notwendigkeit zum Zusatz der Salze.
Es ist natürlich möglich, Messungen anderer Substanzen durch Ablösevoltametrie unter Verwendung geeigneter Elektroden durchzuführen, wie hier beschrieben.
In diesem Sinne sind mögliche Varianten des Beispiels:
(a) Nickel kann unter Verwendung einer Dimethylglyoxym enthaltenden Zelle wie folgt abgeschätzt werden: In der Zelle wird eine Schicht an Dimethylglyoxymsalz, pH 7, als Reagenzschicht (zusammen mit Quecksilberacetat oder -nitrat) bereitgestellt. Dieses reagiert mit Nickel (2+), das mit einer Probe eingeführt wird, unter Bildung eines Komplexes. Bei etwa -0,4 V scheidet sich auf den (z. B. Gold- oder Kohlenstoff-) Elektroden Quecksilber mit einer oxidierten Form des Nickelkomplexes ab. Der Komplex kann dann abgelöst werden und unter Verwendung eines ins Negative gehenden Potentialgradienten analysiert werden.
Bevorzugte Elektrodensysteme bei dieser Variante sind entweder ein Drei-Elektroden-System, das zwei Goldelektroden und eine Silberreferenzelektrode umfaßt, oder ein Zwei-Elektroden-System, das eine Goldelektrode und eine Silber-(Chlorid)-Opferelektrode umfaßt.
(b) Organische Materialien, z. B. Drogen, wie Morphium, können durch absorptive Ablösevoltametrie unter Verwendung von Zellanordnungen, wie hier beschrieben, abgeschätzt werden: Man hält eine Gold- oder Kohlenstoffelektrode für etwa eine Minute bei einem negativen Potential und durch Halten der Elektrode bei etwa 0 Volt für etwa 1 Minute kann das Morphium absorbiert werden: Beim Reduzieren des Elektrodenpotentials über etwa -0,2 V hinaus wird das Morphiumderivat von der Arbeitselektrode abgelöst und erzeugt einen Strompeak, anhand dessen Größe das Ergebnis des Tests erhalten werden kann.
In weiteren Ausführungsformen kann es ausreichend sein, eine Arbeitselektrode zu verwenden und eine weitere Elektrode, die die Funktionen als Referenz- und Gegenelektrode vereint, vorausgesetzt, daß die weitere Elektrode eine Metall/Metallhalogenidreferenzelektrode ist und das entsprechende Halogenid in der Probe vorliegt, vorzugsweise bei einer standardisierten hohen Konzentration. Alternativ kann jede andere weitere Elektrode mit niedriger elektrochemischer Impendanz und adäquat definiertem Potential verwendet werden. Zur Verwendung geeignete Elektroden sind z. B. solche, die in EP 0 186 286 (Unilever) beschrieben sind.
Die hier beschriebene Erfindung ist, wie für den fachmännischen Leser offensichtlich, vielen Modifikationen und Variationen zugänglich und die hier gemachten Offenbarungen umfassen den beanspruchten Schutzumfang der Erfindung.

Claims

1. Verfahren zur Messung oder zum Nachweis eines Bestandteiles einer wäßrigen flüssigen Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

Einführen einer Probe, die den interessierenden Bestandteil möglicherweise enthält, in eine Reaktionszelle, wobei die Reaktionszelle eine kapillarförmige Füllvorrichtung umfaßt und mindestens zwei Elektroden, die eine Impendanz aufweisen, die sie für coulometrische, amperometrische oder voltametrische Verfahren geeignet macht, so daß die Probe eine Flüssigkeitsschicht mit einer Dicke von weniger als etwa 0,2 mm in einer Reaktionszone bildet, die eine der Elektroden überschichtet,

Umsetzen des Bestandteils, falls vorhanden, direkt oder indirekt mit einem Redoxreagenz, das von einer der Elektroden verkörpert wird, um die Ablagerung eines Derivates des Bestandteils auf der Elektrode zu bewirken, gekennzeichnet durch

Überwachen des Stromflusses beim anschließenden Ablösen des Derivats, um eine Anzeige der Gegenwart oder der Menge des interessierenden Bestandteils durch Coulometrie, Voltametrie oder Amperometrie bereitzustellen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der zu messende Bestandteil ein elektrochemisch reduzierbares Ion, ein elektrochemisch oxidierbares anorganisches Ion oder eine elektrochemisch oxidierbare oder reduzierbare organische Verbindung umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin ein Spurenmetall durch anodische Ablösevoltametrie analysiert wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin organische Materialien durch absorptive Ablösevoltametrie abgeschätzt werden.