DE69627378T2

DE69627378T2 - Verfahren zur Bestimmung eines Analyten unter Verwendung einer elektrochemischen Zelle

Info

Publication number: DE69627378T2
Application number: DE69627378T
Authority: DE
Inventors: McIndoe Alastair HODGES; William Thomas BECK; Oddvar Johansen
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1995-06-19
Filing date: 1996-06-19
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-06-20
Also published as: CN100350241C; EP0873514A4; US6284125B1; CA2538966C; CN1184471C; EP1925934A3; CA2538966A1; WO1997000441A1; ES2193242T3; KR100491283B1; KR100568650B1; CA2573423A1; JPH11509311A; CN1388373A; CN1388372A; EP1925934A2; KR20040062664A; KR100483093B1; KR19990023018A; CN1967233B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein elektrochemisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einem Träger. Die Erfindung ist besonders nützlich zur Bestimmung der Glucosekonzentration im Blut und wird hier mit Bezug auf diese Verwendung beschrieben, aber es ist verständlich, daß die Erfindung bei anderen analytischen Bestimmungen anwendbar ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Elektrochemische Biosensoren enthalten im allgemeinen eine Zelle mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Bezugselektrode. Manchmal sind die Funktionen der Gegenelektrode und der Bezugselektrode in einer einzigen Elektrode vereinigt, die eine "Gegen/Bezugs"elektrode oder "Pseudobezugselektrode" genannt wird. Die hier benutzte Bezeichnung "Gegenelektrode" umfaßt eine Gegen/Bezugselektrode, wo der Zusammenhang es zuläßt.
Die den Analyten enthaltende Probe wird mit einem Reagenz in Berührung gebracht, das in der Zelle ein Enzym und einen Redox-Vermittler enthält. Entweder wird der Vermittler reduziert (empfängt wenigstens ein Elektron), während der Analyt oxidiert wird (wenigstens ein Elektron abgibt), oder umgekehrt. Gewöhnlich ist es der Analyt, der oxidiert wird, und der Vermittler, der reduziert wird. Die Erfindung wird hier im Prinzip mit Bezug auf dieses System beschrieben, aber sie ist auch auf Systeme anwendbar, in denen der Analyt reduziert und der Vermittler oxidiert wird.
Elektrochemische Glucose-Analysatoren, wie sie von Diabetikern benutzt werden, um Blutzuckergehalte zu überwachen, oder wie sie in Kliniken und Krankenhäusern eingesetzt werden, beruhen auf der Benutzung eines Emzyms, Glucose-Oxidase-Dehydrogenase (GOD) und eines Redox-Vermittlers, wie Ferricyanid oder Ferrocyanid. Bei diesem bekannten System wird die den Analyten (z. B. Glucose) enthaltende Probe (z. B. Blut) mit den Reagenzien in der Zelle in Kontakt gebracht. Glucose wird zu Gluconsäure oxidiert, und die Glucose-Oxidase wird dadurch reduziert. Der Vermittler oxidiert dann die Glucose-Oxidase zurück und wird in dem Verfahren reduziert. Der reduzierte Vermittler wird dann zurückoxidiert, wenn er Elektronen auf die Arbeitselektrode überträgt. Nach Verstreichen einer bestimmten Zeit, die ausreicht, um den Faraday'schen Strom genau zu bestimmen, wird die Glucosekonzentration aus der Größe des dann gemessenen Strom- oder Spannungssignals bestimmt.
Bekannte elektrochemische Zellen bestehen aus zwei (oder drei) benachbarten Elektroden, die auf einer Seite eines Isolators beabstandet sind und zum Anschluß an ein Meßgerät eingerichtet sind. Eine Zielfläche, auf der die Blutprobe platziert wird, ist auf oder zwischen den Elektroden abgegrenzt. Die schwebende Anmeldung PCT/AU/95/00207, die als WO-A-9528634 veröffentlicht wurde, beschreibt eine Zelle, in der Elektroden auf entgegengesetzten Seiten einer porösen Membran angeordnet sind, wobei eine der Elektroden eine flüssigkeitsdurchlässige Zielfläche hat.
Niwa et al., Anal. Chem., März 1990, Bd. 62, Seiten 447–452, beschreiben eine ineinandergreifende Anordnung von Mikroelektroden und ein Verfahren zu ihrer Verwendung unter Benutzung eines Redox-Kreislaufs. Bei dem Redox-Kreislauf wird eine Sammler-Elektrode genügend dicht an einer Generator-Elektrode platziert, so daß Reaktionsprodukte von der Sammler-Elektrode zu der Generator-Elektrode zurückdiffundieren. Dies dient zur Verstärkung des Diffusionsstroms.
WO-A-94/29731 beschreibt einen Biosensor und eine Methode zur Bestimmung des Hämatokrit-Werts einer Vollblutprobe unter Benutzung der Elektrochemie. Der Biosensor umfaßt Arbeits- und Gegenelektroden, die genügend weit voneinander getrennt sein müssen, so daß elektrochemische Vorgänge an einer Elektrode die elektrochemischen Vorgänge an der anderen Elektrode nicht stören.
In US-A-5,243,516 ist ein Biosensorsystem beschrieben, das eine Analytkonzentration bestimmt, indem überwacht wird, ob ein gemessener Strom sich gemäß einer bestimmten Cottrellstrom-Beziehung verändert. Die dort beschriebene Methode umfaßt die Stufen (1), (2) und (4) des Anspruchs 1.
In dem Stand der Technik besteht die Notwendigkeit, die Arbeitselektrode von der Gegenelektrode (oder Gegen/Bezugselektrode) um einen genügenden Abstand zu trennen, um zu vermeiden, daß Produkte der elek trochemischen Reaktion an einer Elektrode mit denen an der anderen Elektrode zusammenkommen. In der Praxis wird ein Trennabstand der Elektroden von mehr als 500 μm benötigt, um eine annehmbare Genauigkeit zu erreichen.
Jede Charge von Zellen muß zuvor geeicht werden und führt infolge vonVariationen innerhalb der Charge, in der Probenzusammensetzung und in den Umgebungsbedingungen bei der Benutzung zu Ungenauigkeiten.
Es ist erwünscht, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit dieser Biosensoren zu verbessern. Das Erreichen dieser Ziele wird bei Sensoren schwierig, die die Konzentration von Analyten im Blut bestimmen sollen, da Blut gelöste Gase, Ionen, Kolloide, komplexe Mizellen, kleinteilige Zellentrümmer und lebende Zellbestandteile in einem überwiegend wässrigen Medium enthält. Irgendwelche von diesen Bestandteilen können bei der Bestimmung stören. Die existierenden Sensoren unterliegen auch dem Einfluß anderer Störsubstanzen, die in der Probe vorliegen können und an der Arbeitselektrode oxidiert und fälschlicherweise als dem interessierenden Analyten zugerechnet werden können. Auch können Störsubstanzen die oxidierte Form des Redox-Vermittlers reduzieren. Diese Effekte ergeben künstlich erhöhte Werte der Analytkonzentration. Ferner liegt immer etwas reduzierter Redox-Vermittler vor, bevor der Analyt zugesetzt wird, und seine Konzentration muß bekannt sein und von dem gemessenen Wert des reduzierten Vermittlers abgezogen werden, damit sich eine genaue Konzentration des Analyten ergibt. Außerdem kann Sauerstoff in dem Blut in Konkurrenz mit Ferrocyanid als ein Redox-Vermittler für Glucose-Oxidase-Dehydrogenase (GOD) wirken. Somit können hohe Sauerstoffkonzentrationen zu niedrigen Werten der Glucosekonzentration führen. Ferner sind die Messungen gegen Faktoren empfindlich, wie Änderungen der Feuchtigkeit, Temperatur, Lösungsviskosität und Hämatokrit-Gehalt.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Analyseverfahrens von verbesserter Genauigkeit und/oder Zuverlässigkeit und/oder Geschwindigkeit.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung besteht nach einem Aspekt aus einem Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer reduzierten (oder oxidierten) Form einer Redox-Spezies in einer elektrochemischen Zelle von der Art, die eine Arbeitselektrode und eine durch eine bestimmte Entfernung von der Arbeitselektrode beabstandete Gegenelektrode enthält, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:

(1) Anlegen einer elektrischen Potentialdifferenz zwischen den Elektroden,
(2) Auswählen des Potentials der Arbeitselektrode, so daß die Geschwindigkeit der Elektrooxidation der reduzierten Form (oder der Elektroreduktion der oxidierten Form) der Spezies durch Diffusion kontrolliert wird,
(3) Auswählen des Abstandes zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, so daß die Reaktionsprodukte von der Gegenelektrode die Arbeitselektrode erreichen,
(4) Bestimmen des Stroms als Funktion der Zeit nach Anlegen des Potentials und vor Erreichen eines stationären Zustands,
(5) Abschätzen der Größe des Stroms im stationären Zustand, und
(6) Gewinnen eines für den Diffusionskoeffizienten und/oder die Konzentration der reduzierten Form (oder der oxidierten Form) der Spezies bezeichnenden Wertes aus der Änderung des Stroms mit der Zeit und der Größe des Stroms im stationären Zustand.

Die auf diese Weise gemessene Konzentration ist im wesentlichen unabhängig von einer gegebenenfalls vorhandenen Variation des Diffusionskoeffizienten der reduzierten Form und ist daher gegen Temperatur- und Viskositätsänderungen kompensiert. Die so gemessene Konzentration ist unabhängig von Änderungen des Hämatokrits und anderer Substanzen, die den Diffusionskoeffizienten der reduzierten Form der Redox-Spezies beeinflussen.
Es ist zu bemerken, daß die Methode der Erfindung gleichermassen anwendbar ist zur Bestimmung der Konzentration einer reduzierten Form einer Redox-Spezies oder einer oxidierten Form einer Redox-Spezies in der Zelle. Wenn die Konzentration der reduzierten Form zu bestimmen ist, muß das Potential der Arbeitselektrode so eingehalten werden, daß die Geschwindigkeit der Elektrooxidation der reduzierten Form in Stufe (2) diffusionskontrolliert wird, und es ist die Konzentration der reduzierten Form, die man in Stufe (5) erhält. Wenn die Konzentration der oxidierten Form zu bestimmen ist, muß das Potential der Arbeitselektrode so eingehalten werden, daß die Geschwindigkeit der Elektroreduktion der oxidierten Form in Stufe (2) diffusionskontrolliert wird, und es ist die Konzentration der oxidierten Form, die man in Stufe (5) erhält.
Die Redox-Spezies kann ein Analyt oder ein Redox-Vermittler sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird ein Vermittler benutzt, und die Konzentration der reduzierten (oder oxidierten) Form des Vermittlers zeigt seinerseits die Konzentration eines Analyten an, und ein Maß des Diffusionskoeffizienten der reduzierten (oder oxidierten) Form des Vermittlers wird als Vorstufe für die Bestimmung der Konzentration des Analyten bestimmt.
Vorzugsweise umfaßt die Zelle eine Arbeitselektrode und Gegen/ Bezugselektrode. Wenn eine Bezugselektrode getrennt von einer Gegenelektrode benutzt wird, kann sich die Bezugselektrode an irgendeiner geeigneten Stelle befinden, an der sie mit der Probe in dem Sensor in Kontakt ist.
Im Gegensatz zum Stand der Technik sind bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Elektroden genügend dicht beieinander, daß die Produkte der elektrochemischen Reaktion an der Gegenelektrode während der Testdauer zur Arbeitselektrode wandern. Bei einem Enzym/ Ferricyanid-System z. B. diffundiert das an der Gegenelektrode erzeugte Ferrocyanid zu der Arbeitselektrode.
Dies erlaubt das Erreichen eines stationären Konzentrationsprofils zwischen den Elektroden, das zu einem stationären Strom führt. Dies erlaubt seinerseits die Messung des Diffusionskoeffizienten und der Konzentration der Redox-Spezies (des Vermittlers) unabhängig von Änderungen der Probe und verbessert daher in hohem Masse die Genauigkeit und Zuverlässigkeit.
Das Verfahren erlaubt auch die Bestimmung der Hämatokritkonzentration des Blutes aus dem Diffusionskoeffizienten unter Benutzung von Nachschlagetabellen (oder durch Trennung roter Blutkörperchen von dem Plasma und Messung des Diffusionskoeffizienten der Fraktion der roten Blutkörperchen) und der Plasmafraktion, und durch Vergleich der beiden.
Das Verfahren der Erfindung kann in einer Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration einer Redox-Spezies in einer elektrochemischen Zelle durchgeführt werden mit
einer elektrochemischen Hohlzelle mit einer Arbeitselektrode und einer Gegen oder Gegen/Bezugs)elektrode,
Einrichtungen zum Anlegen einer elektr. Potentialdifferenz zwischen den genannten Elektroden, und Einrichtungen zur Messung der Änderung des Stroms mit der Zeit,
dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode von der Gegenelektrode um weniger als 500 μm beabstandet ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zelle ein wirksames Volumen von 1,5 Mikrolitern oder weniger. Die Vorrichtung für die Benutzung bei der Erfindung kann eine poröse Membran, eine Arbeitselektrode auf einer Seite der Membran und eine Gegen/Bezugselektrode auf der anderen Seite umfassen, wobei die Elektroden zusammen mit einer Zone der Membran zwischen ihnen eine elektrochemische Zelle kennzeichnen und wobei sich die Membran seitlich von der Zelle zu einer Probenablagefläche erstreckt, die von der Zellenzone um eine Entfernung beabstandet ist, die größer als die Dicke der Membran ist.
Vorzugsweise werden die poröse Membran, der Abstand der Zielfläche von dem Zellenteil und die Membrandicke in Kombination so gewählt, daß beim Platzieren von (Plasma und rote Blutkörperchen enthaltendem)Blut auf der Zielfläche eine Plasmafront vor den roten Blutkörperchen seitlich zu der elektrochemischen Zelle diffundiert.
Es ist so möglich, eine elektrochemische Dünnschichtzelle mit Plasma zu füllen, das im wesentlichen frei von Hämatokrit ist, der eine Veränderung des Diffusionskoeffizienten des Redox-Vermittlers verursachen und die Testgenauigkeit beeinträchtigen würde, wie nachfolgend erläutert wird.
Bei bevorzugten Ausführungsformen des Biosensors ist eine zweite elektrochemische Zellenzone der Membran durch eine zweite Arbeitselektrode und eine zweite Gegen/Bezugselektrode gekennzeichnet, die sich zu der zweiten Arbeitselektrode auf der anderen Seite der Membran befindet. Die zweite elektrochemische Zellenzone befindet sich zwischen der ersten Zellenzone und der Probenablage- oder "Ziel"-fläche, oder sie befindet sich auf der von der ersten elektrochemischen Zone entfernten Seite der Zielfläche. Bei diesen Ausführungsformen kommt das Plasma mit Enzym in der oder auf dem Weg zu der ersten elektrochemischen Zelle in Kontakt, während die zweite Zelle erreichendes Plasma nicht in Kontakt kommt. Die erste so im Einsatz befindliche Zelle misst die Konzentration des reduzierten Vermittlers in Gegenwart von Plasma (einschließlich elektrochemisch störender Substanzen) und Enzym, während die zweite elektrochemische Zelle sie in Gegenwart von Plasma (einschließlich elektrochemisch störender Substanzen) und in Abwesenheit von Enzym misst. Dies erlaubt die Bestimmung der Konzentration der reduzierten Störsubstanzen in der zweiten Zelle und der Konzentration reduzierter Störsubstanzen plus Analyt in der ersten Zelle. Die Subtraktion des einen Werts von dem anderen ergibt die absolute Konzentration des Analyten.
Bei einer in hohem Maße bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei dem Verfahren der Erfindung wird eine Hohlzelle verwendet, in der die Arbeitselektrode und Bezugs oder Gegen/Bezugs)elektrode voneinander um weniger als 500 μm und vorzugsweise 20 μm bis 200 μm beabstandet sind.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Die Erfindung wird nun beispielhaft nur mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung näher beschrieben.
1 ist eine schematische (nicht maßstäbliche) Darstellung einer ersten Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung in Seitenansicht.
2 zeigt die Ausführungsform der 1 in der Aufsicht. 3 zeigt die Ausführungsform der 1 in der Bodenansicht.
4 zeigt die Ausführungsform der 1 in Stirnansicht. 5 ist eine schematische (nicht maßstäbliche) Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung in Seitenansicht.
6 zeigt die Ausführungsform der 5 in der Aufsicht. 7 ist eine schematische (nicht maßstäbliche) Darstellung einer dritten Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung in der Seitenansicht.
8 zeigt die Ausführungsform der 7 in der Aufsicht. 9 ist eine schematische (nicht maßstäbliche) Darstellung einer vierten Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung in der Aufsicht.
10 zeigt die Ausführungsform der 9 in der Stirnansicht. 11 zeigt die Ausführungsform der 9 in der Seitenansicht.
12 zeigt eine schematische (nicht maßstäbliche) Darstellung einer Hohlzellenausführung der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung im Querschnitt.
13 zeigt eine graphische Darstellung des Stroms (Ordinatenachse) gegen die Zeit (Koordinatenachse) während der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
14 ist eine weitere graphische Darstellung zur Benutzung bei der Erläuterung des Verfahrens der Erfindung.
In den 5 bis 12 sind Bestandteile, die in der Funktion Bestandteilen der Ausführungsform der 1 bis 4 entsprechen, mit identischen Zahlen oder Zeichen bezeichnet.
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Unter Bezugnahme auf die 1 bis 4 ist eine erste Ausführungsform einer Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung gezeigt, in diesem Falle ein Biosensor zur Glucosebestimmung im Blut. Die Ausführungsform hat einen dünnen Membranstreifen 1 mit oberer und unterer Oberfläche 2, 3 und einer zwischen einer auf der oberen Oberfläche 2 angeordneten Arbeitselektrode 5 und einer auf der unteren Oberfläche 3 angeordneten Gegenelektrode 6 begrenzten Zellenzone 4. Die Membrandicke ist so gewählt, daß die Elektroden durch einen Abstand "1" getrennt sind, der genügend eng ist, daß die Produkte der elektrochemischen Reaktion an der Gegenelektrode während der Testdauer an die Arbeitselektrode wandern und im wesentlichen ein stationäres Diffusionsprofil erreicht wird. Typischerweise wird "1" kleiner als 500 μm sein.
Eine Probenablage- oder "Ziel"-fläche 7, die auf der oberen Oberfläche 2 der Membran 1 abgegrenzt ist, hat von der Zellenzone 4 einen Abstand, der größer als die Membrandicke ist. Die Membran 1 hat eine sich zwischen der Zielfläche 7 und der Zellenzone 4 erstreckende Diffusionszone B. Ein geeignetes Reagenz mit einem Redox-Vermittler "M", einem Enzym "E" und einem pH-Puffer "B" sind in der Zellenzone 4 der Membran und/oder zwischen der Zellenzone 4 und der Zielfläche 7 enthalten. Das Reagenz kann auch Stabilisatoren und dergl. enthalten.
In einigen Fällen wird es bevorzugt, das Enzym und den Vermittler und/oder den Puffer in unterschiedlichen Zonen der Membran anzuordnen. Der Vermittler kann z. B, zu Beginn innerhalb der elektrochemischen Zellenzone 4 angeordnet werden, während sich das Enzym unterhalb der Zielfläche 7 oder in der Diffusionszone 8 befinden kann.
Hämoglobin setzt bei niedrigen pH-Werten Sauerstoff frei, aber bei hohen pH-Werten bindet es Sauerstoff sehr fest. Sauerstoff wirkt als Redox-Vermittler für Glucose-Oxidase-Dehydrogenase (GOD). In einem Glucose-Sensor konkurriert er mit dem Redox-Vermittler und führt dabei. zu niedrigen Werten der Glucosekonzentration. Gewünschtenfalls kann daher ein erster pH-Puffer in der Nähe der Zielfläche 7 enthalten sein, um den pH auf einen solchen Wert zu erhöhen, daß aller Sauerstoff an Hämoglobin gebunden wird. Ein solcher pH wäre für die GOD/Glucose-Kinetik nicht optimal und daher für die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit des Tests schädlich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung für die Benutzung bei der Erfindung ist ein zweiter pH-Puffer als Reagenz in der Nähe der Arbeitselektrode enthalten, um den pH-Wert auf kinetisch optimale Werte zurückzustellen. Die Benutzung eines zweiten Puffers verursacht nicht eine Freisetzung von Sauerstoff aus dem Hämoglobin, da das Hämoglobin in den Blutkörperchen enthalten ist, die in der Nähe der Blut-Zielfläche 7 zurückgehalten werden oder im Vergleich mit dem Plasma in der Diffusion zurückbleiben und daher nicht durch den zweiten Puffer beeinflußt werden. Auf diese Weise kann die Störung durch Sauerstoff stark reduziert oder ganz ausgeschaltet werden.
Bei der Benutzung des Sensors wird ein Blutstropfen, der eine zu bestimmende Glucosekonzentration enthält, auf der Zielzone 7 platziert.
Die Blutbestandteile wandern zu der Zellenzone 4 hin, wobei der Plasma bestandteil schneller als die roten Blutkörperchen diffundieren, so daß eine Plasmafront die Zellenzone 4 vor den Blutkörperchen erreicht.
Wenn das Plasma in Kontakt mit dem Reagenz kommt, wird das Reagenz gelöst, und es tritt eine Reaktion ein, die den Analyten oxidiert und den Vermittler reduziert. Nach Verstreichen einer bestimmten Zeit zur Beendigung dieser Reaktion wird eine elektrische Potentialdifferenz zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angelegt. Das Potential der Arbeitselektrode wird ausreichend anodisch gehalten, so daß die Geschwindigkeit der Elektrooxidation der reduzierten Form des Vermittlers an der Arbeitselektrode durch die Geschwindigkeit der Diffusion der reduzierten Form des Vermittlers zu der Arbeitselektrode bestimmt wird und nicht durch die Geschwindigkeit des Elektronenübergangs durch die Grenzfläche Elektrode/Lösung.
Ferner wird die Konzentration der oxidierten Form des Vermittlers an der Gegenelektrode auf einer ausreichenden Höhe gehalten, daß das Potential der Gegenelektrode und somit auch das Potential der Arbeitselektrode beim Stromfluß in der elektrochemischen Zelle nicht so weit in die kathodische Richtung verschoben wird, daß das Potential der Arbeitselektrode nicht mehr in dem diffusionskatrollierten Bereich ist. Dies besagt, daß die Konzentration der oxidierten Form an der Gegenelektrode ausreichen muß, um an der Arbeitselektrode eine diffusionskontrollierte Elektrooxidation der reduzierten form des Vermittlers aufrechtzuerhalten.
Eine Dünnschichtzelle verhält sich so, daß sich bei Anwesenheit der oxidierten und reduzierten Form des Redox-Paares über die Zelle gegebenenfalls ein stationäres Konzentrationsprofil einstellt. Dies führt zu einem stationären Strom. Es wurde gefunden, daß durch Vergleichen eines Meßwerts des stationären Stroms mit der Geschwindigkeit, mit der sich der Strom in der Stromübergangsphase vor Erreichen des stationären Zustands ändert, der Diffusionskoeffizient des Redox-Vermittlers wie auch seine Konzentration gemessen werden kann. Dies steht im Gegensatz zu dem Cottrell-Strom, der nach dem Stand der Technik gemessen wird. Durch Messung des Cottrell-Stroms zu bekannten Zeiten nach Anlegen eines Potentials an die Sensorelektroden ist es nur möglich, das Produkt aus Konzentration mal Quadratwurzel des Diffusionskoeffi zienten zu bestimmen, und daher ist es nicht möglich, die Konzentration des Vermittlers unabhängig von seinem Diffusionskoeffizienten zu bestimmen.
Bei einer Zelle nach der vorliegenden Erfindung kann durch Lösen der passenden Diffusionsgleichung gezeigt werden, daß über einen beschränkten Zeitbereich eine Darstellung von 1n(i/i^∞ – 1) gegen die Zeit (gemessen in Sekunden) linear ist und eine Neigung (mit S bezeichnet) hat, die gleich -4n²D/1² ist, worin i der Strom zur Zeit t ist, i^∞ der stationäre Strom ist, D der Diffusionskoeffizient in cm²/s ist, 1 der Abstand zwischen den Elektroden in cm ist und n etwa 3,14159 beträgt. Die Konzentration des anwesenden reduzierten Vermittlers beim Anlegen des Potentials zwischen den Elektroden ist durch 2π²i^∞/FAlS gegeben, worin F die Faraday'sche Konstante ist, A die Fläche der Arbeitselektrode ist und die anderen Symbole die oben angegebene Bedeutung haben.
Da diese letztere Formel S benutzt, enthält sie den Meßwert des Diffusionskoeffizienten.
Da bei einer gegebenen Zelle 1 eine Konstante ist, erlaubt die Messung von i als Funktion der Zeit und von i^∞ die Berechnung des Wertes des Diffusionskoeffizienten des Redox-Vermittlers und die Bestimmung der Konzentration des Analyten.
Die Bestimmung der Analytkonzentration kompensiert außerdem jegliclhe Änderung des Diffusionskoeffizienten der Spezies, die an der Arbeitselektrode elektrooxidiert oder elektroreduziert wird. Änderungen der Größe des Diffusionskoeffizienten können infolge von Veränderungen der Temperatur und Viskosität der Lösung oder einer Veränderung der Membrandurchlässigkeit eintreten. Andere Einstellungen an dem Meßwert der Konzentration können auf Grund anderer Faktoren nötig sein, wie Änderungen an der Zellengeometrie, Änderungen an der Enzymchemie sowie andere Faktoren, die die gemessene Konzentration beeinflussen können. Wenn die Messung an Plasma erfolgt, das im wesentlichen frei von Hämatokrit ist (das bei Anwesenheit Änderungen des Diffusionskoeffizienten des Redox-Vermittlers verursacht), wird die Genauigkeit der Methode weiter verbessert.
Jede der Elektroden 5, 6 hat eine zuvor bestimmte Fläche. Bei den Ausführungsformen der 1 bis 4 ist die Zellenzone 4 durch die Membranränder 9, 10, 11, die den Rändern der Elektroden 5, 6 entsprechen, und durch die Stirnränder 12, 13 (in Bezug auf Zielfläche 7) der Elektroden begrenzt. In dem vorliegenden Beispiel sind die Elektroden etwa 600 Angström (etwa 60 nm) dick und 1 bis 5 mm breit.
Beide Seiten der Membran sind mit Ausnahme der Zielfläche 7 wahlweise durch Kaschierschichten 14 (bei den Aufsichten weggelassen) bedeckt, die dazu dienen, Wasserverdampfung aus der Probe zu verhindern und der Vorrichtung mechanische Robustheit zu verleihen. Die Wasserverdampfung ist unerwünscht, da sie die Probe konzentriert, eine Austrocknung der Elektroden und die Abkühlung der Lösung erlaubt, was den Diffusionskoeffizienten beeinflußt und die Enzymkinetik verlangsamt, obgleich der Diffusionskoeffizient wie oben bestimmt werden kann.
Eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zur Benutzung bei der Erfindung ist in den 5 und 6 gezeigt und unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform durch Einfügung einer zweiten Arbeitselektrode 25 und Gegen/Bezugselektrode 26, zwischen denen eine zweite Zellenzone 24 begrenzt ist. Diese Elektroden sind in dem vorliegenden Beispiel ebenfalls um weniger als 500 μm voneinander entfernt. Die zweiten Elektroden 25, 26 sind zwischen der Zellenzone 4 und der Zielfläche 7 angeordnet. Bei dieser Ausführungsform ist der Redox-Vermittler in der Membran unterhalb oder an der Zielfläche 7 oder zwischen der Zielfläche 7 und der ersten Zellenzone 4 enthalten. Das Enzym ist in der Membran in der ersten Zellenzone 4 und der zweiten Zellenzone 24 enthalten. Das Enzym erstreckt sich nicht bis in die zweite Zelle 24. In diesem Falle löst es den Redox-Vermittler, wenn Blut auf die Zielfläche aufgegeben wird. Dieses wandert die Membran entlang, so daß die zweite elektrochemische Zelle 24 Redox-Vermittler, Analyt und Serum einschließlich elektrochemischer Störsubstanzen enthält. Die erste elektrochemische Zelle empfängt Vermittler, Analyt, elektrochemische Störsubstanzen enthaltendes Serum und Enzym. Nun wird zwischen beiden Arbeitselektroden und der Gegenelektrode oder -elektroden ein Potential angelegt, jedoch wird die Stromänderung mit der Zeit für jedes Paar separat gemessen. Dies erlaubt die Bestimmung der Konzentration des reduzierten Vermittlers in Abwesenheit des Analyten plus der Konzentration elektrochemischer Störsubstanzen in der zweiten elektrochemi schen Zelle sowie der Konzentration dieser plus Analyt in der ersten elektrochemischen Zelle. Die Subtraktion des einen Wertes von dem anderen ergibt die absolute Konzentration des Analyten.
Der gleiche Vorteil wird durch andere Geometrie bei der Ausführungsform der 7 und 8 erreicht, bei der die zweite Arbeitselektrode und die zweite Gegen/Bezugselektrode die zweite Zelle 24 auf der von der ersten elektrochemischen Zelle 4 entfernten Seite der Zielfläche 7 begrenzen. In diesem Fall kann das Enzym in dem Membranstreifen 1 zwischen der Zielfläche und der Zelle 1 enthalten sein. Der Redox-Vermittler kann in der Nachbarschaft der Zielfläche oder zwischen der Zielfläche und jeder Zelle sein. Der Diffusionskoeffizient des Vermittlers wird durch ungelöstes Enzym herabgesetzt, und die Anordnung der 7 und 8 hat den Vorteil, daß das Enzym außerhalb der Dünnschichtzellen gehalten wird und ein schnellerer Test ermöglicht wird (da der stationäre Strom schneller erreicht wird). Ferner ist dann der Diffusionskoeffizient des Redox-Vermittlers in beiden Dünnschichtzellen der gleiche, was eine genauere Störungssubtraktion erlaubt.
Obgleich die Ausführungsformen der 1 bis 8 Einzelsensoren sind, können verständlicherweise mehrere Sensoren auf einer einzigen Membran ausgebildet sein, wie bei der Ausführungsform der 9 bis 11 gezeigt ist. In diesem Falle sind die Elektroden eines Sensors mit denen eines Nachbarsensors leitfähig verbunden. Die Sensoren können nacheinander benutzt und nach der Benutzung von dem Streifen abgetrennt werden.
Bei der Ausführungsform der 9 bis 11 sind die Elektrodendimensionen in der Diffusionsrichtung (durch Pfeil bezeichnet) durch die Breite der Elektrode in dieser Richtung begrenzt. Die wirksame Dimension der Elektrode in der Richtung quer zur Diffusionsrichtung ist zwischen komprimierten Volumina 16 der Membran in einer Weise begrenzt, die vollständiger in der schwebenden Anmeldung PCT/AU96/00210, veröffentlicht als WO-A-9528635, beschrieben wurde. Zur Deutlichkeit wurde die wahlweise Kaschierschicht 14 der 1 in den 9 bis 11 weggelassen.
Bei der Ausführungsform der 12 ist eine erfindungsgemäße Hohlzelle gezeigt, bei der die Elektroden 5, 6 zur Begrenzung einer Hohlzelle von auf Abstand gehaltenen Polymerwandungen 13 getragen sind.
Auf einer Seite der Zelle ist eine Öffnung 31 vorgesehen, durch die eine Probe in den Hohlraum 32 eingeführt werden kann. Bei dieser Ausführungsform wird keine Membran benutzt. Wie bei den vorherigen Ausführungsformen sind die Elektroden um weniger als 500 μm, vorzugsweise 20 bis 400 μm und insbesondere 20 bis 200 μm beabstandet. Das wirksame Zellenvolumen beträgt gewünschtenfalls 1,5 Mikroliter oder weniger. Das Verfahren der Erfindung kann verständlicherweise mit einer Zelle durchgeführt werden, die nach der schwebenden Anmeldung PCT/ AU95/00207, veröffentlicht als WO-A-9528634, gebaut ist oder mit Zellen anderer bekannter Bauart, vorausgesetzt, sie sind zur Schaffung eines ausreichend geringen Abstands zwischen den Elektrodenflächen modifiziert.
Das Verfahren der Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die 13 und 14 weiter beispielhaft erläutert.
BEISPIEL 1
Eine 130 Mikron dicke Membran wurde beidseitig mit einer 60 nm dicken Platinschicht beschichtet. Eine Fläche von 12,6 mm² wurde durch Komprimieren der Membran abgegrenzt. 1,5 Mikroliter einer 0,2 M Lösung von Kaliumferricyanid, die 1 Gew.-% Glucose-Oxidase-Dehydrogenase enthielt, wurde der abgegrenzten Fläche der Membran aufgegeben, und das Wasser wurde verdampfen gelassen.
Die Platinschichten wurden dann an einen Potentiostaten zur Benutzung als Arbeits- und Gegen/Bezugselektrode angeschlossen. 3,0 Mikroliter einer wässrigen 5 mM D-Glucoselösung, die 0,9 Gew.-% NaCl enthielt, wurde auf die abgegrenzte Fläche der Membran aufgetropft. Nach Verstreichen von 20 Sekunden wurde eine Spannung von 300 Millivolt zwischen die Arbeitselektrode und die Gegen/Bezugselektrode gelegt und der Strom während weiterer 30 Sekunden in Intervallen von 0,1 s aufgezeichnet.
13 ist eine graphische Darstellung des Stroms gegen die Zeit auf Grund der obigen Messungen. Unter Benutzung einer Größe des stationären Stroms von 26,9 Mikroamp, wurde die Funktion 1n(i/26,9 – 1) berechnet und gegen die Zeit aufgetragen. Die Neigung der Kurve (14) beträgt –0,342, was einem Diffusionskoeffizienten von 1,5 × 10^–6 cm² pro Sekunde und einer korrigierten Glucosekonzentration (bei Abzug des Hintergrund-Ferrocyanids) von 5,0 millimolar entspricht.
Der stationäre Strom ist ein solcher, bei dem während des Tests keine weitere signifikante Stromänderung eintritt. Dem Fachmann ist verständlich, daß ein Mindeststrom erreicht werden kann, wonach eine Drift infolge von Faktoren eintreten kann, wie Querdiffusion, Verdampfung, störende elektrochemische Reaktionen oder dergl.. In der Praxis ist es jedoch nicht schwierig, den "stationären" Strom (i^∞) zu bestimmen. Eine Methode hierfür beinhaltet die Approximierung eines Anfangswertes für i^∞. Mit der Anpassung der Daten i gegen t an die theoretische Kurve wird dann eine bessere Bestimmung von i^∞ erhalten. Dies wird mehrfach wiederholt, bis der Meßwert und der approximierte Wert innerhalb einer annehmbaren Differenz konvergieren und so ein bestimmtes i^∞ liefern.
In der Praxis erfolgen die Messungen des Stroms i zur Zeit t zwischen einer Mindestzeit t_min und einer Maximalzeit t_max nach Anlegen der Spannung. Die Mindest- und Maximalzeiten bestimmen sich durch die Anwendbarkeit der Gleichungen und können leicht durch einen routine- mässigen Versuch ermittelt werden. Gewünschtenfalls kann der Test dadurch wiederholt werden, daß man die Spannung abschaltet und die Konzentrationsprofile der Redox-Spezies sich in ihre Ausgangszustände umkehren läßt.
Die Analyse des Stromverlaufs gegen die Zeit zwecks Erhaltung von Werten des Diffusionskoeffizienten und/oder der Konzentration ist verständlicherweise nicht auf die oben angegebene Methode beschränkt, sondern kann auch nach anderen Methoden durchgeführt werden.
In der Praxis der Erfindung wird durch das Gerät ein elektrisches Signal geliefert, das die Änderung des Stroms mit der Zeit anzeigt. Das Signal kann ein analoges oder digitales Signal sein, oder es kann eine Reihe von Signalen sein, die in bestimmten Zeitintervallen geliefert werden. Diese Signale können durch einen Mikroprozessor oder eine andere herkömmliche Schaltung verarbeitet werden, um die erforderlichen Berechnungen nach gespeicherten Algorithmen durchzuführen, um ein Ausgangssignal zu liefern, das den Diffusionskoeffizienten, die Analytkonzentration bzw. die Hämatokritkonzentration oder dergl. anzeigt.
Ein oder mehrere dieser Ausgangssignale können durch einen analogen oder digitalen Bildschirm angezeigt werden.
Durch eine geeignete Ausbildung der Zelle ist es auch möglich, die Zelle als eine Verarmungszelle zu betreiben, die den Strom misst, der zur Verarmung des Vermittlers erforderlich ist. Bei der Ausführungsform der 5 z. B. kann das Verfahren der Erfindung unter Benutzung von Elektroden 5, 6 durchgeführt werden, die weniger als 500 μm voneinander Abstand haben. Eine amperometrische oder voltametrische Verarmungsmessung kann mit Elektroden 5 und 26 erfolgen, die mehr als 500 μm voneinander entfernt sind, so daß es keine Störung zwischen den an den Elektroden 5, 26 amperometrisch bestimmten Redox-Spezien gibt. Die Verarmungsmessung kann vor, während oder nach der Messung des Diffusionskoeffizienten durch das Verfahren der Erfindung erfolgen. Dies erlaubt eine wesentliche Verbesserung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit.
Bei den beschriebenen Ausführungsformen ist die Membran vorzugsweise eine asymmetrische poröse Membran derart, die in den US-Patenten Nr. 4,629,563 und 4,774,039 beschrieben wurde. Jedoch können auch symmetrische poröse Membranen eingesetzt werden. Die Membran kann die Form eines Blattes, Rohres, einer Hohlfaser oder eine andere geeignete Form haben.
Wenn die Membran asymmetrisch ist, befindet sich die Zielfläche vorzugsweise auf der offeneren Seite der asymmetrischen Membran. Die unkomprimierte Membran hat vorzugsweise eine Dicke von 20 bis 500 μm. Die Mindestdicke wird unter Berücksichtigung der Geschwindigkeit, Empfindlichkeit, Genauigkeit und der Kosten ausgewählt. Gewünschtenfalls kann ein Gel benutzt werden, um Hämatokrit von GOD zu trennen. Das Gel kann zwischen den Elektroden und/oder in dem Raum zwischen der Probenaufgabefläche und den Elektroden vorliegen.
Die Arbeitselektrode besteht aus irgendeinem geeigneten Metall, z. B. Gold, Silber, Platin, Palladium, Iridium, Blei oder einer geeigneten Legierung. Die Arbeitselektrode kann vorgeformt werden oder in situ durch ein geeignetes Verfahren gebildet werden, z. B. Aufsprühen, Bedampfung unter Teilvakuum, elektrodenloses Plattieren, Elektroplattieren oder dergl.. Geeignete nichtmetallische Leiter können ebenfalls für die Elektrodenkonstruktion benutzt werden, z. B. leitende Polymere, wie Poly(pyrrol), Poly(anilin), Porphyrin"drähte", Poly(isopren) und Poly(cis-butadien), die mit Jod und "Leiterpolymeren" dotiert sind. Andere nichtmetallische Elektroden können aus Graphit oder mit einem Bindemittel gemischtem Kohlenstoff oder einem mit Kohlenstoff gefüllten Kunststoff bestehen. Anorganische Elektroden, wie etwa aus In₂O₃ oder SnO₂ können auch verwendet werden. Die Gegen/Bezugselektrode kann z. B. von ähnlicher Konstruktion wie die Arbeitselektrode sein. Nickelhydroxid oder ein Silberhalogenid können auch zur Bildung der Gegen/ Bezugselektrode dienen. Silberchlorid kann benutzt werden, aber verständlicherweise ist eine Chlorierung nicht nötig und kann Silber benutzt werden, wenn in der Blutprobe genügend Chloridionen vorliegen. Obgleich bei den beschriebenen Ausführungsformen die Arbeitselektrode auf der oberen Oberfläche des Biosensors und die Gegen/Bezugselektrode auf der unteren Oberfläche dargestellt ist, können diese umgekehrt werden.
Es wird bevorzugt, daß die Arbeitselektrode und die Gegen- (oder Gegen/Bezugs)elektroden im wesentlichen die gleiche wirksame geometrische Fläche haben.
Wenn eine separate Bezugs- und Gegenelektrode benutzt wird, können diese von gleicher Konstruktion sein. Die Bezugselektrode kann an irgendeiner geeigneten Stelle sein.
Die Merkmale einer hier beschriebenen Ausführungsform können verständlicherweise mit denen einer anderen kombiniert werden. Die Erfindung ist nicht auf den Einsatz bei einer bestimmten Kombination aus Enzym und Vermittler beschränkt, und es können Kombinationen, wie sie in EP 0351892 oder anderswo beschrieben sind, benutzt werden. Das System kann dazu dienen, andere Analyte als Glucose (z. B. Cholesterin) bei geeigneter Anpassung der Reagenzien und passender Membranauswahl zu bestimmen. Das System kann auch für den Einsatz bei anderen Medien als Blut angepaßt werden. So kann das Verfahren z. B. dazu dienen, die Konzentration von Verunreinigungen, wie Chlor, Eisen, Blei, Kadmium, Kupfer usw. in Wasser zu bestimmen.
Obgleich die hier beschriebenen Zellen im allgemeinen ebene und parallele Elektroden haben, können verständlicherweise andere Ausbil dungen zur Anwendung kommen, z. B. könnte eine Elektrode ein Stab oder eine Nadel und die andere Elektrode eine konzentrische Hülse sein.
Aus der Beschreibung ist dem Fachmann erkennbar, daß die Erfindung in anderen Ausführungsformen vorliegen kann, ohne von dem hier offenbarten Erfindungskonzept abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer reduzierten (oder oxidierten) Form einer Redox-Spezies in einer elektrochemischen Zelle von der Art, die eine Arbeitselektrode (5) und eine durch eine bestimmte Entfernung (1) von der Arbeitselektrode (5) beabstandete Gegenelektrode (6) enthält, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt: (1) Anlegen einer elektrischen Potentialdifferenz zwischen den Elektroden (5, 6), (2) Auswählen des Potentials der Arbeitselektrode (5), so daß die Geschwindigkeit der Elektrooxidation der reduzierten Form (oder der Elektroreduktion der oxidierten Form) der Spezies durch Diffusion kontrolliert wird, ( 3) Auswählen des Abstands zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Gegenelektrode (6), so daß die Reaktionsprodukte von der Gegenelektrode (6) die Arbeitselektrode (5) erreichen, (4) Bestimmen des Stroms (i) als Funktion der Zeit (t) nach Anlegen des Potentials und vor Erreichen eines stationären Zustands, (5) Abschätzen der Größe des Stroms (i∞) im stationären Zustand, und (6) Gewinnen eines für den Diffusionskoeffizienten (D) und/oder die Konzentration der reduzierten Form (oder der oxidierten Form) der Spezies bezeichnenden Wertes aus der Änderung des Stroms (i) mit der Zeit (t) und der Größe des Stroms (i∞) im stationären Zustand.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem während der Zeitdauer eines Tests zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Gegenelektrode (6) ein stationäres Konzentrationsprofil der elektrochemischen Reaktionsprodukte erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die Elektroden (5, 6) um weniger als 500 μm getrennt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Redox-Spezies ein Vermittler ist und die Konzentration der reduzierten (oder oxidierten) Form des Vermittlers für die Konzentration eines Analyten bezeichnend ist, und bei dem ein Zahlenwert des Diffusionskoeffizienten (D) der reduzierten (oder oxidierten) Form des Vermittlers als Vorstufe zur Bestimmung der Konzentration des Analyten bestimmt wird .
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man den stationären Strom durch Approximierung eines Ausgangswertes für den stationären Strom abschätzt, eine Abweichung zwischen Meßdaten des Stroms gegen die Zeit und einer theoretischen Kurve misst und gegebenenfalls das Maß der Abweichung benutzt, um einen besseren Schätzwert des stationären Strome zu gewinnen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Redox-Spezies ein Analyt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Redox-Spezies ein Vermittler ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zelle eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine getrennte Bezugselektrode enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Abstand zwischen den Elektroden so ausgewählt wird, daß der stationäre Strom in einer gewünschten Zeit erreicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wenn es zur Bestimmung der Hämatokritkonzentration benutzt wird.