DE2920292B2

DE2920292B2 - dessen Säureadditions- oder Alkalisalze, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von γ -Glutamyltranspeptidase

Info

Publication number: DE2920292B2
Application number: DE2920292A
Authority: DE
Inventors: Tadami Tsuchiura Akatsuka; Kazuyo Ichikawa Hagihara; Katsumasa Kuroiwa; Takeshi Nagasawa; Katsuyuki Takabayashi; Norimasa Funabashi Takizawa
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1978-11-16
Filing date: 1979-05-18
Publication date: 1981-02-19
Also published as: SE7905009L; CH640826A5; DE2920292C3; FR2441609B1; GB2034690A; JPS5569549A; US4336331A; SE445829B; JPS5649904B2; FR2441609A1; US4281181A; DE2920292A1; GB2034690B

Description

und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze.

2. Verfahren zur Herstellung von L-y-Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyaniIid und dessen Salzen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise Glutaminsäureanhydrid, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit 3-Carboxy-4-hydroxyanilin umsetzt, die Schutzgruppe abspaltet und das erhaltene Anilid der Formel (I) gegebenenfalls in ein Säureadditions- oder ein Alkalisalz überführt

3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch ί zur Bestimmung der Aktivität von y-Glutamyltranspeptidase.

Die Erfindung betrifft L-y-Glutamyl-S-carboxy-^-hydroxyanilid und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von y-Glutamyltranspeptidase, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Es ist bekannt, daß y-Glutamyltranspeptidase (nachfolgend kurz mit y-GTP bezeichnet) ein Enzym ist, welches in der Lage ist, y-Glutamylpeptide zu hydrolysieren und y-Glutamylreste auf andere Peptide und Aminosäuren zu übertragen. Dieses Enzym ist im lebenden Gewebe und im Blutserum vorhanden. Der y-GTP-Gehalt im Serum eines Patienten verändert sich merklich bei einer Reihe von Erkrankungen.

Der y-GTP-Gehalt ist bei einem Patienten, der an cholangiolitischer Hepatitis, obstruktiver Gelbsucht oder primären oder metastatischen Hepatomen leidet, in dessen Serum sehr hoch. Chronische Hepatitis erhöht den Serum-y-GTP-Gehalt im akuten Stadium, während der Gehalt auf einem niedrigen Niveau bleibt, wenn die Krankheit im inaktiven Stadium ist Im allgemeinen sind die Veränderungen im Serum-y-GTP-Gehalt spezifisch für chronische Lebererkrankungen und daher von diagnostischer Bedeutung. Die Bestimmung der Aktivität von Serum-y-GTP ist deshalb für die Diagnose der vorerwähnten Krankheiten und für die Erkennung der Krankheitsbedingungen unabdingbar.

Für die Bestimmung der y-GTP-Aktivität sind verschiedene Methoden bekannt, bei denen man synthetische Substrate verwendet und dann die gebildeten Amine bestimmt Alle diese Methoden haben Vor- und Nachteile und es besteht ein Bedarf an einem neuen synthetischen Substrat Bei einem Verfahren verwendet man y-Glutamyl-p-nitroanilid als Substrat und bestimmt dann p-Nitroanilin, das gelb ist und aus dem Substrat gebildet wird, kolorimetrisch (Clinica Chimica Acta, Band 65,21 [1975]). Bei diesem Verfahren ist ein genauer Bündlest Für jede Serumprobe erforderlich, um den Einfluß von Serumbestandteilen zu vermeiden, und die Ergebnisse dieser Versuche sind ungenau. Die kolorimetrische Bestimmung von p-Nitroanilin nach Kondensation mit p-Dimethylaminozimtaldehyd ist problematisch, weil die Empfindlichkeit der Farbentwicklung in erheblichem Maße durch die Temoeratur beeinflußt wird, und daher eine nicht ausreichende Reproduzierbarkeit /orliegL Bei einem anderen Verfahren wird p-Nitroanilin diazotiert und dann mit 3,5-Xylenol kondensiert und die dabei entstehende rote Farbe wird kolorimetrisch bestimmt (japanische Offenlegungsschrift 32 092/78). Dieses Verfahren ist nicht einfach genug, weil zahlreiche Stufen bei der Behandlung von p-Nitroanilin erforderlich sind. Aus Chem. Abstracts 81, 1974, 91 933; 85, 1976, 42 661; 85, 1976, 155 503; 86, 1977, 1485; 86, 1977, 85 167, ist die Verwendung eines gutlöslichen hydrophilen Substrates, nämlich 1 -gamma-Glutamyl-S-carboxy-l-nitroanilid, zur Bestimmung der Aktivität von gamma-GIutamyltranspeptidase bekannt Die aus diesem Substrat durch die gamma-GTP-Aktivität freigesetzte Substanz ist 3-Carboxy-4-nitroanilin, das selbst ein Chromogen ist, und eine maximale Absorption im Wellenlängenbereich von etwa 400 nm zeigt und in den chemischen Eigenschaften im wesentlichen den vorerwähntem para-Nitroanilin entspricht Wegen der kurzen Wellenlänge, bei der eine maximale Absorption vorliegt und der gelben Farbe ist auch hier ein genauer Blindtest für jede Serumprobe erforderlich, um den Einfluß von Serumbestandteilen zu vermeiden. Die kollorimetrische Bestimmung von 3-Carboxy-4-nitroanilin nach Kondensation mit para-Dimethylaminozimtaldehyd, die man durchführen kann, um eine Substanz zu erhalten, die

so eine maximale Absorption in einem längeren Wellenbereich aufzuweisen, oder die Kondensation mit Xylenol nach Diazotierung ergibt eine rote Substanz, aber die Farbentwicklung wird erheblich durch die Temperatur beeinflußt, so daß die Reproduzierbarkeit nicht befriedigend ist, und das Verfahren insgesamt kompliziert ist.

Kürzlich wurde versucht, die y-GTP-Aktivität zu bestimmen unter Verwendung von y-Glutamyl-p-Dimethylaminoanilid als Substrat, worauf man dann das gebildete p-Dimethylaminoanilin nach der Farbentwicklung mil einem Peniäcyäflöeiseflkoffiplex kolorimetrisch bestimmte (japanische Offenlegungsschrift 1 46 693/77). Dieses Verfahren hat aber den Nachteil, daß die Lagerbeständigkeit der Farbentwicklerlösung

h5 aufgrund ihrer nicht ausreichenden Stabilität nur einige Tage beträgt, und die Menge an in das Abwasser gelangendem Cyanid umweltverschmutzend ist. Außerdem haben alle vorerwähnten Substrate nur eine

schlechte Löslichkeit in Wasser und daher muß man löslichmachende Mittel, wie oberflächenaktive Mittel, organische Lösungsmittel, die nicht leicht kontrollierbar sind, anwendsn, Selbst bei Verwendung eines solchen Mittels reicht die Konzentration jedoch häufig nicht für die Umsetzung aus.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Substrat für die Verwendung zur Bestimmung der y-GTP-Aktivität bereitzustellen, das eine ausreichende Löslichkeit in Wasser aufweist, und Eigenschaften hat, welche die Schwierigkeiten bei den Produkten des Standes der

HOOC-CH-CH₂-Ch₂-C-NH

Technik hinsichtlich der Anwendbarkeit, Sicherheit, Genauigkeit, Reproduzierbfvkeit, Einfachheit, Stabilität und Umweltverschmutzung nicht aufweist

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, die Bestimmung der y-GTP-Aktivität unter Verwendung des Substrates zu zeigen. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Substrates,

Als Ergebnis wurde ein neues Substrat mit ausgezeichneten Eigenschaften gefunden, und die Erfindung betrifft dieses neue Substrat, nämlich L-y-GIutamyl-3-carboxy-4-hydroxyaniUd der Formel (I),

COOH

OH

NH,

und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze. Bei der Durchführung dir Bestimmungsmethode wird das erfindungsgemäBe Substrat mit γ-GTP eines Serums in einer Pufferlösung vom pH 7,5 bis 9,5 umgesetzt und das 3-Carboxy-4-hydroxyanilin, das sich bei dieser Umsetzung bildet, wird mit einem geeigneten Kuppler oxydativ kondensiert unter Ausbildung einer gefärbten Substanz, weiche dann zur Bestimmung der y-GTP-Aktivität des Serums kolorimetrisch bestimmt wird.

Geeignete Kuppler zur Entwicklung der Farbe im sauren Gebiet sind Anilinverbindungen, wie z.B. Ν,Ν-Diäthylanilin, und für die Entwicklung im alkalischen Gebiet Phenol- und Naphtholverbindungen, wie beispielsweise 2,6-Xylenol und 2£-XyIenoI.

Das am meisten geeignete Oxidationsmittel für die vorerwähnte oxidative Kondensation ist Natriummetaperjodat, jedoch können auch verschiedene andere Verbindungen, wie Wasserstoffperoxid, Persulfate, verwendet werden.

Die gefärbte Substanz, die durch oxidative Kondensation zwischen 3-Carboxy-4-hydroxyanilin und einem Kuppler gebildet wird, zeigt eine maximale Absorption in dem breiten Wellenbereich von 560 bis 770 nm, je nach der Art des Kupplers. Die Farbentwicklung ist sehr konstant und wird nur wenig durch Temperaturänderungen beeinflußt und ist deshalb für die Bestimmung der y-GTP-Aktivität geeignet

Da L-y-GIutamyl-S-carboxy-'t-hydroxyanilid hydrophile funktionell Gruppen hat ist diese Verbindung leicht in Wasser löslich, ohne daß löslichmachende Verbindungen, wie oberflächenaktive Mittel oder organische Lösungsmittel benötigt werden. Deshalb sind die Zubereitung der Reagenzien und das Meßverfahren sehr leicht durchzuführen und das Substrat kann in einer für die Reaktion ausreichend hohen Konzentration verwendet werden. Dies sind die Hauptvorteile der Erfindung.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Bestimmung der y-GTP-Aktivität kaum durch Verunreinigungen, die sich in dem von einem lebenden Körper entnommenen Proben befinden, beeinflußt wird. Dies liegt daran, daß die erfindungsgemäße Untersuchungsmethöde in einem Wellengebiet von mehr als 560 nm durchgeführt wird, im Gegensatz zu der L-y-GIutamyl-p-nitroanilid-Methode, bei der die Messung bei Wellenlängen von kleiner als 560 nm durchgeführt wird. Daher ist auch keine Blindprobe für jede Probe erforderlich und dies ermöglicht eine schnelle Bestimmung. Reduzierende Substanzen, wie Harnsäure und Ascorbinsäure, in der Probe werden durch einen Oberschuß des Oxidationsmittels zersetzt und haben daher keinen Einfluß auf die Genauigkeit der Messung,

Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung bei ihrer Verwendung als Substrat bei der Bestimmung von y-GTP-Aktivität den üblichen Substraten weit überlegen ist Wie aus dem später noch beschriebenen Bestimmungsbeispiel hervorgeht besteht eine befriedigende Übereinstimmung zwischen den unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung erzielten Werten und solchen, die in den bisher verwendeten üblichen Verfahren erzielt wurden.

Die Herstellung der Verbindung der Formel (I) kann in folgender Weise erfolgen:

Glutaminsäureanhydrid, dessen Aminogruppen geschützt sind, läßt man mit 3-Carboxy-4-hydroxyanilin reagieren und entfernt dann die Schutzgruppen von dem Reaktionsprodukt

Geeignete Schutzgruppen, die unter milden Bedingungen leicht entfernt werden können, sind solche, wie sie bei der üblichen Peptidsymhese verwendet werden,

z. B. Phthalylgruppen, die durch Hydrazin, tert-Butoxycdrbonylgruppen und Formylgruppen, die unter schwach sauren Bedingungen, Trifluoracetylgruppen, die unter schwach alkalischen Bedingungen und Benzyloxycarbonylgruppen, die durch Bromwasserstoff oder katalytische Reduktion entfernt werden können. Die Kondensation wird in einfacher Weise durch Erhitzen in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. einem inerten organischen Lösungsmittel, durchgeführt. Erforderlichenfalls kann das freie Aminosäureanilid,

ΐο dessen Schutzgruppen entfernt wurden, in ein Salz überführt werden, durch Zugabe von verschiedenen anorganischen oder organischen Säuren, oder in ein Alkalisalz durch Umsetzung mit einer Alkaliverbindung.

Verwendungsbeispiel Bestimmung der y-GTP-Aktivität in einem Serum

unter Verwendung einer 2,6-Xylenol-Natrium-

metaperjodat-Entwicklungslösung

0,5 g Glycylglyzin und 14 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan wurden in 80 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 8,2 mit 3 n-Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann durch Zugabe von Wasser auf 100 ml unter Herstellung einer Pufferlösung aufgefüllt. Eine Substratpufferlösung wurde erhalten durch Auflösen von 113 mg L-y-Glutamyl-S-carboxy-'J-hydroxyani-Hd in der vorerwähnten Pufferlösung.

0,02 ml einer Serumprobe wurden in ein Reagensglas gegeben, welches 1,0 ml der bei 37"C gehaltenen Substrat-Pufferlösung enthielt, 20 Min. nach der Inkubierung wurde die Mischung mit 3,0 ml einer Lösung versetzt, die hergestellt worden war durch Auflösen von 86 mg 2,6-Xyleno! und 32 mg Natriummetaperjodat in 100 ml einer 0,2 n-wäUrigen Kaliumhydroxidlösung, Man HeB die Mischung 10 Min. bei Raumtemperatur stehen und dann wurde die Absorption bei 615 nm gemessen. Ein Blindtest wurde in gleicher Weise wie vorher beschrieben, ausgeführt, mit der Ausnahme, daß 0,02 ml Wasser ansteile des Serums verwendet wurden. Die Serum-y-GTP-Aktivität wurde berechnet aus dem Unterschied der Absorptionen der beiden vorher beschriebenen Messungen und der Absorption an der 0,02-ml-StandardIösung, enthaltend eine bekannte Menge an 3 Carboxy-4-hydnrey-anilin, die in gleicher Weise, wie vorher beschrieben, behandelt worden war.

In der folgenden Tabelle werden zum Vergleich Meßwerte gezeigt, die die Ergebnisse gemäß der vorliegenden Erfindung und solchen, die unter Anwendung einer üblichen Methode, bei welcher L-y-Glutamyl-p-nitroanilid als Substrat verwendet wurde, erzielt wurden.

Die erfindungsgemäß erzielten Meßwerte wurden auf der Ordinate aufgetragen und die nach der L-y-GIutamyl-p-nitroanilidmethode erzielten auf der Abzisse, wobei sich folgende Regressionsgleichung ergab:

!»robe Nr.

KrfindungsgcrnäUe )>-GluU!rnyl-Methnde p-nitrPMnilid

Meihucle

y= 1,07*- 1,50

Die Übereinstimmung war befriedigend, der Korrelationskoeffizient betrug γ = 0392.

Tabelle

Vergleich der nach der erfindungsgemäßen Methode gemessenen Werte mit denen, die nach der L-y-Glutamyl-p-nitroanilid-Methode gefunden wurden unter Anwendung eines Humanserums.

Probe Nr.	ErfindungsgcmäUc	y-Glutamyl-
	Methode	p-nitroanilid-
		Methode
I	205	209
2	58	58
3	206	196
4	529	495
5	91	81
6	85	114
7	144	143
8	53	49
9	32	31
10	9	9
Il	22	19
12	21	19
13	6	6
14	Il	11
15	10	10

16	62	61
17	26	26
18	21	20
19	7	9
20	5	7
21	72	60
22	326	289
23	164	142
24	392	354
25	13	14
26	16	17
27	22	20
28	42	40
29	8	8
30	17	16
31	9	8
32	9	9
33	13	14

Beispiel

Herstellung von L-y-Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid

Zu einer Mischung aus 253 g (0,1 Mol) N-Phthaloyl-

jo glutaminsäureanhydrid und 153 g (0,1 MoI) 3-Carboxy-4-hydroxyanilin wurden 60 ml Essigsäure gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren 30 Min. auf 6O⁰C erhitzt Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionsrniscnung auf Raumtemperatur gekühlt und zu 500 ml

r> Äther gegossen und unter Abkühlen 2 Stunden stehengelassen und der Niederschlag wurde durch ein Glasfilter abfiltriert. Das Filtrat wurde langsam unter Rühren zu einem Liter η-Hexan in einen 2-l-Kolben gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit N-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 41,0g (993%) des rohen Phthaloyl-L-y-glutamyl-S-carboxy^-hydroxyanilids erhielt Das Rohprodukt wurde in 431 ml Methanol gelöst, mit 26,8 ml 100%igem Hydrazinhydrat vermischt und 24 Stunden zur Entfernung der PJithalylgruppe bei Raumtemperatur stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft Der Rückstand wurde in 212 ml Wasser gelöst und filtriert Das Filtrat wurde auf pH 1 bis 2 eingestellt und über Nacht stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser und Aceton gewaschen und dann vakuumgetrocknet Ausbeute: 11,5 g (41 %); Schmelzpunkt: 175 bis 177⁰C (Zersetzung); spezifische Drehung: [*];: +8,6

5-i (c= 1,0,05 η NaOH).

Elementarai-alyse: Ci₂HuN₂O₆--L hjO (Molekulargewicht 2883)

Gefunden: C 49,78, H 4,90, N 9,69%;
berechne»: C 50,00, H 5,13, N 9,71%.

Claims

Patentansprüche:

1. L-y-Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyaniIid der Formel

COOH

HOOC-CH-CH₂-CH₂-C—NH-<f \

-OH

NH₂