DE68912054T2

DE68912054T2 - Phosphorsäure-Derivate und Verfahren zur Bestimmung der Säure-Phosphatase-Aktivität unter Verwendung derselben.

Info

Publication number: DE68912054T2
Application number: DE68912054T
Authority: DE
Inventors: Katsuhiro Katayama; Katsumasa Kuroiwa; Toshihide Miura; Takeshi Nagasawa
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1988-09-19
Filing date: 1989-09-19
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2009-09-20
Also published as: US5081274A; EP0363688A1; DE68912054D1; EP0363688B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Phosphorsäurederivate und ein Verfahren zur Bestimmung der Säurephosphatase-Aktivität unter Verwendung derselben. Gemäss der vorliegenden Erfindung kann die Säurephosphatase-Aktivität genau auf einfache Weise bestimmt werden, und die vorliegende Erfindung ist als Assay für den klinischen Test zur Bestimmung der Säurephosphatase in medizinischen Behandlungsbereichen und Laborverfahren äusserst geeignet.
Säurephosphatase (im nachfolgenden als Acp bezeichnet) ist ein Enzym, das einen phosphorsäuremonoester unter sauren Bedingungen (pH 4 bis 6) hydrolysiert. Bei Patienten mit Prostatakrebs, Brustkrebs, verbunden mit Knochenmetastasen oder Knochenkrankheiten, und Leber- und Nierenkrankheiten wird ein Anstieg von Acp im Serum oder Urin bemerkt, und der Bestimmung von Acp als Tumormarker ist Beachtung geschenkt worden.
Insofern sind Verfahren unter Verwendung verschiedener synthetischer Substrate, wie im nachfolgenden gezeigt, zum Testen von Säurephosphatase-Aktivität beschrieben worden. Einige von diesen sind praktisch für übliche Laborverfahren verwendet worden.
(a) Verfahren unter Verwendung von β-Glycerinphosphorsäure als Substrat (Bodansky, A.: J. Biol. Chem. 101, 93 (1933)):
Hydrolyse von β-Glycerinphosphorsäure mit Acp ergibt Glycerin und anorganischen Phosphor. Man lässt den anorganischen Phosphor eine Farbe erzeugen, und die Farbe wird gemessen.
(b) Verfahren unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat (Hudson, P.B. : J. Urol., 58, 89 (1947)):
Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphorsäure mit Acp ergibt p-Nitrophenol, welches mit einem Alkali unter Bildung einer Farbe umgesetzt wird, und die Farbe wird gemessen.
(c) Verfahren unter Verwendung von Phenylphosphorsäure als Substrat:
Es gibt ein Verfahren, welches Hydrolysieren von Phenylphosphorsäure mit Acp und Umsetzen des sich ergebenden Phenols mit Folin-Ciocalten-Reagens (King, E.J., Armstrong, A.R.: Canad. Med. Assoc. J., 31, 376 (1934)) umfasst, und ein Verfahren, welches Hydrolysieren von Phenylphosphorsäure mit Acp, oxidatives Kondensieren des sich ergebenden Phenols mit 4-Aminoantipyrin und Messen des gebildeten Chinons roter Farbe (Kind, P.R.N., King, E.J.: J. Clin. Path., 7, 322 (1954)) umfasst.
(d) Verfahren unter Verwendung von Naphthylphosphorsäure als Substrat (Hillmann, G.: Z. Klin. Chem., Klin. U. Biochem., 9, 237 (1971)):
Durch Hydrolyse mit Acp gebildetes Naphthol wird mit Fast Red TR unter Bildung eines Azofarbstoffs umgesetzt, und der Azofarbstoff wird kolorimetrisch bestimmt.
(e) Verfahren unter Verwendung von 2,6-Dichlor-4- nitrophenylphosphorsäure als Substrat (Teshima, S., Hayashi, Y., Ando, M.: Clin. Chim. Acta., 168, 231 (1987)):
Die durch Hydrolyse mit Acp gebildete gelbe Farbe von 2,6-Dichlor-4-nitrophenol wird kolorimetrisch bei 400 nm bestimmt.
Diese Testverfahren beinhalten verschiedene Probleme, und die Probleme sind Ursache für die Ungenauigkeit der Messdaten. Beispielsweise ist in dem Verfahren (a) anorganischer Phosphor in normalem Serum enthalten, und somit muss der anorganische Phosphor in dem zu testenden Serum zuvor bestimmt werden. Darüber hinaus sind komplizierte Verfahren erforderlich, und diese stellen Probleme bei der praktischen Anwendung dar. Bei dem Verfahren (b) sollte das System nach der enzymatischen Reaktion in einem sauren Bereich, welches der optimale pH von Acp ist, mit wässriger Natriumhydroxid-Lösung etc., alkalisch gemacht werden, ansonsten bildet p-Nitrophenol als Chromophor keine Farbe, und es ist somit unmöglich, den Umsatztest durchzuführen. Darüber hinaus entspricht die bei 405 nm zu messende Wellenlänge einer Neigung des UV-Spektrums des Chromophoren und wird ernsthaft durch Bilirubin im Serum beeinflusst, was die Ursache für fehlerhafte Messdaten ist. Bei dem Verfahren (c) ist eine Farbbildungs-Reaktion des durch Hydrolyse mit Acp gebildeten Phenols wie im Verfahren (b) erforderlich. Es ist somit unmöglich, die Mengenbestimmung durchzuführen. Darüber hinaus ist die Farbbildung zwischen Phenol und 4-Aminoantipyrin auch instabil, und dieses stellt eine weitere Fehlerguelle dar. Bei dem Verfahren (d) ist Fast Red TR, welches mit freiem Naphthol umgesetzt wird, instabil. Darüber hinaus hat das Verfahren eine grosse Reaktionsanlaufzeit, welches Fehler bei den Messdaten erzeugt, obwohl das Verfahren auch für die Mengenbestimmung und für eine automatisch betriebene Analysevorrichtung verwendbar ist.
Das Verfahren (e) ermöglicht es, die Mengenbestimmung durchzuführen, ohne dass eine Farbbildungs-Reaktion erforderlich ist, und ist auch für automatisch betriebene Analyseinstrumente verwendbar. Jedoch besteht bei dem Verfahren die Tendenz, dass es durch Bilirubin oder Hämoglobin im Serum beeinflusst wird, weil die Wellenlänge für die Messung in der Nähe von 400 nm liegt. Darüber hinaus ist das Substrat selbst in wässriger Lösung instabil und erzeugt spontane Hydrolyse.
Wie zuvor beschrieben, haben die konventionellen Verfahren zur Bestimmung der Acp-Aktivität verschiedene Fehler, und die Fehler stellen die Ursache für ungenaue Messdaten dar. Deshalb sind diese Verfahren praktisch unvorteilhaft.
Es ist demgemäss Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Phosphorsäurederivate und deren Salze zur Verfügung zu stellen, die extrem stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse sind, die Eigenschaft besitzen, spezifisch mit Acp im Serum zu reagieren, und die extrem geeignet für die Bestimmung der Acp-Aktivität sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Bestimmung der Säurephosphatase-Aktivität unter Verwendung der neuen Phosphorsäurederivate oder deren Salze zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile sind aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft neue Phosphorsäurederivate, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt sind:
wobei X ein Halogen ist und R -(CH&sub2;)nCH&sub3; (n = 0 bis 3) ist, oder deren Salze.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Säurephosphatase-Aktivität unter Verwendung der neuen Phosphorsäurederivate und deren Salze als Substrate.
Fig. 1 zeigt UV-Spektren von (a) DCAP-P (Konzentration von 50 µM,) und (b) 2, 6-Dichlor-4-acetylphenol (Konzentration von 50 µM) in 100 mM Natriumcitrat-Pufferlösung bei pH 5,4 (25ºC)
Fig. 2 zeigt das IR-Spektrum von DCAP-P;
Fig. 3 zeigt den Reaktionszeitverlauf bei Verwendung von DCAP-P als Substrat;
Fig. 4 zeigt den optimalen pH-Wert von Acp;
Fig. 5 zeigt die Stabilität von DCAP-P gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse;
Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen der Acp- Verdünnung und Enzymaktivität;
Fig. 7 zeigt die S-V-Kurve und Lineweaver-Burk- Mengen;
Fig. 8 zeigt den Reaktionszeitverlauf bei Verwendung von DBAP-P als Substrat;
Fig. 9 zeigt den Reaktionszeitverlauf bei Verwendung von DCBP-P als Substrat.
In der zuvor angegebenen Formel (I) umfassen Beispiele für R Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl. X stellt ein Halogen dar, beispielsweise Chlor, Brom, Fluor etc.. Beispiele für die Salze der neuen Phosphorsäurederivate, die durch die zuvor angegebene allgemeine Formel (I) dargestellt sind, umfassen Alkalimetallsalze, wie beispielsweise Natriumsalze, Kaliumsalze etc.; Aminsalze, wie beispielsweise Tris (hydroxy-methyl) aminomethansalze, Cyclohexylaminsalze, Dicyclohexylaminsalze, etc.
Die neuen Phosphorsäurederivate können beispielsweise durch folgendes Reaktionsschema synthetisiert werden: Fries-Umlagerung
Das bedeutet, das neue Phosphorsäurederivat der Formel (I) kann durch Umsetzen eines 2,6-Dihalophenols (II) mit einem Säureanhydrid unter Esterbildung, anschliessender Fries- Umlagerung von 2,6-Dihalophenolester (III) in Anwesenheit eines Katalysators, wie beispielsweise Aluminiumchlorid, Zinkchlorid, etc., Umsetzen des gebildeten 2,6-Dihalo-4- acylphenols (IV) mit einem Alkalimetallhydroxid [MetOH (VI)], wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, etc., unter Erhalt des entsprechenden Salzes (V) und anschliessendes Umsetzen des Salzes (V) mit Phosphoroxychlorid (POCl&sub3;), wodurch Hydrolyse erzeugt wird, erhalten werden. Diese Reaktionen sind alle bekannt und gebräuchlich, und die Reaktionsbedingungen entsprechen denjenigen bekannter Reaktionen.
Die Salze der neuen Phosphorsäurederivate können durch Behandeln der Verbindungen der Formel (I) mit Alkalimetallhydroxiden, wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, etc.; Aminen, wie beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Cyclohexylamin, etc. auf konventionelle Weise erhalten werden.
Als nächstes wird das Verfahren zur Bestimmung der Acp- Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des neuen Phosphorsäurederivats im nachfolgenden beschrieben, wobei auf 2,6-Dichlor-4- acetylphenylphosphorsäure (im nachfolgenden als DCAP-P bezeichnet) Bezug genommen wird.
Die UV-Spektren von (a) DCAP-P und (b) 2,6-Dichlor-4- acetylphenol sind in Fig. 1 dargestellt. Wenn DCAP-P durch Wirkung von Acp hydrolysiert wird, wird 2,6-Dichlor-4- acetylphenol gebildet. Phosphorsäure und DCAP-P haben geringe UV-Absorption bei 300 nm und mehr. 2,6-Dichlor-4- acetylphenol absorbiert UV unterhalb von 370 nm. Deshalb kann die Reaktion in dem Verfahren zur Bestimmung der Acp- Aktivität mit Hilfe des UV-Verfahrens bei einer Messwellenlänge im Bereich von 300 bis 370 nm unter Verwendung von DCAP-P als Substrat verfolgt werden. In diesem Fall ist die Beeinflussung durch andere Serumkomponenten minimiert. Demgemäss kann der Anstieg von 2,6-Dichlor-4-acetylphenol genau verfolgt werden, so dass die Acp-Aktivität genau bestimmt werden kann. Darüber hinaus hat DCAP-P sehr viele ausgezeichnete Vorteile, wie im nachfolgenden beschrieben ist.
Somit umfasst ein bestimmtes Beispiel für das Verfahren zur Bestimmung der Acp-Aktivität unter Verwendung des neuen Phosphorsäurederivats der Formel (I) das folgende Verfahren. Das heisst, das Verfahren umfasst Mischen einer Acp-haltigen Probe mit dem neuen, durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Phosphorsäurederivat oder dessen Salzen, wodurch eine Enzymreaktion erzeugt wird, und anschliessendes Messen der Absorption des Reaktionsproduktes, besonders bei 300 bis 370 nm, wodurch die Acp-Aktivität bestimmt werden kann.
Gemäss dem zuvor beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 2,6-Dichlor-4-nitrophenolphosphorsäure als Substrat kann die Mengenbestimmung in dem sauren Bereich, welches der optimale pH-Wert von Acp ist, durchgeführt werden. Die Messung wird jedoch bei einer Wellenlänge von 400 nm durchgeführt, so dass die Daten stark durch Bilirubin und Hämoglobin, welches Serumkomponenten sind, beeinflusst werden. Im Unterschied hierzu wird die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Wellenlänge von etwa 300 bis 370 nm wenig durch diese Komponenten beeinflusst, und es ist somit leicht, die optimalen Messbedingungen auszuwählen. Daneben hat beispielsweise 2,6-Dichlor-4- acetylphenol, welches mittels Hydrolyse des neuen Phosphorsäurederivats gemäss der Erfindung, beispielsweise DCAP-P gebildet wird, eine maximale Absorption in der Nähe von 300 nm, und somit kann die Wellenlänge für die Messung auf diesen Peak festgelegt werden. Dieses bedeutet, dass Unterschiede im molekularen Extinktionskoeffizienten, etc., im Hinblick auf die Frage der Genauigkeit in bezug auf die Wellenlänge einer Analysenvorrichtung, so wenig wie möglich verringert sind, und dass Unterschiede in bezug auf die Messdaten in Abhängigkeit von den Typen der Analysevorrichtungen extrem minimiert sind.
Darüber hinaus ist das neue Substrat der vorliegenden Erfindung, beispielsweise DCAP-P, sehr stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse. Beispielsweise trat Hydrolyse unter den Bedingungen 37ºC und 10 Minuten in 10 mN Citratpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 5,4 kaum auf (Fig. 5) . Die Ergebnisse zeigen, dass nichtenzymatische Hydrolyse während der Messung ignoriert werden kann, aber die Acp-Aktivität kann genau bestimmt werden.
Darüber hinaus besitzt das neue Phosphorsäurederivat gemäss der Erfindung hohe Affinität gegenüber Acp und eignet sich für die Bestimmung der Acp-Aktivität.
Als Puffermittel zum Aufrechterhalten des pH-Werts bei einem konstanten Niveau in bezug auf die Bestimmung der Acp-Aktivität können Zitronensäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Phthalsäure, etc. verwendet werden. Andere Puffermittel als die zuvor angegebenen sind auch verwendbar, solange sie die Pufferwirkung in einem pH-Bereich von 4,0 bis 6,0 aufrechterhalten können.
Im Falle der Verwendung von beispielsweise DCAP-P als Substrat betrug der optimale pH-Wert von Acp etwa 5,4 in 100 mM Citratpuffer-Lösung (siehe Fig. 4) . Weil DCAP-P gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse bei einem pH-Wert von 5,4 stabil ist, können die Reaktionen, wie zuvor beschrieben, bei dem optimalen pH-Wert von Acp gemäss dem Verfahren zur Bestimmung gemäss der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
Das Verfahren zur Bestimmung der Acp-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung kann die Probleme konventioneller Verfahren in verschiedenen Punkten lösen. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung sind im nachfolgenden angegeben.
(1) Der Reaktionsmechanismus in dem Messsystem ist einfach und klar, so dass Ursachen für Fehler in den Messdaten extrem gering sind.
(2) Die Messung kann bei der Peak-Wellenlänge (330 nm) durchgeführt werden.
(3) Das neue Phosphorsäurederivat, beispielsweise DCAP-P, gemäss der vorliegenden Erfindung, welches als Substrat verwendet wird, ist gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse sehr stabil, und somit ist die Reproduzierbarkeit der Messdaten gut.
(4) Es ist nicht erforderlich, die Daten einer Probe unter Verwendung einer Kontrollprobe zu korrigieren, so dass die Messung rasch auf einfache Weise durchgeführt werden kann, und-eine grosse Anzahl von Proben behandelt werden kann.
(5) Weil das neue Phosphorsäurederivat, beispielsweise DCAP-P, gemäss der vorliegenden Erfindung stabil ist, können die Reaktionen bei dem optimalen pH-Wert (5,4) durchgeführt werden.
(6) Weil der molekulare Extinktionskoeffizient von beispielsweise 2,6-Dichlor-4-nitrophenol, welches durch Hydrolyse von beispielsweise DCAP-P gebildet ist, welches das neue Phosphorsäurederivat gemäss der vorliegenden Erfindung ist, ausreichend gross bei der Messwellenlänge bei dem optimalen pH-Wert (5,4) von Acp ist, können die Reaktionen kontinuierlich verfolgt werden, ohne zeitweilig die Reaktion zu beenden, das System alkalisch zu machen und anschliessend Kolorimetrie durchzuführen, wie es im Falle der Verwendung von p-Nitrophenol erforderlich ist.
(7) Das Verfahren ist für eine automatisierte Analysenvorrichtung leicht verwendbar.
(8) Das neue Phosphorsäurederivat gemäss der vorliegenden Erfindung hat eine hohe Affinität gegenüber Acp und eignet sich für die Bestimmung der Acp-Aktivität.
Das Verfahren zur Bestimmung der Acp-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung hat die mit den Verfahren des Standes der Technik verbundenen Probleme, wie zuvor beschrieben, gelöst, und weist viele Vorteile und charakteristische Eigenschaften auf, so dass die Acp- Aktivität genau auf einfache Weise bestimmt werden kann. Deshalb trägt die vorliegende Erfindung ausreichend zur Bestimmung der Acp-Aktivität bei den täglichen Laborverfahren bei.
Im nachfolgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, aber sie wird dadurch nicht begrenzt.

BEISPIEL 1

Synthese von 2,6-Dichlor-4-acetylphenylphosphorsäure:
(1) In 28 ml Essigsäureanhydrid wurden 50,0 g 2,6- Dichlorphenol gelöste und ein oder zwei Tropfen konzentrierte Schwefelsäure wurden zu der Lösung gegeben. Man liess die Mischung 10 Minuten bei 130ºC sich umsetzen, wodurch acetyliert wurde. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf 300 ml Eiswasser gegossen, und die Mischung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen der Ethylacetat-Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat während der Nacht wurde die Ethylacetat- Phase unter Erhalt von 58,2 g farbloser öliger Substanz konzentriert. Als nächstes wurde die ölige Substanz in 150 ml Nitrobenzol gelöst und 56,8 g pulveriges Aluminiumchlorid wurden allmählich zu der Lösung gegeben. Die Reaktion wurde 27 Stunden lang bei 60 bis 70ºC unter Erhalt der Fries-Umlagerung durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf 1 l kalte verdünnte Salzsäure gegossen, und die organische Phase wurde von der wässrigen Phase abgetrennt. Die organische Phase wurde mit 2 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung extrahiert. Nach der Extraktion wurde die Lösung durch Hinzufügen von 5 N Salzsäure sauer gemacht, woran sich Extrahieren mit Ethylacetat anschloss. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Ethylacetat-Phase unter Erhalt von 38,5 g 2,6-Dichlor-4-acetylphenol als Rohkristalle konzentriert. Die Kristalle wurden aus heissem Ethylacetat unter Erhalt von 19,9 g reinem weissen 2,6-Dichlor-4-acetylphenol umkristallisiert. 2,6-Dichlor- 4-acetylphenol (3,5-Dichlor-4-hydroxy-acetophenon):
C&sub8;H&sub6;Cl&sub2;O&sub2;
Schmelzpunkt 160 bis 162ºC
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 47,05 H 2,78
berechnet (%) : 46,86 2,95
(2) In Aceton wurden 8,9 g 2,6-Dichlor-4- acetylphenol gelöst, und 10,8 ml wässrige 2 N Natriumhydroxid-Lösung wurden zu der Lösung unter Eiskühlung gegeben.
Aceton und Ether wurden wiederum zu der Lösung zum Zwecke der Fällung von Kristallen gegeben. Die Kristalle wurden mittels Filtration herausgenommen und bei vermindertem Druck unter Erhalt von 8,04 g leicht gelbem 2,6-Dichlor-4- acetylphenol-Natriumsalz getrocknet. Anschliessend wurden 2,61 g Natriumsalz allmählich zu 10,4 ml auf etwa 10ºC gekühltes Phosphoroxychlorid gegeben. Nach Hinzugabe wurde die Reaktion bei 12 bis 15ºC durchgeführt. Nachdem das gefällte Natriumchlorid mittels Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat unter Erhalt einer braunen öligen Substanz konzentriert. Zu der öligen Substanz wurden etwa 100 ml gekühltes Wasser für die Durchführung einer 45-minütigen Hydrolyse bei 0ºC bis Raumtemperatur gegeben. Nach Entfernung des unlöslichen Materials mit Hilfe von Filtration wurde das Filtrat mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Ethylacetat-Phase unter Erhalt von 1,22 g 2,6-Dichlor-4- acetylphenylphosphorsäure als Rohkristalle konzentriert. Die Rohkristalle wurden aus heissem Ethylacetat/n-Hexan unter Erhalt von 682 mg Kristallen umkristallisiert. Die Kristalle wurden weiterhin mittels Säulenchromatografie gereinigt (feste Phase: Sephadex LH-20, Lösungsmittel: Methanol), wobei 521 mg 2,6-Dichlor-4- acetylphenylphosphorsäure als weisse Kristalle erhalten wurden. 2,6-Dichlor-4-acetylphenylphosphorsäure:
C&sub8;H&sub7;Cl&sub2;O&sub5;P
Schmelzpunkt: 165 bis 170ºC (Zersetzung)
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 33,38 H 2,53
berechnet (%) 33,71 2,48
Das UV- und das IR-Spektrum sind in den Fig. 1 bzw. 2 dargestellt.

BEISPIEL 2

Verfahren zur Bestimmung der Acp-Aktivität im Serum:
(1) 100 mM Citratpuffer-Lösung, pH 5,4 (25ºC)
(2) Probe
(3) 7,8 mM Substrat (DCAP-P)-Lösung
Zu 2,0 ml Pufferlösung (1) werden 0,1 ml der Probe (2) hinzugefügt. Die Mischung wird vorhergehend bei etwa 37ºC erwärmt, und 0,5 ml Substratlösung (3) werden hinzugefügt. Gleichzeitig beginnt eine Stoppbeobachtung, und die Absorption bei 330 nm wird genau 1 und 2 Minuten danach gemessen. Die Änderung der Absorption pro Minute wird somit bestimmt. Der Zeitverlauf ist in Fig. 3 dargestellt.
Als Probe wurde Acp, welches aus menschlichen Prostatitisdrüsen stammt (hergestellt von Sigma Inc.) verwendet. Die Acp-Aktivitat wird mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
IE/l = ΔOD/min* x Gesamtmenge der Reaktionslösung x 10&sup6; molekularer Extinktionskoeffizient** x Probenmenge
* ΔOD/min bedeutet eine Änderung der Absorption pro Minute bei der Messwellenlänge von 330 nm
** der molekulare Extinktionskoeffizient von 2,6-Dichlor-4-acetylphenol bei der Wellenlänge von 330 nm beträgt 18500.
Gemäss der zuvor dargestellten Gleichung betrug die Acp- Aktivität in der verwendeten Probe 205 (IE/l) . Wie in Fig. 3 dargestellt, wurde Linearität während eines Zeitverlaufs von 10 Minuten gezeigt. Dieses bedeutet, dass die automatisierten Analyseinstrumente verwendbar sind.

BEISPIEL 3

Durch Ändern des pH-Werts der Pufferlösung (1) in Beispiel 2 von 4,8 auf 6,2 wurde der optimale pH-Wert von Acp bei diesem Verfahren bestimmt. Die Bedingungen entsprachen denjenigen des Beispiels 2, jedoch mit der Ausnahme, dass der pH-Wert der Pufferlösung geändert wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Unter den Bedingungen betrug der optimale pH-Wert 5,4.

BEISPIEL 4

0,5 ml der Probe (3) des Beispiels 2 wurden zu 2,0 ml Pufferlösung (1) gegeben. Die Mischung wurde in eine Thermostatenzelle von 37ºC gebracht, und die Anderung der Absorption bei der Wellenlänge von 330 nm wurde während des Zeitverlaufs verfolgt, wobei die Stabilität des Substrats gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse untersucht wurde. Wie in Fig. 5 dargestellt ist, zeigen die Ergebnisse, dass das Substrat beinahe bis zu 10 Minuten lang stabil ist. Weil das Substrat DCAP-P bei dem optimalen pH-Wert von 5,4 stabil ist, ist es nicht erforderlich, einen Kontrollwert für jede Probe zu messen.

BEISPIEL 5

Es wurde die Beziehung zwischen dem Verdünnungsausmass von Acp, welches von menschlicher Prostatitisdrüse abstammt, und der Enzymaktivität untersucht (Fig. 6) . Die Probenverdünnung wurde unter Verwendung von (1) in Beispiel 2 durchgeführt. Wie in Fig. 6 dargestellt ist, zeigt es sich, dass die Probenverdünnung und Enzymaktivität in einer linearen proportionalen Beziehung zueinander stehen, die durch den Ursprung geht, und die Acp-Aktivität kann über einen weiten Bereich von einer niedrigen Einheit bis zu einer hohen Einheit bestimmt werden.

BEISPIEL 6

Unter Verwendung der Probe (3) in Beispiel 2, welche entsprechend verdünnt wurde, wurde der Km-Wert zum Substrat aus den Lineweaver-Burk-Plots bestimmt und festgestellt, dass er 0,14 mM/l betrug (Fig. 7) . Die Ergebnisse zeigen, dass die Substrataffinität gegenüber Acp hoch ist und gut annehmbar für dieses Reaktionssystem ist.

BEISPIEL 7

Synthese von 2, 6-Dibrom-4-acetylphenylphosphorsäure:
(1) In 5 ml Essigsäureanhydrid wurden 5,0 g 2,6-Dibromphenol gelöst, und ein Tropfen konzentrierte Schwefelsäure wurde zu der Lösung gegeben. Während manchmal manuell geschüttelt wurde, wurde die Mischung gerührt. Nach Beendigung der Wärmeerzeugung wurde die Lösung auf 50 ml Eiswasser gegossen, und die gefällten Kristalle aus Essigsäure-2,6-Dibromphenyl wurden mittels Filtration entfernt. Die Kristalle wurden mit gekühltem Wasser gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet. Als nächstes wurde dieses Essigsäure-2,6-Dibromphenyl in 20 ml Nitrobenzol gelöst, und 4,0 g pulveriges Aluminiumchlorid wurden allmählich zu der Lösung gegeben. Die Reaktion wurde 50 Stunden bei 60 bis 70ºC durchgeführt, wobei die Fries-Umlagerung erfolgte. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf 100 ml kalte verdünnte Salzsäure gegossen. Nach Stehenbleiben bei 5ºC während der Nacht wurden die gefä1lten Kristalle mittels Filtration entfernt, mit n-Hexan gewaschen und bei vermindertem Druck unter Erhalt von 3,87 g 2,6-Dibrom-4-acetylphenol als Rohkristalle getrocknet. Die Kristalle wurden aus heissem Ethylacetat unter Erhalt von 2,42 g reinem 2,6-Dibrom-4-acetylphenol als leicht braune Kristalle umkristallisiert. 2,6-Dibrom-4-acetylphenol (3,5-Dibrom-4-hydroxyacetophenon)
C&sub8;H&sub6;Br&sub2;O&sub2;
Schmelzpunkt: 180 bis 183ºC
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 32,71 H 1,90
berechnet (%) : 32,69 2,06
(2) In Aceton wurden 2,21 g 2,6-Dibrom-4- acetylphenol gelöst, und 3,75 ml wässrige 2 N Natriumhydroxid-Lösung wurden zu der Lösung unter Eiskühlung gegeben. Aceton und Ether wurden wiederum zu der Lösung gegeben. Die gefällten Kristalle wurden mittels Filtration entfernt und bei vermindertem Druck unter Erhalt von 1,88 g leicht gelbem 2,6-Dibrom-4-acetylphenol- Natriumsalz getrocknet. Anschliessend wurde 0,90 g Natriumsalz in 10 ml n-Hexan suspendiert. Nach dem Kühlen der Suspension auf -10ºC wurden 2 ml Phosphoroxychlorid tropfenweise zu der Suspension gegeben. Nach der tropfenweisen Zugabe wurde die Temperatur der Reaktionslösung wieder auf Raumtemperatur gebracht, woran sich 20-stündiges Reagieren anschloss. Nach Entfernung des gefällten Natriumchlorids mittels Filtration wurde das Filtrat unter Erhalt einer braunen öligen Substanz konzentriert. Zu der öligen Substanz wurden 50 ml Eiswasser hinzugefügt, wobei Hydrolyse bei 0 bis 15ºC 1 Stunde lang und bei 30 bis 45ºC 1 Stunde lang durchgeführt wurde. Nach Entfernen des unlöslichen Materials mittels Filtration wurde Natriumchlorid zu dem Filtrat bis zur Sättigung gegeben. Anschliessend wurde das Filtrat mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde Ethylacetat unter Erhalt von 323 mg 2,6-Dibrom-4-acetylphenylphosphorsäure als Rohkristalle abdestilliert. Die Rohkristalle wurden aus Dimethylsulfoxid (DMF) und Ether unter Erhalt von 234 mg reiner 2,6-Dibrom-4-acetylphenylphosphorsäure umkristallisiert. 1/2 DMF als leicht braune Kristalle.
C&sub8;H&sub7;Br&sub2;O&sub5;P 1/2C&sub3;H&sub7;NO
Schmelzpunkt: 149 bis 154ºC
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 28,03 H 2,82 N 1,75
berechnet (%) : 27,80 2,56 1,71

BEISPIEL 8

Synthese von 2, 6-Dichlor-4-(n-butyryl)phenylphosphorsäure:
(1) In 10 ml n-Buttersäureanhydrid wurden 10,0 g 2,6-Dichlorphenol gelöst, und 1 Tropfen konzentrierte Schwefelsäure wurde zu der Lösung gegeben. Während das Reaktionsgefäss manchmal manuell geschüttelt wurde, wurde die Mischung gerührt. Nach Beendigung der Wärmeerzeugung wurde die Lösung auf 100 ml Eiswasser gegossen. Die Lösung wurde mit n-Hexan extrahiert und mit gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat über Nacht wurde n-Hexan abdestilliert, wobei 13,22 g n-Buttersäure-2,6- dichlorphenyl als farblose ölige Substanz erhalten wurden. Als nächstes wurde dieses n-Buttersäure-2,6-dibromphenyl in 25 ml Nitrobenzol gelöst und 13,8 g pulveriges Aluminiumchlorid wurden allmählich zu der Lösung gegeben. Man liess die Mischung 40 Stunden bei 55 bis 65ºC reagieren, wodurch Fries-Umlagerung erzeugt wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf 500 ml kalte verdünnte Salzsäure gegossen. Nach Stehenlassen bei 5ºC über Nacht wurde die wässrige Phase von dem System abgetrennt, und die organische Phase wurde mit wässriger 2 N Natriumhydroxid-Lösung extrahiert. Nach der Extraktion wurde die Lösung durch Hinzufügen von 5 N Salzsäure sauer gemacht, und die gefällten Kristalle wurden mit Ethylacetat extrahiert. Nach Waschen mit gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung wurde die Ethylacetat-Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat über Nacht getrocknet. Anschliessend wurde Ethylacetat unter Erhalt von 2,09 g 2,6-Dichlor-4-(n-butyryl)phenol als Rohkristalle abdestilliert. Die Kristalle wurden aus Ether und n-Hexan unter Erhalt von 1,95 g reinem 2,6-Dichlor-4- (n-butyryl)phenol als leicht braune Kristalle umkristallisiert. 2,6-Dichlor-4-(n-butyryl)phenol:
C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;O&sub2;Cl&sub2;
Schmelzpunkt 93 bis 96ºC
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 51,58 H 4,35
berechnet (%) : 51,53 4,32
(2) In Aceton wurden 2,33 g 2,6-Dichlor-4- (n-butyryl)phenol gelöst und 2,5 ml wässrige 4 N Natriumhydroxid-Lösung wurden zu der Lösung unter Eiskühlung gegeben. Aceton und Ether wurden wiederum zu der Lösung gegeben, und die gefällten Kristalle wurden mittels Filtration entfernt und bei vermindertem Druck unter Erhalt von 2,14 g leicht braunem 2,6-Dichlor-4- (n-butyryl)phenol-Natriumsalz getrocknet. Anschliessend wurden 2,14 g Natriumsalz in 20 ml n-Hexan suspendiert. Nach dem Kühlen der Suspension auf -10ºC wurden 7,25 ml Phosphoroxychlorid tropfenweise zu der Suspension gegeben. Nach der tropfenweisen Zugabe wurde die Temperatur der Reaktionslösung wieder auf Raumtemperatur gebracht, woran sich 24-stündiges Reagieren anschloss. Nach Entfernung des gefällten Natriumchlorids mittels Filtration wurde das Filtrat unter Erhalt einer braunen öligen Substanz konzentriert. Zu der öligen Substanz wurden 75 ml Eiswasser hinzugefügt, wobei die Hydrolyse 1 Stunde lang bei 0 bis 15ºC und 1 Stunde lang bei 40 bis 50ºC durchgeführt wurde. Nach der Reaktion wurde unlösliches Material mittels Filtration entfernt, und Natriumchlorid wurde zu dem Filtrat bis zur Sättigung gegeben. Anschliessend wurde das Filtrat mit Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde Ethylacetat unter Erhalt von 2,06 g 2,6-Dichlor-4-(n-butyryl)phenylphosphorsäure als Rohkristalle abdestilliert. Die Rohkristalle wurden aus DMF und Ether unter Erhalt von 1,79 g reiner 2,6-Dichlor-4-(n-butyryl)phenylphosphorsäure umkristallisiert. DMF als weisse Kristalle. 2,6-Dichlor-4- (n-butyryl) phenylphosphorsäure:
Schmelzpunkt: 78 bis 80ºC
C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;Cl&sub2;O&sub5;P C&sub3;H&sub9;NO
Elementaranalyse
gefunden (%) : C 40,39 H 5,18 N 3,61
berechnet (%) : 40,43 4,70 3,63

BEISPIEL 9

Bestimmung der Acp-Aktivität unter Verwendung von 2,6-Dibrom-4-acetylphenylphosphorsäure und 2, 6-Dichlor-4- (n-butyryl) phenylphosphorsäure als Substrate:
Die Acp-Aktivität wurde unter Verwendung von 2,6-Dibrom-4- acetylphenylphosphorsäure (DBAP-P) und 2, 6-Dichlor-4- (n-butyryl) phenylphosphorsäure (DCBP-P) anstelle des Substrats (3) (DCAP-P) in Beispiel 2 bestimmt. Die Reagenzien und die Verfahrensweise entsprachen denjenigen des Beispiels 2. Die Zeitverläufe sind in den Fig. 8 und 9 dargestellt. Die Acp-Aktivität der Probe betrug 103 IE/l bei DBAP-P und 109 IE/l bei DCBP-P. Die molekularen Extinktionskoeffizienten betrugen 18900 bzw. 11200. Wie in den Fig. 8 und 9 dargestellt, zeigte sich Linearität während eines 10-minütigen Zeitverlaufs. Dieses bedeutet, dass diese Substrate auch für die automatisierten Analyseinstrumente verwendbar sind.

Claims

1. Neues Phosphorsäurederivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (I):

wobei X ein Halogen ist und R -(CH&sub2;)nCH&sub3; (n = 0 bis 3) ist, oder Salze davon.

2. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, wobei x Chloratom oder Bromatom ist.

3. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, wobei n 0 oder 3 ist.

4. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, welche aus der Gruppe aus 2,6-Dichlor-4- acetylphenylphosphorsäure, 2, 6-Dibrom-4- acetylphenylphosphorsäure und 2, 6-Dichlor-4- (n-butyryl) phenylphosphorsäure ausgewählt ist.

5. Verfahren zur Bestimmung der Säurephosphatase unter Verwendung eines neuen Phosphorsäurederivats, welches durch die allgemeine Formel (I):

dargestellt ist, wobei X ein Halogen ist und R -(CH&sub2;)nCH&sub3; (n = 0 bis 3) ist, oder Salze davon.

6. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 5, umfassend: Mischen einer Säurephosphatase-haltigen Probe mit dem neuen Phosphorsäurederivat, welches durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist, oder mit einem Salz davon für die Durchführung der enzymatischen Reaktion und anschliessendes Messen der Absorption des Reaktionsproduktes, wodurch die Aktivität der Säurephosphatase in der Probe bestimmt wird.

7. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 6, wobei die Absorption bei einer Wellenlänge von 300 bis 370 nm gemessen wird.