DE2818822C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den durch die Ansprüche näher gekennzeichneten Gegenstand.

Aminoglycoside sind eine wohlbekannte Klasse von Antibiotika und wurden in der Literatur ausführlich beschrieben. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung ist der Artikel "Structures and Syntheses of Aminoglycoside Antibiotics" von Sumio Umezawa, in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 30, 111-182, Academic Press, N. Y. (1974). In diesem Artikel (und auch in den darin zitierten Literaturstellen) sind viele bekannte 1-N-(Acyl)aminoglycosid-Antibiotika beschrieben, wie die 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-Derivate von Kanamycin A, Kanamycin B, 3′,4′-Dideoxykanamycin B, Tobramycin, Paromomycin I, Ribostamycin, 3′,4′-Dideoxyribostamycin und Lividomycin A.

Die US-PS 40 29 882 beschreibt 1-N-Acyl-Derivate von Gentamycinen A, B, B₁, C₁, C₁_a, C₂, C₂_a und X₂, Sisomicin, Verdamicin, Mutamicinen 1, 2, 4, 5 und 6 und den Antibiotica G-418, 66-40B, 66-40D, Ji-20A, JI-20B und G-52, worin die Acylgruppen von einer geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen abgeleitet sind, welche einen Amino- oder einen Hydroxysubstituenten, oder einen Amino- und einen Hydroxysubstituenten aufweisen können. Die Verbindungen werden hergestellt durch Acylierung teilweise neutralisierter Säureadditionssalze des Antibiotikums mit einem acylierenden Derivat der gewünschten Nebenkettensäure.

Die US-PS 40 55 715 beschreibt die 1-N[L-(-)-γ-Amino-α- hydroxybutyryl]-Derivate des Aminoglycosids XK-62-2, und das Verfahren zu deren Herstellung durch Acylieren der Verbindung XK-62-2, deren 2′-Amino-oder 2′- und 6′-Aminogruppen durch eine bekannte Aminoschutzgruppe (wie die Carbobenzyloxygruppe) geschützt sind, mit einem acylierenden Derivat von L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure (wie deren N-Hydroxysuccinimidester).

Die GB-PS 15 00 218 beschreibt die D-, L-, und D,L-Formen von 1-N-[β-Amino-α-hydroxypropionyl]-XK-62-2 und deren Herstellung durch ein Verfahren das im wesentlichen dem gemäß der US-PS 40 55 715 entspricht.

Die GB-PS 14 99 041 beschreibt 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxy- butyryl]-6′-N-alkylkanamycin A, worin die 6′-N-Alkylgruppe 1 bis 4 C-Atome enthält. Die Verbindungen werden unter anderem hergestellt, indem man 6′-N-Alkylkanamycin A (entweder ungeschützt oder in der Form, daß die 3- oder 3′′-Aminogruppe durch eine herkömmliche Aminoblockierungsgruppe geschützt sind) mit einem acylierenden Derivat von L-(-)-q-Amino-α-hydroxy buttersäure umsetzt.

Die GB-PS 14 75 481 beschreibt 1-N-Acylderivate von 6′-N-Methyl- 3′,4′-dideoxykanamycin B, worin die Acylgruppen in der L- oder D,L-Form vorliegen können und der Formel

entsprechen, worin n für 1, 2 oder 3 steht. Die Verbindungen werden hergestellt, indem man das Aminoglycosid (dessen 6′-Amino- und gegebenenfalls 2′-Aminogruppen durch herkömmliche Aminoblockierungsgruppen geschützt sind) mit einem acylierenden Mittel, das die obige Acylgruppe enthält, gegebenenfalls mit dessen N-Hydroxysuccinimidester, umsetzt.

Die südafrikanische PS 77/1944 beschreibt unter anderem ein Verfahren zur Herstellung von 1-N-(niedrig)Alkanoyl-Derivaten von Kanamycin A und B, wobei die Alkanoylgruppen durch Hydroxy- und/oder Amino substituiert sein können. Bei dem Verfahren acyliert man Kanamycin A oder B, wobei die 3-Aminogruppe von Kanamycin A oder B und die 2′-Aminogruppe von Kanamycin B (und gegebenenfalls die 6′-Aminogruppe jedes Antibiotikums) durch eine herkömmliche Aminoblockierungsgruppe geschützt sind. Die Acylierung erfolgt auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Verwendung des N-Hydroxysuccinimidesters der acylierenden Säure.

Die US-PS 39 74 137 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A; gemäß dem man 6′-Carbobenzyloxykanamycin A mit mindestens 3 Mol Benzaldehyd, einem substituierten Benzaldehyd oder Pivaldehyd umsetzt, wobei man das 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A erhält, welches Schiff′sche Baseneinheiten an den 1,3- und 3′′-Positionen aufweist, und dann dieses tetra-geschützte Kanamycin-A-Derivat mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-q-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

In The Journal of Antibiotics, 26, 790-3 (1973), T. P. Culbertson et al. ist die Herstellung von 5′′-Amino-5′′-deoxybutirosinen A und B aus Butirosin A und B beschrieben. Die ersten Synthesestufen sind wie folgt:

• 1) teilweise N-Trifluoracetylierung der Butirosinbase durch zum Rückfluß Erhitzen in einer Mischung von Methanol und Äthyl-trifluoracetat,
• 2) Eindampfen zur Trockne, Lösen des Rückstands in Pyridin, Behandeln des Rückstands mit Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan, dann Abkühlen auf <10°C und Behandeln mit Trifluoressigsäureanhydrid,
• 3) Eindampfen zur Trockne und Hydrolysieren des Rückstands in einer 2 : 1 Mischung von Äthanol und 2n Essigsäure am Rückfluß, wobei man dann tetra-[N-(Trifluoracetyl)]- butirosin erhält.

Die Endprodukte des Reaktionsschemas, 5′′-Amino-5′′-deoxybutirosin A und B, wurden ebenfalls nach den obigen drei Stufen umgesetzt, wobei man penta-[N-(Trifluoracetyl)]-5′′- amino-5′′-deoxy-butirosine A und B erhält. Auch diese Veröffentlichung beschreibt die Acylierung eines trimethylsilylierten (und teilweise acylierten) Aminoglycosidantibiotikums, wobei man immer eine völlige Acylierung aller primären Aminogrupppen im Molekül erhält (4 im Butirosinausgangsprodukt und 5 im Produkt). Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet im wesentlichen Polyacylierung und bringt einen hohen Grad an selektiver Acylierung in der gewünschten 1-N-Stellung.

J. J. Wright et al, in The Journal of Antibiotics, 29, 714-719 (1976) beschreiben ein allgemeines Verfahren zur selektiven 1-N-Acylierung von Gentamicin-Sisomicin-Aminoglycosiden. Sie berichten, daß die Selektivität der Acylierung vom pH-Wert abhängig ist und daß die C-1-Aminogruppe für die Acylierung am reaktivsten ist, wenn die Aminogruppen des Moleküls nahezu vollständig protoniert sind. Diese Bedingungen erreicht man durch Zugabe eines Äquivalents einer tert.-Aminbase zu einer Lösung des völlig neutralisierten Säureadditionssalzes. Wenngleich die Autoren eine 1-N-Selektivität bei der Acylierung von Gentamicin C₁_a, Sisomicin und Verdamicin erreichten, so berichten sie, daß bei der Acylierung hoch hydroxylierter Aminoglycoside, wie Gentamycin B und Kanamycin A eine geringe Selektivität zu beobachten war. In J. Antibiotics 24, 430-434 (1971) und Chemical Abstracts 79, 83498y (1973) sind Verfahren zur Silylierung von Aminoglycosid-Antibiotika beschrieben. Die Silylierung erfolgt dabei um flüchtige Derivate für die Gaschromatographie zu erhalten, wobei die Produkte persilyliert sind.

GB-PS 14 60 039 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Deoxyaminoglycosid-Antibiotika durch Halogenieren eines phosphorylierten Aminoglycosids (bei dem die zu entfernende Hydroxygruppe in eine Phosphonoxygruppe überführt worden war), wobei man das entsprechende Aminoglycosid erhält, dessen Hydroxygruppe in Halogen überführt wurde, und Reduzieren der Halogenverbindung, wobei man dann das entsprechende Deoxyaminoglycosid erhält. Bevor man das phosphorylierte Aminogylcosid halogeniert, werden alle seine funktionellen Gruppen vorzugsweise durch Silyl- oder Acylgruppen geschützt.

Die vorliegende Erfindung betrifft polysilylierte Aminoglykolside mit 2 bis 10 Silylgruppen, die erhältlich sind durch Silylierung eines Aminoglycosids der Formel

worin R² für einen Hexopyranosylring der Formel

steht, worin R⁶ Wasserstoff oder CH₃, R⁷ Wasserstoff oder CH₃, R⁸ oder NH₂, R⁹ Wasserstoff oder OH und R¹⁰ Wasserstoff oder OH bedeuten;

R³ für einen Hexopyranosylring der Formeln

steht, worin R¹¹ Wasserstoff oder CH₃ bedeutet; R⁵ für Wasserstoff oder OH steht; und R⁴ für Wasserstoff, OH oder einen Pentofuranosylring der Formeln IX oder X steht:

worin R¹² für Wasserstoff oder einen Hexopyranosylring der Formeln XI oder XII steht

worin R¹³ Wasserstoff oder α-D-Mannopyranosyl bedeutet; wobei Voraussetzung ist, daß wenn R³ nicht Wasserstoff bedeutet, einer der Reste R⁴ und R⁵ für Wasserstoff steht und der andere OH bedeutet; und wobei weiterhin Voraussetzung ist, daß wenn R³ für Wasserstoff steht, R⁵ Wasserstoff bedeutet und R⁴ für einen Pentofuranosylring der Formel IX oder X steht; wobei das polysilylierte Aminogylcosid gegebenenfalls 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist.

Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen polysilylierten Aminoglycoside eine durchschnittliche Anzahl von 3 bis 8 Silylgruppen pro Molekül auf. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den Silylgruppen um Trimethylsilylgruppen. Bei den Aminoblockierungsgruppen handelt es sich vorzugsweise um eine Carbobenzyloxy- oder Trifluoracetylgruppe.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen polysilylierten Verbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Aminoglycosid der allgemeinen Formel XIV

worin R², R³ und R⁵ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in an sich bekannter Weise silyliert, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Silylierungskatalysators.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy- alkanoyl]-aminoglycosid-Antibiotika der allgemeinen Formel I:

oder pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze davon, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet und R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein polysilyiertes Aminoglycosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem im wesentlichen wasserfesten organischen Lösungsmittel mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel XIII:

worin B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt; und anschließend alle Blockierungsgruppen entfernt.

Die erfindungsgemäßen polysilyierten Aminoglykoside weisen eine gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln auf, so daß man mit realtiv konzentrierten Lösungen arbeiten kann. Im allgemeinen wird man die Umsetzung in einer Lösung durchführen, die etwa 10 bis 20% der polysilyierten Aminoglykoside enthält. Ausgezeichnete Ergebnisse werden jedoch auch dann erhalten, wenn die Lösung etwa 50% Gew./Vol. (beispielsweise 50 g/100 ml Lösung) enthält.

Wie bei den Arbeitsweisen des Standes der Technik ergibt das erfindungsgemäße Verfahren eine Mischung acylierter Produkte und das gewünschte Produkt wird von den anderen Produkten durch Chromatographie abgetrennt. Die Substitution wird jedoch viel selektiver, wenn man das erfindungsgemäße Verfahren anwendet, wodurch man geringere Mengen unerwünschter Nebenprodukte erhält, was sowohl die Ausbeute an gewünschtem Produkt erhöht als auch die chromatographische Reinigung vereinfacht.

Wenn man 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxy- butyryl]-kanamycin A (Amikacin) mittels verschiedener Verfahren nach dem Stand der Technik herstellt, erhält man auch das 3′′-N- acylierte Produkt (BB-K11), das 3-N-acylierte Produkt (BB-K29), das 6′-N-acylierte Produkt (BB-K6) und polyacyliertes Material sowie nicht umgesetztes Kanamycin A.

Bei der gewerblichen Herstellung von Amikacin und Acylieren von 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A in wäßrigem Medium und anschließendem Entfernen der Schutzgruppe wurde gefunden, daß gewöhnlich etwa 10% des gewünschten Amikacins verlorengingen, da BB-K11 als Nebenprodukt vorhanden war. Das 3′′-N-acylierte Material verursachte außerdem einen Verlust von etwa der gleichen Menge an gewünschtem 1-N-acyliertem Produkt, da sich dieses sehr schwer vom erstgenannten trennen läßt. Die Selektivität der Substitution des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich durch die extrem geringe Menge an unerwünschtem 3′′-N-acyliertem Produkt, das sich bei der erfindungsgemäßen Herstellung von BB-K8 ergibt. Es ist typisch, daß sich BB-K11 in der Mischung nicht einmal nachweisen läßt.

Die Aminogruppe der acylierenden Säure der Formel XIII muß während der Acylierungsreaktion durch eine aminoblockierende Gruppe geschützt sein. Dies erfolgt normalerweise durch Verwendung einer herkömmlichen Aminoblockierungsgruppe. Die gleichen herkömmlichen Aminoblockierungsgruppen können zum Schützen der anderen als der C-1-Aminogruppe des Aminoglycosids verwendet werden. Solche herkömmlichen Aminoblockierungsgruppen zum Schutz von primären Aminogruppen sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Blockierungsgruppen gehören Alkoxycarbonylgruppen, beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonylgruppen; Aralkoxycarbonylgruppen, wie Benzyloxycarbonyl; Cycloalkyloxycarbonylgruppen, wie Cyclohexyloxycarbonyl; Halogenalkoxycarbonylgruppen, wie Trichloräthoxycarbonyl; Acylgruppen, wie Phthaloyl und o-Nitrophenoxyacetyl; Halogenacetylgruppen, wie Trifluoracetyl; und andere bekannte Blockierungsgruppen, beispielsweise die o-Nitrophenylthiogruppe, die Tritylgruppe, und dergleichen.

Die acylierende Säure der Formel XIII enthält ein asymmetrisches Kohlenstoffatom und kann in ihrer (+) oder (-) isomeren Form, oder als Mischung der beiden Isomeren (d,l-Form) vorliegen. Auf diese Weise wird die entsprechende Verbindung der allgemeinen Formel I gebildet, in der die 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy- alkanoyl)-gruppe in ihrer (+) [oder (R)]-Form oder ihrer (-) [oder (S)]-Form, oder in einer Mischung davon vorliegt. Jede isomere Form und deren Mischungen fallen in den Rahmen der Erfindung, jedoch ist die (-)-Form bevorzugt.

Die Acylierung der polysilylierten Aminoglycoside (mit oder ohne 1 bis 3 von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe) kann im allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, in dem das Ausgangsmaterial genügend löslich ist. Diese Ausgangsmaterialien sind in den üblichsten organischen Lösungsmitteln sehr gut löslich. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Diäthylketon, Methyl-n-propyl- keton, Methyl-isobutyl-keton, Methyl-äthyl-keton, Heptan, Glyme, Diglyme, Dioxan, Toluol, Tetrahydrofuran, Cyclohexanon, Pyridin, Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff. Die Wahl des Lösungsmittels ist abhängig vom speziell verwendeten Ausgangsmaterial. Ketone sind im allgemeinen bevorzugte Lösungsmittel. Das jeweils günstigste Lösungsmittel für eine bestimmte Kombination von Reaktionspartnern kann durch Routineuntersuchungen leicht herausgefunden werden.

Zu geeigneten Silylierungsmitteln zur Verwendung bei der Herstellung der hier verwendeten polysilylierten Aminoglycosid- Ausgangsmaterialien gehören die der nachfolgenden allgemeinen Formeln XV und XVI:

worin R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils für Wasserstoff, Halogen, (niedrig)Alkyl, (niedrig)Alkoxy, Halogen(niedrig)alkyl und und Phenyl stehen können, wobei mindestens eine der Gruppen R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ von Halogen oder Wasserstoff verschieden sind; R¹⁴ für (niedrig)Alkyl steht, m eine ganze Zahl von 1 bis 2 darstellt und Z die Bedeutungen Halogen und

hat, worin R¹⁸ für Wasserstoff oder (niedrig)Alkyl steht und R¹⁹ die Bedeutungen Wasserstoff, Niedrigalkyl oder

hat, worin R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Als Beispiele für spezifische Silylverbindungen der Formeln XV und XVI kann man nennen: Trimethylchlorsilan, Hexamethyldisilazan, Triäthylchlorsilan, Methyltrichlorsilan, Dimethyldichlorsilan, Triäthylbromsilan, Tri-n-propylchlorsilan, Methyldiäthylenchlorsilan, Dimethyläthylchlorsilan, Dimethyl-tert.- butylchlorsilan, Phenyldimethylbromsilan, Benzylmethyläthylchlorsilan, Phenyläthylmethylchlorsilan, Triphenylchlorsilan, Triphenylfluorsilan, Tri-o-tolylchlorsilan, Tri-p-dimethylaminophenylchlorsilan, N-Äthyltriäthylsilylamin, Hexaäthyldisilazan, Triphenylsilylamin, Tri-n-propylsilylamin, Tetraäthyldimethyldisilazan, Hexaphenyldisilazan und Hexa-p-tolyldisilazan. Ebenfalls brauchbar sind Hexaalkylcyclotrisilazane und octa-Alkylcyclotetrasilazane. Andere geeignete Silylierungsmittel sind Silylamide (beispielsweise Trialkyl- silylacetamide und bis-Trialkylsilylacetamide), Silylharnstoffe (beispielsweise Trimethylsilylharnstoffe) und Silylureide. Man kann auch Trimethylsilylimidazol einsetzen.

Eine bevorzugte Silylgruppe ist die Trimethylsilylgruppe. Bevorzugte Silylierungsmittel zur Einführung der Trimethylsilylgruppe sind Hexamethyldisilazan, Bis(trimethylsilyl)acetamid, Trimethylsilylacetamid und Trimethylchlorsilan. Am bevorzugtesten ist das Hexamethyldisilazan.

Die Polysilylierung von Aminoglycosiden verändert die Aktivität der darin enthaltenen Aminogruppen. So ist die 6′-Aminogruppe des Kanamycins die aktivste. Wenn ungeschütztes Kanamycin A oder B acyliert wird, sind die hauptsächlichen Produkte die 6′-N-Acylkanamycine. Aus diesem Grund war es bei Verfahren nach dem Stand der Technik zur Herstellung von 1-N-Acylkanamycinen erforderlich, den 6′-N- Aminorest (beispielsweise mit Carbobenzyloxy) zu schützen, um gute Ausbeuten an 1-N-Acyl-Produkt zu erhalten. Wenn man jedoch die polysilylierten Kanamycine acyliert, sind die Hauptprodukte die 1-N-Acyl-Kanamycine. Man nimmt an, daß dies der sterischen Wirkung angrenzender (oder nahebei liegender) silylierter Hydroxygruppen (sowie angrenzenden Glycosidbindungen) zuzuschreiben ist, welche die Acylierung an den normalerweise aktiveren Aminogruppen verhindern.

Kanamycin B entspricht der allgemeinen Formel

Betrachtet man Kanamycin B, bei dem alle Hydroxygruppen silyliert sind, im Lichte der obigen Theorie, so ist ersichtlich, daß die 3′′-Aminogruppe durch die angrenzenden 2′′- und 4′′- silylierten Hydroxygruppen sterisch gehindert ist. Man nimmt an, daß man aus diesem Grunde normalerweise kein 3′′-acyliertes Produkt entdeckt, wenn man polysilyliertes Kanamycin B (oder die strukturell ähnlichen polysilylierten Kanamycine A oder C) acyliert, wenngleich schwierige 3′′-N-acylierte Produkte erhalten werden können, wenn man Verfahren nach dem Stand der Technik anwendet. Ähnlich ist die 6′-Aminogruppe durch die nahebei liegenden 4′- und 3′-silylierten Hydroxygruppen gehindert. Die 2′-Aminogruppe ist durch die angrenzende 3′-silylierte Hydroxygruppe und die angrenzende Glycosidbindung gehindert.

Weitere Aminoglycoside, welche strukturell mit den Kanamycinen verwandt sind, und wenn sie polysilyliert werden, in erster Linie das 1-N-Acyl-Produkt ergeben, sind beispielsweise 3′-Deoxykanamycin A, 3′-Deoxykanamycin B (Tobramycin), die 6′-N-Alkylkanamycine A, die 6′-N-Alkylkanamycine B, die 3′-Deoxy-6′-N-alkylkanamycine A, die 3′-Deoxy-6′-N-alkylkanamycine B, Gentamicine A, B, B₁ und X₂, Seldomycin Faktoren 1 und 3 und Aminogylcoside NK-1001 und NK-1012-1. Jede dieser Verbindungen und andere strukturell ähnliche Aminoglycoside ergeben hauptsächlich das 1-N-substituierte Produkt, wenn man sie in Form ihrer polysilylierten Derivate acyliert. Es werden jedoch geringe Mengen 6′-N- und 3-N-substituierter Produkte gebildet, und einer oder beide dieser Aminogruppen kann gewünschtenfalls, beispielsweise durch eine Carbabenzyloxygruppe, geschützt werden.

Eine weitere Gruppe von Aminogylcosiden enthalten, wenngleich sie den oben beschriebenen Kanamycin-Typen strukturell ähnlich sind, weder 3′- noch 4′-Hydroxygruppen (d. h. es sind 3′,4′-Dideoxy-Verbindungen). Werden diese polysilyliert, so hindern sie die 6′-Aminogruppe (oder die 2′-Aminogruppe, falls vorhanden) nicht sterisch, und die 6′-N-substituierten (oder 2′,6′-di-N-substituierten) Verbindungen sind die Hauptacylierungsprodukte. Bei diesen Aminoglycosiden muß man die 6′-Aminogruppe (und, falls vorhanden, die 2′-Aminogruppe) mit einer von Silyl verschiedenen Aminoschutzgruppe (beispielsweise mit Carbobenzyloxy) schützen und das polysilylierte 6′-N-blockierte (oder 2′,6′-di-N-blockierte) Aminoglycosid acylieren. Aminoglycoside, welche in diese Gruppe fallen, sind beispielsweise 3′,4′-Dideoxykanamycin A, 3′,4′-Dideoxykanamycin B, die 6′-N-Alkyl-3′,4′-dideoxykanamycine A, die 6′-N-Alkyl-3′,4′-dideoxykanamycine B, Gentamicine C₁, C₁_a, C₂ und C₂_a, Aminoglycoside XK-62-2, Aminoglycosid 66-40D, Verdamicin und Sisomicin.

Eine weitere Klasse von Aminoglycosiden bilden diejenigen, bei denen die Glycosidbindung an den 4- und 5-Stellungen des Deoxystreptaminrings sind anstelle der 4- und 6-Stellungen, wie bei den oben beschriebenen Aminoglycoside vom Kanamycintyp. Diese können dargestellt werden durch das Ribostamycin der Formel

Bei Aminoglycosiden vom Ribostamycin-Typ hindert die Polysilylierung die gewünschte 1-N-Gruppe mehr als die unerwünschte 3-N-Gruppe (wobei die anderen Aminogruppen wie oben für die Kanamycin-Typen beschrieben gehindert werden). Somit bilden polysilylierte Antibiotika vom Ribostamycin- Typ nach der Acylierung hauptsächlich das 3-N-substituierte Produkt, und deshalb muß die 3-Aminogruppe durch eine Aminoblockierungsgruppe, wie Carbobenzyloxy geschützt werden, um nach der Acylierung des polysilylierten Ausgangsmaterials das 1-N-substituierte Produkt zu erhalten. Weitere Aminoglycoside, welche in diese Klasse fallen, sind beispielsweise die Neomycine B und C, die Paromomycine I und II, die Lividomycine A und B, Aminoglycosid 2230-C und Xylostasin, sowie deren 3′-Deoxy-Derivate. Die 6′-N-Alkyl- und 3′-Deoxy-6′-N- alkyl-Varianten jeder dieser oben erwähnten Antibiotika vom Ribostamycin-Typ, welche eine 6′-Aminogruppe enthalten, fallen ebenfalls unter diese Klasse. Einige der Aminoglycoside dieser Klasse enthalten eine 6′-Hydroxygruppe anstelle einer 6′-Aminogruppe.

Eine weitere Gruppe von Aminoglycosiden sind die des oben beschriebenen Ribostamycin-Typs, welche jedoch 3′,4′-Dideoxykanamycin- Aminoglycosiden, die oben beschrieben wurden, werden die 2′- und 6′-Aminogruppen (derjenigen Aminoglycoside dieser Klasse, welche eine 6′-Aminogruppe enthalten) durch Polysilylierung nicht gehindert. Somit muß man bei Verbindungen wie 3′,4′-Dideoxyribostamycin, 3′,4′-Dideoxy-neomycinen B und C, und 3′,4′-Dideoxyxylostasin, sowie bei deren 6′-N-Alkyl- Analogen, die 2′- 3- und 6′-Aminogruppen durch eine Aminoblockierungsgruppe, wie Carbobenzyloxy, schützen, damit man bei der Acylierung des polysilylierten Ausgangsmaterials hauptsächlich das 1-N-Acyl-Produkt erhält. Bei denjenigen Aminogylcosiden dieser Klasse, welche eine 6′-Hydroxygruppe anstelle einer 6′-Aminogruppe aufweisen (beispielsweise 3′,4′-Dideoxyparomomycin I und II und 4′-Deoxylividomycin A oder B) muß man nur die 2′- und 3-Aminogruppen schützen.

Verwendet man als Ausgangsmaterial ein polysilyliertes Aminoglycosid, das 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist, so kann das Ausgangsmaterial entweder durch Polysilylierung des gewünschten N-blockierten Aminoglycosids oder durch Einführen der gewünschten N-Blockierungsgruppe in das polysilylierte Aminoglycosid hergestellt werden (gegebenenfalls nach teilweiser Desilylierung durch Hydrolyse oder Solvolyse).

Verfahren zur Einführung von Silylgruppen in organische Verbindungen, einschließlich gewisser Aminoglycoside, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Die polysilylierten Kanamycine (mit oder ohne von Silyl verschiedene Blockierungsgruppen an Aminoresten, die von der C-1-Aminogruppe verschieden sind) können auf an sich bekannte Weise oder wie in der vorliegenden Beschreibung dargestellt hergestellt werden.

Die bei der Beschreibung der Erfindung verwendete Bezeichnung polysilyliertes Aminoglycosid umfaßt kein persilyliertes Aminoglycosid. So umfaßt beispielsweise der Begriff polysilyliertes Kanamycin A, Kanamycin A mit 2 bis 10 Silylgruppen im Molekül [wobei insgesamt 11 Positionen (4-Aminogruppen und 7 Hydroxygruppen) silyliert werden könnten].

Die genaue Anzahl der Silylgruppen (oder deren Stellung) in den polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterialien (mit oder ohne 1 bis 3 von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe) ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Untersilylierung und Übersilylierung die Ausbeute an gewünschtem Produkt absenken und zu einem Ansteigen anderer Produkte führen. Im Falle einer starken Unter- oder Übersilylierung kann es dazu kommen, daß nur wenig oder überhaupt kein gewünschtes Produkt gebildet wird. Der Silylierungsgrad, der zur größten Ausbeute an gewünschtem Produkt führt, hängt von den jeweiligen Reaktionspartnern ab, die bei der Acylierungsstufe eingesetzt werden. Der jeweils vorteilhafteste Silylierungsgrad bei irgendeiner Kombination von Reaktionspartnern kann durch routinemäßiges Ausprobieren leicht festgestellt werden.

Die bevorzugte durchschnittliche Anzahl von Silylgruppen im polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterial liegt im allgemeinen zwischen einer unteren Grenze von 4 und einer oberen Grenze, welche gleich der Gesamtzahl der Hydroxygruppen ist oder eine darüberhinaus, die im Aminoglycosid-Molekül enthalten sind, und daß diese oberen und unteren Grenzen für jede im Aminoglycosid enthaltenen Aminoblockierungsgruppen um jeweils 1 Gruppe verringert werden. Diese Erklärung ist jedoch nur theoretischer Natur.

Polysilylierte Aminoglycoside, welche die gewünschte Anzahl von Silylgruppen enthalten, können hergestellt werden, indem man entweder einer Menge an Silylierungsmittel verwendet, welche ausreichend ist, um die gewünschte Anzahl von Silylgruppen einzuführen, oder indem man einen Überschuß an Silylierungsmittel verwendet und das Aminoglycosid persilyliert, und dann durch Hydrolyse oder Solvolyse teilweise desilyliert.

Wenn man beispielsweise 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]- kanamycin A herstellt, indem man polysilyliertes Kanamycin A mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-γ-Benzyloxy- carbonylamino-a-hydroxybuttersäure in Acetonlösung acyliert, so erhält man gute Ausbeuten des gewünschten Produkts, wenn man polysilyliertes Kanamycin A verwendet, welches hergestellt wurde durch Umsetzung von etwa 4 bis etwa 5,5 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin A.

Es können größere oder geringere Mengen an Hexamethyldisilazan verwendet werden, jedoch wird dadurch die Ausbeute an gewünschtem Produkt in der nachfolgenden Acylierungsstufe bedeutend verringert. Bei dem speziellen oben beschriebenen Verfahren verwendet man vorzugsweise 4,5 bis etwa 5 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin, um bei der Acylierungsstufe eine maximale Produktausbeute zu erhalten.

Pro Mol Hexamethyldisilazan können zwei Äquivalente der Trimethylsilylgruppe in Kanamycin A oder B eingeführt werden. Sowohl Kanamycin A wie auch Kanamycin B weisen insgesamt 11 Stellen (NH₂- und OH-Gruppen) auf, die silylierbar sind, während Kanamycin A und Kanamycin B, die eine von Silyl verschiedene Aminogruppe an einer anderen Aminogruppe als der C-1-Aminogruppe aufweisen, insgesamt 10 derartige Stellen aufweisen. So müßten 5,5 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin A oder B theoretisch zu einer vollständigen Silylierung sämtlicher OH- und NH₂-Einheiten des Kanamycins führen, während 5,0 Mol Hexamethyldisilazan zu einer vollständigen Silylierung von einem Mol Kanamycin A oder B, das eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe an einer anderen Aminogruppe als der C-1-Aminogruppe aufweist, führen sollte. Jedoch wird erfindungsgemäß angenommen daß eine derartig extensive Silylierung bei diesen molaren Verhältnissen während vernünftiger Reaktionszeiten nicht erfolgt, obgleich man bei vorgegebener Reaktionszeit höhere Silylierungsgrade erzielt, wenn man einen Silylierungskatalysator zugibt.

Silylierungskatalysatoren führen zu einer beträchtlichen Erhöhung der Silylierungsgeschwindigkeit. Geeignete Silylierungskatalysatoren sind bekannt. Hierzu gehören unter anderem Aminsulfate (beispielsweise Aminoglycosidsulfat), Sulfaminsäure, Imidazol und Trimethylchlorsilan. Silylierungskatalysatoren fördern im allgemeinen einen höheren Silylierungsgrad als beim erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich. Man kann jedoch auch übersilylierte Aminogylcoside als Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen, wenn man sie zuerst mit einem Desilylierungsmittel behandelt, um den Silylierungsgrad zu vermindern, bevor die Acylierungsreaktion durchgeführt wird.

Man erhält gute Ausbeuten an gewünschtem Produkt, wenn man polysilyliertes Kanamycin A acyliert, das unter Verwendung eines 5,5 : 1 molaren Verhältnisses von Hexamethyldisilazan zu Kanamycin A hergestellt wurde. Wenn man jedoch Kanamycin A mit einem 7 : 1 molaren Verhältnis an Hexamethyldisilazan (oder mit einem 5,5 : 1 molaren Verhältnis in Gegenwart eines Silylierungskatalysators) in Aceton mit dem N-Hydroxysuccinimidester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert, so erhält man weniger als eine 1%-ige Ausbeute des gewünschten Produkts. Wenn man jedoch dasselbe "übersilylierte" Kanamycin A mit demselben Acylierungsmittel in einer Acetonlösung acyliert, zu dem man 1 Stunde vor der Acylierungsreaktion Wasser [21 Mol Wasser pro Mol Kanamycin/2,5% Wasser (Gew./Vol.)] als Desilylierungsmittel zugesetzt hatte, so erhält man eine Ausbeute von angenähert 40% des gewünschten Produkts. Dieselben Ergebnisse werden erhalten, wenn das Wasser durch Methanol oder durch eine andere Verbindung mit aktivem Wasserstoff ersetzt wird, die zu einer Desilylierung führen kann, beispielsweise durch Äthanol, Propanol, Butandiol, Methylmercaptan, Äthylmercaptan oder Phenylmercaptan.

Obgleich man beim Arbeiten mit silylierten Materialien üblicherweise trockene Lösungsmittel einsetzt, wurde überraschend gefunden, daß selbst in Abwesenheit einer "Übersilylierung" die Zugabe von Wasser zum Reaktionslösungsmittel vor der Acylierung häufig gleich gute Ausbeute ergibt, ja bisweilen sogar zu besseren Ausbeuten an gewünschtem Produkt als in einem trockenen Lösungsmittel, führt. Bei Acylierungsreaktionen, die in Aceton bei den üblichen Konzentrationen von 10 bis 20% (Gew./Vol.) polysilyliertem Kanamycin A durchgeführt werden, wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A erhält, wenn man bis zu 28 Mol Wasser pro Mol polysilyliertes Kanamycin A zusetzt. Arbeitet man bei 20%iger Konzentration, so bedeuten 28 Mol pro Mol angenähert 8% Wasser. Mit anderen Kombinationen von Reaktionspartnern kann man sogar die Anwesenheit von noch mehr Wasser dulden; sie kann sogar vorteilhaft sein. Die Acylierungsreaktion kann in Lösungsmitteln durchgeführt werden, die bis zu ungefähr 40% Wasser enthalten, obgleich man bei derart hohen Wasserkonzentrationen kurze Acylierungszeiten wählen muß, um eine übermäßige Desilylierung des polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterials zu vermeiden. Wenn demgemäß im vorliegenden Falle der Begriff "im wesentlichen wasserfreies organisches Lösungsmittel" gebraucht wird, so umfaßt dieser Begriff auch Lösungsmittel, die bis zu ungefähr 40% Wasser enthalten. Ein bevorzugter Bereich geht bis zu ungefähr 20% Wasser, ein bevorzugter Bereich geht bis ungefähr 8% Wasser und ein am meisten bevorzugter Bereich geht bis zu ungefähr 4% Wasser.

Mit Ausnahme der oben beschriebenen Fälle für Lösungsmittel, welche große Mengen Wasser enthalten, ist die Acylierungsdauer nicht kritisch.

Temperaturen im Bereich von etwa -30°C bis etwa 100°C können während Reaktionszeiten von etwa 1 Stunde bis zu 1 Tag oder mehr verwendet werden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Reaktion bei Raumtemperatur üblicherweise gut verläuft, und aus Gründen der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit ist bevorzugt, die Reaktion bei Umgebungstemperatur durchzuführen. Wenn es jedoch um maximale Ausbeuten und um selektive Acylierung geht, wird bevorzugt, die Acylierung bei einer Temperatur von ungefähr 0°C bis 5°C durchzuführen.

Die Acylierung der 1-Aminogruppe des polysilyierten Aminoglycosids (mit oder ohne von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe) kann mit irgendeinem acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel XIII durchgeführt werden, von dem bekannt ist, daß es sich zur Acylierung einer primären Aminogruppe eignet. Zu Beispielen für geeignete acylierende Derivate der freien Säure gehören die entsprechenden Säureanhydride, gemischten Anhydride, beispielsweise Alkoxyameisensäureanhydride, Säurehalogenide, Säureazide, aktive Ester und aktive Thioester. Man kann die freie Säure mit dem polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterial kuppeln, nachdem man zuerst die freie Säure mit N,N′-Dimethylchlorformiminiumchlorid [vgl. GB-PS 10 08 170 und Novak und Weichet, Experienta XXI, 6, 360 (1965)] umgesetzt hat oder mit Hilfe eines N,N′-Carbonyldiimidazols oder eines N,N′-Carbonylditriazols [vgl. südafrikanische Patentschrift 63/2684] oder mit Hilfe eines Carbodiimidreagenzes [insbesondere N,N′-Dicyclohexyl- carbodiimid, N,N′-Diisopropylcarbodiimid oder N-Cyclohexyl-N′- (2-morpholinoäthyl)carbodiimid; vgl. Sheehan und Hess, J. A. C. S., 77, 1967 (1955)] oder mit Hilfe eines Alkynylaminreagenzes [vgl. R. Buÿle und H. G. Viehe, Angew. Chem. International Edition, 3, 582 (1964)] oder mit Hilfe eines Isoxazoliumsalzreagenzes [vgl. R. B. Woodward, R. A. Olofson und H. Mayer, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1010 (1961)] oder mit Hilfe eines Keteniminreagenzes [vgl. C. L. Stevens und M. E. Munk, J. Amer. Chem. Soc., 80, 4065 (1958)] oder mit Hilfe eines Hexachlorcyclotriphosphatriazins oder Hexabromcyclotriphosphatriazins (US-PS Nr. 36 51 050) oder mit Hilfe von Diphenylphosphorylazid [DDPA; J. Amer. Chem. Soc., 94, 6203-6205 (1972)] oder mit Hilfe von Diäthylphosphorylcyanid [DEPC; Tetrahedron Letters Nr. 18, Seiten 1595-1598 (1973)] oder mit Hilfe von Diphenylphosphit [Tetrahedron Letters Nr. 49, Seiten 5047-5050 (1972)] umgesetzt hat. Ein anderes Äquivalent der Säure ist ein entsprechendes Azolid, d. h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoff Glied eines quasi-aromatischen 5-gliedrigen Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome enthält, d. h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß es bisweilen wünschenswert oder erforderlich sein kann, die Hydroxylgruppe des acylierenden Derivats der Säure der allgemeinen Formel XIII zu schützen, beispielsweise wenn man acylierende Derivate, wie beispielsweise Säurehalogenide, einsetzt. Der Schutz der Hydroxy-gruppe kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, z. B. unter Verwendung einer Carbobenzyloxygruppe, durch Acetylieren und durch Silylieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das acylierende Derivat der Säure der Formel XIII ein aktiver Ester, und bevorzugt deren aktiver Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das acylierende Derivat der Säure der Formel XIII ein Gemisch des Säureanhydrids, und vorzugsweise ein Gemisch des Säureanhydrids mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzylkohlensäure.

Nach Beendigung der Acylierungsreaktion des polysilylierten Aminoglycosids werden sämtliche Blockierungsgruppen in an sich bekannter Weise entfernt, um das gewünschte Produkt der allgemeinen Formel I zu liefern

Die Silylgruppen kann man beispielsweise leicht dadurch entfernen, daß man mit Wasser hydrolysiert. Dies erfolgt vorzugsweise bei niedrigem pH. Aminoblockierungsgruppen am Aminoglycosidmolekül (falls vorhanden) oder an der Acyl-Seitenkette können ebenfalls nach bekannten Methoden entfernt werden. So kann man beispielsweise eine tert.-Butoxycarbonyl- gruppe durch Verwendung von Ameisensäure entfernen, eine Carbobenzyloxygruppe durch katalytisches Hydrieren, eine 2-Hydroxy-1-naphthcarbonylgruppe durch saure Hydrolyse, eine Trichloräthoxycarbonylgruppe durch Behandlung mit Zinkstaub in Eisessig, die Phthaloylgruppe durch Behandlung mit Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erhitzen und die Trifluoracetylgruppe durch Behandeln mit NH₄OH entfernen.

Bevorzugte Aminoblockierungsgruppen, welche zum Schutz der Aminogruppen im Aminoglycosidmolekül, sowie zum Schutz der Aminogruppe der acylierenden Säure der Formel XIII brauchbar sind, entsprechen den Gruppen der nachstehenden Formeln:

worin R²⁰ und R²¹, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, F, Cl, Br, NO₂, OH (niedrig)Alkyl oder (niedrig)Alkoxy bedeuten, X für Cl, Br, F oder J steht und Y Wasserstoff, Cl, Br, F oder J bedeutet. Eine zur Verwendung im Aminoglycosidmolekül besonders bevorzugte Aminoblockierungsgruppe ist die Carbobenzyloxygruppe. Besonders bevorzugte Aminoblockierungsgruppen zur Verwendung bei der acylierenden Säure der Formel XIII sind die Carbobenzyloxy, Trifluoracetyl- und tert.-Butyloxycarbonyl-gruppen.

Einige der Verbindungen der Formel I enthalten eine Doppelbindung (d. h. wenn der Substituent R² der Formel IV entspricht). Dies sind Verbindungen, welche von Aminoglycosiden, wie Sisomicin, Verdamicin, G-52, 66-40B und 66-40D, abgeleitet sind. Verwendet man solche Verbindungen, so ist jedem Fachmann bekannt, daß man sämtliche Reduktionstechniken, welche die Doppelbindung reduzieren könnten, vermeiden muß. So sollten beispielsweise Aminoblockierungsgruppen verwendet werden, welche durch Hydrolyse oder durch ein Alkalimetall in flüssigem Ammoniak entfernt werden können, um die Reduktion der Doppelbindung zu vermeiden, welche bei Methoden wie katalytischer Hydrogenolyse eintreten würde.

Die Ausbeuten an Produkt wurden nach verschiedenen Methoden bestimmt. Nach Entfernung sämtlicher Blockierungsgruppen und Chromatographie an einer CG-50®(NH₄⁺) Säule, ließ sich die Ausbeute durch Isolierung des kristallinen Feststoffs aus den entsprechenden Fraktionen oder durch mikrobiologische Untersuchung (turbidimetrische Methode oder Plattentest) der entsprechenden Fraktionen bestimmen. Eine andere erfindungsgemäß eingesetzte Technik war Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie der nicht reduzierten Acylierungsmischung, d. h. mit Hilfe der wäßrigen Lösung, die nach der Hydrolyse der Silylgruppen und Entfernung des organischen Lösungsmittels erhalten wurde, jedoch vor der Hydrogenolyse zur Entfernung der verbleibenden Blockierungsgruppe(n). Diese Untersuchung ist keine direkte Untersuchung auf das Endprodukt, sondern auf die entsprechenden N-blockierten Verbindungen.

Als Instrument verwendete man einen Hochdruck-Flüssigkeitschromatograph mit einem Absorptionsdetektor und einer 30 cm × 3,9 mm (Innendurchmesser) µ-Bondapak C-18®-Säule, und zwar unter den folgenden Bedingungen:

Mobile Phase:
25% 2-Propanol 75% 0,01 m Natriumacetat pH4,0
Flußrate:	1 ml/Minute
Detektor:	UV bei 254 nm
Empfindlichkeit:	0,04 AUFS
Verdünnungsmittel:	DMSO
Injizierte Menge:	5 µl
Konzentration:	10 mg/ml

Die Schreibergeschwindigkeit variierte, jedoch waren 2 Minuten/ 2,54 cm typisch. Die obigen Bedingungen ergaben UV-Spuren mit Peaks, die quantitativ leicht zu bestimmen waren. Die Ergebnisse der obigen Analysen sind im vorliegenden Text als HLPC-Tests bezeichnet.

Um die Wiederholung komplizierter chemischer Bezeichnungen zu vermeiden, werden im vorliegenden Text bisweilen die nachfolgenden Abkürzungen gebraucht:

AHBA
L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure
BHBA	N-Carbobenzyloxyderivat von AHBA
HONB	N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
NAE (oder BHBA-′ONB′)	Ester von BHBA
HONS	N-Hydroxysuccinimid
SAE (oder BHBA-′ONS′)	N-Hydroxysuccinimid-aktivierter Ester von BHBA
DCC	Dicyclohexylcarbodiimid
DCU	Dicyclohexylharnstoff
HMDS	Hexamethyldisilazan
BSA	Bis(trimethylsilyl)acetamid
MSA	Trimethylsilylacetamid
TFA	Trifluoracetyl
t-BOC	tert.-Butyloxycarbonyl

"Dicalite®" ist ein Produkt aus Diatomeenerde.

"Amberlite CG-50®" ist ein schwach-saures Kationenaustauscherharz des Carbonsäure- polymethacrylsäuretyps von chromatographischer Qualität.

"µ-Bondapak®" bezeichnet eine Reihe von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesäulen.

Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

Die Begriffe "(niedrig)Alkyl" und "(niedrig)Alkoxy" beziehen sich auf Alkyl- oder Alkoxygruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.

Die in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete Bezeichnung "pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz" einer Verbindung der Formel I bezeichnet ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- (oder ein höheres) Salz, das durch Einwirkung eines Moleküls einer Verbindung der Formel I auf eines oder mehrere Äquivalente einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure, abhängig von der speziellen Verbindung der Formel I, gebildet wurde. Es versteht sich, daß ein Säureadditionssalz an jeder Aminogruppe im Molekül gebildet werden kann, sowohl im Aminoglycosidkern als auch in der Acylseitenkette. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Äpfelsäure und Citronensäure und die anderen Säuren, welche herkömmlicherweise zur Herstellung von Salzen aminhaltiger Pharmazeutika verwendet werden.

Die meisten der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterialien verwendeten Aminoglycoside sind nach dem Stand der Technik bekannt. Jedes spezielle Aminoglycosid, das nicht per se bekannt ist, (z. B. ein zuvor noch nicht beschriebenes 6′-N-Methyl- Derivat eines bekannten Aminoglycosids) kann nach bekannten Verfahren wie sie zur Herstellung analoger Verbindungen verwendet werden, leicht hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen der Formel I sind sowohl gegen gram-positive als auch gram-negative Bakterien aktiv und werden analog zu anderen bekannten Aminoglycosiden verwendet. Viele der Verbindungen der Formel I sind per se bekannt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden polysilylierte Aminoglycoside der Formel XIV oder polysilylierte Aminogylcoside der Formel XIV, welche 1 bis 3 von Silyl verschiedene Blockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweisen, hergestellt.

Beispiel 1 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-carbobenzyloxykanamycin A in wasserfreiem Diäthylketon

Man schlämmt 15 g (24,24 mMol) 6′-N-Carbonbenzyloxykanamycin A in 90 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Dann gibt man im Verlauf von 30 Minuten langsam 17,5 g (108,48 mMol) Hexamethyldisilazan zu und hält die erhaltene Lösung 24 Stunden lang am Rückfluß. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum (40°C) und vollständigem Trocknen unter Vakuum (10 mm) erhält man 27,9 g eines weißen, amorphen Feststoffs. Ausbeute 90,71%, berechnet als 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)₉.

Diesen Feststoff löst man in 150 ml trockenem Diäthylketon bei einer Temperatur von 23°C auf. Man gibt 11,05 g (26,67 mMol) L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy- 5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE), gelöst in 100 ml trockenem Diäthylketon bei 23°C unter gutem Rühren im Verlauf von einer halben Stunde langsam zu. Man rührt die Lösung 78 Stunden lang bei 23°C. Man verdünnt die gelbe, klare Lösung (pH 7,0) mit 100 ml Wasser. Der pH der Mischung wird mit 3 n HCl auf 2,8 eingestellt und man rührt 15 Minuten lang heftig bei einer Temperatur von 23°C. Die wässerige Phase wird abgetrennt, und die organische Phase wird mit 50 ml Wasser von pH 2,8 extrahiert. Die vereinigten wässerigen Fraktionen wäscht man mit 50 ml Äthylacetat. Man gibt die Lösung in eine 500 ml-Parr- Vorrichtung zusammen mit 5 g 5%igem Palladium-auf-Aktivkohle- Katalysator und reduziert 2 Stunden lang bei 23°C bei einem Druck von 3.4475 bar (50 psi) H₂. Man filtriert die Mischung durch ein Filterbett aus Dicalite®, das dann mit zusätzlichen 30 ml Wasser gewaschen wird. Man konzentriert das farblose Filtrat im Vakuum (40 bis 45°C) auf 50 ml. Die Lösung wird auf eine 5 × 100 cm CG-50®(NH₄+)-Ionenaustauschersäule aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1000 ml Wasser eluiert man unumgesetztes Kanamycin A, 3-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl] kanamycin A (BB-K29) und Amikacin mit 0,5 n Ammoniumhydroxyd. Mit 3 n Ammoniumhydroxyd wird Polyacylmaterial wiedergewonnen. Zur Überwachung der fortlaufenden Eluierung wählt man Biotest, Dünnschichtchromatographie und optische Drehung. Volumen, beobachtete optische Drehung jeder Fraktion des Eluats und Gewicht und prozentuale Ausbeute des aus jeder Fraktion durch Eindampfen zur Trockene isolierten Feststoffs sind nachstehend zusammengestellt:

Durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird gezeigt, daß die verbrauchte Diäthylketonschicht weitere 3 bis 5% Amikacin enthält.

Man löst das rohe Amikacin (6,20 g) in 20 ml Wasser auf und verdünnt mit 20 ml Methanol und setzt dann 20 ml Isopropanol zu, um die Kristallisation einzuleiten. Man erhält 6,0 g (45,8%) kristallines Amikacin.

Beispiel 2 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A, wobei man in situ blockiert A) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Man schlämmt Kanamycin A in Form der freien Base mit 18 g Aktivität (37,15 mMol) in 200 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man 29,8 g (184,6 mMol) Hexamethyldisilazan zu und rührt die Mischung 78 Stunden am Rückfluß, wobei man eine hellgelbe klare Lösung erhält. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum bleibt ein amorpher, fester Rückstand übrig. Die Ausbeute beträgt 43 g (94%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀).

1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A

Man schlämmt 5,56 g (20,43 mMol) p-(Benzylcarbonyloxy)- benzoesäure in 50 ml trockenem Acetonitril bei einer Temperatur von 23°C auf. Dann gibt man unter gutem Rühren 8,4 g (41,37 mMol) N,O-bis-Trimethylsilylacetamid zu. Die Lösung wird 30 Minuten bei 23°C gehalten und dann im Verlauf von 3 Stunden unter heftigem Rühren zu einer Lösung von 21,5 g (17,83 mMol, berechnet als (Silyl)₁₀-Verbindung) Poly(trimethylsilyl) kanamycin A in 75 ml trockenem Acetonitril von 23°C zugegeben. Man rührt die Mischung 4 Stunden lang, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum (40°C) und löst dann den öligen Rückstand in 50 ml trockenem Aceton mit einer Temperatur von 23°C.

Im Verlauf von 5 Minuten gibt man 8,55 g (20,63 mMol) L-(-)- γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5- norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 30 ml Aceton zur obigen Lösung. Man erhält die Mischung 78 Stunden bei 23°C. Dann verdünnt man die Lösung mit 100 ml Wasser und senkt den pH (7,0) mit 6 n HCl auf 2,5 ab. Die Mischung wird in eine 500 ml Parr-Flasche zusammen mit 3 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle- Katalysator gegeben und 2 Stunden bei einer Temperatur von 23°C bei einem Druck von 2.758 bar (40 psi) H₂ reduziert. Man filtriert die Mischung durch ein Filterbett aus Diatomeenerde, das anschließend mit 20 ml Wasser gewaschen wird. Bei den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten (168 ml) wird durch mikrobiologischen Test gegen E. coli festgestellt, daß sie angenähert 11 400 mcg/ml Amikacin enthalten (Ausbeute 19%).

Beispiel 3 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A A) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Eine Suspension von 10 g (20,6 mMol) Kanamycin A in 100 ml trockenem Acetonitril und 25 ml (119 mMol) 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan wird 72 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Man erhält eine klare, hellgelbe Lösung. Die Lösung wird im Vakuum bei 30 bis 40°C zur Trockene eingedampft. Man erhält 21,3 g Poly(trimethylsilyl)kanamycin A in Form eines hellockerfarbenen, amorphen Pulvers. Die Ausbeute beträgt 85%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

B) 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A

Zu einer Lösung von 2,4 g (2,0 mMol) Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A in 30 ml trockenem Aceton gibt man langsam 2,0 mMol L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure- N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 10 ml trocknem Aceton bei einer Temperatur von 0 bis 5°C zu. Die Reaktionsmischung wird 1 Woche lang bei 23°C gerührt und dann im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 40°C zur Trockne eingedampft. Dann gibt man 60 ml Wasser zum Rückstand, gefolgt von 70 ml Methanol, um eine Lösung zu erhalten. Die Lösung wird mit 3 n HCl auf pH 2,0 angesäuert und dann 2 Stunden lang bei einem Druck von 3.4475 bar (50 psi) H₂ reduziert, wobei man 500 mg 5% Palladium-auf-Aktivkohle- Katalysator verwendet. Das Material wird filtriert, und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit dem mikrobiologischen Test gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß eine Ausbeute von 29,4% Amikacin erhalten wurde.

Beispiel 4 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A in Tetrahydrofuran mit dem gemischten Säureanhydrid aus Pivalinsäure und BHBA A) Herstellung des gemischten Anhydrids

Man löst 5,066 g (20,0 mMol) BHBA, 4,068 g (20,0 mMol) BSA und 2,116 g (22,0 mMol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran, das zuvor über einem Molekularsieb getrocknet wurde. Man hält die Lösung 2 1/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann auf -10°C ab. Im Verlauf von 2 bis 3 Minuten gibt man 2,412 g noch 2 Stunden lang bei -10°C. Dann läßt man die Temperatur auf 23°C ansteigen.

B) Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A

5,454 g (4,97 mMol, berechnet als 6′-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, wie in Beispiel 1 hergestellt, wird in 50 ml trockenem (Molekularsieb) Tetrahydrofuran von 23°C aufgelöst. Man gibt die Hälfte der Lösung des wie in Stufe A beschrieben hergestellten gemischten Anhydrids (10,0 mMol) im Verlauf von 20 Minuten unter Rühren zu und rührt dann noch weitere 7 Tage.

Dann gibt man 100 ml Wasser zur Reaktionsmischung und stellt den pH (5,4) mit 3 m H₂SO₄ auf 2,0 ein. Man rührt noch 1 Stunde und extrahiert dann die Lösung mit Äthylacetat. Die Kristallisation von polyacyliertem Material setzt ein, so daß die Reaktionsmischung gefiltert wird. Nach dem Trocknen über P₂O₅ wiegen die gewonnenen Feststoffe 0,702 g. Die Extraktion der Reaktionsmischung wird insgesamt mit 4 × 75 ml Äthylacetat durchgeführt. Anschließend wird das überschüssige Äthylacetat aus der wässerigen Schicht entfernt. Man führt einen Test mit Hilfe von HPLC bei einem aliquoten Anteil der wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 26,4%.

Dann hydriert man die wässerige Schicht in einer Parr-Vorrichtung 2 Stunden lang bei einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi), wobei man 0,5 g 10% Pd-auf-Aktivkohle-Katalysator verwendet. Man filtriert das Material und stellt bei dem vereinigten Filtrat und den Waschflüssigkeiten durch Test gegen E. coli fest, daß eine Ausbeute an Amikacin von 31,2% vorliegt. Das Verhältnis Amikacin/BB-K29 beträgt angenähert 9-10/1. Es liegen Spuren von Polyacylverbindungen und unumgesetzten Kanamycin A vor.

Beispiel 5 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-kanamycin A in Aceton mit dem gemischten Anhydrid aus BHBA und Isobutylkohlensäure A) Herstellung des gemischten Anhydrids

1,267 g (5,0 mMol) BHBA und 1,313 g (10,0 mMol) N-Trimethylsilylacetamid (MSA) in 20 ml über Molekularsieb-getrocknetem Aceton wird bei 23°C gerührt und man gibt 0,70 ml (5,0 mMol) Triäthylamin (TEA) zu. Die Mischung wird 2 1/2 Stunden unter einer N₂-Atmosphäre am Rückfluß gehalten. Man kühlt die Mischung auf -20°C ab und gibt 0,751 g (0,713 ml; 5,50 mMol) Isobutylchlorformiat zu. Es setzt eine sofortige Abscheidung von Triäthylaminhydrochlorid ein. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei -20°C.

B) Acylierung

Man löst 6,215 g (4,9 mMol), berechnet als (Silyl)₉-Verbindung) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Molekularsieb- getrocknetem Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man kühlt die Lösung auf -20°C ab und gibt langsam im Verlauf von 30 Minuten die kalte Lösung des gemischten Anhydrids aus Stufe A zu. Man rührt die Reaktionsmischung weitere 1 1/2 Stunden bei -20°C und anschließend 17 Stunden bei 23°C. Die Reaktionsmischung wird dann unter Rühren in 150 ml Wasser von 23°C gegossen, der pH (7,75) wird mit 3 n HCl auf 2,5 eingestellt, und das Rühren wird noch 15 Minuten fortgesetzt. Dann wird das Aceton im Vakuum bei 40°C entfernt. Man führt einen Test mit HPLC bei einem Aliquot der erhaltenen wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 34,33% an.

Der Hauptteil der wässerigen Lösung wird 3 1/4 Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, und bei den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten wird durch mikrobiologische Untersuchung gegen E. coli festgestellt, daß eine Ausbeute von 35,0% an Amikacin vorliegt.

Beispiel 6 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Cyclohexanon bei unterschiedlichen Reaktionszeiten

A) 2,537 g (2,0 mMol), berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 300 ml trockenem Cyclohexanon wird 20 Stunden bei 23°C mit einer NAE-Lösung in trockenem Cyclohexanon (10,8 ml einer 0,1944 mMol/ml-Lösung, 2,10 mMol) acyliert. Dann gibt man die Reaktionsmischung zu 150 ml Wasser unter Rühren zu und stellt den pH (5,6) mit 3 n HCl auf 2,5 ein. Das Cyclohexanon wird im Vakuum bei 40°C entfernt, und ein aliquoter Anteil der verbliebenen wässerigen Phase wird zur Untersuchung mit HPLC herangezogen.

Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 Stunden lang bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi), wobei man 1,0 g eines 10%igen Pd/C-Katalysators verwendet. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht.

B) Die obige Reaktion A wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acylierung diesmal nicht 20 Stunden lang, sondern 115 Stunden lang durchgeführt wurde.

Ausbeuten

Beispiel 7 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Tetrahydrofuran bei unterschiedlichen Reaktionszeiten

A) Man wiederholt Beispiel 6, A mit der Ausnahme, daß man anstelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet.

B) Man wiederholt Beispiel 6, B mit der Ausnahme, daß man anstelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet.

Ausbeuten

Beispiel 8 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Dioxan während unterschiedlicher Reaktionszeiten

A) Man wiederholt Beispiel 6, A mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 44 Stunden lang acyliert.

B) Man wiederholt das Beispiel 6, B mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 18 1/2 Stunden acyliert.

Ausbeuten

Beispiel 9 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Diäthylketon bei 75°C

Zu einer gerührten Lösung von 2,537 g (2,0 mMol), berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N- Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 32 ml Molekularsieb-getrocknetem Diäthylketon bei 75°C gibt man im Verlauf von 15 Minuten eine Lösung von NAE (10,8 ml mit 0,1944 mMol/ml Diäthylketon, 2,10 mMol) zu. Man rührt noch weitere 3 Stunden bei 75°C und gießt dann die Mischung in 150 ml Wasser. Der pH wird mit 3 n HCl auf 2,8 eingestellt und das Diäthylketon wird bei 40°C im Vakuum entfernt. HPLC-Test eines aliquoten Anteils der wässerigen Phase zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 39,18% an.

Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 1/4 Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,4337 bar (49,8 psi), wobei man 1,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht. Die turbidimetrische Untersuchung zeigt eine Ausbeute von 27,84% an, der Plattenrest ergibt eine Ausbeute von 28,6%.

Beispiel 10 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A mit NAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"-Hydrolyse mit Wasser A) Silylierung von Kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit IMCS als Katalysator

Man bringt 10 g Kanamycin A (97,6% rein, 20,14 mMol) in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Zur rückflußkochenden Reaktionsmischung gibt man im Verlauf von 10 Minuten eine Mischung aus 22,76 g (141 mMol, 7 mMol pro Mol Kanamycin A) HMDS und 1 ml (0,856 g, 7,88 mMol) TMCS. Man hält noch 4 3/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Mischung, konzentriert im Vakuum zu einem gelben, viskosen Sirup und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Die Ausbeute an Produkt beträgt 23,8 g (97,8%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀).

B) Acylierung

Man löst 23,8 g (20,14 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das in Stufe A hergestellt wurde, in 250 ml Molekularsieb- getrocknetem Aceton bei 23°C auf und kühlt dann auf 0 bis 5°C ab. Dann gibt man unter Rühren 3,63 ml (201,4 mMol), 10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) Wasser zu und läßt die Mischung 30 Minuten lang unter mäßigem Vakuum stehen. Im Verlauf von weniger als 1 Minute werden 19,133 mMol (0,95 Mol pro Mol polysilyliertes Kanamycin A) NAE in 108,3 ml Aceton zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 0 bis 5°C, verdünnt mit Wasser, stellt den pH auf 2,5 ein und entfernt dann das Aceton im Vakuum. Dann wird die wässerige Lösung 2 1/2 Stunden bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g 10% Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte Reaktionsmischung wird durch Dicalite® filtriert, im Vakuum bei 40°C auf ungefähr 100 ml konzentriert und dann auf eine CG-50®(NH₄+)-Säule (6 Liter Harz, 5 × 100 cm) aufgegeben. Man wäscht mit Wasser und eluiert dann mit 0,6 n-1,0 n- 3 n NH₄OH. Man erhält 60,25% Amikacin, 4,37% BB-K6, 4,35% BB-K29, 26,47% Kanamycin A und 2,18% Polyacylverbindungen.

Beispiel 11 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- 6′-N-Cbz-Kanamycin A mit SAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"- Methanolyse A) Silylierung von 6′-N-Cbz-Kanamycin A

Man bringt 20,0 g (32,4 mMol) 6′-N-Cbz-Kanamycin A in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Im Verlauf von 10 Minuten gibt man 47,3 ml (226,8 mMol, 7 Mol pro Mol 6′-N-Cbz-Kanamycin A) HMDS zu und setzt das Rückflußkochen noch 20 Stunden fort. Dann kühlt man die Mischung, konzentriert im Vakuum und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum, wodurch man 39,1 g weißen amorphen Feststoff erhält. Ausbeute 95,4%, berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉.

B) Acylierung

Man löst 39,1 g (32,4 mMol) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz- Kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in 400 ml trockenem Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man gibt 6,6 ml (162 mMol, 5 Mol pro Mol polysilyliertes 6′-N- Cbz-Kanamycin A) Methanol zu und rührt die Mischung 1 Stunde unter einer starken Stickstoffspülung bei 23°C. Die Mischung wird auf 0 bis 5°C abgekühlt, und eine Lösung von 11,35 g (32,4 mMol) SAE in 120 ml zuvor abgekühltem, trockenem Aceton wird zugesetzt. Man rührt die Mischung weitere 3 Stunden bei 0 bis 5°C und gibt sie dann 1 Woche lang in einem bei 4°C gehaltenen Kälteraum. Dann gibt man 300 ml Wasser zu, stellt den pH auf 2,0 ein, rührt die Mischung 1 Stunde und entfernt das Aceton im Vakuum. Die erhaltene wässerige Lösung wird 17 Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,7233 bar (54,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann filtriert man durch Dicalite®, konzentriert im Vakuum auf 75 bis 100 ml, gibt auf eine CG-50®(NH₄+)-Säule auf und eluiert mit Wasser und 0,6 n NH₄OH. Man erhält 52,52% Amikacin, 14,5% BB-K29, 19,6% Kanamycin A und 1,71% Polyacylverbindungen.

Beispiel 12 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- Kanamycin A mit SAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"-Hydrolyse mit Wasser A) Silylierung von Kanamycin A mit TMCS in Acetonitril unter Verwendung von Tetramethylguanidin als Säureakzeptor

Man suspendiert 4,88 g (10,07 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Zur gerührten Suspension gibt man 16,234 g (140,98 mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin A) Tetramethylguanidin (TMG). Man erhitzt die Mischung zum Rückfluß und gibt im Verlauf von 15 Minuten 15,32 g (140,98 mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin A) TMCS zu. Ungefähr 1/2 Stunde nach der Zugabe des TMCS bildet sich ein weißer Niederschlag von TMG · HCl. Man kühlt die Mischung auf Raumtemperatur, konzentriert zu einem klebrigen Rückstand und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Der Feststoff wird mit 100 ml trockenem THF verrieben, und das unlösliche TMG · HCl wird abfiltriert und mit 5 × 20 ml- Portionen THF gewaschen. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 40°C zu einem klebrigen Rückstand konzentriert und 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet. Man erhält 10,64 g eines hell-cremefarbigen, klebrigen Rückstands. Die Ausbeute beträgt 87,6%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

B) Acylierung

Man löst 10,64 g (10,07 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in 110 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton unter Rühren bei 23°C auf und kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C. Dann gibt man 1,81 ml Wasser (100,7 mMol, 10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem Vakuum. 3,70 g (10,57 mMol, 5%iger Überschuß) SAE in 40 ml vorgekühltem, trockenem Aceton werden im Verlauf von weniger als 1 Minute zugegeben, und die Mischung wird 1 Stunde gerührt. Man arbeitet die Mischung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 16 B auf, wobei man ungefähr 50% Amikacin, ungefähr 10% BB-K29, 5 bis 8% BB-K6, ungefähr 20% Kanamycin A und 5 bis 8% Polyacylverbindungen erhält.

Beispiel 13 Herstellung von Poly(triäthylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von Triäthylchlorsilan mit Triäthylamin als Säureakzeptor

5,0 zu 97,6% reines Kanamycin A (10,07 mMol) werden in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril bei 23°C suspendiert. Man gibt 33,8 ml (24,5 g, 241,7 mMol) Triäthylamin zu und bringt die Suspension zum Rückfluß. Eine Lösung von 23,7 ml (21,3 g, 140,98 mMol) Triäthylchlorsilan in 25 ml trockenem Acetonitril wird im Verlauf von 20 Minuten zugesetzt. Man hält noch weitere 7 Stunden am Rückfluß und kühlt die Mischung auf Raumtemperatur ab, worauf lange, feine Nadeln von TEA · HCl abgeschieden werden. Man läßt die Mischung ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen, konzentriert im Vakuum bei 40°C zu einem klebrigen Feststoff und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum zu einem dunkel-orangefarbenen, klebrigen Feststoff. Man verreibt den Feststoff mit 100 ml trockenem THF von 23°C und filtriert das unlösliche TEA · HCl ab, wäscht mit 5 × 20 ml THF und trocknet. Hierbei erhält man 16,0 g TEA · HCl. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum zu einem Feststoff konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum. Man erhält 19,3 g Poly(triäthylsilyl)-kanamycin A als dunkelorangen, viskosen Sirup.

Beispiel 14 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von bis-Trimethylsilylharnstoff

Man suspendiert 10,0 g zu 99,7% reines Kanamycin A (20,58 mMol) in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Zur Suspension gibt man 29,45 g bis-Trimethylsilylharnstoff (BSU) (144,01 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin) und bringt die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Man hält noch 17 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur ab. Eine kleine Menge unlösliches Material wird durch Filtrieren entfernt, mit 3 × 10 ml-Portionen Acetonitril gewaschen und getrocknet (1,1381 g). Infrarot-Spektroskopie zeigt, daß es sich hierbei um BSU und eine kleine Menge unumgesetztes Kanamycin A handelt. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden 16 Stunden auf 4°C abgekühlt. Es scheidet sich weiterer Feststoff ab, der wie oben beschrieben gewonnen wird. Man erhält 7,8 g. Durch Infrarotanalyse wird gezeigt, daß es sich um BSU und Harnstoff handelt. Das hellgelbe Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 40°C konzentriert. Anschließend trocknet man unter Hochvakuum, wobei man 27,0 g eines weißen Feststoffs erhält, der teilweise klebrig ist und teilweise aus feinen, nadelartigen Kristallen besteht. Man behandelt den Feststoff mit 150 ml Heptan von 23°C, entfernt den unlöslichen Anteil durch Filtrieren, wäscht mit 2 × 50 ml-Portionen Heptan und trocknet. Hierbei erhält man 6,0 g weiße Nadeln, bei denen es sich nach Infrarotanalyse um BSU und Harnstoff handelt. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssigkeit werden im Vakuum bei 40°C konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden lang unter Hochvakuum, wobei man 20,4 g weiße Nadeln erhält. Deren Infrarotspektrum ist typisch für polysilyliertes Kanamycin A. Berechnungen zeigen, daß das Produkt durchschnittlich 7,22 Trimethylsilylgruppen enthält.

Beispiel 15 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Per(trimethylsilyl)- kanamycin A nach teilweiser Desilylierung mit 1,3-Butandiol A) Herstellung von Per(trimethylsilyl)-kanamycin A

Man suspendiert 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Man bringt die Suspension unter Stickstoffspülung zum Rückflußkochen und gibt dann im Verlauf von 10 Minuten 23,322 g (144,5 mMol), 7 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS zu. Man hält noch 16 Stunden lang am Rückfluß und kühlt dann die Mischung auf Raumtemperatur ab und konzentriert dann im Vakuum. Anschließend trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum. Man erhält 24,3 g eines weißen, klebrigen Rückstands. Die Ausbeute beträgt 92,1%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₁.

B) Acylierung

24,3 g in Stufe A hergestelltes Per(trimethylsilyl)-kanamycin A werden in 240 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton bei 23°C unter Rühren gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 9,25 ml 1,3-Butandiol (103,2 mMol, 5 Mol pro Mol Per(trimethylsilyl)- kanamycin A). Man rührt die Mischung 2 Stunden bei 23°C unter Stickstoffspülung und kühlt dann auf 0 bis 5°C ab. Im Verlauf von ungefähr 1 Minute gibt man 7,23 g SAE (20,64 mMol) in 70 ml vorgekühltem Aceton zu. Die Mischung wird 3 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt und dann ungefähr 16 Stunden lang in einem bei 4°C gehaltenen Kälteraum stehengelassen. Man gibt 200 ml Wasser zu, stellt den pH auf 2,5 ein und rührt die klare, gelbe Lösung 30 Minuten bei 23°C. Das Aceton wird im Vakuum entfernt und die wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,7923 bar (55,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann filtriert man die reduzierte Lösung durch Dicalite® und chromatographiert wie in Beispiel 16 B beschrieben. Man erhält 47,50% Amikacin, 5,87% BB-K29, 7,32% BB-K6, 24,26% Kanamycin A und 7,41% Polyacylverbindungen.

Beispiel 16 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A, das in THF unter Verwendung von SAE mit Sulfaminsäurekatalysator hergestellt wurde

Zu einer unter Rückfluß gehaltenen Mischung von 5,0 g (10,32 mMol) Kanamycin A in 50 ml Molekularsieb-getrocknetem Tetrahydrofuran (THF) gibt man 100 mg Sulfaminsäure und 12,32 g (76,33 mMol) HMDS. Man hält die Mischung 18 Stunden lang am Rückfluß, wobei nach 6 Stunden vollständige Auflösung erfolgt. Man kühlt die Lösung auf 23°C, behandelt mit 0,1 ml Wasser und hält 30 Minuten bei 23°C. Eine Lösung von 3,61 g (10,3 mMol) SAE in 36 ml THF wird im Verlauf von 30 Minuten zugesetzt. Nach 3-stündigem Rühren wird die Mischung mit 100 ml Wasser verdünnt und der pH mit 10%iger H₂SO₄ auf 2,2 eingestellt. Man rührt 30 Minuten lang bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum, um das THF zu entfernen. Die erhaltene wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi) reduziert, wobei man 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte Lösung wird durch Dicalite® filtriert, und die Feststoffe werden mit Wasser gewaschen. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (150 ml) werden mikrobiologisch gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß sie 1225 mcg/ml (31,5% Ausbeute an aktivem Material) Amikacin enthält.

Beispiel 17 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Dicarbenzyloxy-AHBA A) Herstellung des Dicarbobenzyloxy-L-(-)-α-amino-α-hydroxybuttersäure- N-hydroxysuccinimidesters

Man löst 8 g (20,65 mMol) Dicarbobenzyloxy-L-(-)-α-amino-α- hydroxybuttersäure und 2,37 g (20,65 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 50 ml trockenem Aceton von 23°C auf. 4,25 g (20,65 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 20 ml trockenem Aceton, werden zugegeben und das Ganze wird 2 Stunden bei 23°C gerührt. Man filtriert den Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht den Filterkuchen mit 10 ml trockenem Aceton und vereinigt Filtrate und Waschflüssigkeiten.

B) Acylierung

Aus 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 15 hergestelltes Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A wird in 100 ml trockenem Aceton gelöst.

Man kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C ab, gibt 3,7 ml entionisiertes Wasser zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem Vakuum bei 0 bis 5°C.

Zu dieser Lösung gibt man die Lösung des in Stufe A hergestellten di-Cbz-blockierten Acylierungsmittels und rührt die Mischung dann 30 Minuten lang bei 0 bis 5°C. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, der pH wird auf 2,2 eingestellt und das Aceton wird im Vakuum entfernt. Man reduziert die wässerige Lösung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 und filtriert dann durch Dicalite®. Durch Chromatographie wird festgestellt, daß 40 bis 45% Amikacin, etwa 10% BB-K29, eine Spur BB-K6, ungefähr 30% Kanamycin A und eine kleine Menge Polyacylverbindungen vorliegen.

Beispiel 18 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit Imidazol als Katalysator

Man erhitzt 11 g (22,7 mMol) Kanamycin A und 100 mg Imidazol in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Stickstoffspülung zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man 18,48 g HMDS (114,5 mMol, 5 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und hält die Mischung 20 Stunden am Rückfluß. Nach ungefähr 2 1/2 Stunden erfolgt vollständige Auflösung. Man kühlt die Lösung auf 23°C und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, wobei 21,6 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als schaumiger Rückstand zurückbleiben. Die Ausbeute beträgt 93,1%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₁.

Beispiel 19 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin B (BB-K26) durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B mit SAE A) Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B unter Verwendung von HMDS mit TMCS-Katalysator

25 g (51,7 mMol) Kanamycin B in 250 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril werden unter einem Stickstoffstrom zum Rückfluß erhitzt. Man gibt im Verlauf von 30 Minuten 62,3 g HMDS (385,81 mMol, 7,5 Mol pro Mol Kanamycin B), gefolgt von 1 ml TMCS als Katalysator, zu. Die Mischung wird 21 Stunden unter Rückfluß gehalten, wobei nach 1 Stunde vollständige Auflösung erfolgt. Dann wird das Lösungsmittel bei 60°C im Vakuum entfernt. Den öligen Rückstand hält man 3 Stunden bei 60°C unter Hochvakuum. Man erhält 53,0 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B. Die Ausbeute beträgt 85,2%, berechnet als Kanamycin B (Silyl)₁₀.

B) Acylierung

53,0 g des in der obigen Stufe A hergestellten Poly(trimethylsilyl)- kanamycins B werden in 500 ml trockenem Aceton bei 0 bis 5°C aufgelöst. Man gibt 20,9 ml Methanol zu und rührt die Mischung 30 Minuten bei 0 bis 5°C im Vakuum. Eine Lösung von 18,1 g (51,67 mMol) SAE in 200 ml vorgekühltem, trockenem Aceton wird im Verlauf von weniger als 1 Minute zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten bei 0 bis 5°C gerührt. Die Mischung wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 aufgearbeitet und dann auf eine Säule mit CG-50®(NH₄+) (8 × 120 cm) aufgegeben. Man eluiert mit einem NH₄OH-Gradienten von 0,6 n auf 3 n. Erhalten werden 38% BB-K26, 5% des entsprechenden 6′-N-acylierten Kanamycins B (BB-K22), 10% des entsprechenden 3-N-acylierten Kanamycins B (BB-K46), 14,63% Kanamycin B und eine kleine Menge polyacyliertes Kanamycin B.

Beispiel 20 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit Kanamycin A-Sulfat als Katalysator

19,5 g (40,246 mMol) Kanamycin A und 0,5 g (0,858 mMol) Kanamycin A-Sulfat [insgesamt= 20,0 g, 41,0 mMol] in 200 ml Molekularsieb- getrocknetem Acetonitril werden zum Rückfluß gebracht. Man gibt langsam 60,3 ml HMDS (287,7 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und hält die Mischung 28 Stunden am Rückfluß. Dann wird am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und anschließend unter Dampfstrahlvakuum getrocknet. Man erhält 47,5 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als blaßgelbes Öl. Die Ausbeute beträgt 95,82%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

Beispiel 21 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A mit N-Trifluoracetyl-blockiertem AHBA- N-hydroxysuccinimidester A) Herstellung von N-Trifluoracetyl-AHBA und Umwandlung in den N-Hydroxysuccinimidester

Zu einer Suspension von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml THF gibt man 40 g (191 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid unter Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu. Man rührt die Lösung 18 Stunden bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum bei 50°C zur Trockne. Den Rückstand löst man in 100 ml wässerigem Methanol (1 : 1) und rührt 1 Stunde. Dann konzentriert man im Vakuum zur Trockne und löst in 50 ml H₂O wieder auf. Die wässerige Lösung wird mit 3 × 50 ml-Portionen MIBK extrahiert, und nach dem Trocknen über Na₂SO₄ wird der Extrakt zu einem Öl konzentriert. Spuren an Lösungsmittel werden durch Zusatz und Abdestillieren von 4 ml Wasser entfernt. Beim Stehenlassen geht das Öl in einen wachsartigen, kristallinen Feststoff über. Man erhält 2,5 g Produkt, Ausbeute 28%.

Man löst 2,4 g (11,3 mMol) des N-Trifluoracetyl-AHBA in 50 ml trockenem Aceton und gibt 1,30 g (11,31 mMol) N-Hydroxysuccinimid zur Lösung. Eine Lösung von 2,33 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml trockenem Aceton wird langsam zugesetzt. Man rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei 23°C und entfernt dann den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters der N-Trifluoracetyl-AHBA) wird bei der nachfolgenden Stufe ohne Isolierung verwendet.

B) Acylierung

Zu einer Lösung von 11,31 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das wie in Beispiel 20 beschrieben hergestellt wurde, in 54 ml Aceton gibt man 2,0 ml (113,4 mMol) Wasser und rührt die Mischung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. Zu der Mischung gibt man den in der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidester der N-Trifluoracetyl-AHBA (11,31 mMol) und hält die Mischung dann 1 Stunde bei 5°C. Der pH wird mit 20%iger H₂SO₄ auf ungefähr 2,0 festgestellt, die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 erhöht. Anschließend dampft man die Mischung am Rotationsverdampfer zur Trockne ein. Man erhält 14,4 g eines klebrigen, weißlichen Feststoffs. Der Feststoff wird in 100 ml Wasser gelöst, der pH wird mit 10 n NH₄OH von 5,5 auf 11,0 angehoben und die Lösung wird in einem Ölbad 1 Stunde bei 70°C erhitzt. Dann senkt man den pH (9,5) mit HCl auf 7,0 ab, führt mit der Lösung eine Klarfiltration durch, um eine kleine Menge unlösliche Materialien zu entfernen und wäscht das Filter mit Wasser. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (188 ml) werden auf eine Säule mit CG-50®(NH₄+) (8 × 90 cm) aufgegeben, mit 2 Liter Wasser gewaschen und mit einem NH₄OH-Gradienten (0,6 n-1,0 n konzentriert) eluiert. Man erhält 28,9% Amikacin, 5,0% BB-K6, 5,7% BB-K29, 43,8% Kanamycin A, 3,25% Polyacylverbindungen und 14,3% eines unbekannten Materials, das in der ersten Funktion aus der Säule austritt.

Beispiel 22 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)- kanamycin A mit tert.-Butoxycarbonyl-blockiertem AHBA- N-hydroxysuccinimidester A) Herstellung von tert.-BOC-AHBA und Umwandlung in den N-Hydroxysuccinimidester

Eine Lösung von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml Wasser und 20 ml Aceton wird mit 10 n NaOH auf pH 10 eingestellt. Im Verlauf von 3 bis 4 Minuten gibt man 11,6 g (53 mMol) Di- tert.-butyldicarbonat zu und rührt die Lösung 35 Minuten, während man den pH durch periodische Zugabe von 10 n NaOH bei pH 10 hält. Das Aceton wird im Vakuum entfernt, und die wässerige Phase wird mit 40 ml Äthylacetat gewaschen. Man senkt den pH der wässerigen Lösung mit 3 n HCl auf 2,0 ab und extrahiert dann mit 3 × 30 ml MIBK. Die vereinigten MIBK-Extrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und zu einem klaren, öligen Rückstand konzentriert. Man erhält 8,2 g Produkt, Ausbeute 89%.

4,25 g (19,4 mMol) des tert.-BOC-AHBA werden in 50 ml Aceton gelöst, und man gibt 2,23 g (19,4 mMol) N-Hydroxysuccinimid zu. Eine Lösung von 4,00 g (19,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Aceton wird langsam zugesetzt, und die Mischung wird 2 Stunden bei 23°C gerührt. Man entfernt den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA) werden in der nachfolgenden Stufe ohne Isolierung eingesetzt.

Acylierung

Zu einer Lösung von 41,28 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, wie in Beispiel 20 beschrieben hergestellt, in 94 ml Aceton gibt man 3,5 ml (194 mMol) Wasser und rührt die Lösung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. 19,4 mMol des in der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA werden zugesetzt und die Mischung wird 1 Stunde bei 5°C stehengelassen. Dann gibt man 200 ml Wasser zu und senkt den pH (7,0) mit 20%iger H₂SO₄ auf 2,0 ab. Nach 30-minütigem Rühren wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 angehoben, und die Mischung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 36,3 g eines goldfarbenen Öls erhält. Das Öl wird in 200 ml Trifluoressigsäure gelöst. 15 Minuten lang stehengelassen und dann am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft. Man wäscht das Öl mit Wasser und destilliert das Wasser ab. Man gibt konzentriertes NH₄OH auf pH 6,0 zu und destilliert dann ab. Der erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst, filtriert, und das Filter wird mit Wasser gewaschen. Man gibt vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (259 ml) auf eine CG-50® (NH₄+)Säule (8 × 92 cm), wäscht mit 4 Litern Wasser und eluiert mit einem NH₄OH-Gradienten (0,6 n-1,0 n konzentriert). Man erhält 40,32% Amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29, 30,50% Kanamycin A und 7,43% Polyacylverbindungen.

Beispiel 23

2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin wird in trockenem Acetonitril aufgeschlämmt und unter Stickstoffatmosphäre 4 Stunden am Rückfluß erhitzt. Man gibt während 30 Minuten Hexamethyldisilazan zu [4 Mol pro Mol 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)- sisomicin] und erhitzt die sich ergebene Lösung 24 Stunden zum Rückfluß. Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum ergibt festes polysilyliertes 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin.

Das polysilylierte 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin wird gemäß der allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 21 B mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-γ-Trifluoracetylamino-a-hydroxybuttersäure acyliert und wie in Beispiel 21 B beschrieben aufbereitet, wobei man dann 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl- sisomicin erhält. Siliziumgehalt: 23,3% (entsprechend (Silyl)₁₀).

Beispiel 24 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-4′-deoxy- 6′-N-methylkanamycin A (BB-K311) durch Acylierung von polysilyliertem 6′-N-Benzyl-3-N-carbobenzyloxy-4′-deoxy-6′-N-methyl- kanamycin A A) Herstellung von 6′-N-Carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A und 3,6′-Di-N-carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A

Zu einer gerührten Lösung von 10,4 g (22,2 mMol) 4′-Deoxykanamycin A und 27,5 g (111 mMol) Ni(OAc)₂ · 4H₂O in 450 ml DMSO werden 7,0 g (22,4 mMol) N-Hydroxy-5-norbornen-2,4-dicarboximid- Ester von Benzyloxyameisensäure (Cbz-ONB) bei etwa 10°C hinzugefügt und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird im Vakuum eingeengt und man erhält einen blauen, öligen Rückstand, der über CG-50®-Harz chromatographiert wird (NH₄⁺, 500 ml), wobei mit verdünntem Ammoniakwasser eluiert wird. Die auf Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen, die aus dem Abwasser (hervorgerufen durch ein Auslaufen des 3,6′-Di-N-Cbz-Derivats) und dem Eluat mit 0,1 N Ammoniak gesammelt werden, werden vereinigt und im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird über Diaion HP-10®-Harz (400 ml) nochmals chromatographiert unter Verwendung von einer wäßrigen Methanollösung als Eluierungsmittel, um die Mono- und Di-Cbz-Derivate zu trennen. Das 6′-N-Cbz-Derivat wird mit 30%iger wäßriger Methanollösung eluiert und aus H₂O-Äthanol kristallisiert. Man erhält 4,73 g (35%) farblose Kristalle. Schmelzpunkt 232 bis 233°C. IR(KBr): 1700, 1540, 1275, 1135, 1075, 1040, 770, 750, 695 cm^-1.

Analyse für C₂₆H₄₂N₄O₁₂ · EtOH · 1/2H₂O:

ber.:
C 51,13, H 7,51, N 8,52%
gef.:	C 51,03, H 7,31, N 8,42%

Das 3,6′-Di-N-Cbz-Derivat wird mit 90%iger wäßriger Methanollösung eluiert und aus H₂O-Methanol kristallisiert. Man erhält 3,08 g (18,4%) Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 220 bis 221°C. IR(KBr): 1690, 1545, 1260, 1135, 1075, 1045, 780, 750, 700 cm^-1.

Analyse für C₃₄H₄₈N₄O₁₄ · H₂O:

ber.:
C 54,10, H 6,68, N 7,42%
gef.:	C 54,10, H 6,69, N 7,07%

B) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-6′-N-carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A

Zu einer gerührten Suspension von 4,70 g (7,8 mMol) 3,6′-Di-N- Cbz-4′-deoxykanamycin A in 240 ml Methanol werden 29 ml (307 mMol) Essigsäureanhydrid hinzugefügt. Die Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum abgezogen. Man erhält 5,68 g (100%) des obigen Tri-N-acetylderivats mit einem Schmelzpunkt von 290 bis 291°C (Zers.). IR(KBr): 1700, 1650, 1550, 1380, 1260, 1140, 1080, 1035, 745, 695 cm^-1.

Analyse für C₃₂H₄₈N₄O₁₅ · H₂O:

ber.:
C 51,47, H 6,75, N 7,50%
gef.:	C 51,66, H 7,13, N 7,06%

C) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-4′-deoxykanamycin A

Eine Lösung von 5,5 g (7,6 mMol) 1,3,3"-Tri-N-acetyl-6′- N-carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A in 80 ml einer 50%igen wäßrigen Äthanollösung wird in Anwesenheit eines 10%igen Pd-C-Katalysators bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird unter reduziertem Druck abgezogen und man erhält 4,49 g (100%) der obigen Verbindung. Eine analytische Probe wird durch Säulenchromatographie auf Amberlite IRA-410®-Harz (OH^-) und Kristallisation aus H₂O-Methanol mit einem Schmelzpunkt von 280 bis 283°C erhalten. IR(KBr): 1650, 1550, 1380, 1135, 1080, 1035 cm^-1.

Analyse für C₂₄H₄₂N₄O₁₃ · MeOH · 1/2 H₂O:

ber.:
C 47,24, H 7,45, N 8,81%
gef.:	C 47,61, H 7,45, N 8,58%

D) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-6′-N-benzyl-4′-deoxykanamycin A

Eine Lösung von 4,39 g (7,39 mMol) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-4′- deoxykanamycin A und 5 ml Benzaldehyd in 60 ml wäßriger Methanollösung werden 30 Minuten auf 60°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt, mit 4,0 g (106 mMol) NaBH₄ behandelt, zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend im Vakuum abgezogen. Der ölige Rückstand wird über HP-10®-Harz (150 ml) unter Verwendung von wäßrigem Methanol als Eluierungsmittel chromatographiert und man erhält 3,86 g (74%) der obigen Verbindung und 1,70 g feuchtes Ausgangsmaterial, welches in demselben Verfahren zurückgeführt wird und aus welchem man zusätzliche 1,32 g (26%) der obigen Verbindung erhält. Eine analytische Probe wird hergestellt durch nochmalige Chromatographie auf HP-10®- Harz und Kristallisation aus H₂O-Äthanol. Schmelzpunkt über 300°C. IR(KBr): 3280, 1640, 1555, 1380, 1135, 1080, 1040, 750, 700 cm^-1.

Analysen für C₃₁H₄₈N₄O₁₃:

ber.:
C 54,38, H 7,07, N 8,18%
gef.:	C 54,01, H 7,16, N 7,87%

E) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-6′-N-benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A

Zu einer gerührten Mischung von 3,86 g (5,6 mMol) 1,3,3′′- Tri-N-acetyl-6′-N-benzyl-4′-deoxykanamycin A und 5,6 ml 37%ige wäßrige HCHO in 85 ml 95%igem Methanol werden 850 mg (13,5 mMol) NaBH₃CN gegeben. Die Mischung wird 4 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird unter Verwendung von wäßrigem Methanol als Eluierungsmittel über HP-10®-Harz chromatographiert und man erhält 3,88 g (100%) der obigen Verbindung. Eine analytische Probe wird durch Kristallisation aus H₂O-Äthanol mit einem Schmelzpunkt von 295 bis 297°C (Zers.) erhalten. IR(KBr): 3280, 1645, 1500, 1375, 1145, 1075, 1040, 740, 700 cm^-1. NMR(D₂O): δ in ppm von DSS, 2,27 (3H, s, N-CH₃), 7,34 (5H, s, Ar-H).

Analyse für C₃₂H₅₀N₄O₁₃ · 1/2H₂O:

ber.:
C 54,30, H 7,26, N 7,92%
gef.:	C 54,30, H 7,33, N 7,64%

F) 6′-N-Benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A (BB-K312)

Eine Mischung von 5,18 g (7,42 mMol) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-6′- N-benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A und 15 g NaOH in 80 ml Wasser werden über Nacht am Rückfluß gehalten. Die Mischung wird abgekühlt, mit konzentrierter HCl neutralisiert und zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile filtriert. Das Filtrat wird auf eine Säule mit CG-50®-Harz (NH₄⁺, 370 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1,5 Liter Wasser wird die Säule nacheinander mit 2 Liter 0,05 N NH₄OH und 2 Liter 0,1 N NH₄OH eluiert. Das Eluat, welches auf Ninhydrin eine positive Reaktion zeigt, wird abgezogen und man erhält 3,23 g (76%) der obigen Verbindung.

G) 6′-N.-Benzyl-3-N-benzyloxycarbonyl-4′-deoxy-6′-N-methyl- kanamycin A

Zu einer gerührten Lösung von 2,94 g (5,14 mMol) 6′-N- Benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A (BB-K312) und 6,37 g (25,7 mMol) Ni(OAc)₂ · 4H₂O in 100 ml DMSO werden 1,62 g (5,20 mMol) Cbz-ONB hinzugefügt und es wird bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Nach 2 Tagen werden 72 ml einer 0,2 M wäßrigen EDTA-Lösung und 30 ml konzentrierte NH₄OH zu der Reaktionsmischung hinzugefügt. Die erhaltene blaue Lösung wird auf eine Säule mit HP-10®-Harz (150 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 200 ml 7 N NH₄OH und anschließend mit 300 ml H₂O wird die Säule mit 400 ml 80%igem wäßrigem Methanol eluiert und man erhält 2,65 g (73%) der obigen Verbindung. Eine analytische Probe wird durch Kristallisation aus Methanol mit einem Schmelzpunkt 216 bis 217°C erhalten. IR(KBr): 3340, 1690, 1540, 1290, 1135, 1045, 745, 700 cm^-1.

Analyse für C₃₄H₅₀N₄O₁₂ · 1/2 H₂O:

ber.:
C 57,06, H 7,18, N 7,83%
gef.:	C 57,29, H 7,22, N 7,58%

H) 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-4′-deoxy-6′-N-methyl 05565 00070 552 001000280000000200012000285910545400040 0002002818822 00004 05446- kanamycin A (BB-K311)

Eine Suspension von 2,49 g (3,53 mMol) 6′-N-Benzyl-3-N- benzyloxycarbonyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A und 5 ml HMDS in 40 ml trockenem CH₃CN wird über Nacht am Rückfluß gehalten. Die erhaltene klare Lösung wird zur Trockne eingeengt. Zu einer gerührten Lösung des öligen Rückstandes in 50 ml Diäthylketon werden 1,23 g (3,51 mMol) SAE hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Man erhält einen öligen Rückstand, der mit H₂O-Äthanol behandelt und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von ca. 3 eingestellt wird und den man dann 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen läßt. Die Lösung, die das acylierte Produkt enthält (eine kleine Probe, die der Lösung entnommen wird, zeigt eine Carbonylabsorptionsbande bei 1655 cm^-1, die auf ein Amid zurückzuführen ist), wird über Nacht bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von 1 g eines 10%igen Pd-C-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine Säule mit CG-50®-Harz (NH₄⁺, 160 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 250 ml Wasser wird die Säule nacheinander mit 250 ml 0,1 N NH₄OH, 1 Liter 0,2 N NH₄OH und 1 Liter 0,5 N NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 85 bis 100, die eine positive Ninhydrinreaktion zeigen, werden im Vakuum abgezogen und man erhält einen öligen Rückstand. Der Rückstand verfestigt sich in H₂O-Äthanol und man erhält 1,255 g eines kristallinen Produktes und 144 mg einer zweiten Ausbeute, insgesamt also 1,399 g (68%) der obigen Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 182 bis 184°C. [α] +93° (c 1, H₂O).

Analyse für C₂₃H₄₅N₅O₁₂ · EtOH · H₂O:

ber.:
C 46,36, H 8,25, N 10,81%
gef.:	C 46,37, H 8,40, N 10,38%

Dieses Produkt wird nochmals über CG-50®-Harz (NH₄⁺, 100 ml) unter Verwendung von carbonatfreiem wäßrigem Ammoniak als Eluierungsmittel chromatographiert und aus H₂O-Methanol- Isopropanol kristallisiert und man erhält 927 mg der obigen Verbindung in Form farbloser Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 193 bis 194°C.
[α] +101° (c 1, H₂O).
NMR(D₂O): δ in ppm von DSS 1,37 (2H, q, J=12, 2-Hax und 4-Hax), 1,86 (4H, m, 2-Häq, 4-Häq und β-CH₂), 2,29 (3H, s, N-CH₃), 4,14 (1H, dd, J=8 und 4,5, α-CH), 5,00 (1H, d, J=3,5, 1′′-H), 5,24 (1H, d, J=3,5, 1′-H).
IR(KBr): 1640, 1540, 1135, 1080, 1040, 955 cm^-1.

Analyse für C₂₃H₄₅N₅O₁₂ · 2 H₂O:

ber.:
C 44,58, H 7,97, N 11,30%
gef.:	C 44,85, H 7,90, N 11,85%

Beispiel 25 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-4′-deoxykanamycin A (BB-K160) durch Acylierung von polysilyliertem 3,6′-Di-N-carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A

Eine Suspension von 2,27 g (3,08 mMol) 3,6′-Di-N-carbobenzyloxy- 4′-deoxykanamycin A und 5 ml HMDS in 35 ml trockenem CH₃CN wird 2 Tage lang am Rückfluß gehalten. Die erhaltene klare Lösung wird im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird in 40 ml trockenem Diäthylketon gelöst. Zu dieser Lösung werden 1,08 g (3,08 mMol) SAE unter Rühren hinzugefügt. Die Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthanol-H₂O behandelt und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Nach 30-minütigem Stehen wird die angesäuerte Lösung 3 Tage lang bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von 1,2 g eines 10%igen Pd-C-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine Säule mit CG-50®-Harz (NH₄⁺, 130 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 500 ml H₂O wird die Säule nacheinander mit 1 Liter 0,2 N NH₄OH und 1 Liter 0,5 N NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 79 bis 95, die eine positive Ninhydrinenreaktion zeigen, werden zusammengefügt und im Vakuum abgezogen. Man erhält 1 g (56,1%) der obigen Verbindung in Form eines amorphen Pulvers. Das Produkt wird nach demselben Verfahren, das für die Verbindung BB-K311 in Stufe H) des Beispiels 31 verwendet wurde, umkristallisiert. Es hat einen Schmelzpunkt von 179 bis 180°C.
[α] +99° (c 1, H₂O).
IR(KBr): 1640, 1535, 1120, 1065, 1030, 945 cm^-1.
NMR(D₂O): δ in ppm 1,37 (2H, q, J=12,2- und 4′-Hax), 186 (4H, m, 2- und 4′-Häq und β-CH₂), 4,13 (1H, dd, J=8 und 4,5, a-CH), 5,02 (1H, d, J=3, 1′′-H), 5,28 (1H, d, J=3,5, 1′-H).

Analyse für C₂₂H₄₃N₅O₁₂ · 1/2 MeOH · 2 H₂O:

ber.:
C 43,47, H 7,95, N 11,27%
gef.:	C 43,69, H 7,92, N 10,91%

Claims (6)

1. Polysilylierte Aminoglykoside mit 2 bis 10 Silylgruppen, erhältlich durch Silylierung eines Aminoglycosids der Formel worin R² für einen Hexopyranosylring der Formel steht, worin R⁶ Wasserstoff oder CH₃, R⁷ Wasserstoff oder CH₃, R⁸ OH oder NH₂, R⁹ Wasserstoff oder OH und R¹⁰ Wasserstoff oder OH bedeuten;
R³ für einen Hexopyranosylring der Formeln steht, worin R¹¹ Wasserstoff oder CH₃ bedeutet;
R⁵ für Wasserstoff oder OH steht; und
R⁴ für Wasserstoff, OH oder einen Pentofuranosylring der Formeln IX oder X steht: worin R¹² für Wasserstoff oder einen Hexopyranosylring der Formeln XI oder XII steht worin R¹³ Wasserstoff oder α-D-Mannopyranosyl bedeutet;
wobei Voraussetzung ist, daß wenn R³ nicht Wasserstoff bedeutet, einer der Reste R⁴ und R⁵ für Wasserstoff steht und der andere OH bedeutet; und wobei weiterhin Voraussetzung ist, daß wenn R³ für Wasserstoff steht, R⁵ Wasserstoff bedeutet und R⁴ für einen Pentofuranosylring der Formel IX oder X steht;
wobei das polysilylierte Aminoglycosid gegebenenfalls 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist.

2. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß Anspruch 1 mit einer durchschnittlichen Anzahl von 3 bis 8 Silylgruppen pro Molekül.

3. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die Silylgruppen Trimethylsilylgruppen sind.

4. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminoblockierungsgruppen die Carbobenzyloxy- oder Trifluoracetylgruppe sind.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoglycosid der allgemeinen Formel XIV: worin R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, in an sich bekannter Weise silyliert, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Silylierungskatalysators.

6. Verfahren zur Herstellung von 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy- alkanoyl]-aminoglycosid-Antibiotika der allgemeinen Formel I: oder pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze davon,
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet und
R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein polysilyiertes Aminoglycosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel XIII: worin B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt; und anschließend alle Blockierungsgruppen entfernt.