DE2741431C3

DE2741431C3 - l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C, l-N-(L-4-Amino-2hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C und deren Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibakterielle Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE2741431C3
Application number: DE2741431A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Yokohama Kondo; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-10-12
Filing date: 1977-09-14
Publication date: 1979-10-25
Also published as: FR2367775B1; FR2367775A1; JPS5346940A; JPS6043356B2; DE2741431A1; DE2741431B2; GB1567560A; CA1081693A

Description

A) die 1-Aminogruppe von 3'-Desoxykanamin-C oder 3',4'-Didesoxykanamycin-C durch Umsetzung mit einem an der Aminogruppe geschütz-

ten Derivat von L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure oder einem funktionellen Äquivalent hiervon acyliert,

B) die Aminoschutzgruppe aus dem erhaltenen

1-N-Acylierungsprodukt abspaltet und

C) die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt

3. Antibakterielle Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit üblichen Trägern und Verdünnungsmitteln enthalten.

Die Erfindung betrifft

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C,

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C

und deren Säureadditionssalze, eia Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende antibakterielle Zusammensetzungen.

Es ist bereits bekannt, daß Butirosin-B, d. h. 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-ribostamycin nach einer Fei mentationsmethode hergestellt werden kann, siehe Tetrahedron Letters, 28 (1971), S. 2617-2620 und daß l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von Kanamycin-A und Kanamycin-B synthesiert wurden, siehe US-PS 37 81 268. l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von einigen anderen Aminoglycosid-Antibiotika wurden ebenfalls synthesiert, siehe britische Patentschrift 14 26 908. Weiterhin wurden Desoxyderivate von Kanamycinen ebenfalls auf der Grundlage der früheren Entdeckungen synthesiert, welche von H. U m e ζ a w a et. al. hinsichtlich des Resistensmechanismus von Bakterien gegenüber Aminoglycosid-Antibiotika als Folge der verschiedenen, inaktivierenden, von den resistenten Bakterien erzeugten Enzymen erhalten wurden. Bleispielsweise wurden 3',4'-Didesoxykanamycin-B und 3'-Desoxykanamycin-B synthesiert, welche gegenüber den resistenten, Aminoglycosid-3'-phosphotransferase erzeugenden Bakterien aktiv sind, siehe US-PS 37 53 973 und 39 29 762 und H. Umezawa »Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry«, 30 (1974), S. 183 und »Drug Action and Drug Resistance in Bacertia«, 2 (1975), S. 211.3',4'-Didesoxykanamycin-B wurde bei der therapeutischen Behandlung von Infektionen, welche durch eine Vielzahl von resistenten Bakterien einschließlich Pseudomonas aeruginosa verursacht wurden, weitverbreitet eingesetzt. Jedoch wurde gefunden, daß diese Desoxyderivate von K.anamycin-B das Wachstum von solchen resistenten Bakterien nicht hemmen, welche zur Erzeugung von Aminoglycodid-e'-acetyltransferase und 2"-Nucleotidyltransferase in der Lage sind. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen gelang es der Anmelderin, die 6'-Aminogruppe von Kanamycin-B oder dessen Desoxyderivaten synthetisch in die Hydroxylgruppe umzuwandeln und dadurch Kanamycin-C und dessen Desoxyderivate herzustellen, welche durch die 6'-Acetyltransferase selbstverständlich nicht inaktiviert werden können, siehe DE-OS 27 24 597.
Jedoch sind auf diese Weise erhaltenes Kanamycin-C, 3'-Desoxykanamycin-C und 3',4'-Didesoxykanamycin-C nicht in der Lage, das Wachstum von solchen resistenten Bakterien zu hemmen, welche 2"-Nucleotidyltransferase erzeugen.

Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung solcher neuen Kanamycin-Derivate, welche von Natur aus nicht durch die stark in einer Vielzahl der aminoglycosidresistenten Bakterien vorkommenden 3'-Phosphotransferase inaktiviert werden können, und die ebenfalls nicht durch die 6'-Acetyltransferase und die 2"-Nucleotidyltransferase inaktiviert werden können, so daß die neuen Verbindungen nicht nur gegenüber den Aminoglycosidresistenten, 3'-Phosphotransferase erzeugenden Bakterien aktiv sind, sondern auch gegenüber den 6'-Acetyltransferase erzeugenden, aminoglycosidresistenten Bakterien und den 2"-Nucleotidyltransferase erzeugenden, aminoglycosidresistenten Bakterien aktiv sind und die dennoch eine sehr geringe Toxizität aufweisen, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Kanamycin-C-Derivate, das in einfacher Weise und mit vernünftiger Wirksamkeit durchgeführt werden kann.

Aufgrund von Untersuchungen der Anmelderin wurde nun gefunden, daß l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von 3'-Desoxykanamycin-C und 3', 4'-Didesoxykanamycin-C sowie deren Säureadditionssalze gegenüber einer großen Vielzahl von aminoglycosidresistenten Bakterien einschließlich den 2"-Nucleotidyltransferase erzeugenden Bakterien aktiv sind.

3 4

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die folgende allgemeine Formel:

CH₂OH
HO

CO

(L) CHOH CH₂ CH₂NH₂

worin im Falle des 3'-DesoxykanamycinC-Derivates R₁ ein Wasserstoffatoin und R₂ eine Hydroxylgruppe sind, und im Fall des 3',4'-DidesoxykanamycinC-Derivates Ri und R2 jeweils Wasserstoffatome bedeuten.

Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen sind wie folgt:

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C ist eine Substanz in Form eines farblosen Pulvers mit keinem definierten Schmelzpunkt, welche sich jedoch bei 151 —160° C zersetzt. Es zeigt eine spezifische, optische Drehung [a]|⁷ +83° (c=l, Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für

C₂₂H₄₃N₅O₁₂ · H₂O

überein (C = 44,96%; H = 7,72%; N = 11,92%). Diese Substanz ergibt einen einzigen, gegenüber Ninhydrin positiven Fleck bei Rf = 0,22 bei der zuvor genannten Dünnschichtchromatographie auf Kieselerdegel und der Entwicklung mit Butanol-Aethanol-Chloroform ■ 17%igern wäßrigem Ammoniak (4 :5 : 2 :8 in Volumen) als Entwicklerlösungsmittel und bei Rf = 0,24 bei der gleichen Dünnschichtchromatographie und Entwicklung mit Chloroform-Methanol-28%igem wäßrigem Ammoniak (1 :4 :2 in Volumen).

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C ist ebenfalls eine Substanz in Form eines farblosen Pulvers mit keinem definierten Schmelzpunkt, welche sich jedoch bei 142—158°C zersetzt. Es zeigt eine spezifische, optische Drehung [α]!" +76° (c = 1, Wasser). Seine Elernentaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für C22H43N5O11 · H2O überein (C = 46,22%; H = 7,94%; N = 12,25%). Es ergibt einen einzigen, gegenüber Ninhydrin positiven Fleck bei Rf = 0.31 bei der zuvor genannten Dünnschichtchromatographie auf Kieselerdegel und der Entwicklung mit dem zuerst genannten Entwicklerlösungsmittel und bei Rf = 0,30 bei der gleichen Dünnschichtchromatographie und der Entwicklung mit dem als zweiten genannten Entwicklerlösungsmittel. Die Molekülstruktür dieser neuen Kanamycin-C-derivate wurde durch Säurehydrolyse und durch die Absorptionsspektren der kernmagnetischen Resonanz von ¹H und ¹³C identifiziert.
Die minomalen Hemmkonzentrationen ^g/ml) von 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C (im folgenden als AHB-DKC abgekürzt) und von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C (im folgenden abgekürzt als AHB-DDKC) gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der Reihenverdünnungsmethode auf Nähragarmedium bei 37°C bestimmt, wobei die Abschätzung nach einer Inkubation von 18 Stunden durchgeführt wurde. Zum Vergleich wurden ebenfalls die minomalen Hemmkonzentrationen von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-A (Amikacin) in der gleichen, zuvor beschriebenen Weise bestimmt

Die antibakteriellen Spektren dieser Substanzen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Minimale Hemmkonzentrationen in [ig/m\	AHB-DKC	AHB-DDKC	Amikacin
	6,25	12,5	(Vergleich)
Test-Organismen	12,5	6,25
Staphylococcus aureus FDA 209P	6,25	12,5	0,39
Mycobacterium smegmatis ATCC 607	6,25	12,5	<0,20
Escherichia coli NIHJ	6,25	12,5	0,78
Escherichia coli K-12	6,25	6,25	0,78
Escherichia coli K-12 R5		0,39
Escherichia coli K-12 ML 1629		0,78

Fortsetzung

Minimale Heramkonzentrationen in [/g/ml	AHB-DKC	AHB-DDKC	Amikacin
	12,5	12,5	(Vergleich)
Test-Organismen	6,25	25
Escherichia coli K-12 ML 1630	12,5	25	0,78
Escherichia coli K-12 ML 1410	12,5	12,5	0,78
Escherichia coli K-12 ML 1410 R 81	6,25	6,25	1,56
Escherichia coii LA 290 R55	3,13	12,5	0,78
Escherichia coli LA 290 R56	6,25	12,5	0,39
Escherichia coli LA 290 R64	12,5	25	0,39
Escherichia coli W 677	3,13	6,25	<0,20
Escherichia coli Jr66/W677	6,25	25	1,56
Klebsieila pneumoniae PCI 602	6,25	12,5	0,39
Klebsiella pneumoniae 22 No. 3038	50	100	1,56
Pseudomonas aeruginosa A3	50	100	3,13
Pseudomonas aeruginosa No. 12	50	100	3,13
Pseudomonas aeruginosa TI-13	100	100	3,13
Pseudomonas aeruginosa GN 315	50	100	100
Pseudomonas aeruginosa 99		6,25
Pseudomonas aeruginosa H 11		12,5

Aus der Tabelle I ist ersichtlich, daß die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen das Wachstum von zahlreichen Arten von Bakterienstämmen hemmen. Die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen weisen außerdem eine äußerst niedrige, akute Toxizität bei Tieren und bei Menschen auf. Es wurde abgeschätzt, daß AHB-DKC einen LD₅₀-Wert von mehr als 400 mg/kg bei der intravenösen Injektion bei Mäusen hat. Daher können die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen als chemotherapeutische Mittel zur therapeutischen Behandlung Behandlung von Infektionen welche durch gram-negative und gram-positive Bakterien hervorgerufen werden, eingesetzt werden.

l-N-(L-4-Arnino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-A
(Amikacin) und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-B wurden von Kawaguchi et. al., US-Patentschrift 37 81 268, synthesiert, und diese bekannten Verbindungen werden durch eine 6'-Acetyltransferase acetyliert, w-.ilche aus aminoglycosidresistenten Stämmen wie Pseudomonas aeruginosa GN 315, siehe M. Yagisawa et. al., J. Antibiot, 28 (1975), S. 486, erhalten wurde, und in dieser Hinsicht unterscheiden sie sich von den neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen, welche durch die 6'-Acetyltransferase nicht inaktiviert werden.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht in die Form eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes umgewandelt werden, z. B. in das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Ascorbat, Methansulfonat, Äthansulfonat und dergleichen, und zwar durch Umsetzung der freien Base in Form des 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivates von

3'-Desoxykanamycin-C oder 3',4'-Didesoxykanamycin-C mit der geeigneten Säure in wäßrigem Medium. Die neuen, erfindungsgemäßen Kanamycin-C-verbindungen und ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intramuskulär unter Anwendung einer beliebigen, auf dem Fachgebiet an sich bekannten, pharmazeutischen Form für eine solche Applikation und in ähnlicher Weise wie die bekannten Kanamycine appliziert werden. Beispielsweise können die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen oral unter Benutzung einer beliebigen, pharmazeutischen, an sich bekannten Form für die orale Applikation appliziert werden. Beispiele der pharmazeutischen Formen für die orale Applikation sind Pulver, Kapseln, Tabletten, Sirup und dergleichen. Eine geeignete Dosierung der neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen zur effektiven Behandlung von bakteriellen Infektionen liegt in einem Bereich von 0,5 bis 4 g pro Person pro Tag bei der oralen Gabe. Es wird bevorzugt, daß diese Dosierung oral in drei oder vier Teilmengen pro Tag appliziert wird. Die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls durch intramuskuläre Injektion in einer Dosismenge von 200 bis 2000 mg pro Person zweimal bis viermal pro Tag appliziert werden. Darüber hinaus können die neuen, erfindungsgemäßen Verbindüngen zu einer Salbe für den äußeren Auftrag, welche die aktive Verbindung in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% in Verbindung mit einer bekannten Salbengrundlage wie Polyäthylenglykol enthält, formuliert werden. Darüber hinaus sind die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen zur Sterilisation von chirurgischen Instrumenten brauchbar.

Die Erfindung betrifft weiterhin antibakterielle Zusammensetzungen welche

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-

3'-desoxykanamycin-C oder

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C

oder ein Säureadditionssalz hiervon in einer antibakteriell wirksamen Menge zur Hemmung des Wachstums von Bakterien in Kombination mit einem Träger oder Verdünnungsmittel für den aktiven Inhaltsstoff enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur

Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, das" dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Stufen umfaßt:

Acylierung der 1-Aminogruppe von 3'-Desoxykanamycin-C oder 3',4'-Didesoxykanamycin-C durch Reaktion mit einem an der Aminogruppe geschützten Derivat von L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder einem funktioneilen Äquivalent hiervon in an sich bekannter Weise unter Bildung des 1-N-Acylierungsproduktes der Ausgangsverbindung und Entfernung der Aminoschutzgruppe aus dem erhaltenen 1-N-Acylierungsprodukt in an sich bekannter Weise.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann als weitere Stufe die Umsetzung der so erhaltenen Verbindung in Form der Base mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure zur Bildung des entsprechenden, pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes umfassen.

Schutzgruppe für die L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure kann eine einwertige Aminoschutzgruppe wie eine Alkyloxycarbonyl-, Cycloalkyloxycarbonyl- oder Aralkyloxycarbonylgruppe sein oder eine zweiwertige Aminoschutzgruppe wie eine Phthaloylgruppe oder eine Schiffsche Basengruppe der Formel N =CHR sein, worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe wie die Phenylgruppe ist.

Bei solchen Arninoschutzgruppen handelt es sich um bekannte Aminoschutzgruppen, wie sie üblicherweise bei der konventionellen Synthese von Peptiden verwendet werden. Jedoch muß die eingesetzte Aminoschutzgruppe so beschaffen sein, daß sie leicht auf eine solche Weise und unter solchen Reaktionsbedingungen entfernt werden kann, welche die zwischen dem L-4-Amino-2-hydroxybutyrylsubstituenten und der 1-Aminogruppe der aminoglycosidischen Einheit des erhaltenen Acylierungsprodukts vorhandene Aminobindung nicht aulbrechen, wi nn die Entfernung der Aminoschutzgruppe aus dem 1-N-Aminoalkanoyl-substituenten des Acylierungsprodukts durchgeführt wird.

Die Einführung der Aminoschutzgruppe in die L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure kann durch Umsetzung der Säure mit einem geeigneten Reagens zur Einführung der Aminoschutzgruppe, welche in Form eines Säurehalogenids. eines Säureazids, eines aktiven Esters oder eines Säureanhydrids vorliegt, erreicht werden, wie dies beispielsweise in den US-PS 39 29 762 und 39 39 143 sowie in der GB-PS 14 26 908 beschrieben ist.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Ausgangsverbidnungen 3'-Desoxykanamycin-C und 3'.4'-Didesoxykanamycin-C sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung sind in in der DE-OS 27 24 597 beschrieben.

Die Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann im allgemeinen so durchgeführt werden, wie dies in der GB-PS 14 26 908 oder der US-PS 40 01 208 beschrieben ist

Das hierbei erhaltene Acylierungsprodukt liegt in Form der gemischten Acylierungsprodukte vor, welche das gewünschte l-N-(L-4-geschützte Amino-2-hydroxybutyryl)-derivat wie auch die nichtgewünschten übrigen mono-N-acylierten, di-N-acylierten und poly-N-acylierten Produkte umfassen, in denen eine oder mehrere der 1-Amino-, 3-Amino-, 2'-Amino- und möglicherweise 3"-Aminogruppen der Kanamycin-C-Einheit acyliert sind. Das Acylierungsprodukt, d.h. das Gemisch der Acylierungsprodukte, kann als solches direkt in der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Entfernung der Aminoschutzgruppe behandelt werden, wobei dies in für die Peptidsynthese an sich bekannter Weise durchgeführt wird. Alle Aminoschutzgruppen der zuvor genannten Art können leicht durch schwache Säurehydrolyse unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure oder Essigsäure oder verdünnter Salzsäure durchgeführt werden. Wenn die Aminoschutzgruppe eine Aralkyloxycarbonylgruppe ist, kann diese ebenfalls durch gewöhnliche Hydrogenolyse entfernt werden.

Das in der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene, von den Schutzgruppen befreite Acylierungsprodukt liegt ebenfalls in Form der gemischten Produkte vor, wobei diese das gewünschte 1-N-Acylierup.gsprodukt wie auch in anderer Weise acylierte Derivate der Ausgangskanamycin-C-Verbindung zusammen mit nicht-umgesetzter Ausgangs-kanamycin-C-verbindung enthalten. Zur Isolierung des gewünschten 1-N-Acylierungsprodukts aus den gemischten Produkten kann eine chromatografische Trennung durchgeführt werden, z. B. eine lonenaustauscherchromatografie unter Verwendung eines Carboxylfunktionen enthaltenden Kationenaustauscherharzes und Carboxymethylcellulose oder durch lonenaustauscherchromatografie unter Verwendung eines starken Anionenaustauscherharzes oder durch Säulenchromatografie unter Verwendung von Kieselerdegel. Auf diese Weise kann die Isolierung und Gewinnung des gewünschten Produktes mit hoher Wirksamkeit erreicht werden. Bei der Chromatografie und Verwendung eines schwachen, Carboxylfunktionen enthaltenden Kationenaustauscherharzes wird verdünntes, wäßriges Ammoniak als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Hierbei ist es möglich, sowohl die gewünschten Endprodukte als auch nicht-umgesetzte Ausgangs-kanamycin-C-verbindung in wirksamer Weise und in reinem Zustand zu gewinnen. Je nach der angewandten, chromatografischen Methode wird das gewünschte Kanamycin-C-derivat in Form seiner freien Base, des Hydrates oder des Carbonates gewonnen.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Synthese von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C

Eine Lösung von 440 mg (0,92 mMol) der freien Base 3'-Desoxykanamycin-C (Hemihydrat). in 8,8 ml Wasser wurden auf pH = 6,60 durch Zugabe von 2,75 ml IN Salzsäure eingestellt Zu der erhaltenen Lösung wurde tropfenweise während 10 Minuten eine Lösung von 449 mg (1,42 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von L^-tert-Butoxycarbonylamino^-hydroxybuttersäure in 4,7 ml Dimethylformamid bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugesetzt Die so erhaltene Mischung wurde weitere 6 Stunden bei Umgebungstemperatur zur Herbeiführung der Acylierung gerührt Die Reaktionslösung, welche das so gebildete l-N-(L-4-tert-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C enthielt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde mit 11 ml einer wäßrigen Lösung von 90%iger Trifluoressigsäure vermischt und das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur zur Durchführung der Entfernung der tert-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe gerührt Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde

zweimal mit 20 m! Äthyläther gewaschen, wobei 2,12 g eines rohen Produktes von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C als farbloses Pulver erhalten wurden.

Dieses rohe Produkt wurde in 15 ml Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf pH 7,8 durch Zugabe von IN wäßrigem Ammoniak eingestellt, und dann durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm mit 220 ml Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharz in der NH-i-Form zur Durchführung der Adsorption des gewünschten Produktes geschickt. Nachdem die Säule mit 1040 ml Wasser gewaschen worden war, wurde sie mit 1340 ml 0,2 N wäßrigem Ammoniak und dann mit !32Om! 0,5 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 71—80 des unter Verwendung von 0,2N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluats wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 149 mg von nicht-umgesetztem 3'-DesGxykanarnycin-C {Ausbeute der Gewinnung 34%) wiedergewonnen wurden. Die Fraktionen 134—145 des unter Verwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluats wurden ebenfalls miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei 155 mg eines farblosen, das gewünschte Produkt enthallenden Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 2 ml eines Mischlösungsmittels aus Chloroform-Äthanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (1 :4 :2 in Volumen) suspendiert, und die so erhaltene Suspension wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm mit 25 g Kieselerdege! hinduichgeschickt, diese wurde mit den zuvor genannten Mischlösungsmitteln anschließend entwikkelt. Die abgegebene Flüssigkeit wurde in 3,2-ml-Fraktionen gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 99—140 wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und in einer Säule von 5 ml eines Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes in der NH₄-Form unter Verwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Es wurde l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 46 mg = 8,5% erhalten. Dieses Pulver besaß keinen definierten Schmelzpunkt, sondern zersetzte sich bei 151-160⁰C. [«]'„' +83° (c = 1, Wasser).

Beispiel 2

Synthese von i-N-(L-4-Aiiiifiü-2-iiyuruxybuiyry!)-3',4'-didesoxykanamycin-C

Eine Lösung von 340 mg (0,74 mMol) der freien Base 3\4'-Didesoxykanamycin-C(Hemihydrat) in 7,5 ml Wasser wurde auf pH = 6,70 durch Zugabe von 2,45 ml 1N Salzsäure eingestellt Zu dieser Lösung wurde tropfenweise während 5 Minuten eine Lösung von 373 mg (1,18 mMo!) des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4-tert-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure in 3,75 ml Dimethylformamid bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde weiter während 6 Stunden zur Herbeiführung der Acylierung gerührt. Die das so gebildete l-N-(L-4-tert.-

Butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C enthaltene Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde mit 8,5 ml einer wäßrigen Lösung von 90%iger Trifluoressigsäure vermischt. Das Gemisch wurde während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur zur Herbeiführung der Entfernung der tert.-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde zweimal mit 20 ml Äthyläther gewaschen, wobei 1,46 g eines rohen Produktes von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C als farbloses Pulver erhalten wurden.

Dieses rohe Produkt wurde in 14 ml Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf pH 7,8 durch Zugabe von IN wäßrigem Ammoniak eingestellt. Die Lösung wurde dann durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm mit 220 ml Carboxylgruppen aufweisendem Kaiionenaustauscherharz in der NH-i-Form zur Adsorption der aktiven Verbindungen hindurchgeschickt. Nachdem die Säule mit 1040 ml Wasser gewaschen worden war, wurde sie mit 1560 ml 0,2 N wäßrigem Ammoniak und dann mit 1460 ml 0,5N wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei das Eluat in 20-ml-Fraktionen aufgefangen wurde. Die Fraktionen 74—93 des mit 0,2N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 143 mg von nicht umgesetztem 3',4'-Didesoxykanamycin-C (Ausbeute der Gewinnung 45%) wiedergewonnen wurden. Die Fraktionen 152—168 des mitO,5N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden ebenfalls miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 116 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches das gewünschte Produkt enthielt.

Dieses Pulver wurde in 2 ml eines Mischlösungsmittels aus Chloroform-Äthanol- 17%igem wäßrigem Ammoniak (1 :4 :2 in Volumen) suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde auf eine Säule mit einem innendurchmesser von 10 mm von 25 g Kieselerdegel aufgegeben, diese wurde dann mit dem zuvor genannten Mischlösungsmittel eluiert. Die abgegebene Flüssigkeit wurde in 3,2-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 71—96 wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde in einer Säule von 5 ml Carboxylgruppen aufweisendem Kationenaustauscherharz in der NH4-Form in der gleichen Weise wie zuvor unter Verwendung von 0,5 N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 35 mg l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 8,3% erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte keinen definierten Schmelzpunkt, sondern zersetzte sich bei 142—158°C.
[a] g>+76° (c = !,Wasser).

Claims

Patentansprüche:

1.1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-desoxykanamycin-C,
l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-didesoxykanamycin-C
und deren Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise