DE2512587A1

DE2512587A1 - Kanamycinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE2512587A1
Application number: DE19752512587
Authority: DE
Inventors: Shinichi Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-03-22
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1975-09-25
Also published as: GB1499041A; FR2264556B1; FR2264556A1; DE2512587B2; JPS5512039B2; DE2512587C3; JPS50140420A

Description

ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI No. 14-23, 3-chome, Kamiosaki,Shinagawa-ku, Tokyo, Japan

Kanamycinderxvate, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Mittel

Die Erfindung betrifft neue, wertvolle Kanamycinderivate, nämlich l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^f-N-alky!kanamycine, und ihre pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie entl^ltende pharmazeutische Mittel.

Kanamycin (worunter nachfolgend, wenn nichts anderes angegeben ist, Kanamycin A zu verstehen ist) ist ein bekanntes aminoglycosidisches Antibiotikum, das in großem Umfange als wortvolles antibakterielles Agens verwendet wird. In den letzten Jahren wurden jedoch unglücklicherweise einige

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gegen Kanamycin resistente Stämme gefunden und man ist seither eifrig bemüht, den Resistenzmechanismus bei diesen gegen Kanamycin resistenten Stämmen zu untersuchen.

Es wurde festgestellt, daß einige Stämme von gramnegativen Bakterien, die den R-Faktor tragen, der Familien Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, die bei Patienten isoliert wurden, gegen Kanamycin resistent sind. Bei der genauen Untersuchung des Resistenzmechanismus wurde gefunden, daß diese resistenten Stämme Phosphotransferasen, welche die 3'-Hydroxylgruppe von Kanamycin phosphorylieren können, eine Mucleotidyltransferase,dfedLe 2"~Hydroxylgruppe von Kanamycin nucleotidylieren kann,oder Acetyltransferasen, welche die 6'-Aminogruppe von Kanamycin acetylieren können, bilden, so daß diese Transferasen das Kanamycin inaktivieren. Daraufhin wurden die verschiedensten Kanamycinderivate hergestellt und getestet, um die Beziehung zwischen ihren Strukturen und ihren antibakteriellen Wirksamkeiten zu untersuchen. Dabei ist es gelungen, neue Kanamycinderivate zu finden, die eine verbesserte antibakterielle Wirksamkeit (Aktivität) selbst gegenüber den verschiedenen Arten von gegen Kanamycin resistenten Stämmen aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind die neuen Kanamycinderivate 1 -H- (L--4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6' -N-alkylkanamycine der al - gardinen Formel

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„ 6"

^H2^N 3"

H₀HCh₀-CH₀CHCOHS
2 d d_x _

OH

CH₀NHR

worin R eine niedere Alkylgruppe, insbesondere eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, speziell eine Methyl- oder Äthylgruppe,bedeutet, und ihre pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze.

Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat, Äthansulfonat und dgl.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methy!kanamycin (nachfolgend abgekürzt mit "Ι-ΑΗΒ-β'-ΜΚΜ") und 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-äthylkanamycin (nachfolgend abgekürzt mit "l-AHB-e'-EKM'^haben die folgenden Eigenschaften;

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Die Verbindung l-AHB-6'-MKM liegt in Form eines weißen

Pu
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kristallinen Pulvers vor, das sich bei 169 bis 173 C

7 J Λ

zersetzt, [oc]_n = + 78 (c = 1, in Wasser).Sie entspricht der empirischen Formel C₀₀HZr-NcO₁₀, wie ihre Elementarana-

23 45 5 13

lyse gezeigt hat. Diese Verbindung ergibt bei der Dünnschicht Chromatographie (TLC) auf Silicagel unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform/Methanol/28%igem wässrigemAmmoniak/-Wasser (1:4:2:1, bezogen auf das Volumen) als Entwicklungslösungsmittel bei Rf =0,13 einen einzelnen Fleck, der positiv gegenüber der Ninhydrin-Reaktion ist.

Die Verbindung l-AHB-6'-EKM liegt in Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 184 bis 188 C zersetzt, [α] - + 80 (c- 1, in Wasser). Sie entspricht der empirischen Formel Cu,H,₇Nr0,„, wie ihre Elementaranalyse zeigte. Diese Verbindung ergibt bei der TLC an Silicagel unter Verwendung der gleichen Lösungsmittelmischung wie oben bei Rf = 0,20 einen einzelnen Fleck, der gegenüber der Ninhydrin-Reaktion positiv ist.

Die Strukturen dieser Verbindungen wurden durch NMR-Spektroskopie und durch Papierchromatographie für die Produkte bestätigt, die 40 Minuten
6nHCl unterworfen wurden.

bestätigt, die 40 Minuten lang bei 100 C einer Hydrolyse in

Diese beiden Verbindungen sind be5.de wenig toxisch, der LD₅₀-Wert beträgt mehr als 200 mg/kg bei intravenöser Verabreichung an Mäuse. Die Verbindungen können bei niedrigen

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Konzentrationen das Wachstum von verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin beständigen Stämme hemmen und sie können daher mit Erfolg zur Behandlung von durch diese Bakterien hervorgerufenen Infektionserkrankungen verwendet werden*

Es wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von l-AHB-6*-MKM und l-AHB-ö'-EKM gegenüber verschiedenen Mikroorganismen nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung eines Agar-Nährmediums bei 37 G bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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untersuchte Mikroorganismen MIC ( ,ug/ml)

l-AHB-6i-MKM 1-AIIB-6' -EKM

Staphylococcus	aureus PDA209P	K-12 R5	22//3038	0.78	I.56
»■Iycobacterium £	smegmatis ATCG607	K-12 MLI629	i'uginosa A3	0.39	3.12
Escherichia coil K-12	K-12 IILI63O	Mo .12	0.39	I.56
tt	K-12 KLl410	TI-13	0.78	1.56
π	LA290 R55	GN315	0.78	3.12
(I	LA290 R56	99 509839/0951	1.56	6.25
!I	LA290 R64	1.56	3.12
ΪΙ	W677	1,56	3.12
Il	JR66/¥677^	0.73	-1.56
It	Klebsieila pneumoniae PCI 602	0.78	1.56
IT	(I	1,56	I.56
)!	Pseudomonas ae:	6.25	25
·(	0,78.	1.56
il	6,25	25
ii	6.25	25
(	3.12	25
12 „5	50
50	100
12. 5	100

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegenüber den 6'-N-Acetyltransferase bildenden Stämmen, wie z. B. Escherichia coli K-12 R5 und Pseudomonas aeruginosa GN315, aktiver (wirksamer) als die in der US-Patentschrift 3 781 beschriebene verwandte Verbindung l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)kanamycin. Es wurde auch gefunden, daß diese Verbindungen durch eine durch Pseudomonas aeruginosa GN315 gebildete 6'-N-Acety!transferase im wesentlichen nicht acetyliert werden. Eine andere verwandte Verbindung, das in der britischen Patentschrit 1 384 221 beschriebene 6'-N-Methylkanamycin, ist nicht in der Lage, das Wachstum der gegen Kanamycin resistenten Stämme, wie z. B. Escherichia coli K-12 ML 1629, K-12 ML 1630 und JR66/W677, Klebsieila pneunomiae 22^3038, Pseudomonas aeruginosa TI-13 und GN315, die 3'-Phosphotransferasen und 2"~Nucleotidyltransferasen bilden, zu hemmen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Behandlung von verschiedenen Infektionen, die durch Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hervorgerufen werden, oral oder parenteral,beispielsweise durch intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind höchst wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen, wenn sie parenteral verabreicht werden. Sie eignen sich auch für die Sterilisierung des Körperinnern (der Eingeweide) durch orale Verabreichung und für die chirurgische Sterilisierung durch mechanische Reinigung,

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Es wurde gefunden, daß sie bei subkutaner Verabreichung in einer Dosis von mehr als 2 mg/kg gegenüber bei Mäusen durch Staphylococcus aureus Smith und Klebsiella pneuraoniae S-1802 künstlich hervorgerufenen Infektionen wirksam sind.

Für die parenterale Verabreichung können sie in üblichen Dosierungsformen, beispielsweise in Form von sterilisierten wässrigen Lösungen und physiologischen Kochsalzlösungen, verwendet werden. Bei der parenteralen Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 200 bis 2000 mg, die in 2 bis 4 Teildosen pro Tag verabreicht werden kann.

Für die orale Verabreichung können sie in konventionellen, bekannten Dosierungsformen verwendet werden, beispielsweise in Form von Pulvern, Kapseln, Tabletten, Suppositorien, Sirupen und dgl. Bei der oralen Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 500 bis 2500 mg.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der oben angegebenen Formel I können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, bei dem man von Kanamycin der Formel ausgeht

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das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die 1-Aminogruppe des Kanamycins mit L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder einem funktioneIlen Äquivalent davon acyliert und die 6'-Aminogruppe des Kanamycins auf an sich bekannte Weise alkyliert.

Die Alkylierung kann der Acylierung folgen oder ihr vorausgehen. Das als Ausgangsmaterial verwendete Kanamycin weist 4 Aminogruppen in einem Molekül auf. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen dürfen ein Teil oder alle Aminogruppen nicht reagieren und erforderlichenfalls sollten die in dem Kanamycirunolekül vorhandenen Hydroxylgruppen vorher auf an,sich bekannte Weise mit Schutzgruppen blockiert werden.

Bei einer /usführ-ungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein Teil oder alle 3 Aminogruppen außer der 1-Aminogruppe des Kanamycins mit bekannten Aminoschutzgruppen blockiert und das so gebildete Derivat mit den blockierten Aminogruppen wird mit L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder einem entsprechenden funktioneilen Äquivalent davon, bei-

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- ίο -

spielsweise einem Säurehalogenid, einem Säureanhydrid oder einem aktiven Ester, umgesetzt, um die 1- Amino -Gruppe zu acylieren. Das Acylierungsprodukt wird dann einer 6'-N-Alkylierung unterworfen.Alternativ kann man bei dem Verfahren von einem vorher hergestellten 6^f-N-Alkylkanamycin (vgl. die britische Patentschrift 1 384 221) ausgehen, bei dem ein Teil oder alle 3- und 3"-Aminogruppen und die 6'-Alkylaminogruppe des Alky!kanamycins mit einer oder mehreren bekannten Aminoschutzgruppen blockiert ist (sind)_iund das blockierte Derivat wird auf die gleiche Weise wie oben acyliert unter Bildung der 1-acylierten Verbindung, woran sich keine 6^f-N-Alkylierung mehr anschließt.

Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein Teil oder alle 3 Aminogruppen außer der 6'-Aminogruppe des Kanamycins mit bekannten Aminoschutzgruppen blockiert und das auf diese Weise gebildete Derivat mit den blockierten Aminogruppen wird einer 6'-N-Alkylierung unterworfen. Das Alkylierungsprodukt wird dann mit einem l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybuty.ryl)- Best acyliert. Bei aner alternativen Ausführungsform geht man von einem vorher hergestellten l~N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)kanamycin aus, bei dem in gleicher Weise eine oder beide 3- und 3"-Aminogruppen blockiert wird (werden), und das Derivat mit der (den) blockierten Aminogruppe(n) wird alkyliert unter Bildung des 6~N-Alkylierungsproduktes, das anschließend nicht acyliert zu werden braucht.

Bei jeder der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen

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können die Aminoschutzgruppen aus dem so erhaltenen Produkt, welches die l-N-Acyl-6¹-N-alky!gruppe aufweist, auf an sich bekannte,übliche Weise entfernt v/erden unter Bildung der gewünschten Verbindung l~N-(L-4~Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycin.

Geeignete Beispiele für die Aminoschutzgruppe,ihre Einführung und Entfernung sind allgemein in dem zusammenfassenden Artikel von Y. Wolman in "The Chemistry of the Amino Group" Seiten 669 bis 700, Interscience Publishers, 1968, und von J. W. Barton in "Protective Groups in Organic Chemistry" Seiten 43 bis 94, Plenum Press, 1973, zu finden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nur die ö'-Aminogruppe des Kanamycins, die unter den 4 Aminogruppen die reaktionsfähigste ist, mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert und das auf diese Weise gebildete blockierte Derivat wird dann mit einem Derivat der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure mit geschützer Aminogruppe oder einem funktionellen Äquivalent davon acyliert unter Bildung des gewünschten 1-N-monoacylierten Derivats und der beiden monoacylierten Derivate als Nebenprodukt. Ohne diese 3 monoacylierten Derivate (Positionsisomere) voneinander zu trennten, werden die restlichen freien Aminogruppen jedes dieser Derivate mit üblichen, bekannten Aminoschutzgruppen blockiert, die jedoch von der zum Blockieren der ö'-Aminogruppe verwendeten verschieden sind. Anschließend wird nur die 6'-Aminoschutzgruppe selektiv aus den Derivaten entfernt, danach wird alkyliert unter Bildung des 6'-N-Alky-

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lierungsproduktes, aus dem die restlichen Aminoschutzgruppen dann entfernt werden. Aus der Reaktionsmischung, welche die so gebildeten Positionsisomeren enthält, kann die erfindungsgemäße Verbindung l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alky!kanamycin bequem, beispielsweise nach e-iner chromatographischen Methode, wie sie nachfolgend näher beschrieben wird, isoliert werden.

Bei den oben in Verbindung mit dem erf indungsgemäßen Verfahren erwähnten Aminoschutzgruppen kann es sich um solche handeln, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Peptiden verwendet werden, und sie können auf übliche Weise eingeführt werden, obgleich es bevorzugt ist,solche Aminoschutzgruppen zu verwenden, die mit einer guten Reaktionsausbeute gegebenenfalls leicht entfernt werden können.

Beispiele für Aminoschutzgruppen die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind eine Alkyloxycarbonylgruppe, wie Äthoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl; eine Cyclo'alkyloxycarbonylgruppe, z. B. Cyclopentyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und eine Aralkyloxycarbonylgruppe, z. B. Benzyloxycarbonyl und p-Nitrobenzyloxycarbonyl. Zur Herstellung von blockierten Derivaten in Form einer Schiffschen Base kann eine divalenlze Amino schutz gruppe, wie z. B. eine Salicylidengruppe, verwendet werden. Vorzugsweise werden 2 oder mehr verschiedene Aminoschutzgruppen verwendet, die selektiv und unabhängig voneinander im Verlaufe von verschiedenen Reaktionen entfernt werden können. ·

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In bezug auf die Schutzgruppe die zum Blockieren der 6^f-Aminogruppe von Kanamycin verwendet wird, ist es höchst zweckmäßig, eine tert.-Butoxycarbonylgruppe zu verwenden, die vorzugsweise gegenüber der 6'-Aminogruppe reaktiv ist und gegebenenfalls leicht entfernt werden kann. Wenn die 6'-Aminogruppe beispielsweise mit der tert-rButoxycarboriylgruppe blockiert werden soll, wird das Kanamycin in einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Mäthylamin gelöst, dann werden 1 bis 3 Molmengen tert.-Butoxycarbonylazid unter Rühren zugetropft. Die Reaktionsinischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Rückstand wird durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, wie "Amberlite CG5O", gereinigt, wobei man das 6'-N-tert.-Butoxycarbony!kanamycin in einer ziemlich guten Ausbeute erhält, wenn das nicht-umgesetzte Kanamycin für die erneute Verwendung zurückgewonnen werden kann.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zum Acylieren der 1-Aminogruppe des Kanamycins verwendete L~4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder ein funktionelles Derivat davon zweckmäßig in einer solchen Form vorliegen, daß die 4-Aminogruppe des Acylierungsmittels mit einer geeigneten Schutzgruppe blockiert ist, bei der es sich um irgend-eine der oben erwähnten Aminoschutzgruppen handeln kann. Wenn die Hydroxyaminosaure mit 6'-N-tert.Butoxycar~ bon}'· !kanamycin umgesetzt werden soll, wird die Amino schutz« gruppe de j: H/droxyaminosäure vorzugsweise mit einer Schutz-

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gruppe, beispielsweise einer BenzyIoxycarbonylgruppe, blockiert, die bei der Entfernung der 6'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Butoxycarbonylkanamycin nicht frei—gesetzt wird. Die Acylierung der 1-Aminogruppe von Kanamycin mit dem L-4-Amino-2-hydrocybutyryl~Rest kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie es üblicherweise bei der Synthese von Amiden angewendet wird. Bei einer bevorzugten Ausführtmgsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der zuerst das 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin hergestellt wird, kann das Acylierungsmittel vorzugsweise in einer solchen Form verwendet werden, die mit der 1-Aminogruppe des 6'-N-tert.-Butoxycarbony!kanamycins mit hoher Selektivität reagiert, z. B. in Form eines aktiven Esters der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure. Der aktive Ester kann nach irgend—einem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Umsetzung der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure, in welcher die Aminogruppe mit einer Benz3?-loxycarbonylgruppe blockiert worden ist, mit N-Hydroxysuccinimid in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines DehydratLsierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid. 0,5 bis Molmengen des so hergestellten aktiven Esters können mit 6'- N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin in einem wässrigen organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyäthan_fumgesetzt werden»

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Acylierungsprodukt besteht überwiegend aus der gewünschten 1-N-acylier-

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Verbindung und zu einem geringeren Anteil aus den 3-N-acylierten und 3"-N-acylierten Verbindungen als Nebenprodukt. Diese Verbindungen brauchen für die Verwendung in der nachfolgenden Stufe nicht voneinander getrennt zu werden, in der alle in dem Ayclierungsprodukt vorhandenen restlichen freien Aminogruppen mit geeigneten Aminoschutzgruppen, die bei der Entfernung der 6'-N-tert.-Butοxycarbonylgruppe nicht freigesetzt werden, und vorzugsweise mit den gleichen Aminoschutzgruppen, wie sie zum Blockieren der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure verwendet worden sind, z. B. der Benzyloxycarbonylgruppe_>blockiert werden. Die Blockierung der Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden und im allgemeinen wird sie durch Umsetzung mitBenzyloxycarbonylchlorid unter basischen Bedingungen in Wasser oder in einem wässrigen organischen Lösungsmittel durchgeführt.

Das aufdißse Weise erhaltene Benzyloxycarbonylierungsprodukt kann mit einer wässrigen Lösung von Trifluoressigsäure, Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure behandelt werden, um nur die 6'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt selektiv zu entfernen. Das dabei erhaltene Produkt, in dem die 6'-Aminogruppe \iicht mehr blockiert ist, wird einer 6'-N-Alkylierung unterworfen, wobei das gewünschte aminoblockierte Derivat erhalten wird. Die Alkylierung kann auf irgendeine bekannte, übliche Art und Weise durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise durchgeführt durch Umsetzung der G'-Aminogruppe mit einem Aldehyd mit der gleichen An-

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zahl von Kohlenstoffatomen wie die Alkylgruppe_? die eingeführt werden soll, d. h. mit Formaldehyd oder einem Niedrig-alkyl-aldehyd, wie Acetaldehyd, Propionaldehyd, Butyraldehyd, um die Aminogruppe in die Form der Schiffschen Base umzuwandeln, woran sich die normale katalytische Reduktion oder die Reduktion mit Natriumborhydrid anschließt, um sie in die 6^!-N-Alkylaminogruppe zu überführen.

Die Aminoschutzgruppen in dem die i-N-Acyl-6¹-N-alky!gruppe aufweisenden .Produkt, welches das letzte Zwischenprodukt in dem erfindungsgemäßen Verfahren darstellt, können auf übliche Weise daraus entfernt werden. Wenn beispielsweise die Aminoschutzgruppe eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, kann sie nach einem üblichen Verfahren, beispielsweise durch katalytische Reduktion oder durch Behandlung mit Bromwasserstoff/Essigsäure,leicht entfernt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd umgesetzt wird unter Bildung einer Schiffsehen Base, die dann reduziert wird, um die Alkylierung (unter Bildung einer entsprechenden Alkylaminogruppe) wie oben erwähnt zu bewirken, kann diese Reduktion auf katalytische Weise unter Verwendung von Pd-G oder Pt-C durchgeführt werden, wodurch gleichzeitig die Einführung der Alkylgruppe und die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe erzielt werden kann.

Das nach der Entfernung der restlichen Aminoschutzgruppen erhaltene Reaktionspradukt besteht aus der erfindungsgemäßen

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e'-N-Alkyl-l-N-acyl-Verbindung und ihren Positionsisomeren einschließlich der 3-N-Acyl-und 3"-N-Acyl-Verbindungen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem die Isomeren enthaltenden Reaktionsprodukt durch Säulenchromatographie, beispielsweise unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes, wie z, B. "Amberlite IRG5O" und^MCG50ⁿ (hergestellt von der Firma Rohm & Haas Co., U.S.A.) und "CM-Sephadex C-25" (hergestellt von der Firma Pharmacia Co., Schweden))isoliert werden. Das Eluat aus der chromatographischen Säule mit wässrigem Ammoniak wird in Fraktionenmitjeweils einem geringen Volumen gesammelt und jede der Fraktionen wird auf ihre antibakterielle Aktivität hin untersucht. Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus den vereinigten Fraktionen gewonnen werden, die gegenüber einem resistenten Stamm eine höhere antibakterielle Aktivität (Wirksamkeit) aufweisen als üblich*

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Herstellung von l-N^L^-Amino^-hydroxybutyryl)^¹-N-methy!kanamycin

(a) 6'-N-tert.-ButoxycarbonY!kanamycin

20 g (41,3 mMol) Kanamycin wurden i_n 1600 ml einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin (Volumenverhältnis 10:10:1) gelöst, der Lösung wurden dann 5,9 g (41,3 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid zugegeben. Die Reaktionsmischung

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wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Feststoff wurde in Wasser gelöst und die wässrige Lösung wurde durch eine mit einem Kationenaustauscherharz gefüllte 1000 ml-Säule geleitet, das im wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Mischpolymerisat (Handelsprodukt "Amberlite CG50") bestand, um die Butoxycarbonylierungsprodukte an dem Harz zu adsorbieren. Die Säule wurde dann mit 5000 ml Wasser und 5000 ml 0,05n wässrigem Ammoniak gewaschen, dann mit 3000 ml 0,1 η wässrigem Ammoniak eluiert. Die gegenüber der Ninhydrinreaktion und der Rydon-Smith-Reaktion positiven Fraktionen des Eluats und diejenigen Fraktionen, die bei einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese einen einzelnen Fleck ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 10,9 g ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin in Form eines weißen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 202 bis 203 C in einer Ausbeute von 45,3% erhielt. Durch weiteres Eluieren mit 0,3 η wässrigem Ammoniak erhielt man 7,3 g nicht-umgesetztes Kanamycin, Rückgewinnung 36,6%.

(b) Tri-N-benzyloxycarbonyl-mono-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyry1)kanamycin

1,754 g (3 mMol) des obe^ hergestellten 6*-N-tert.Butoxycarbony!kanamycins wurden in einer Mischung aus 12,5 ml Wasser und 12,5 ml Dimethoxyäthan gelöst, dann wurde eine Lösung von 1,156 g (3,3 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der L-4-Benzyloxycarbonylamido-2-hydroxybuttersäure in 25 ml Dimethoxyäthan zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem

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Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene Kondensationsprodukt wurde ohne weitere Reinigung in einer Mischung aus 12,5 ml Wasser und 12,5 ml Aceton gelöst, dazu wurde 1 g (11,9 tnMol) Natriumbicarbonat zugegeben. Die Mischung wurde unter Eiskühlung gerührt, während 1,68 g (9,9 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid zugetropft wurden. Danach wurde die Mischung 1 Stunde lang unter Eiskühlung und weitere 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der dabei erhaltene weiße Nieder schlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen unter Bildung von 3,0 g des Benzyloxycarbonylierungsproduktes in Form eines weißen Pulvers. Dieses Produkt wurde in 75 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wurde I Stunde lang bei Raumtemperatur stehengeIßssen, um die tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt zu entfernen. Die Lösung wurde dann eingeengt, dann wurden 50 ml Äthyläther zugegeben, um die Ausfällung zu bewirken. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Äthyläther gewaschen,wobei man 2,87 g Tri-N-benzyloxycarbony1-mono-N-(L-4-amino-2-hydroxybutyry1)kanamycin in Form eines weißen Pulvers erhielt.

(c) 1-N-(L-4-Amino-2-h^drox^but^r^l)-6'-N-meth^lkanam^cin

575 mg des in der obigen Stufe (b) hergestellten Tri-N-benzyloxycarbonyl-mono-N-(L-4-amino-2-hydroxybutyrylkanamycins wurden in 8 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden 1 ml einer In wässrigen Natriumhydroxidlösung und 0,25 ml einer 37%igen wässrigen Formaldehydlösung zugegeben. 10 Minuten später wurden 222 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehenge-

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lassen und dann zur Trockne eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 7 ml Wasser zugegeben und der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 675 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Letzteres wurde in einer Mischung aus 5 ml Essigsäure, 4 ml Methanol und 1 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4,5 Stunden lang in Gegenwart eines aus 300 mg 5% Pd auf Kohle bestehenden Katalysators Wassers toffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das FiItrat und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 7 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde mit wässrigem Ammoniak auf pH 8,8 bis 9,0 eingestellt und dann durcheine Säule mit 30 ml "Amberlite CG-50" (in der Ammoniumform) laufen gelassen. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser und 150 ml 0,3n wässrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 150 ml 0,5n wässrigem' Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 3 ml-Fraktionen gesammelt und jede der Fraktionen wurde nach einem üblichen Plattenversuchsverfahren auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Bacillus subtilis PCI 219 und gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Escherichia coli JR66/W677 getestet. Die Fraktionen (39 ml), die eine höhere antibakterielle Aktivität gegenüber diesen Stämmen aufwiesen, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 53 mg 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^f-N-methylkanamycin in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 169 bis 173°C, Ausbeute 15 % (bezogen auf 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin).

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Beispiel 2

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^l-N-

äthy !kanamycin _________________

1,13 g des in dem obigen Beispiel 1 (b) hergestellten Tri-N-benzyloxycarbonyl-mono-N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycins wurden in 16 ml Methanol gelöst, dann wurden 1,8 ml einer 2n wässrigen Natriumhydroxidlösung und 0,74 ml einer 90%igen wässrigen Acetaldehydlösung zugegeben. 10 Minuten später wurden 444 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt, danach wurden 25 ml Wasser zugegeben. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 804 mg eines weißen Pulvers erhielt. Das so erhaltene Pulver wurde in eine. Mischung aus 6 ml Essigsäure, 4,8 ml Methanol und 1,2 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde 6,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 400 mg 5% Pd auf Kohle als Katalysator Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde dann abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt, zur Trockne eingedampft und derRückstand wurde in 12 ml Wasser gelöst. Die "Lösung wurde mit wässrigem Ammoniak auf pH %2 eingestellt und durch eine Säule mit 80 ml "Amberlite CG-50" (Ammonium-Form) laufen gelassen. Das Harz in der SäuleA-iürde mit 435 ml Wasser und 384 ml 0,3n wässrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 384 ml 0,5 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 8 ml-Fraktionen gesammelt und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (c) getestet.

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Die aktiven Fraktionen (56 ml) wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei man 92 mg 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^l-N-äthylkanamycin in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 184 bis 188 C, Ausbeute 13 % (bezogen auf 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin).

Patentansprüche;

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Claims

- 23 Patentansprüche

1./ 1-N-(L-4-Amino~2-hydroxybutyryl)-6'-N-alky!kanamycin, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

6"
» CH₂OH₀

'CH₂NHR 6'

h₀nch₀ch₀chcohn\

OH

3^^-llH

(D

worin R eine niedere Alkylgruppe bedeutet, und die pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R eine Methylgruppe

bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R eine Äthylgruppe bedeutet.

4. Verfahren zur Herstellung des l-N-(L-4-Amino~2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die 1-Aminogruppe von

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Kanamycin mit L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder einem funktioneilen Äquivalent davon acyliert und die 6'-Aminogruppe von Kanamycin in an sich bekannter Weise alkyliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylierung nach der Acylierung durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylierung vor der Acylierung durchgeführt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Kanamycin in einer solchen Form verwendet, daß die Aminogruppai des Kanamycins mit Ausnahme der Aminogruppe, die später umgesetzt werden soll, mit Aminoschutzgruppen blockiert sind, wobei letztere nach der Acylierung und Alkylierung" aus dem Reaktionsendprodukt wieder entfernt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminoscnutzgruppen ausgewählt werden aus Alkyloxycarbonyl-, Gycloalkyloxycarbonyl- und Aralkyloxycarbonyl-Gruppen.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminoschutzgruppe die tert.-Butoxycarbonylgruppe verwendet wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure in einer solchen Form verwendet wird,, bei^igr die Aminogruppe der

Hydroxyaminosäure mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminoschutzgruppe die Benzyloxycarbonylgruppe verwendet wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure in Form ihres aktiven Esters verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als aktiver Ester der N-Hydroxysuccinimidester verwendet wird.

14. Verfahren zur Herstellung des l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycins nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man nur die 6'-Aminogruppe mit einerAminoschutzgruppe blockiert, das blockierte Kanamycinderivat mit einem; aktiven Ester der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure, deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe, die von derjenigen verschieden ist, die zum Blockieren der 6'-Aminogruppe verwendet wurde, acyliert, die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktes mit den gleichen Aminoschutzgruppen wie sie zum Blockieren der Aminogruppe des Acylierungsmittels verwendet worden sind, blockiert,die 6'-Aminoschutzgruppe selektiv aus dem blockierten Acylierungsprodukt entfernt, die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes in an sich bekannter Weise alkyliert, die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem Alkylierungsprodukt entfernt und die gewünschte Verbindung aus der so

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gebildeten Reaktionsmischung durch Säulenchromatographie isoliert.

15. Pharmazeutisches Mittel, das sich für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei lebenden Tieren und Menschen eignet, dadurch gekennzeichnet, daß es eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines der l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6^f-N-alkylkanamycine nach den Ansprüchen 1 bis 3 oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

N-alky!kanamycine nach den Ansprüche! 1 bis 3

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pharmazeutisch verträglichen Salze füjj-'die therapeutische \\ Behandlung von bakteriellen--iiirektionen bei lebenden Tiereiö-g und Menschen, jwpJje^Tinan eine therapeutisch wirksame Menge g, mindesteasTeiner der genannten Verbindungen dem erkrankten —

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