DE2704883A1 - Einfache gradientvorrichtung mit variablem volumen fuer die hochdruckfluessigkeitschromatographie - Google Patents

Description

• Einfache Gradientvorrichtung mit variablem Volumen für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie Einleitung Bei der hochdruckflüssigkeitschromatographischen Trennung von Verbindungen mit stark unterschiedlichen Polaritäten und Kapazitätefaktoren (auch Trennungszeiten) werden vorzugsweise Lösungsmittelgemische verwendet, die mit längeren Trennungszeiten eine stärkere Elutionswirkung zeigen. Solche Gradienten können grundsätzlich an der Niederdruck- oder Hcchdruckseite des Flüssigkeitschromatographen erzeugt werden. Über die bekannten gradienterzeugenden Geräte ist von KIRKLiND (1971), SNYDER und KTRtLAND (1973) und ENGELHBRDII (1975) referiert worden. Weitere Angaben sind den Firmenschriften von Siemens und Applied Science Laboratores zu entnehmen.
• Diese Gradientvorrichtungen haben den Nachteil, kompliziert und kostspielig zu sein, da in den meisten Pällen eine zweite Hochdruckpumpe mit elektronischer Steuerung erforderlich ist. Mit den einfacher gebauten Yorrichtungen können nur bestimmte Gradienten erzeugt werden.
• Die Erfindung hat den Zweck, mit einfachen Mitteln eine anpassungsfähige Gradientvorrichtung verfügbar zu machen, mit der auch die nach Jeder Trennung erforderliche Regenerierung auf den insgangszustand durchgefahrt werden kann.
• Beschreibung der Vorrichtung Die hierzu erforderlichen Mischvorrichtungen und ihre Anordnung sind in den Bildern 1, 2, 3, 4 und 5 dargestellt. Die Anlage besteht aus einem Mischgefäß mit variablem Volumen, welches an der Eingangsseite mit einer Hochdruckpumpe und an der Ausgangsseite mit einer Trennsäule verbunden ist. An das Mischgefäß ist ein Rohr angeschlossen, das nach der Trennsäule zu mit einem Dreiweghahn versehen ist. Das Rohr ist austauschbar und mit drucksicheren Verschraubungen mit den anderen Teilen verbunden.
• Lange und Volumen des Rohrs richten sich nach dem Volumen der verwendeten Grennsäule.
• Um die Trennsäule auf den Auagangazustand zu bringen, benötigt man mindesteins doppelt so viel Lösungsmittel, als das Leervolumen der Trennsäule beträgt. Auch an der Eingangsaeite des Druckgefäßes befindet sich ein Dreiweghahn.
• Wirkungsweise der Vorrichtung Zu Beginn der chromatographischen Trennung wird ein Lösungsmittel von größerer Elutionskraft (Lösungsmittel I) mit der Hochdruckpumpe durch die Gradientvorrichtung und die Trennsäule gepumpt. Anschließend wird die Pumpe abgeschaltet, und die beiden Dreiweghähne werden so gestellt, daß Lösungsmittel II aus dem Behälter ungehindert durch die Gradientvorrichtung und das Rohr abfließen kann. Auf diese Weise wird das sich in dem Mischgefäß befindliche Lösungsmittel I durch Lösungsmittel II ersetzt. Der Vorgang kann durch eine Förder- oder Wasserstrahlpumpe beschleunigt werden.
• Wenn Hochdruckpumpe und Msgnetrührer angestellt werden, strömt das Lösungsmittel I in das Druckgefäß und verdrängt darin das Lösungsmittel II, bis das Gefäß vollständig mit Lösungsmittel 1 angefüllt ist. In dem Rohr befindet sich zuerst nur Lösungsmittel II. Bedingt durch das Strömungsprofil in diesem Rohr, strömt das unvermischte Lösungsiittel II in die Trennsäule, die hiermit regeneriert wird. Erst Jetzt kann die Analysenlösung aufgegeben werden, und die Trennung erfolgt mit dem in dem Mischgefäß erzeugten Lösungsmittelgradienten.
• Der Vorteil der neuen Gradientvorrichtung besteht darin, daß mittels eines variablen Volumens des Mischgefäßes beliebige und gut reproduzierbare Gradienten erzeugt werden können. Mit Hilfe des sich in dem Rohr befindlichen iusgangslösungsmittels kann die Trennsäule leicht und reproduzierbar konditioniert werden.
• werden kann, 3. das Volumen des Mischgefäßes stufenlos geändert werden karn, indem die Länge des Kolbens mit Hilfe eines Gewindes variiert wird (Abb. 4), 4. das Volumen des Mischgefäßes variabel gestaltet ist durch einen Kolben, der mit einer Spindel in seiner Position verändert werden kann (8bb. 5), ohne fest mit dem Kolben verbunden zu sein. Diese Anordnung hat den Vorteil, daß bei einer Vergrößerung des Mischgefäßvolumens der Kolben durch den Pumpendruck von selbst nach oben gedrückt wird, 5. an der Eingangsseite des Mischgefäßes ein Mehrweghahn angebracht ist, 6. an der Ausgangsseite, d.h. zwischen dem Mischgefäß und der Trennsäule sich ein austauschbares Rohr befindet, das sich zur Trennsäule hin mit einem Dreiweghahn absperren läßt, 7. das Volumen des austauschbaren Rohres (abt. 1) mindestens zweimal so groß ist als das Leervolumen der Urennsäule 8. der Innendiameter des austauschbaren Rohres maximal 10 mm beträgt.
• Beispiele Bild 6 zeigt eine hochdruckflüssigkeitschromatographische Trennung eines Phenolgemisches aus 11 Verbindungen auf einer 30 x 0,3 cm Stahlsäule.
• Die Trennung erfolgte auf einem chemisch modifizierten Kieselgel. Auf diesem Gel ist eine C18-Verbindun& mittels einer Si-O-Si-Bindung dauerhaft verbunden. Diese Säule entspricht einer sogen. umgekehrten Phase.
• Bei einer solchen Trennung erscheinen die polareren Verbindungen zuerst am Säuleneingang, während die weniger polaren Substanzen erst später erscheinen. Lösungsmittelgemische mit einem größeren Anteil an Wasser haben weniger Elutionskraft als solche mit mehr Anteilen an organischen Lösungsmitteln.
• Die im Bild 6 gezeigte Trennung wurde mit einem Gemisch aus 60 % Methanol und 40 % Wasser bei einer Durchflußmenge von 0,7 ml/Minute durchgeführt und bietet keine ausreichende Trennung. Erst eine Trennung mit einem Gradienten, ausgehend von 10 % Wasser und 90 % Methanol bis zu 60 ffi Methanol und 40 % Wasser, lieferte ein gutes Ergebnis (Bild 7). Die hier benutzte Anordnung entspricht dem Schema 1.
• Das Mischgefäß hat ein Volumen von 12,6 ml, und das austauschbare Rohr ist 120 cm lang mit einem Innendiameter von 2,2 mm. Das Volumen ist dementsprechend 4,6 ml. Dieses Volumen reicht vollständig aus, die Trennsäule mit einem Leervolumen von 2 ml zu regenerieren oder in den ursprünglichen Zustand zu überführen, wie es im Bild 8 gezeigt wird.
• Dieses Diagramm zeigt den Verlauf der UV-Absorption von Aceton, das dem Lösungsmittel I (Schema 1), bestehend aus 60 % Methanol und 40 % Wasser),zugemischt wurde,bei 350 nm. Da zunächst dieses Lösungsmittelgemisch durch die Hochdruckpumpe gepumpt wurde, ist die Trennsäule vollständig mit dieser Phase gefiillt. Dies ist aus der UV-Absorption zu Beginn des Diamgramms im Bild 8 zu sehen. Wenn das Mischgefäß und das austauschbare Rohr mit dem Lösungsmittel II gefüllt und die Hochdruckpumpe sowie Magnetrührer angestellt werden, strömt dieses Lösungsmittel in die Trennsäule und regeneriert sie. Das erste Lösungsmittel wird durch das zweite ersetzt. Dies macht sich durch das Fehlen der UV-Absorption von Aceton bemerkbar. Bei einer chromatographischen Trennung soll die Probe Jetzt aufgetragen werden. Im vorliegenden Fall ist dieser Zustand in dem Detektor nach 7,5 Minuten erreicht. Dies entspricht 5,25 ml Lösungsmittel oder ist 2,6mal so groß als das Leervolumen der Trennsäule.
• Das zur Regenerierung der Trennsäule benötigte Volumen der mobilen Phase (um die Trennsäule zu regenerieren) wird durch die Eigenschaften des frennmaterials selbst bestimmt.
• Literatur 1. J.J.KIRrL£W#: Modern Practice of Liquid Chromatography. Wiley-Interscience, Hew Tor,1971.
• 2. L.R.SHYDER and J.J.KIRKLAND: Introduction to Modern Liquid Chrouatography. Wiley-Interscience, Hew York,1973~ 3. H. EHGIMkRDT: Hochdruckfltlssigkeitschromatographie. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-Hew Tork, 1975.
• 4. Ipplied Science Laboratories, Inc., State College, PA, USA.
• Katalog 19, 1976, s. 54.
• 5. Siemens AG., Bundesrepublik Deutschland, Labor-Chromatographen, Katalog MP 44, 1975/76, S. 1/15 und 1/16.

Claims (1)

1. Patentanspruch Eine Gradientvorriohtung fUr die Fltssigkeitschromatographie mit variablem Nischgefäßvolumen und einem angeschlossenen, in seinem Volumen variablen Rohr für die Konditionierung der Trennsäule ist dadurch gekennzeichnet, daß 1. das Mischgefäß mit austauschbaren Einsätzen unterschiedlicher Volumina versehen ist (z.B. wie auf Bild 2), 2. das Volumen des Hischgefäßes durch austauschbare kolben unterschiedlicher Länge (wie z.B. auf Bild 3) geändert