DE2639876A1

DE2639876A1 - Verfahren zur herstellung der alkaloide raubasin und serpentin durch in vitro-zuechtung von zellen von catharanthus

Info

Publication number: DE2639876A1
Application number: DE19762639876
Authority: DE
Inventors: Meinhart H Prof Dr Zenk
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-09-04
Filing date: 1976-09-04
Publication date: 1978-03-09

Description

Verfahren zur Herstellung der Alkaloide Raubasin und
Serpentin durch in vitro-Züchtung von Zellen von Catharanthus Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Ilrdolalkaloide Rauhasin (Ajmalicin) und Serpentin durch in vitro-Züchtung von Catharanthus-Zellsuspensionskulturen.
Es wurden schon zahlreiche Versuche unternommen, mit Hilfe von pflanzlichen Zellkulturen pharmazeutisch oder technisch wichtige Inhaltsstoffe zu produzieren. In den meisten Fällen enthalten pflanzliche Zellkulturen die gewünschten Inhaltsstoffe jedoch gar nicht oder nur in solch geringen Konzentrationen, daß sich eine technische Ausbeute nicht lohnt (E. Teuscher,Pharmazie 28, 6, (1973); DOS 22 24 336).
Catharanthus-Pflanzen enthalten eine Reihe von Alkaloiden, von denen u. a. das Serpentin bzw. sein Hydrierunasprodukt, das Raubasin, Bedeutung für die Therapie von Durchblutungsstörungen verlangt hat.
Es ist bekannt, daß die Zellen der höheren Pflanzen in vitro in einer entdifferenzierten Form undefinierter Gestalt leben und sich vermehren können. Diese Zellen liefern bei der Teilung entweder isolierte Elemente oder kleine Zellhaufen oder auch größere Formen, die als "Kallus" bezeichnet werden (vgl. R. J. Gautheret, "La culture des tissus véqétaux", Masson, Paris (1959)).
Es ist ferner bekannt, daß die in vitro gezüchteten Zellen von höheren Pflanzen unter gewissen Bedingungen durch Biosynthese Sekundärverbindungen bilden können, die analog zu jenen Verbindungen sind, die die normalwachsende Pflanze liefert. Als solche Sekundärverbindungen wurden vornehmlich Alkaloide beschrieben. So wurde u, a. festgestellt, daß Kulturen entdifferenzierter Zellen von Catharanthus roseus zur Produktion von Indolalkaloiden befähigt sind. Jedoch wurden diese Alkaloide bisher nur in Spuren und lediglich aufgrund chromatographischer Vergleiche in diesem Gewebe nachgewiesen.
Ganz allgemein behalten die in vitro gezüchteten Pflanzenzellen die Gesamtheit der genetischen Information der Pflanzen bei, aus denen sie hervorgegangen sind, was als Totipotenz der Pflanzenzellen bezeichnet wird. Diese Tatsache wird dadurch bestätigt, daß Teile oder ganze Pflanzen aus entdifferenzierten Zellen rückgebildet werden können.
Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnis müßte es daher möglich sein, die genetische Information zur Sekundärstoffbiosynthese in entdifferenziertem Gewebe auszunutzen und durch geeignete Kulturbedingungen eine Akkumulation des gewUnschten Sekundärstoffes zu erreichen. Dies sollte eventuell durch Hormone und Nährstoffkomponenten bzw. durch biosynthetische Vorstufen der gewünschten Sekundärstoffe zu erreichen sein.
Die Aufgabe bestand nun darin, zunächst Zellkulturen von Catharanthus bereitzustellen, die eine Alkaloidbiosynthese von Raubasin und Serpentin ermöglichen.
Die Aufgabe bestand weiterhin darin, ein Verfahren zur Auswahl von Catharanthus-Zellkulturen zu finden, durch das eine besonders hohe Ausbeute der gewünschten Alkaloide Raubastn und/oder Serpentin erzielt wird.
Ferner bestand die Aufgabe darin, Züchtungsbedingungen zu finden, unter denen die Catharanthuszellen optimal vermehrt und zur optimalen Biosynthese von Alkaloiden stimuliert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Erzeugung der Alkaloide Serpentin und Raubasin unter Verwendung von Suspensionskulturen von Catharanthus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Pflanzen oder Samen mit erhöhtem Serpentin- und/oder Raubasin-Gehalt selektiert, b) hiervon über Kallusgewebe Zellkulturen anlegt, c) Einzelzellen oder Aggregate dieser Zellkulturen in einem Produktionsmedium auf Agar plattiert, d) Zellen der erhaltenen Kolonien, die den höchsten Serpentin- und/oder Raubasingehalt aufweisen, in einem Wachstumsmedium zur Vermehrung bringt, e) diese Zellkulturen anschließend in einem Produktionsmedium zur Alkaloidproduktion stimuliert und f) daraufhin aus diesen Zellen in an sich bekannter Weise die Alkaloide gewinnt.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt zunächst mit der Auswahl geeigneter Catharanthus-Pflanzen, Bestimmung ihres Älkaloid-Gehalts und Anlegen eines Kallusgewebes. Hierzu wurde als Vertreter der Catharanthus-Pflanzen Catharanthus roseus gewählt, jedoch können auch andere Catharanthusarten verwendet werden, wie z. B. Catharanthus longifolius, Catharanthus pusillus, Catharanthus ovalis, Catharanthus scitulus, Catharanthus lanceus, Catharanthus trichophyllus oder Hybriden dieser Arten.
Von einer Vielzahl von Catharanthus roseus Pflanzen wird der Alkaloid-Gehalt bestimmt, was durch Dünnschicht- oder Gaschromatographie etc. erfolgen kann. Sehr vorteilhaft lassen sich jedoch diese Alkaloidanalysen mit einem Radioimmunassay (RIA) -Verfahren durchführen, wobei ohne weiteres über 200 Proben pro Tag analysiert werden können.
Eine Analyse von 184 Pflanzen, die aus verschiedenen geographischen Regionen stammten und unter gleichen Bedingungen 45 Tage gezüchtet wurden, ergab ein weites Spektrum an Gehalten von Raubasin und Serpentin, gemäß einer Gaußschen Verteilung, d.h. nur wenige Pflanzen hatten einen hohen bzw.
niederen Alkaloid-Gehalt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden nun die Pflanzen ausgesucht, die den höchsten gehalt an Raubasin und/oder Serpentin aufweisen. Damit sich eine technische Ausbeutung lohnt, sollte der Alkalold-Gehalt in der Wurzel größer als 0,7 % Sein.
Von diesen so ausgewählten Pflanzen werden Gewebekulturen angelegt, indem man Wurzel, Stengel, Blatt, Blütenteile oder auch Teile von aus Samen sterilgezogenen Keimpflanzen keimfrei auf ein geeignetes Nährmedium, das mit Agar verfestigt ist, aufbringt und im Licht verschiedener Intensität oder im Dunkeln zwischen 150 C und 400 C vorzugsweise bei 300 C inkubiert. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, bei Catharanthus roseus als Ausgangsmaterialien für Kalli Keimpflanzen des Samens zu verwenden, da sich diese schneller weiterentwickeln als Ralli von Pflanzenteilen der ausgewachsenen Pflanze.
Nach 1 - 6 Wochen bildet sich, insbesondere an den Wundflächen der Pflanzenteile, Kallusgewebe in Form von entdifferenzierten Zellmassen, die unter Beachtung steriler Arbeitsbedingungen vom ursprünglichen Pflanzenteil getrennt und in frische Gefäße mit Ågarmedium eingebracht werden.
Nach jeweils 2 - 6 Wochen werden die neu heranwachsenden Zellmassen geteilt und abermals auf frisches Nährmedium übertragen. Die Kulturen können gewöhnlich auf den in der Gewebekultur verwendeten Nährmedien gezogen werden, bevorzugt jedoch auf den von Linsmaier und Skoog angegebenen (Physiologia Plantarum 18, 100 (1965)). Dem Medium können dabei Wuchsstoffe wie Indol-3-Essigsäure (IAA), Benzyladenin etc. zugegeben werden.
Von dem auf diese Weise gewonnenen Kallusgewebe werden --Suspenskulturen angelegt. Hierzu wird das Kallusgewebe in ein flüssiges Wachstumsmedium gebracht, wobei wiederum das von Linsmaier und Skoog bevorzugt ist. In diesem Medium zerfallen die Zellklumpen und ergeben eine homogene Zellmasse, die aus Einzelzellen und kleinen Zellaggregaten besteht.. Diese Zellsuspensionen werden durch regelmäßiges Uberimpfen in 10 Tagesabständen in einer ständigen Wachstumsphase gehalten.
So erhaltene Einzelzellen bzw. kleinere Zellaggregate werden daraufhin isoliert und in einem Alkaloid-Produktionsmedium unter Zusatz von 0,8 % Agar in Petrischalen plattiert. Nach ca 3 3 - 6 Wochen sind kleine Kolonien herangewachsen, die einzeln auf ihren Alkaloid-Gehalt untersucht werden. Eine Auswertung der erhaltenen Analysenergebnisse von 160 verschiedenen Kolonien nach der RIA-Methode ergab ein ähnlich g.estreutes Spektrum der Alkaloidwerte wie bei der ursprünglichen Pflanze, wobei sich die Werte für Serpentin zwischen 0 und 1,4 t und für Raubasin zwischen 0 und 0,8 % bewegten. Damit ist der Beweis erbracht, daß die Einzelzellen von Catharanthus roseus-Zellkulturen unterschiedlich sind, obwohl sie von genetisch einheitlichen Pflanzenzellen abstammen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.wer.den.nun die Kolonien, die den höchsten Alkaloid-Gehalt aufweisen, von den Agar-Platten entfernt und in Petrischalen überführt, die ein festes Wachstumsmedium enthalten. Auf diese Weise wird weiterer~Kallus entwickelt, der dann wieder in ein flüssiges Wachstumsmedium überführt wird.
Nach einer Wachstumsphase von etwa 2 - 4 Wochen wird, für den Fall, daß bereits ein reiner Stamm eingesetzt wurde, dieser Stamm in einem Alkaloid-Produktionsmedium zur Alkaloidproduktion gebracht. In der Regel werden aber die Ver--fahrensstufen Plattieren, Züchtung von Kolonien, Bestimmung des Alkaloid-Gehaltes, Selektion der besten Stämme etc. so oft wiederholt, bis ein erbbeständiger, reiner Stamm mit hohem Alkaloid-Gehalt erhalten wird, der dann beliebig zur Alkaloid-Produktion eingesetzt werden. kann.
Aus dem Stand der Technik ist bereits bekannt, daß die Zusammensetzung der Kulturmedien die Höhe der Akkumulation der Sekundärstoffe in den Zellstämmen beeinflussen kann.
So spielen z. B. Hormone, bestimmte Nährstoffkomporienten und biosynthetische Vorstufen der Indolalkaloide in Kulturmedien eine wesentliche Rolle bei der Synthese der gewünschten Alkaloide; desgleichen eine Kombination verschiedener Mineralsalze, Vitamine und Kohlenstoffquellen.
Als Wachstumsmedien werden Nährmedien verwendet, die als Komponenten assimilierbare Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenelementen enthalten.
Dabei können als Quellen für Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenelemente Mineralsalze, wie z. B. Kaliumnitrat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Ammoniummolybdat etc., Borsäure und Salze des Tetraäthylendiamintetraacetats eingesetzt werden, während als Kohlenstoffquelle hauptsächlich Saccharose Verwendung findet. Ferner können den Medien Vitamine wie z. B. Biotin, Thiamin, Inosit, Pyridoxin, Nicotinsäure, Folsäure etc. und Auxin-aktive Verbindungen wie 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und l-Naphthylessigsäure zugesetzt werden. Von den verschiedenen bekannten Medien wird gemäß der Erfindung bevorzugt das Medium nach Linsmaier und Skoog verwendet.
Als Basis für ein geeignetes Produktionsmedium wurde ein Medium gefunden, das ebenfalls die assimilierbaren Quellen Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Spurenelemente in Form von Mineralsalzen, Säuren, organischen Salzen und Saccharose sowie Vitamine enthält.
Als sehr vorteilhaft im Sinne des erfinderischen Verfahrens hat sich nun gezeigt, daß ein Zusatz von bestimmten Hormonen die Alkaloidproduktion günstig beeinflußt. Es wurde gefunden, daß ein Gemisch von 10 6 Mol/l Indolyl-3-essigsäure (IAA) und 5 x 10 Mol/l N - Benzyladenin als Zusatz zum Basis-Medium optimale Ausbeuten liefert, wobei große oder kleinere Zusätze um den Faktor 10 jedoch ebenfalls noch erfindungsgemäß zu verwenden sind. Andere Hormone wie z. B. 2,4-Dichlorphenoxy-essigsäure (2,4-D) und l-Naphthylessigsäure (NAA) sind nicht günstig. Sie senken die Alkaloidausbeute und wirken wohl im Sinne von Inhibitoren.
Weitere Zusätze, die die Alkaloidproduktion beeinflussen, sind die biosynthetischen Vorstufen der Indolalkaloide, wobei u. a. Tryptophan, Tryptamin, Anthranilsäure, Loganin, Loganinsäure, Secologanin, Secologaninsäure und das Reaktionsprodukt aus Secologanin mit Tryptamin in Frage kommen.
Dabei zeigte ein Zusatz von 10 3 - 5 bloc3 Mol/l, insbesondere von 2,5 x 10 3 Mol/l L-Tryptophan überraschend eine bemerkenswerte Steigerung der Alkaioidausbeuten, da dieser Stoff in einer solch hohen Konzentration gewöhnlich als Inhibitor wirkt.
Als- erfindungsgemäßes Alkaloidproduktionsmedium wird nun hunter Berücksichtigung der oben aufgeführten Erkenntnisse ein Medium verwendet, das vorwiegend aus dem Basismedium (Mineralsalzen, EDTA, Vitaminen und Saccharose) und den iusätzen an Indolyl-3-essigsäure, N6-Benzyladenin und L-Tryptophan besteht, wobei es vorteilhaft ist, den Saccharose-Gehalt, der in üblichen Medien ca. 5 % beträgt, auf 8 - 9 z zu erhöhen. Die Zusaminensetzung der erfindungsgemäß verwendeten Medien ist in den nachstehend aufgeführten Beispielen angegeben.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden zwei Hochleistungsstämme isoliert, die im oben aufgezeigten Produktionsmedium optimale Ausbeuten an Alkaloiden liefern und ihre Prpduktionseigenschaften über mehr als 2 Jahre beibehalten haben. Der eine isolierte Stamm produziert vorwiegend Serpentin (Stamm S), während der andere v.orwiegend Raubasin liefert (Stamm A>.
Die erfindungsgemäß hergestellten Hochleistungsstämme Stamm S und Stamm A sind unter dieser Bezeichnunq am Institut für Pflanzenphysiologie, Ruhr-Universität Bochum, D-4630 Bochum, BRD, hinterlegt.
Zusammenfassend werden die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand des Ubersichtsschemas gemäß Abb. 1 erläutert: 1. Untersuchung einer Vielzahl differenzierter Pflanzen auf ihren Alkaloidgehalt und Auswahl der Pflanzen, die in ihren Wurzeln einen hohen Alkaloidgehalt, vorzugsweise von mehr als 0,7 %,aufweisen 2. Anlegen von Kalluskulturen von diesen ausgewählten .. Pflanzen (oder deren Samen) 3. Isolierung, Suspendierung und Vermehrung der Kalluskulturen in einem flüssigen Wachstumsmedium 4. Plattierung von Einzelzellen oder Zellaggregaten dieser Kulturen auf festem Agar in einem geeigneten Produktionsmedium 5. Analysieren der entstehenden Kolonien auf ihren Alkaloid-Gehalt 6. Selektion von Kolonien mit hohem Alkaloidgehalt und Vermehrung dieser Kolonien in einem flüssigen Wachstumsmedium 7. Überführung der so erhaltenen Suspensionskulturen in ein flüssiges Produktionsmedium, wenn sie die gewünschten Konzentrationen an Zellen aufweisen 8. Trennung von Gewebe und Nährmedium, Trocknung des Gewebes, Extraktion des Rückstandes und Isolierung der Alkaloide nach bekannten Methoden Die Inkubation des selektierten Stammes (Stufen 6 und 7 des Verfahrens) wird vorzugsweise bei 300 C in einem Fermenter durchgeführt, wobei das Produktionsmedium gemäß Verfahrensschritt 7 mit 0,1 - 0,5 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute.begast wird.
Zur Aufarbeitung wird nach ca. 20 - 30 Tagen der Inhalt des Fermenters in Gewebe und Nährlösung getrennt. Das Gewebe wird daraufhin getrocknet und in der für die Catharanthuswurzeln bekannten Weise mit organischen Lbsüngsmitteln extrahiert, die in den Extrakten vorhandenen Alkaloide durch multiplikative Verteilung oder Adsorptionschromatographie aufgetrennt und die gesuchten Alkaloide kristallisiert.
Der Reaktionsverlauf und der Zeitpunkt optimaler Ausbeute an Alkaloiden kann - wie bereits aufgeführt - durch den Radioimmunoassay auf Serpentin bzw. Raubasin bzw. durch qualitative und quantitative Dünnschichtchromatographie von Probeextrakten der Gewebe und Nährmedien aus den Versuchsansätzen verfolgt werden. Für die Dünnschichtchromatographie verwendet man am besten: DC - Fertigplatten Kieselgel G, Fließmittel I = Benzol: Aceton: Diäthylamin = 70:20:in Fließmittel II = Xylol: Methyläthylketon: Diäthylamin = 60:30:1,8.
Die quantitative Alkaloidmessung erfolgt dünnschichtchromatographisch direktfluorimetrisch.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert: Beispiel 1 Erzeugung von Serpentin Als Wachstumsmedium wird eine Lösung. folgender Zusammensetzung (pro Liter Lösung) verwendet (nach Linsmaier und Skoog): Komponente Konzentration mq/l Kaliumnitrat 1900 Ammoniumnitrat 1650 Magnesiumsulfatheptahydrat 370 Calciumchloriddihydrat 440 Kaliumdihydrogenphosphat 170 Mangansulfatmonohydrat 22,3 Borsäure 6,2 Zinksulfatheptahydrat 8,6 Kaliumjodid 0,83 Kupfersulfatpentahydrat 0,025 Natriummolybdatdihydrat 0,25 Kobaltchloridhexahydrat 0,025 Äthylendiamintetraessigsäure 37,3 Dinatriumsalz Eisensulfatheptahydrat 27,8 meso-Inosit * 100 Thiaminiumdichlorid 0,4 l-Naphthylessigsäure 0,186 2, 4-Dichlorphenoxy-essigsäure 0,22 Saccharose 30 pH-Wert 6,0 In zwei Erlenmeyerkolben (1 Liter) werden Suspensionskulturen aus vorkultivierten Kulturen von Catharanthus roseus Kallusgewebe (ein aus tausenden Einzelkalli selektierter hauptsächlich Serpentin liefernder Stamm) in je 250 ml Nährmedium herangezogen. Die Anzucht erfolgt bei 230 C auf einer Rundschüttelmaschine mit 100 Umdrehungen /Min. unter Belichtung. Die Inkubationsdauer beträgt 14 Tage. Danach wird der Inhalt der Kolben in einen Erlenmeyerkolben (5 Liter) mit 3,5 Liter Wachstumsmedium steril überführt.
Nach 10 Tagen Inkubation unter obigen Bedingungen aber bei 300C wird mit dieser Suspensionskultur ein 30 Liter Schlaufenreaktor mit 20 Liter Produktionsmedium steril angeimpft.
Als Produktionsmedium wird eine Lösung folgender Zusammensetzung (pro Litermedium) verwendet: Komponente . . Konzentration mg/l Kaliumnitrat 900 Ammoniumnitrat 700 Magnesiumsulfatheptahydrat 150 Calciumchloriddihydrat 160 --~ Kaliumdihydrogenphosphat 60 Mangansulfatmonohydrat 7 Borsäure 2,5 Zinksulfatheptahydrat 4,0 Ammoniummolybdattetrahydrat 0,01 Kupfersulfatpentahydrat 0,01 thylendiamintetraessigsäure 37,3 Eisensulfatheptahydrat 27,8 Glycin 2,0 meso-Inosit 100 Nicotinsäure 5,0 Pyridoxolhydrochlorid 0,5 Thiaminiumdichlorid 0,5 Biotin 0,05 Folsäure 015 je N -Benzyladenin 1,13 Indol-3-essigsäure 0,18 Saccharose 50 L-Tryptophan 500 pH-Wert 5,0 ° Der Fermenter wird bei 30 C mit 0,1 - 0,5 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute begast. Nach Erreichen der maximalen Alkaloidausbeute (nach etwa 20 - 30 Tagen) wird der Inhalt des Fermenters in Gewebe und Nährlösung getrennt.
Ein Aliquot des Gewebes wird für die Trockengewichtsbestimmung getrocknet, das Restsewebe mit 80 % wässrigem Äthanol am Rückfluß extrahiert. An.einem Aliquot des äthanolischen Extraktes wird der Serpentin- und Raubasingehalt dc chromatographisch bestimmt.
Die Analysen ergeben: pro Liter Medium Trockenrückstand des Gewebes: 20 g pro Liter Medium Serpentin:162 mg pro Liter Medium Raubasin: 15 mg pro Liter Medium Beispiel 2 Erzeugung von Raubasin Die Versuchsanordnung und Kulturbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird ein vornehmlich Raubasin liefernder Stamm verwendet, der aus tausend von Einzelkalli mit Hilfe des Radioimmunoassay selektiert wurde.
Die Analysen ergeben: Trockentückstand des Gewebes: 26 g pro Liter Medium Raubasin: 264 mg pro Liter Medium Serpentin: 77 mg pro Liter Medium B e i s p i e 1 3 Die Versuchs-Anordnungen und Kultur-Bedingungen sind die gleichen,wie in Beispiel- 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird der gleiche vorselektierte, Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet. Die Ansätze wurden in 1 Liter Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 250 ml Medium durchgeführt.
Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Wachstuinsmedium (nach Linsmaier und Skoog), l.c.) Trockenrückstand des Gewebes: 23 g pro Liter Medium Serpentin: 8 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktions-Medium, aber ohne Zusatz von L-Tryptophan Trockenrückstand des Gewebes: 21 g pro Liter Medium Serpentin: 62 mg pro Liter Medium Beispiel 4 Die Versuchsanordnung und Kulturbedingungen sind die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird ein normaler, nicht selektierter Stamm verwendet, der von einer differenzierten Pflanze stammte, die 0,3 % Serpentin und nur Spuren Raubasin in der Droge aufwies. Die Ansätze wurden in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Wachstums-Medium (nach Linsmaier und Skoog, l.c.) Trockenrückstand des Gewebes: 13 g pro Liter Medium Serpentin: 1,9 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktions-Medium (siehe Beispiel 1), aber ohne L-Tryptophan-Zusatz Trockenrückstand des Gewebes: 15 g pro Liter Medium Serpentin: 6,4 mg pro Liter Medium c) Inkubation im Produktions-Medium (siehe Beispiel 1), aber mit L-Tryptophan (500 mg/l) Trockenrückstand des Gewebes: 16 g pro Liter Medium Serpentin: 12 mg pro Liter Medium B e i s p i e 1 ~ 5 Die Versuchs-Anordnung und Kulturbedingungen sind die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird der gleiche vorselektierte, Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet. Die Ansätze wurden in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Produktions-Medium (nach Beispiel 1), aber ohne Zusatz von L-Tryptophan Trockenrückstand des Gewebes: 20 g pro Liter Medium Serpentin: 60 mg pro Liter Medium b) Inkubation im Produktionsmedium (nach Beispiel 1) ohne Zusatz von L-Tryptophan, äber mit Zusatz vorn Loganin (250 mg pro Liter)-Trockenrückstand des Gewebes: 22 g pro Liter Medium Serpentin: 114 mg pro Liter Medium B e i s p i e 1 6 Die Versuchs-Anordnungen und Kultur-Bedingungen sind die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Als Suspensions-Kultur wird der gleiche vorselektierte Serpentin liefernde Hochleistungsstamm verwendet. Die Ansätze wurden in 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml Medium durchgeführt.
Die Analysen ergaben: a) Inkubation im Produktions-Medium (nach Beispiel 1), aber mit 8 % Saccharose Trockenrückstadd des Gewebes: 22 g pro Liter Medium Serpentin: 193 mg pro Liter Medium Leerseite

Claims

P A T E. N T A N S P R U C-H E c£. Verfahren zur Erzeugung von Serpentin und Raubasin durch Zellsuspensionskulturen von Catharanthus, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Pflanzen oder Samen mit erhöhtem Serpentin- und/oder Raubasin-Gehalt selektiert, b) hiervon über Kallusgewebe Zellkulturen anlegt, c) Einzelzellen oder Aggregate dieser Zellkulturen in einem Produktionsmedium auf Agar plattiert, d) Zellen der erhaltenen Kolonien, die den höchsten Serpentin- und/oder Raubasingehalt aufweisen, in einem Wachstumsmedium zur Vermehrung bringt, e) diese Zellkulturen anschließend in einem Produktionsmedium zur Alkaloidproduktion stimuliert und f) daraufhin aus diesen Zellen in an sich bekannter Weise die Alkaloide gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen c) und d) mehrfach durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Catharanthus-roseus-Pflanze benutzt, die in ihrem Wurzelsystem einen GehaLt von mehr als 0,7 % des gewünschten Alkaloids aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrigen Kulturmedien assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Kalium, Phosphor, Magnesium und Vitamine enthalten.
5. Verfahren nach Ansprüche 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Produktionsmedium zusätzlich Indolyl-3-essigsäure, N6-Benzyladenin und L-Tryptophan enthält.
6. Verfahren zur Erzeugung von Serpentin, dadurch gekennzeichnet, daß der Catharanthus roseus-Gewebestamm "Stamm S", hergestellt rach Anspruch 1, VerfahHensstufe a) bis e) eingesetzt wird.
7. Verfahren zur Erzeugung von Raubasin, dadurch gekennzeichnet, daß der Catharanthus roseus-Gewebestamm Stamm A", hergestellt nach Anspruch 1, Verfahrensstufe a) bis e) eingesetzt wird.