DE2146580A1 - Verfahren zum Herstellen eines lakntzenextraktartigen Produktes als Tabak Aromastoff - Google Patents
Verfahren zum Herstellen eines lakntzenextraktartigen Produktes als Tabak AromastoffInfo
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Description
1 BERLIN 33 (GRUNEWALD), den ] £ g£p
HERBERT8TRASSE 22
THE JAPAN MONOLOPY CORPORATION, Akasaka-aoi-cho 2-1, Minata-kuf
Tokio, Japan
Verfahren zum Herstellen eines Lakritzenextrakt artigen Produktes als Tabal-Aromastoff
Verfahren zum Herstellen eines Lakritzenextrakt-artigen Produktes als Aromastoff für Tabak, das die folgenden Arbeitsstufen umfaßt:
Kultivieren eines Fragments eines Pflanzenkörpers der Lakritzenpflanze
in einem flüssigen Medium für die Pflanzengewebe-Kultur under aeroben Bedingungen zwecks Ableiten von Lakritzezellen, die
in der Flüssigkeit suspendiert sind, Erhitzen der die Lakritzezellen enthaltenden Kulturbrühe, Filtrieren der Brühe nach dem
Abkühlen und Einengen des Filtrates auf 1/40 - 1/50 seines Volumen unter Ausbilden eines konzentrierten Extraktes.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Lakritzeextrakt-artigen
Produktes als Aromastoff für Tabak unter Anwenden der Gewebekultur von Eakritzepflanzen als Rohmaterial.
Der Ausdruck "callus" wie er hier angewandt wird, betrifft einen amorphen Zellklumpen, der seine organbildendes Vermögen verloren
hat, der ausgebildet wird, wenn ein Fragment des Pflanzenkörpers auf einem festen Medium gewebekultiviert wird und der eine äußere
Form zeigt, die dem Agglutinationsgewebe de» Pflanzenkörpers ähnlich
ist. Der Ausdruck "Lakritzezellen" bezieht sich auf eine feine flockige Dispersion der Zellen, die ausgebildet werden, wenn
Stücke des callus weiter beimpft und gewebekultiviert werden in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen. Eine derartige
Lakritzezellen enthaltende Flüssigkeit wird als "Kulturbrühe" bezeichnet.
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Drahtwort: Invention Berlin
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itm ο
Der für das Würzen von Tabak angewandte Lakritzeextrakt wurde bisher in einer derartigen Weise hergestellt, daß Stücke der
Wurzeln der Lakritzepflanze in Stücke zerschnitten und in Wasser extrahiert wurden, wobei dem Filtrat der erhaltenen extrahierten
Flüssigkeit Äthanol zugesetzt wurde und dieses Gemisch erneut nach dem Stehenlassen filtriert wurde und das so
erhaltene Filtrat vermittels Verdampfen konzentriert wird. Der
Lakritzeextrakt enthält Glycyrrhizin (C42Hß2°l6^ als HauPtbe~
standteil und schmeckt sehr süß und wenig bitter. Bisher ist die Lakritzewurzel lange Zeit als unentbhrlicher Gegenstoff,
Abirritant oder Anodyn angewandt worden, da dieselbe bei gastritischem Ulcer und duodenalem Ulcer wirksam ist. Der aus
der Lakritzewurzel hergestellte Lakritzeextrakt wurde überwie-™
gend als Süßstoff und Excipient für verschiedene Arten an Medizin und Nahrungsmitteln angewandt.
Die Lakritzepflanzen können jedoch nur in begrenzten Gebieten der Welt wachsen und so war die Prodkktion von Lakritzewurzeln
und die industrielle Verarbeitung derselben notwendigerweise auf bestimmte Gebiete beschränkt.
Der Pflanzenkörper besteht im allgemeinen aus unzähigen Zellen, die Gewebe und Organe der Pflanze bilden und hierdurch die
Lebesnfunktion bedingen. Es wurde kürzlich gefunden, daß ein vollständiger Pflanzenkörper direkt aus beliebig ausgewählten
Zellen des Pflanzenkörpers gezogen werden kann vermittels der sogenannten Gewebekultivierung dieser Zellen. Eine derartige
Gewebekultur ist für Untersuchungen zwecks Verbessern der Pflanzenzüchtung durch Auswahl von Zellen angewandt worden, die
ausgezeichnete genetische Eigenschaften der Pflanze besitzen. Es ist weiterhin bekannt, daß der sogenannte "callus" auf einem
festen Medium vermittels dieser Gewebekultur ausgebildet wird, sowie eine Suspension feiner Zellen der Pflanze vermittels
Gewebekultivierung des callus in flüssigem Medium unter aeroben Bedingungen erhalten wird.
Es wurde die Gewebekultivierung unter Anwenden von Lakritzepflanzen
untersucht und es wurde gefunden, daß die von dem callus abgeleiteten Lakritzezellen und die die Lakritzezellen
enthaltende Kulturbrühe in einen Lakritzeextrakt-artigen Stoff
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— j —
als Würze für Tabak verarbeitet werden kann.
Eine der ERfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein
einfaches und leichtes Verfahren zum Herstellen von Lakritzeextrakt
zu schaffen, der als Würze für Tabak angewandt werden kann.
Ein weitere der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein industrielles Verfahren zum Herstellen von Lakritzeextrakt
als Tabakwürze zu schaffen, das nicht unter dem Einfluß von Land-, Boden- oder klimatischen Verhältnissen steht.
Eine weitere der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zum Herstellen von Lakritzeextrakt als
Tabakwürze zu schaffen unter Anwenden vrschiedener Spezien der
Lakritzepflanze, die selbst nur in bestimmten Gebieten wächst und somit entsprechende Qualität besitzt.
Erfindungsgemäß können verschiedene Arten an Lakritzepflanzen
für die Gewebekultivierung angewandt werden, z.B. Glycyrrhiza -glabra Linne var. glandulifera RgI. et Herd., G. uralensis D.G,
G. echinata L., und dgl. Die herkömmlichen Zusammensetzungen des Mediums für die Gewebekultur, wie sie sich in der Literatur finden,
sind z.B. die als White's Medium (1943), Heller's Medium (1953), Murashige und Skoog's Medium (1962) und Linsmaier und
Skoog's Medium (1965) bezecihneten Medien, die erfindungsgemäß angewandt werden. Diese bekannten Medien bestehen aus anorganischen
Substanzen und weiteren kleinen Elementen, die bisher in dem Medium der Wasserkulturverfahren für Pflanzen angewandt
wurden, Saccharide, Auxine (Wachstumsfördernde Substanz), Cytokinine,
Vitamine und Aminosäuren. Insbesondere werden die folgenden in diesen Medien verwendet: anorganische Salze ausgewählt
aus Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Kaliumnitrat, Calciumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Natriumsulfat,
Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Eisen-III-chlorid,
Eisen-III-sulfat, Ua2-EDTA (Na^Äthylendiamintetraessigsäure),
Mangansulfat, Zinksulfat, Borsäure, Kaliumjodid, Kupfersulfat, Natriummolybdat, Aluminiumchlorid, Kobaltchlorid
und dgl., Saccharide, ausgewählt aus Sukrose, Fructose, Glucose, Mannose und dgl. Auxine, wie 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure,
alpha-Naphthalinessigsäure, Indol-3-essigsäure, Kytokinine, wie
Kinetin, Vitamine, wie Thaimin, Hydrochlorid, PyridoxinHydro-
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Chlorid, Nikotinsäure, Myoinositol, Biotin und Aminosäuren, wie Glycin. Die Tabelle I zeigt Beispiele für herkömmliche Zusammensetzungen
von Medien für die Gewebekultivierung.
| Bestandteile | White·s | Murashige & | Linsmaier & |
| (mg/1) | Medium | Skoog's Medium | Skoog's Medium |
| KCl | 65 | ||
| CaCl2. 2 H2O | 440 | 440 | |
| KNO3 | 80 | 1900 | 1900 |
| Ca(NO3) 2 . 4 H2O | 300 | ||
| H3BO3 | 1,5 | 6,2 | 6,2 |
| MgSO4. 7 H2O | 720 | 370 | 370 |
| Na2SO4 | 200 | ||
| NH4NO3 | 1650 | 1650 | |
| KH2PO4 | 170 | 170 | |
| NaH3PO4 | 16,5 | ||
| Fe2(SO4J3 | 2,5 | ||
| FeSO4. 7 H2O | 27,8 | 27,84 | |
| Na2EDTA | 37,34 | ||
| MnSO4. 4 H2O | 7 | 22,3 | 22,3 |
| ZnSO4. 7 H2O | 3 | 11,5 | 8,6 |
| KI | 0,75 | 0,83 | 0,83 |
| CuBO4 . 5H2O | 0,0025 | 0,025 | 0,035 |
| MoO2 | 0,00015 | ||
| Na3MoO2 . 2 H2O | 0,25 | 0,25 | |
| CoCl2 . 6 H2O | 0,025 | 0,025 | |
| Thiamin-HCl | 0,1 | 0,1 | |
| Pyridoxin-HCl | 0,1 | 0,5 | |
| Nikotinsäure | 0,5 | 0,5 | |
| Myoinositol | 100 | 100 | |
| Glycin | 3,0 | 2,0 | |
| Kinetin | 0,2 | 0,2 | |
| Indolessigsäure | 2,0 | 2,0 | |
| Sukrose | 20000 | 30000 | 30000 |
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ErfindungsgeraäS werden z.B. zwecks Gewebekultivierung des
Pflanzenkörpers der Lakritzepflanze Fragmente von Blättern, Stielen, Wurzel, Blüten, Samen oder weiteren Organen oder
Geweben der Pflanze gewaschen, oberflächensterilisiert, auf ein steriles Agarmedium zwecks Gewebekultur aufgebracht, das in
einem Erlenmeyer Kolben vorliegt, der mit Baumwolle ausgestopft ist, und eine Zusammensetzung gleich derjenigen nach
der Tabelle I aufweist, und bei 25-3O°C inkubiert. Die Fragmente der Organe oder Gewebe quellen und es resultiert nach
2-3 Wochen weißer oder gelblich weißer callus. Dieser callus kann stufenweise vermittels Wiederholen der gleichen Kultur
auf festem Medium reiner gestaltet werden, d.h. vermittels Beimpfen frischen festen Mediums mehrmals mit kleinen Callusstücken,
die von dem bei der vorhergehenden Kultur auf festem Medium erhaltenen Callus abgeschnitten worden sind.
Der so auf dem festen Medium erneut gebildete und raffinierte callus wird sodann in ein flüssiges Medium eingeimpft, daß
eine der in der Tabelle I beschriebenen Zusammensetzungen aufweist und auf einem Schüttler bei Temperaturen von 25-3O°C
2-3 Wochen lang kultiviert. Der Impfstoff beträgt etwa 3 g (auf der Frischgewichtsgrundlage) des callus pro 100 ml flüssigen
Mediums, und der callus pflanzt sich in der Kulturbrühe in Form einer flockigen Suspension fort, «.d.h. als "Lakrltzezellen".
Diese Lakritzezellen werden feiner ausgebildet vermittels Wiederholen der gleichen Schüttelkultur im flüssigen
Medium, d.h. vermittels Beimpfen frischen flüssigen Mediums mehrmals mit einem Teil der zuvor kultivierten und die Lakritzezellen
enthaltenden Brühe.
Die durch Schüttelkultur erhaltene Kulturbrühe wird in ein flüssiges Medium in einer Fermentiervorrichtung aus rostfreiem
Stahl eingeimpft und unter Belüftung kultiviert, wobei leicht gerührt wird. Die Menge des Impfstoffes beträgt 1/10 der Menge
des gesamten Mediums und ein intensives Rühren hat sich als unzweckmäßig erwiesen, da hierdurch die Membranen der Lakritzezellen
brechen. Die zur Belüftung erforderliche Luft beträgt
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— ο —
0,5 -2,0 Liter/Liter Medium/Minute und die Kultivierungszeit
2-3 Wochen, d.h. gleich wie bei der oben angegebenen Schüttelkultur. Die Ausbeute an Trockengewicht dieser Lakritzezellen
berträgt 30-35% des in der Kulturbrühe verbrauchten Zuckers
und beläuft sich auf 5,7 g pro Liter Medium.
In Verbindung mit der obigen Erläuterung wird beobachtet, daß 2-3 Wochen für jede Agar-Mediumkuttur erforderlich sind, d.h.
flüssige Schüttelkultur und flüssige Belüftungskultur unter Rühren, wobei die Gesamtzeit 6-9 Wochen beträgt, um eine die
Lakritzezellen als Rohprodukt enthaltende Kulturbrühe für den erfindungsgemäßen Lakritzeextrakt zu erhalten, und weiterhin
wird die geaamte Kulturzeit bemerkenswert verlängert, wenn
sowohl die Agarmediumkiltur als auch die flüssige Schüttelkultur in der oben beschriebenen Weise wiederholt werden.
Wenn jedoch die Kulturbrühe, in der sich die Lakritzezellen in homogener Suspension fortgepflanzt haben, einmal in der
Belüftungskultur unter Rühren erhalten worden ist, kann die Kulturbrühe praktisch in einer kürzeren Zeitspanne bei Anwenden
eines derartigen halbkontinuierlichen Verfahrens erhalten werden, wobei ein Teil der Kulturbrühe abgenommen wird
und der weitere Teil derselben in der Fermentiervorrichtung verbleibt und der verbleibenden Brühe frisches steriles
Medium zugesetzt wird, um so dieselbe zu der Lakritzezellen-Kultur zurückzuführen. Wenn z.B. etwa die Hälfte des Volumens
der Kulturbrühe aus der Fermentiervorrichtung entnommen wird und die Belüftungskultur unter Zuführen frischen Mediums zu
der Fermentiervorrichtungfortgesetzt wird, wird die sich anschließende logarithmische Wachstumsphase der Lakritzezellen
angenähert in 5-7 Tagen beendigt sein und somit kann eine Hälfte der angenähert fertiggestellten Kulturbrühe alle
5-7 Tage erhalten werden.
Erfindungsgemäß werden die Lakritzezellen und die vermittels Gewebekultur von Lakritzepflanzen erhaltene Kulturbrühe in
ein Lakritzeextrakt-artiges Produkt für die Tabakwürze aufgearbeitet. D.h. die die Lakritzezellen enthaltende Kulturbrühe
wird unter Rückfluß 1-2 Stunden erhitzt, um die Bestandteile
-T-
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der Lakritzezellen in die flüssige Phase zu extrahieren und diese erhitzte Kulturbrühe wird nach dem Abkühlen und Filtrieren
auf 1/40 - 1/50 ihres Volumens konzentriert. Dieser konzentrierte Extrakt enthält viel Saccharid und eine geringe
Menge Glycyrrhizin, besitzt jedoch ein so gutes Aroma, daß derselbe als Würze für Tabak geeignet ist.
Die Tabellen II und III zeigen ein Beispiel der Zusammensetzung des erfindungsgemäß hergestellten Lakritzeextrakt-artigen Produktes
und die Testergebnisse mit Zigaretten, die mit diesem Produkt gewürzt worden sind. Der spezifische Extraktgehalt,
Zucker als auch reduzierter Zucker und Glycyrrhizin in der Tabelle II wurden entsprechend dem Ostwalt"sehen Verfahren,
Somogyi's Verfahren und Robert H. Curdiff·sehen Verfahren geschätzt
(Analytical Chem. 36, 1871 (1964)). Der "Fühltest" (unter Anwenden des Paartest-Verfahrens durchgeführt von
einer Gruppe von 6 Experten) in der Tabelle III wird ausgerückt durch die Anzahl der Personen, die sich günstig bezüglich
des Gerüchts, Geschmacks, Milde und physiologischer Leichtigkeit der Zigaretten geäußert haben, die unter Anwenden
der entsprechenden Lakritzextrakte, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden im Gegensatz
zu herkömmlichem Lakritzenextrakt, gewürzt worden sind. Hierbei sind beide Extrakte aus Glycyrrhiza glabra Linne var.
glanduilfera RgI. et Herd gewonnen.
spezifischer Extraktgehalt 1200
Zucker 36,2%
reduzierter Zucker 32,3%
Glycyrrhizin 1,84%
Feuchtigkeitsgehalt 60 %
Anzahl der Personen, die Geschmack sich günstig äußerten
Lakritzeextrakt 0 stark süß
erfindungsgemäßes Lakritze-Extrakt-artiges Produkt 6 mild und angenehm.
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Von den Tabellen II und III ergibt sich, daß das erfindungsgemäßhergestellte
Lakritzeextrakt-artige Produkt ausgezeichnet als Tabakwürze trotz des swhr geringen Gehaltes an Glycyrrhizin
ist.
Erfindungseiaäß belaufen sich die Gehalte an Glycyrrhizin in
der gewebekultivierte Brühe der Lakritzepflanzen auf 0,020
- 0,025% bezogen auf das Gewicht der Gesamtbrühe und das in den Lakritzezellen vorliegende Glycyrrhizin beläuft sich
auf 3-4% bezogen auf das Trockengewicht derselben.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung:
W
Beispiel 1
Es wird ein Wurzelfragment von Glycyrrhiza glabra Linne var. glandulifera RgI. et Herd, mit entionisiertem Wasser gewaschen,
einige Sekunden in 95% Äthanol eingeweicht und weiterhin in 2% Natriumhypochloritlösung etwa 10 Minuten und sodann mit
sterilem Wasser gewaschen. Dieses Wurzelfragment wird auf ein steriliseirtes festes Kulturmedium gebracht, das vermittels
Zusatz von 1% Agar zu der Masse des Linsmaier & Skoog's Medium wie in der Tabelle I gezeigt hergestellt worden ist und in
einen mit Baumwolle ausgestopften Erlenmeyer-Kolben eingebracht. Es wird bei Temperaturen von 26-3O°C etwa 3 Wochen inkubiert.
Nachdem das Wurzelfragment gequollen und in Berührung mit dem
fc festen Medium gebracht worden ist, bildet sich an der Berührungsstelle callus. Dieser callus wird abgeschnitten auf ein frisches
Medium der gleichen Zusammensetzung überführt und in der oben
beschriebenen Weise kultiviert. Nachdem diese Kultivierung des callus dreimal wiederholt worden ist, werden 3 g (auf der
Grundlage des Frischgewichtes) des in der letzten Kulturstufe
gebildeten callus in 100 ml flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung eingeimpft, jedoch ohne Agar, das in einem
500 ml Sakaguchi Kolben vorliegt und auf einer Schüttelvorrichtung
bei Temperaturen von 28-3O°C kultiviert. Nach etwa 3 Wochen haben sich Lakritzezellen in Suspension in der Lösung
fortgepflanzt. Etwa 10 ml dieser Kulturbrühe werden in 100 ml frisches Medium der gleichen Zusammensetzung überführt und der
Schüttelkultur unterworfen. Nach einer derartigen Kultivierung
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die fünfmal wiederholt wird wird eine Kulturbrühe erhalten, in der Lkaritzezellen wesentlich feiner und einheitlicher
dispergiert vorliegen.
Etwa 100 ml dieser Kulturbrühe werden sodann in 1 Liter flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung in einem
3-Liter Kblben eingeimpft und 2 Wochen schüttelkultiviert. Die in dem 3 Liter Koben erhaltene Kulturbrühe wird sodann
in 11 Liter flüssiges Medium, das in einer 15 Liter Jar-Fermentiervorrichtung gehalten wird, eingeimpft und bei einer
Temperatur von 28°C unter einer Belüftungsgeschwindigkeit von 8 Liter/min, und Rühren mit 50 ü/min. kultiviert. Nach
etwa 2 Wochen werden angenähert 5 Liter, d.h. die Hälfte der Kulturbrühe in der Fermentiervorrichtung, in der sich
die Lakritzezellen in Suspension fortgepflanzt haben, abgenommen und 5,5 Liter frisches Medium, das getrennt hergestellt
und sterilisiert worden ist, der Fermentiervortichtung
zugeführt. Es erfolgt eine Belüftungskultur unter Rühren under den gleichen wie oben beschriebenen Bedingungen mit
der Ausnahme, daß die Belüftungsgeschwindigkeit auf 12 Liter/ min. erhöht wird. Nach 6 Tagen werden etwa 5 Liter der Kulturbrühe
in ähnlicher Weise abgenommen und frisches Medium der Fermentiervorrichtung zugeführt. Es werden somit Lakritzezellen
in einer Menge von etwa 6 g Trockengewicht pro Liter der Kulturbrühe durchschnittlich alle 6 Tage erhalten durch
Wiederholen der oben angegebenen halbkontinuilerliehen Kultivierung
der Lakritzezellen.
Es werden 10 Liter der in der obigen Weise gesammelten und 58 g Lakritzezellen enthaltenden Kulturbrühe unter Anwenden
eines Rückflußkondensers 2 Stunden erhitzt und die Brühe nach dem Abkühlen filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem
Druck konzentriert unter Erzielen von 25Og Lakritzeextrakt-Produkt.
Die mit einer lO-fachen wässrigen Berdünnung dieses Lakritzeextraktes besprühten Zigaretten haben einen guten
Geruch und Geschmack.
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Es werden Lakritzezellen in der gleichen wie im Beispiel 1 beschriebenen
Arbeitsweise fortgepflanzt mit der Ausnahme, daß ein Fragment eines Stiels von G. uralensis D.C. anstelle eines
Wurzelfragmentes von Glycyrrhiza glabra Linne var. glanduliefera RgI.et Herd, angewandt wird. Es werden 10 1 52 g LakritzezeIlen
enthaltende Kulturbrühe erhitzt, filtriert und in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben konzentriert. Man erhält
215 g Lakritzeextrakt zum Würzen von Tabak.
Es werden Lakritzezellen in der gleichen wie im Beispiel 1 ^ beschriebenen Arbeitsweise fortgepflanzt mit der Ausnahme, daß
ein Fragment eines Blattes von G. echinata L. anstelle eines Wurzelfragments von Glycyrrhiza glabra Linne var. glandulifera
RgI. et Herd, angewandt wird. IO 1 der 55 g Lakritzezellen
enthaltenden Kulturbrühe werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt und man erhält 215 g
Lakritze-Extrakt zum Würzen von Tabak.
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Claims (2)
1. Verfahren zum Herstellen von Lakritzeextrakt-artigem Produkt zum Würzen von Tabak, gekennzeichnet durch die folgenden Arbitsschritte:
(1) Kultivieren eines Fragmentes eines Pflanzenkörpers der
Lakritzepflanze auf einem festen Medium für die Pflanzengewebe-Kultur bestehend aus Saccharid, anorganischen Salzen, Auxinen,
Kytokininen, Vitaminen und Aminosäuren unter Ableiten eines amorphen Klumpens der Zellen, d.h. callus, auf dem festen Medium;
(2) Beimpfen des callus in ein flüssiges Medium der gleichen Zusammensetzung und Kultivieren desselben under aeroben Bedingungen,
so daß sich derselbe in Form von Lakritzezellen suspendiert in der Flüssigkeit fortfplanzt;
(3) Erhitzen der Kulturbrühe, die die Lakritzezellen enthält unter Anwenden eines Ruckflußkondensers;
(4) Filtrieren der Brühe nachdem diesebe abgekühlt worden ist;
(5) Konzentrieren des Filtrates auf 1/40-1/50 seines Volumens, um dasselbe in einen konzentrierten Extrakt zu überführen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lakritzepflanze ein Glied der Gruppe bestehend aus Glycyrrhiza
glabra L., G. glabra Linne var. glandulifera RgI. et Herd., G. uralensis D.C. und G. echinata L. ist.
Dipl.-Ing. P. E. Meissner
Patentanwalt
209823/09S8
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