DE2224336A1 - Erzeugung von Metaboliten durch Synthese in Pflanzenzellen - Google Patents

Description

, EÄTENTÄNW/fCTE

DR. I. MAAS
DR. F. VOITHENLEITNER

8 MÜNCHEN 40
SCHLEISSHEIMERSTR.299-TEL 3592201/205

24 154

American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, V.St.A.

Erzeugung von Metaboliten durch Synthese in Pflanzenzellen

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von chemischen Substanzen durch Züchten von Pflanzengeweben unter submersaeroben Bedingungen in Flüssigkultur und betrifft insbesondere die Herstellung von chemischen Pflanzenstoffwechselprodukten.

Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß Pflanzengewebe unabhängig von der ganzen Pflanze durch Züchten des Gewebes unter Bedingungen vermehrt werden kann, die allgemein den Bedingungen ähnlich sind, die zur Züchtung von Microorganismen für die Produktion von Antibiotica und dergleichen angewandt werden. Es ist anerkannt worden, daß solche Pflanzengewebekulturen eine potentielle Quelle für wertvolle chemische Pflanzenmetaboliten, d.h. chemische Substanzen, die während des normalen Wachstums der Pflanzen erzeugt werden, darstellen. Bisher wurde jedoch diese Möglichkeit trotz des offensichtlichen Vorteils völlig geregelter Wachstumsbedingungen, die Pflanzengewöbekulturen im Vergleich zu üblichen Agrikulturmethoden bieten,

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nicht verwirklicht. So wurde bereits vorgeschlagen, wertvolle Pflanzenmetaboliten durch Züchten ganzer Wurzelorgane unter submers-aeroben Bedingungen in einem geeigneten wässrigen Nährmedium nach einer Arbeitsweise, die der zur Produktion von Antibiotica angewandten genau analog ist, zu erzeugen. Diese Technik hat zwar im Laboratorium mäßigen Erfolg erreicht, es erscheint jedoch unwahrscheinlich, daß sie gewerblich verwertbar ist, hauptsächlich wegen der mechanischen Probleme der Züchtung und Verarbeitung einer großen Masse von grobem faserartigem Wurzelmaterial. Ein anderer Lösungsversuch beruhte auf der Züchtung von undifferenzierten einzelnen Zellen der Pflanze. Da selbst eine einzelne Zelle einer Pflanze die gesamte genetische Information enthält, die für die Pflanze als Ganzes charakteristisch ist, erscheint die Erwartung begründet, daß die Züchtung von einzelnen Pflanzenzellen unter geeigneten Bedingungen zur Erzeugung der Metaboliten führt, die normalerweise bei der betreffenden Pflanze auftreten. In der Tat sind einige Berichte veröffentlicht worden, wonach normale Pflanzenmetaboliten in dispersen nominell undifferenzierten Zellenwuchssystemen nachgewiesen wurden. Selbst wenn jedoch die Berichte über diese früheren Arbeiten für bare Münze genommen werden, liegen die erzielten Metabolitkonzentrationen erheblich unter denen, die bei der normalen Pflanzenentwicklung erreicht werden. Eine solche Züchtung von undifferenzierten Zellen hat daher keine praktische Anwendung gefunden.

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Pflanzenmetaboliten in vorteilhaften Mengen durch Suspensionskultur erhalten werden können, indem Organprimordien einer Pflanze, die den Metaboliten bekanntermaßen entwickelt, durch Verminderung der Konzentration an

2 0 9 8 4 9/0858 _or|G)nal

Auxinaktivität in einem wässrigen aeroben Nährmedium mit wachsenden undifferenzierten Zellen oder Zellhaufen der darin untergetauchten Pflanze erzeugt und die erhaltenen Organprimordien kultiviert werden, bis die vorteilhaften Mengen an Pflanzenmetaboliten erhalten werden.

Dies wird erreicht/ indem ein wässriges Nährmedium mit kräftig wachsenden undifferenzierten Zellen der Pflanze, die bekanntermaßen den Metaboliten entwickelt, inokuliert wird. Die undifferenzierten Zellen werden in dem Medium einige Zeit unter submers-aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Substanz, die dem Medium Auxinaktivität verleiht, wachsen gelassen. Dann wird die Konzentration der Auxinaktivität vermindert, wodurch eine Redifferenzierung der Pflanzenzellen unter Auftreten von Pfanzenorganprimordien und der gleichzeitigen Entwicklung des Metaboliten stattfindet. Die redifferenzierten Pflanzenzellen in dem Medium werden einige Zeit unter submers-aeroben Bedingungen wachsen gelassen, wodurch eine Masse erzeugt wird, die als "reife Vollmaische" bezeichnet wird. Dieses Wachstum führt zur Ansammlung vorteilhafter Mengen der Metaboliten, die dann durch übliche Methoden isoliert und gewonnen werden.

Der Begriff "Primordium" , wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein rudimentäres Organ, das analoge mikroskopische Strukturelemente enthält, wie sie in dem entsprechenden Organ des normalen Pflanzenembryos in einem Abschnitt seiner Entwicklung zu sehen sind. So können die Primordien Wurzelprimordien," die embryonalem Wurzelgewebe erkennbar, ähnlich sind, Cotyledonprimordien, die den Embryonalstufen der Cotyledonentwicklung ähnlich sind,und Stengel- und Sproßprimordien, die wiederum solchen Teilen des normalen Embryos in einem Abschnitt seiner Entwicklung analog sind, sein. Unter gewissen Umständen können

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~⁴~ 2 2 2 Λ 3 3 G

komplexere Primordien auftreten, die Elemente von mehr als einer embryonalen Komponente enthalten, und in manchen Fällen können sogar ganze embryoidale Strukturen erscheinen, die dann als Primordien der ganzen Pflanze angesehen werden.

Es ist für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich, daß die undifferenzierten Zellen oder Zellhaufen unter Bedingungen, die für die Redifferenzierung und die Ausbildung von Primordien günstig sind, weiter gezüchtet werden. So wurde gefunden, daß in solchen Fällen, in denen keine Zelldifferenzierung aufgetreten ist oder ihr Auftreten behindert worden ist, keine Bildung von normalen chemischen Metaboliten stattfindet. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einigen der veröffentlichten Arbeiten über Einzelzellkulturen und die der Erfindung zugrundeliegenden eigenen Versuche stützen im Gegenteil die Theorie, daß die Bildung chemischer Metaboliten, die in geringem Ausmaß in nominell undifferenzierten Zellsystemen von früheren Bearbeitern beobachtet wurde, wahrscheinlich durch das Vorliegen '/on differenzierten Zentren in Zellhaufen der Systeme bedingt war, wenn dies auch nicht erkannt wurde. Jedenfalls werden erfindungs· gemäß Wachstumsbedingungen angewandt, die zur Bildung von Primordien in beträchtlichem Ausmaß führen, während bisher Wachstumsbedingungen gewählt wurden, die für die Erhaltung von undifferenzierten Zellen günstig waren, d.h. die Bildung von Primordien wurde absichtlich verhütet.

Als Beispiele für die Arten von chemischen Pflanzenmetaboliten, die auf dem erfindungsgemäßen Wege erhalten werden können, sind zu nennen: Alkaloide, zum Beispiel Strychnin und Brucin aus Strychnos-Arten; die Rauwolfiaalkaloide aus Rauwolfia- oder Alstonia-Arten;

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Vinblastin aus der Art Catharanthus (früher Vinca); Atropaalkaloide aus den Arten Beta vulgaris und Malva; Farbstoffe aus den Arten Indigofera, Rhus, Beta und Lawsonia; essentielle öle aus den Arten Mentha, Lavandula und Rosa; Pesticide aus den Arten Chrysanthemum, Derris und Lonchocarpus; Harze aus Pinus- und Juniperusarten; Kautschuk aus den Arten Parthenium argentatum, Heva, Ficus und Taraxacum; Aromastoffe aus den Arten Sassafras, Smilax und Betula; Herzglycoside aus Convaleria und Digitalis; usw. Eine ausführliche Aufstellung von nützlichen Pflanzenmetaboliten kann aus Handbüchern entnommen werden. Die Natur der chemischen Pflanzenmetaboliten, die erfindungsgemäß erhältlich sind, kann jedoch nicht mit Hilfe von einzelnen Pflanzengattungen (genera) oder -familien (familiae)und noch weniger mit Hilfe der tatsächlichen Produkte definiert werden, da die Erfindung allgemeine Anwendbarkeit auf den gesamten samenbildenden Teil des Pflanzenreichs, d.h. auf den Stamm (phylum) Spermatophyta hat, der einige 300 QOO Arten (species) umfaßt.

Für die Durchführung des submersed Züchtiangsverfahrens nach der Erfindung wird ein wässriges Medium wsrweadet, das eine oder mehrere metabolisierbare Kohlenstoffquellen, zum Beispiel Kohlenhydrate oder Fettsäurederivat©, und eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, zum Beispiel Nitrationen, Ammoniuraionen, Glycin oder Harnstoff enthält. Die Bedürfnisse der verschiedenen Typen von Pflansengewebe sind im einzelnen etwas unterschiedlich. Stoffe wie Glucose, Saccharose, Maissirup, Stärke, Dextrose und andere Substanzen dieser Art können jedoch als bevorzugte Kohlenstoffquelle verwendet werden. Außerdem enthält das Nährmedium Mineralsalze, darunter Phosphate, Chloride, Sulfate und Metalle, darunter Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und solche Elemente, die in Spurenmengen erforderlich sind. Die Spurenmetalle sind normalerweise als

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Verunreinigungen in allen außer den am höchsten gereinigten anorganischen Verbindungen enthalten. Wenn gereinigte Chemikalien in den Medien verwendet werden, können sie eigens zugesetzt werden. Der optimale Mineralbedarf der jeweils verwendeten Kultur kann durch Routineversuche ermittelt werden. Häufig sind Mischungen von Metallsalzen, wie sie in Medien für Pilzfermentationen verwendet werden, sehr geeignet. Eine weitere Komponente der Grundmedien außer einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und Mineralsalzen sind Vitamine. Im allgemeinen können wenigstens eines oder mehrere der üblichen Vitamine für ein optimales Wachstum der Pflanzengewebe in dem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich sein. Zu diesen Vitaminen gehören Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure und Niacin. Durch eine Mischung dieser Vitamine wird ein befriedigendes Wachstum gewährleistet. Besonders vorteilhaft ist eine rohe Vitaminquelle, zum Beispiel Hefeextrakt. Wie im Fall der Mineralsalze kann der Vitaminbedarf des jeweils verwendeten Gewebes verhältnismäßig leicht festgestellt werden. Im allgemeinen wird eine mit Mineralen und Vitaminen verstärkte Kohlenhydratlösung zur Züchtung der Pflanzengewebe verwendet. Geeignete Bereiche für die Nährstoffe in Milliäquivalent pro Liter sind Kalium, 2 bis 20; Ammonium, 5 bis 50; Magnesium, 0,2 bis 2; Calcium, 0,5 bis 5; Phosphor, 0,25 bis 2,5; und Nitrat, 0 bis 50. Kohlenhydrate werden zweckmäßig in Mengen von 5 bis 50 g/l und vorzugsweise 10 bis 30 g/l angewandt. Wenn eine auxinaktive Substanz zur Förderung des richtigen Wachstums eines undiffsrenzierten Pflanzenmaterials verwendet wird, soll sie in festen oder flüssigen Medien in sehr verdünnter Konsentration angewandt werden. Geeignet ist eine

—4 =-? ~6

1 χ 10 bis 0,5 χ 10 ' und vorzugsweise etwa 5 χ 10 molare Konzentration, jedoch können etwas höhere oder niedrigere Konzentrationen angewandt werden«

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Der Begriff "Auxin", wie er hierin verwendet wird, ist eine allgemeine Bezeichnung für die wuchsfördernden Phytohormone oder wachstumsregulierenden Bestandteile von Pflanzen. Zu natürlichen Auxinen, d.h. Substanzen, die wachstumsregulierende Aktivität zeigen und in lebenden ganzen Pflanzen vorkommen, werden im allgemeinen 3-Indolessigsäure und gewisse Derivate davon gerechnet, zum Beispiel ihre Ester, Glycoside, usw. Auxinaktive Substanzen umfassen die natürlichen Auxine sowie künstlich hergestellte chemische Verbindungen, die wachstumsfördernde phytohormonale Aktivität besitzen. Auxinaktive Substanzen werden manchmal als das Wachstum von embryonalen Zellen stimulierende Stoffe bezeichnet. Typische auxinaktive Substanzen, die für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet sind, sind allgemein bekannt. Beispiele dafür sind 3-Indolessigsäure, 3-Indolbuttersäiire, 1-Naphthalinessigsäure, p-Chlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure und dergleichen. Ebenfalls bekannt sind "Antiauxin"-Verbindungen, d.h. Verbindungen, welche die phytohormonale Aktivität der auxinaktiven Substanzen hemmen oder neutralisieren können. Typische bekannte Antiauxine sind beispielsweise 1-Naphthoxyessigsäure, Zimtsäure, Tropasäure, 2,3,5= Trijodbenzoesäure und 2,4,6-Trichlorphenoxyessigsäure»

Verschiedene Nährmedien für die Züchtung von undifferenzierten Pflanzenzellen sind in der Literatur beschrieben worden. Beispielsweise besteht ein adaptierter Ansatz eines von P.R.White in der Literatur angegebenen Mediums aus folgenden Bestandteilen:

ORIQiMAL INSFEOTiD 209849/0858

"•ft —

222A336

Konzentration Komponente mg/1

Calciumnitrat 200

Magnesiumsulfat 360 Kaliumnitrat 80

Kaliumchlorid 65

Natriumsulfat 200 Natriumdihydrogenphosphat 16,5

Ferrosulfat 2,5

Kaliumjodid 0,75

Manganosulfat 4,50

Zinksulfat 1,50

Borsäure 1,50

Thiamin 0,1

Pyridoxin 0,1

Nicotinsäure 0,5

Glycin 3,0

Saccharose 20 000

Naphthalinessigsäure nach Bedarf

Geeignet ist ferner das bekannte Grundnährmedium nach Heller, das folgende Bestandteile enthält:

Komponente

Kaliumchlorid Natriumnitrat Magnesiumsulfatheptahydrat Natriumdihydrogenphosphathydrat Calciumchloriddihydrat Saccharose

plus folgende Mikronährstoffe:

Ferrichlorid Zinksulfat Borsäure Manganosulfat Cuprisulfat Aluminiumchlorid Nickelchlorid Kaliumjodid Natriummolybdat

Konzentration	,0
mg/1	,0
750	,0
600	,1
250	,03
125	,03
75	,03
20 000	,01
1	,03
1
1
0
0
0
0
0
0

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Diese Medien sowie die verschiedenen anderen, die ebenfalls in der Literatur beschrieben sind, werden in der erforderlichen Weise für den jeweiligen Zweck mit auxinaktiven Verbindungen oder Antiauxinen und/oder Cytokinenen ergänzt. Das jeweilige Grundmedium hat jedoch allgemein keine große Bedeutung, sondern dient lediglich dem Zweck, das Wachstum eines bestimmten Pflanzenmaterials zu optimieren. Es wurde gefunden, daß das Medium nach Linsmaier und Skoog (vgl. Beispiel 29) oder das nach Gambory (vgl. Beispiel 10) ein angemessenes Grundmedium ist, aus dem optimale Medien für Pflanzenmaterial aller Arten entwickelt werden können.

Zur praktischen Anwendung der Erfindung ist es erforderlich, zunächst eine kräftig wachsende undifferenzierte Zellkultur der gewünschten Species zu erzeugen, und die Kenntnisse auf dem Gebiet der Pflanzengewebekultur haben sieh nunmehr soweit entwickelt, daß dies nach Belieben durch einfache Experimente geschehen kann. Beispielsweise kann eine Einzelzellenkultur von Catharanthus roseus durch Inokulieren der Oberfläche von Schrägagar, das aus eisern Nährmedium, das eine auxinaktive Substanz enthält,, bereitet ist, mit keimfreien lebenden Stengelabschnitten von Catharanthus roseus erhalten werden. Vorteilhafterweise wird ein Cytokinen, zum Beispiel Kinetin oder Zeatin„ als Zellteilungshilfsfaktor zugesetzte Das Währmedium enthält die üblichen Hauptmineral·= und Spurenelemente _g eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und für Stickstoff, zum Beispiel Ammonium- oder Mitrationen, und vorzugsweise ein oder mehrere Vitamine der B-Gruppe. Nach einer Inkubationsdauer von einigen Tagen bis Wochen bei 15 bis 35 ⁰C wird beobachtet, daß sich an dem ursprünglichen Inoculumsegment "Kailus"-Gewebe, das aus einem Verband oder Haufen von unorganisiertem neuem Zellenwuchs besteht, gebildet hat. Dieses neue Wachstum wird abgeschnitten

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und aseptisch auf frisches Schrägagar oder vorzugsweise in flüssiges Medium mit der gleichen Zusammensetzung (ohne das Agar) überführt und auf einer Schüttelvorrichtung, wiederum bei 15 bis 35 ⁰C, inkubiert. Wenn weiteres Wachstum stattfindet, werden eine Unterteilung und weitere Übertragungen des Zellenmaterials auf frisches Medium vorgenommen, wobei besonders darauf geachtet wird, daß bevorzugt kleinere Aggregate, die sich in der vorhergehenden Inkubationsstufe entwickelt haben, übertragen werden. Nach mehreren solchen Übertragungen auf frisches Medium zeigt sich, daß eine Umwandlung des Materials in eine stärker zerstreute Wuchsform stattgefunden» hat, und durch sachgemäßes Arbeiten ist es möglich, zu einem System zu gelangen, das praktisch völlig aus einem Haufen von undifferenzierten Zellen oder einzelnen undifferensierten Zellen besteht, die in dem flüssigen Medium dispergiert sind. Dies ist der ideale Zustand für die ErhaltungsZüchtung des Stammklons. Mit diesem Material können nun Selektionen oder Mutationen des Pflanzenorganismus in genau der gleichen Weise vorgenommen werden, wie solche Maßnahme» bei Mikroorganismen durchgeführt werden. So kann ein® Selektion von neuen Zellkulturlinien (Zellstämmen) aus einer solchen Population entweder mit oder ohne begleitende Mutationsmaßnahmen aufgrund der Zellmorphologie, Pigmentbildung (oder deren Fehlen), Wuchsgeschwindigkeit , Wuchsfähigkeit auf einem bestimmten Medium oder ganz allgemein aufgrund irgendeines der Faktoren erfolgen, die für die klassische Selektion von industriellen Mikrobenkulturen benutzt werden. Am zweckmäßigsten erfolgt die Selektion aufgrund der Fähigkeit aur Bildung einer vermehrten Menge des gewünschten Metaboliten in der produktiven differenzierten Stufe und diese Selektion wird aufgrund von Probeergebnissen durchgeführt.

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2 2 2 Λ 3 3

Das Medium und andere Wachstumsbedingungen, die nötig sind, um die undifferenzierten einzelnen Pflanzenzellen oder Zellhaufen zum Redifferenzieren bis zum Punkt der Bildung von Primordien und damit zum Eintritt in die Phase der Produktion von chemischen Metaboliten zu veranlassen, werden ebenfalls durch Versuche ermittelt. Die Redifferenzierungsphase des Wachstums kann auf festen Medien oder in halbfesten breiartigen oder flüssigen Medien durchgeführt werden, die letzteren Medien werden jedoch bevorzugt. Vorzugsweise werden die undifferenzierten Zellen und Zellenhaufen, die als "Präembryonen" bezeichnet werden können, in einem submers-aeroben flüssigen System in genau der gleichen Weise gezüchtet, als ob sie Mikroorganismen wären, was sie in gewissem Sinn als freie Zellen auch sind. Für eine submers-aerobe Kultur wird das Medium nicht durch ein Geliermittel verfestigt, niedere Konzentrationen von Verdickungsmittel wie Agar oder Methylcellulose können jedoch nützlich sein, um die Viskosität und damit die Scherwirkung in dem gerührten System zu modifizieren. Sonst enthält das Wuchsmedium wiederum die üblichen Hauptmineral- und Spurenelementionen, verfügbaren Kohlenstoff, verfügbaren Stickstoff, Schwefel- und Phosphorquellen und ein oder mehrere B-Vitamine. Allgemein gesprochen wird der Übergang von dem undifferenzierten Zellenzustand" in die redifferenzierte Phase oder Metabolitenproduktionsphase durch Verminderung der Konzentration des Wuchsmediums an Auxinaktivität erreicht» Diese verminderte Konzentration an Auxinaktivität kann durch Überführung der undifferenzierten Zellen in ein Medium mit verminderter Konzentration an Auxinaktivität oder durch Verdünnen des Mediums der undifferenzierten Wachstumsphase mit frischem Medium, das keine Auxinaktivität enthält, oder durch Zusatz einer Antiauxinverbindung zu dem undifferenzierten Wachstumsphasenmedium, nachdem ein brauchbares Ausmaß an undifferenziertem Wachstum erreicht ist, erfolgen. In den Fällen, in denen

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die auxinaktive Substanz metabolisch unbeständig ist, zum Beispiel 3-Indolessigsäure, kann man die Konzentration an Auxinaktivität einfach natürlich mittels einer verlängerten Inkubationsdauer absinken lassen. Es ist schwierig oder unmöglich, einen absoluten Wert für die Auxinaktivität anzugeben, bei dem undifferenziertes Wachstum erhalten bleibt, da dieser Wert für verschiedene auxinaktive Verbindungen verschieden ist und auch für Zellen von verschiedenen Pflanzenarten unterschiedlich ist. Diese gegenseitige Abhängigkeit von Species und Auxinaktivitätskonzentration für aufrechterhaltenes undifferenziertes Wachstum ist wahrscheinlich eine Folge unterschiedlicher Empfindlichkeit verschiedener Arten gegen bestimmte auxinaktive Verbindungen und kann auch von der Menge an endogen erzeugtem Auxin abhängen, die sich ebenfalls von einer Art zu einer anderen ändert. Deshalb wird die optimale Konzentration für eine gegebene auxinaktive Substanz zur Erhaltung undifferenzierten Zellenwachstums einer gegebenen Pflanzenspecies durch Versuche ermittelt. Durch solche Versuche mit der gebräuchlichsten auxinaktiven Substanz, nämlich 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, wurde gefunden, daß etwa 2 bis 20 χ 10 Mol pro Liter der auxinaktiven Verbindung ausreichen, um undifferenziertes Zellenwachstum für viele Arten von Pflanzenmaterial zu erhalten. Bei einer zu hohen Konzentration an auxinaktiver Substanz treten Anzeichen von Toxicität, zum Beispiel schlechtes Wachstum oder sogar Zelltod, auf. Bei zu niedrigen Konzentrationen an auxinaktiver Verbindung bleibt die gewünschte undifferenzierte Wuchsform nicht erhalten. Stärker aktive auxinaktive Verbindungen, zum Beispiel 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, müssen in geringeren Konzentrationen angewandt werden., als sie

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oben für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure genannt wurden. Umgekehrt müssen weniger aktive Auxinsubstanzen, zum Beispiel 1-Naphthalinessigsäure, in etwas höheren Konzentrationen als den oben für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure genannten angewandt werden.

Wenn eine Redifferenzierung eines gegebenen Pflanzenmaterials durch Verminderung der Konzentration an Auxinaktivität herbeigeführt werden soll, ist es selbstverständlich zweckmäßig, wenn die Konzentration an auxinaktiver Verbindung in dem Medium der undifferenzierten Phase nicht wesentlich höher als die Menge ist, die nötig ist, um gerade ein Wachstum in der undifferenzierten Form aufrechtzuerhalten. Dann ist nur eine minimale Verdünnung mit auxinfreiern Medium erforderlich, um die Konzentration an Auxinaktivität auf den Wert zu senken, bei dem eine Redifferenzierung stattfinden kann. Im allgemeinen ist eine Verdünnung auf wenigstens das doppelte Volumen mit frischem auxinfreiem Medium erforderlich, um die Auxinaktivität von der Konzentration für das undifferenzierte Wachstum auf den Wert zu vermindern, der eine Redifferenzierung zuläßt. Verdünnungen in stärkerem Ausmaß ermöglichen die Anwendung von weniger kritischen höheren Konzentrationen an Auxinaktivität· in der undifferenzierten Phase. Wenn die Auxinaktivität durch Waschen der undifferenzierten Zellen entfernt wird, dann ist selbstverständlich keine Erhöhung des Endvolumens erforderlich. Dies gilt auch dann (d.h. es ist keine Volumenerhöhung erforderlich), wenn zur Verminderung der wirksamen Konzentration an Auxinaktivität ein Antiauxin zugesetzt wird.

Zur Einleitung des differenzierten Wachstums wird das geeignete Medium (mit niedrigerer Auxinaktivität), bezogen auf sein Volumen,mit 5 bis 50 % der dispersen (undifferenzierten) Wuchsphase inokuliert, die wie oben für

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Catharantus roseus beschrieben erhalten wird, und dann in einem geschüttelten, gedrehten, oder gerührten Gefäß bei 15 bis 35 ⁰C und vorzugsweise 20 bis 30 C inkubiert, bis organisiertes differenziertes Wachstum in dem gewünschten Ausmaß stattgefunden hat. Unter diesen Bedingungen nimmt das organisierte Wachstum die Form von kleinen rundlichen Gebilden, gewöhnlich mit 0,5 bis 4 mm in ihrer größten Abmessung, an, die eine mikroskopische odjer sogar makroskopische Struktur zeigen, die Strukturen entspricht, wie sie in einem Organ oder Organen der intakten Pflanze zu sehen sind.

Wenn ein befriedigendes Wachstum in der differenzierten Wuchsphase erreicht ist, d.h. wenn beträchtliche Mengen des gewünschten Metaboliten entstanden sind, gewöhnlich nach 3 Tagen bis 3 Wochen, wird die Aufschlämmung von Pflanzenprimordien geerntet und normalerweise anschließend zur Gewinnung des gewünschten Metabolitprodukts aufgearbeitet. Je nach der Natur des erzeugten Metaboliten kann dies durch Extraktion mit Lösungsmittel oder durch kurzes Kochen mit anschließender Filtration zur Entfernung der erschöpften festen Pflanzenteile und spezifische Fällung des gewünschten Produkts oder durch Abtrennung des Produkts durch Adsorption oder durch Ionenaustausch erfolgen. Die Isolierungsmethode folgt allgemein dem Verfahren, das zur Isolierung des betreffenden Metaboliten aus ganzen Pflanzen angewandt wird, und die Erfindung liegt nicht in der im Einzelfall angewandten Isolierungsmethode.

In manchen Fällen ist es nicht nötig, das gewünschte Stoffwechselprodukt aus der Masse der Pflanzenprimordien zu isolieren, sondern diese Masse selbst kann das gewünschte Produkt sein. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße

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Verfahren auf die Maiszüchtung mit hohem Lysingehalt ange wandt werden, so daß im Ergebnis billige Saccharose und Ammonium- oder Nitrationen in hochwertiges Protein umgewandelt werden.

Durch die folgenden Beispiele, in denen sich alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht beziehen, wenn nichts anderes angegeben ist, wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Einleitung und Erhaltung von Kalluswachstum von Beta vulgaris auf normalem Pflanzenmaterial auf verfestigtem Medium

Samen der gewöhnlichen roten Rübe Beta vulgaris, Varietät Detroit Select Globe, werden auf feuchtem Filterpapier gekeimt und nach völligem Auskeimen werden die gekeimten Sämlinge durch 5 Minuten langes Eintauchen in 1-prozentige Hatriumhypochloritlösung sterilisiert. (Von diesem Zeitpunkt ab werden alle Vor.gänge,an denen lebendes Gewebe beteiligt ist, unter streng aseptischen Bedingungen durchgeführt)» Die Keimlinge werden auf ein feuchtes steriles rundes Filterpapier überführt^ und in Wurzelsegmente, Hypoeotylsegmente und Cotyledonsegmente zerschnitten. Jedes dieser Segmente wird in getrennte 10 cm (4") Petrischalen überführt, die jeweils 30 ml des folgenden Mediums enthalten.

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MS-Medium

	Komponente	Konzen tration mg/1
	(Kaliumnitrat	950
Hauptmineral-	(Ammoniumnitrat	720
ionen und Stick	(Magnesiumsulfatheptahydrat	185
stoffquellen	(Calciumchloriddihydrat	220
	(Kaliumphosphat	68
	(Ferrosulfatheptahydrat	30
	(Manganosulfathydrat	7
	(Zinksulfatheptahydrat	4
Spurenelemente	(Borsäure, wasserfrei	2
	(Ammoniummolybdat	0,1
	(Kaliumjodid	0,4
	(Cuprisulfatpentahydrat	0,12

Kohlenstoffquelle

Saccharose

Verfestigungsmittel Agar

Vitamine

(Biotin

(Cholinchlorid

(Inosit

(Nicotinsäure

(Pantothensäure

(Pyridoxin

(Riboflavin

(Thiamin

20000 10000

1000 1 1 1 1 1

auxin-aktive
Verbindung

Cytokinin

2,4-Dichlorphenoxyessigsäure

Kinetin

Destilliertes Wasser bis auf 1 Liter

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Das Medium wird 20 Minuten im Autoklaven bei einem Wasserdampfdruck von 1,05 atü (15 psig) sterilisiert. Die inokulierten Schalen werden bei 25 ⁰C und gedämpftem Licht inkubiert. Nach 3 Wochen zeigen sich Klumpen von Kallusgewebe an den Enden mehrerer der ursprünglichen Inokulumstücke. Einige Schalen sind durch Pilz- oder Bakterienbewuchs kontaminiert und werden verworfen. Der Kallus, der auf den unkontaminierten Schalen erscheint, wird in 100 ml Kolben überführt, die jeweils 30 ml des gleichen Agarmediums enthalten, und die Inkubation wird weitere 5 Wochen unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Nach dieser Zeit hat genügend Wachstum stattgefunden, so daß Subkulturen auf mehrere weitere Kolben übertragen werden können.

Beispiel2

Einleitung von unorganisiertem Wachstum in flüssigem Medium und Selektion von Subklonen mit gewünschten Wuchseigenschaften

Aus jedem der mehreren Agarsubkulturkolben von Beispiel 1 wird ein Klumpen aus dunkelbraunem Kallusgewebe mit einem Durchmesser von etwa 8 mm in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 60 ml Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung, jedoch ohne das Agar, enthält. Diese Kolben, die nun das inokulierte flüssige Medium enthalten, werden auf eine Rotationsschüttelvorrichtung gebracht, die mit 120 UpM und einem Schüttelkreis von 25 mm arbeitet, und unter ständigem Schütteln in diffusem Licht 4 Wochen bei 25 ⁰C inkubiert. Nach dieser Zeit zeigen sich in den verschiedenen Kolben unterschiedliche Ergebnisse, die in gewissem Ausmaß die unbeabsichtigte Selektion "von Zelltypen i-yänrend der vorhergehenden Stufen wiedergeben_o Einige Kolben zeigen nur einen größeren Kallusklumpen _t einige enthalten den Stammklumpen sowie einige kleinere anscheinend identische

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Fragmente, die Sektoren darstellen, die aus dem Stammklumpen gewachsen sind und während der Inkubation abgebrochen sind, und einige Kolben enthalten abgebrochene Fragmente, die sich selbst im Aussehen unterscheiden und wahrscheinlich eine weitere Segregation von Zelltypen darstellen. '

Die Kolben, die kleinere Fragmente enthalten,und die Kolben, die Fragmente mit anderem Aussehen als dem der Stammklumpen enthalten, werden zur weiteren Subkultur ausgewählt. Nach 6 solchen Stufen weiterer Selektion,überführung und Inkubation wird eine Zellkulturlinie erhalten,welche die gewünschten Eigenschaften eines raschen Wachstums in Schüttelkolben und eines Wachstums in Form von völlig unpigmentierten einzelnen Zellen und kleinen Aggregaten mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm aufweist. Diese Aggregate zeigen anders als die Zellen der Pflanzenteile im Mikroskop keine Feinstruktur. Das Wachstum erfolgt mit solcher Geschwindigkeit, daß ausgehend von weniger als 1 Volumenprozent Zellen in dem Inokulum das Zellenvolumen nach 2 Wochen langer Inkubation auf der Rotationsschütte!vorrichtung 20 % des gesamten Flüssigkeitsvolumens beträgt. Diese Eigenschaften bleiben bei überführung in dem gleichen Medium stabil.

Beispiel 3

Einleitung von differenziertem Wachstum in Form von Pflanzen-Primordien in submers-aerober Flüssigkultur

Der Inhalt eines der Kolben. mit dispersem nichtpigmentiertem unorganisiertem Zellenmaterial von Beta vulgaris, wie es in Beispiel 2 erhalten wird, wird absitzen gelassen, und die überstehende klare Flüssigkeit wird abdekantiert und verworfen. Die abgesetzten Zellen and Zellhaufen werden zweimal gewaschen, iaicir jt.wsils 60 mxl au::infreies f liku."ic":■;£■· Medium

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(das Medium von Beispiel 1, jedoch ohne die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und auch ohne das Agar) zugesetzt werden und die freie Flüssigkeit abdekantiert wird, nachdem sich das Zellenmaterial abgesetzt hat. Dann werden jeweils gleiche Teile der gewaschenen Zellen zum Inokulieren von zehn 250 ml-Erlenmeyerkolben verwendet, von denen jeder 60 ml des auxinfreien flüssigen Mediums enthält. Die Kolben werden wie oben auf der Rotationsschüttelvorrichtung drei Wochen bei' 25 ⁰C inkubiert. Während dieser Inkubationszeit erfolgt eine beträchtliche Vermehrung der Inokulumzellen und -zellhaufen, und gegen Ende der Inkubationsdauer findet Redifferenzierung statt, wodurch sich eine Aufschlämmung von leuchtend orangefarbenen und roten Teilchen bildet, die, wie in einem wenig vergrößernden Mikroskop zu sehen ist, fast völlig aus winzigen Wurzelprimordien bestehen, von denen jedes das normale Pigment der verwendeten ursprünglichen Kulturrasse von Beta vulgaris in reichlichem Maße enthält.

Beispiel 4 Isolierung des Pigments

Die Aufschlämmung von Wurzelprimordien aus den zehn Kolben des vorhergehenden Beispiels wird filtriert. Zu diesem Zeitpunkt zeigt sich, daß das gesamte Pigment in der Zellenfraktion und keines in dem Filtrat, das verworfen wird, vorliegt. Die Zellenmasse wird in 500 ml Wasser wieder aufgeschlämmt, und die Mischung wird gekocht, wodurch, das Pigment in die Flüssigkeit abgegeben wird. Durch Filtration werden verbrauchte Zellen, die verworfen werden, von einem leuchtend-roten Filtrat abgetrennt, das zur weiteren Aufarbeitung langsam durch eine 2,5 cm χ 15 cm(l" χ 6")-

(R) Säule mit Kationenaustauscherharz Dowex 50X2 ^v geleitet wird, die praktisch das gesamte Pigment als 5 cm(2") breite leuchtend-rote Bande nahe am oberen Ende der Säule zurückhält. Das Pigment wird aus der Säule mit Hilfe einer

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1-prozentigen Natriuinbicarbonat lösung eluiert und aus dem Eluat durch Ansäuern auf pH 5, Gefriertrocknen der Lösung und Extrahieren des freien Betanidinpigments aus dem gefriergetrockneten Produkt mit Methanol isoliert. Betanidin ist als pflanzlicher Farbstoff zum Färben von Lebensmitteln vorteilhaft.

Beispiel 5 Züchtung von Beta vulgaris-Primordien in größerem Maßstab

Gewaschenes Inokulum wird wie in Beispiel 2 erzeugt, und 1 Kolben dieses Inokulums wird zum Inokulieren einer Zwischenkulturstufe verwendet, die aus 500 ml des flüssigen Mediums von Beispiel 3 besteht, das in einer 1-Liter-Borsilicatglasflasche enthalten ist. Nach 8 Tage langem Schütteln mit 120 UpM bei 25 ⁰C wird der gesamte Inhalt dieser Flasche zum Inokulieren von 10 Liter des gleichen Mediums verwendet, das in einem 20 Liter-Borsilicatglasballon enthalten ist. Dieses Medium wird dann unter Verwendung eines magnetischen Rührers zur Durchmischung und unter Durchleiten von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter pro Minute durch einen untergetauchten Sprühverteiler inkubiert. Das Produkt ist eine rote Aufschlämmung von Wurzelprimordien, die der Aufschlämmung, die in den Laboratoriumsschüttelkolbenkulturen erhalten wird, völlig analog ist.

Beispiel 6

Erzeugung undifferenzierter Zellkulturen von Digitalis purpurea durch Staubbeutelkultur

Von einer im Freien gezogenen Pflanze von Digitalis purpurea wird eine ungeöffnete Blütenknospe abgenommen und durch kurzes

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Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert. Die Knospe wird unter aseptischen Bedingungen zerschnitten, und die Staubbeutel werden auf die Agaroberflache einer Petrischale überführt, die 15 ml des verfestigten MS-Mediums, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,enthält. Nach 18 Tage langer Inkubation bei 28 °C sind mehrere kleine Kallusklumpen zu sehen, die aus den verpflanzten Staubbeuteln gewachsen sind. Nach weiteren 20 Tagen hat ein umfangreiches weiteres Wachstum der undifferenzierten Kallusklumpen stattgefunden. Die Kallushaufen werden abgetrennt, auf frische Agarplatten des gleichen Mediums überführt und auf diesem Medium gehalten, wobei alle 14 Tage eine überführung vorgenommen wird.

Beispiel 7

Wachstum undifferenzierter Zellen von Digitalis pupurea als disperse Kultur in Schüttelkolben

Kallushaufen mit einem Durchmesser von etwa 8 mm von einer Agarplatte von Beispiel 6 werden als Inokulum für fünf Erlenmeyerkolben verwendet, die jeweils 25 ml flüssiges steriles Medium mit folgender Zusammensetzung enthalten.

MMS-Medium

Konzentration Komponente mg/1

Kaliumnitrat 950

Magnesiumsulfatheptahydrat 185

Calciumchloriddihydrat ' 220

Kaliumdihydrogenphosphat 68

209849/085 8

plus die Spurenelemente, Saccharose, Vitamine, auxinaktive Verbindung und Cytokinen des MS-Mediums.

Nach 18 Tage langer Inkubation wird der Inhalt der Kolben, die das beste und zerstreuteste Wachstum zeigen, vereinigt, das Zellenmaterial wird absitzen gelassen, die überstehende klare Flüssigkeit wird abgegossen und die Zellenmasse wird mit 50 ml frischem auxinfreiem MMSR-Medium mit folgender Zusammensetzung gewaschen.

MMSR-Medium	Komponente	Konzentration
	Kaliumnitrat	mg/1
Magnesiumsulfatheptahydrat	950
Calciumchloriddihydrat	185
Kaliumdihydrogenphosphat	220
Ferrosulfatheptahydrat	68
Manganosulfathydrat	30
Zinksulfatheptahydrat	7
Borsäure	4
Ammoniummolybdat	2
Kaliumjodid	0,1
Cuprisulfatpentahydrat	0,4
Saccharose	O712
Biotin	20000
Cholinchlorid	0,1
meso-Inosit	1,0
Nicotinsäure	lOOO
Pantothensäure	1,0
Pyridoxin	1,0
Riboflavin	1,0
Thiamin	1,0
Kinetin	1,0
	0,06

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-.23- 7224336

Die rekonstituierte Zellsuspension wird 5 Minuten lang geschüttelt und dann erneut absitzen gelassen. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Die Zellenmasse wird in der gleichen Weise ein weiteres Mal mit MMSR-Medium gewaschen.

Beispiel 8

Wachstum von Digitalis pupurea-Zellen unter Redifferenzierungsbedingungen

Die gewaschene Zellmasse des vorhergehenden Beispiels wird zum Inokulieren von 20 Kolben (250 ml Erlenmeyerkolben) verwendet, von denen jeder 25 ml MMSR-Medium enthält. Die Kolben werden auf der Rotationsschütte!vorrichtung bei gedämpftem Licht und 28 ⁰C 10 Tage lang inkubiert. Zu dieser Zeit enthält jeder Kolben eine Vielzahl von kleinen Teilchen, von denen jedes Teilchen aus einer kleinen Kallusmasse mit einer oder mehreren ausstrahlenden Primordialwurzeln besteht.

Bei. spiel 9

Nachweis von Steroid-Glycosiden in Wurzelprimordienkulturen

von Digitalis purpurea

Der Inhalt der Kolben mit Digitalis purpurea-Wurzelprimordiensuspension aus dem vorhergehenden Beispiel wird vereinigt und unter Schwerkraftwirkung durch ein gefaltetes Papierfilter filtriert. Die gesammelte feste Masse wird bei 60 C über Nacht getrocknet und liefert 14 g trockenen Feststoff. 100 mg dieses Produkts werden mit 3 ml 70-prozentigem wässrigem Äthanol eine Stunde bei Rückflußtemperatur

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gehalten, und der äthanolische Extrakt wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Der äthanolische Extrakt wird in einem Stickstoffstrom auf ein Volumen von 0,9 ml eingedampft, und dieser wässrige Rückstand wird zweimal mit Chloroform extrahiert. Der gesamte Chloroformextrakt wird auf eine Kieselsäure-Dünnschichtchromatogrammplatte aufgetüpfelt, und das Chromatogramm wird mit einer Lösungsmittelmischung aus 50 Teilen Cyclohexan, 50 Teilen Aceton und 2 Teilen Eisessig entwickelt. Nach der Entwicklung wird die Dünnschichtplatte getrocknet und mit einer gesättigten Lösung von Vanillin in 50-prozentiger wässriger Phosphorsäure besprüht. Die besprühte Platte wird in einem Heißluftofen 15 Minuten auf 120 ⁰C erwärmt. Zu dieser Zeit sind dunkelblau-graue Flecken bei Rf 0,32 und Rf 0,50 zu sehen, deren Lage mit der von Kontrollflecken von Digitoxin und Digoxin auf der gleichen Platte genau übereinstimmt. Weitere Steroid-Glycoside sind bei Rf 0,0, 0,05 und 0,80 zu sehen, diese wurden jedoch nicht positiv identifiziert.

Beispiel 10 Erzeugung einer undifferenzierten Zellenkultur von Datura stramonium

In Töpfen gezogene Schößlinge von Datura stramonium werden 1 cm über dem Boden abgeschnitten, und der abgeschnittene Trieb wird durch 1 Minute langes Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert. Dann wird der gesamte Trieb in sterilem Wasser gewaschen, und quadratische Stücke von mehreren Blättern mit 5 mm werden auf die Oberfläche von Agar G(Gamborg)-Medium in 100 mm-Petrischalen überpflanzt.

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G-Medium	Komponente	Konzentration
	Kaliumnitrat	mcr/1
Ammoniumsulfat	2500
Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat	134
Magnesiumsulfatheptahydrat	150
Calciumchloriddihydrat	250
Ferroäthylendiamintetraacetat	150
Manganosulfatmonohydrat	28
Borsäure	10
Zinksulfatheptahydrat	3
Natriummolybdatdihydrat	2
Cuprisulfatpentahydrat	0,250
Cobaltochloridhexahydrat	0,025
Kaliumjodid	0,025
meso-Inosit	0,750
Nicotinsäure	100
Thiamin	1
Pyridoxin	10
gereinigtes Agar	1
Saccharose	1000
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure	20000
Kinetin	1
	0,060

Der pH-Wert wird nötigenfalls auf 5,5 eingestellt.

Nach fünf Wochen langer Inkubation in der Dunkelheit bei 28 ⁰C zeigt sich an der Oberfläche und den Rändern der überpflanzten Blatteile kräftiges Wachstum von Kallushaufen. Einige dieser Kallusklumpen werden abgetrennt und jeweils aseptisch in 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt, die 50 ml flüssiges G-Medium (Zusammensetzung wie oben, jedoch ohne das Agar) enthalten. Die Kolben

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werden auf der Rotationsschüttelvorrichtung bei gedämpftem Licht und 25 ⁰C inkubiert. Wenn das undifferenzierte Kallusmaterial wächst, werden in einem Cyclus von 14 Tagen Subkulturen in ähnliche Kolben überführt, wobei das stärker zerstreute Material gewählt wird, wo es erscheint. Nach drei solchen Selektionen und Überführungen wird eine Zellkulturlinie erhalten, die die gewünschte Wuchsform in einzelnen Zellen und kleinen Zellhaufen aufweist.

Beispiel 11 Redifferenzierung von Datura stramonium in Suspensionskultur

zu Wurzelprimordien

Ein Kolben mit disperser undifferenzierter Zellenkultur von Datura stramonium, wie sie in dem vorhergehenden Beispiel erhalten wird, wird 6 Tage nach der vorhergehenden überführung ausgewählt und aseptisch unter Schwerkraftwirkung auf einem 100 Mikron-Nylonsiebfilter filtriert. Die Zellenmasse wird mit G-Medium, in dem die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure fehlt, gewaschen, und die erhaltenen auxinfreien Zellen werden zum Inokulieren einer Reihe von 5 Kolben verwendet, die jeweils G-Medium enthalten, in denen jedoch die jeweilige Gesamtkonzentration an zugesetzter 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 0,002, 0,004, 0,008, 0,016 bzw. 0,032 mg pro Liter beträgt. Die Kolben werden auf der Rotationsschüttelvorrichtung bei gedämpften Licht und bei 28 ⁰C 10 Tage lang inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die drei Kolben mit den niedrigsten Konzentrationen an zugesetzter Auxinaktivität reichliche Bildung von Wurzelprimordien.

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Beispiel 12

Isolierung von Hyoscyamin und/oder seines Racemats Atropin aus Kulturen differenzierter Zellen von Datura stramonium

Der Inhalt eines der Kolben aus dem vorhergehenden Beispiel (enthält ursprünglich O,004 mg pro Liter 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure) wird unter Schwerkraftwirkung durch ein gefaltetes Papierfilter filtriert. Die gesammelte Masse von Wurzelprimordien wird mit Wasser gewaschen, und die erhaltene feuchte Gewebemasse (7 Gramm feucht) wird mit 5 ml 0,1 η wässriger Schwefelsäure verrieben. Die freie Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit konzentriertem Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht und dreimal mit je 10 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit 2 ml 0,1 η Schwefelsäure rückextrahiert, wodurch ein wässriges Konzentrat von Alkaloidprodukten erhalten wird, das wiederum mit konzentriertem Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht und mit O,6 ml Chloroform extrahiert wird. Der Chloroformextrakt wird auf etwa 50 Mikroliter eingedampft, und die gesamte Menge wird auf die Anfangsstelle einer KiesQlsäuredünnschichtchromatogrammplatte aufgetüpfelt. Die Platte wird mit einer Lösungsmittelmischung aus 9 Teilen Chloroform und 1 Teil Diäthylamin entwickelt. Nach Trocknen der entwickelten Platte wird mit Jodplatinatlösung (0,5 ml 10-prozentige Platinchloridlösung werden zu 25 ml 2-prozentiger Kaliumjodidlösung gegeben) besprüht, wodurch sich mehrere Alkaloidflecken zeigen, von denen der stärkste bei Rf 0,45 in genauer Obereinstimmung mit einem Kontrollfleck von Atropin auf der gleichen Platte erscheint. Das Alkaloid, das gewöhnlich in Datura stramonium-Pflanzen im natürlichen Zustand gefunden wird, ist das optisch aktive 1-Hyoscyamin, dieses Material wird jedoch gewöhnlich in der Medizin in seiner racemisierten Form, die als Atropin bekannt ist, verwendet. Im Chromatogramm wird zwischen der aktiven Form und der Racematform nicht unterschieden.

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222^336

Beispiel 13

Redifferenzierung von Datura stramonium in Suspensionskultur zu ganzen Pflanzenprimordien

Sterile Blattausschnitte von Datura stramonium werden als Inokulum für Schüttelkolben verwendet, die G-Medium mit einem Gehalt von 2 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthalten. In 8 Tagen bildet sich Kallus, der auf das gleiche Medium überführt und weitere 10 Tage inkubiert wird, wodurch eine disperse undifferenzierte Suspension von freien Zellen und kleinen Zellenhaufen erhalten wird. Dieses Zellenmaterial wird mit auxinfreiem G-Medium gewaschen und als Inokulum für Schüttelkolben verwendet, die das auxinfreie G-Medium enthalten. Nach 16 Tage langer Inkubation auf einer Pendelschüttelvorrichtung bei 25 ⁰C zeigt die mikroskopische Untersuchung das Vorliegen einer großen Zahl von Ganzpflanzenprimordien, d. h. embryoartigen Gebilden, die in ihrer Struktur der "Herz-Phase" und "Torpedo-Phase" der normalen Pflanzenembryoentwicklung entsprechen.

Beispiel 14

Erzeugung von Kulturen undifferenzierter Zellen von Rauwolfia serpentina

Frische im Handel erhältliche von Fruchtfleisch befreite Früchte von Rauwolfia serpentina werden durch sorgfältiges Zerbrechen der harten Schale und Entnahme des unversehrten inneren Samens geschält. Die Samen werden durch 5 Minuten langes Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und mit sterilem Wasser

2 0 9 8 A 9 / 0 8 5 8 ORIGINAL

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gewaschen. Die sterilen Samen werden durch Inkubieren auf sterilem feuchtem Filterpapier in Petrischalen in einem Inkubator mit 28 ⁰C gekeimt. Die Keimung setzt in 8 Tagen ein, und nach etwa 18 Tagen haben sich die Schößlinge vollständig aus der Samenhülle entwickelt. Die sterilen Schößlinge werden unzerteilt auf die Agaroberfläche von Petrischalen überführt, die MMS-Agar-Medium enthalten, dem 10 Volumenprozent sterile Kokosnußmilch zugesetzt wurden. Nach 2 Wochen sind Kallusmassen auf den Wurzeln, Stengeln und Cotyledonen der Schößlinge erschienen, und dieses Kallusmaterial wird abgeschnitten und in frisches Medium der gleichen Art in Petrischalen überführt. Zwei weitere solche Überführungen werden in 2 Wochen-Abständen vorgenommen, und dann werden ausgewählte Kailusteile in 50 ml-Anteile von flüssigem MMS-KokosnußmiIch-Medium in 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt. In mehreren Kolben tritt disperses undifferenziertes Zellenwachstum auf, und dieses Material wird dann durch Überführungen in Abständen von 2 Wochen in G-Medium erhalten.

Beispiel 15 Wachstum von Rauwolfia serpentina als redifferenziertes

Material

Zwei Kolben mit dem dispersen Wachstum von Rauwolfia serpentina aus dem vorhergehenden Beispiel werden vereinigt, und die Zellenmasse wird durch Dekantieren mit dreimal ausgetauschtem G-Medium, in dem die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure fehlt, gewaschen. Die auxinfreie gewaschene Zellmasse wird als Inokulum für Kolben mit auxinfreiem G-Medium verwendet, das folgende Zusätze enthält:

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2 2 2 A 3 3 B

1	kein Zus
2	0,1 mg/1
3	1,0 mg/1
4	5,0 mg/1
5	1,0 mg/1
6	5,0 mg/1
7	10,0 mg/1
8	20,0 mg/1
9	0,5 mg/1
10	1,0 mg/1
11	5,0 mg/1

Kolben zugesetzte Auxinaktivität

1-Naphthalinessigsäure 1-Naphthalinessigsäure 1-Naphthalinessigsäure 3-Indolessigsäure 3-Indolessigsäure 3-Indolessigsäure 3-Indolessigsäure 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 2 ,4-Dichlorphenoxyessigsäure

Nach 8 Tage langer Inkubation auf der Rotationsschüttelvorrichtung zeigen die ersten neun Kolben (Kolben 1 bis 9) verschiedene Grade an Redifferenzierung (am Auftreten von Wurzelprimordien ersichtlich), die von schwacher Redifferenzierung in Kolben 5 und 9 bis zu ausgedehnter Redifferenzierung in Kolben 1 und 8 reicht. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den allgemein anerkannten relativen Intensitäten der Auxinaktivität der drei verwendeten Substanzen. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ist nämlich wesentlich aktiver als 1-Naphthalinessigsäure, und diese ist ihrerseits wesentlich aktiver als 3-Indolessigsäure. Durch überführung von Rauwolfia serpentina-Zellen von G-Medium, das 1 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält, auf G-Medium, das keine Auxinaktivität enthält,oder G-Medium, das 20 mg/1 3-Indolessigsäure enthält, wird also eine Nettoverminderung der Auxinaktivität erzielt, und es erfolgt die gewünschte Redifferenzierung.

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Beispiel 16

Nachweis der Gegenwart von Reserpin in redifferenziertem Rauwolfia serpentina-Material

Die Flüssigkeit in Kolben 8 aus dem vorhergehenden Beispiel wird abdekantiert, und das Wurzelprimordien enthaltende feste Material wird im Vakuum 6 Stunden bei 40 ⁰C getrocknet. Die getrocknete Masse wird in einem Mörser zu einem· Pulver gemahlen, mit 5 ml konzentriertem Ämmoniumhydroxid befeuchtet und mit 30 ml Benzol verrieben. Die Benzolphase wird durch Zentrifugieren abgetrennt und bei 40 C in einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 2 ml 1 η Salzsäure aufgeschlämmt, und die wässrige Säure wird mit 2 ml Chloroform extrahiert (das Hydrochloridsalz von Reserpin ist chloroformlöslich). Der Chloroformextrakt wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird in 0,1 ml Chloroform aufgenommen, und diese Lösung wird entlang der Ursprungslinie einer 5 cm χ 20 cm(2"x8")-Kieselsäuredünnschichtchromatogrammplatte aufgestrichen. Bei Entwicklung mit einer Lösungsmittelmischung aus .16 Teilen n-Butanol, 1 Teil Essigsäure und 4 Teilen Wasser wird ein Chromatogramm erhalten, das unter einer 365 nm-üV-Lampe sieben fluoreszierende Banden zeigt, darunter eine mit dem gleichen Rf-Wert (0,61) wie eine authentische Probe von Reserpin, die in der gleichen Weise auf einer anderen Platte chromatographiert wurde. Die fluoreszierende Bande bei Rf 0,61 ist offensichtlich kein reines Reserpin, da die Fluoreszenzfarbe wesentlich blauer als bei reinem Reserpin ist. Deshalb wird diese Bande von der Platte abgeschabt, das Adsorbens wird mit 2 ml Methanol ausgelaugt, und das Methanoleluat wird durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung untersucht. Das Massenspektrum zeigt nur eine Gruppe von Banden im Massenbereich von 600 bis 650, die ausgezeichnet mit denen, die bei reinem Reserpin beobachtet werden, übereinstimmt. Die Feststellung des Maximums der Hauptmassenbande der Gruppe ergibt genau eine Masse von 608,2724 Masseneinheiten in ausgezeichneter

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2 2 ? Λ 3 3 β

Übereinstimmung mit dem für Reserpin erwarteten Wert, für das die für das Molekülion berechnete genaue Masse 608,2733 Masseneinheiten beträgt. Damit wird also bewiesen, daß eine redifferenzierte Suspensionskultur von Rauwolfia serpentina Reserpin erzeugt.

Beispiel 17 Erzeugung von Kulturen undifferenzierter Zellen von Catharanthus roseus

Im Handel erhältliche Pflanzen von Catharanthus roseus (auch als Vinca rosea bekannt) werden wie folgt als Quelle für vegetatives Gewebe verwendet. Ein Schößling von Catharanthus roseus mit einer Höhe von etwa 100 mm wird 10 mm über der Bodenoberfläche gekappt, und der gesamte Pflanzentrieb wird durch 2 Minuten langes Eintauchen in eine 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert. Der Pflanzentrieb wird mit sterilem Wasser gewaschen, und Teile werden davon aseptisch abgeschnitten und auf die Oberfläche von Agar-G-Medium überführt, das in Petrischalen enthalten ist. Nach 18 Tage langer Inkubation bei 25 ⁰C werden die entstandenen Kallusauswüchse direkt in 50 ml-Anteile von G-Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben überführt und bei 25 ⁰C auf der Rotationsschüttelvorrichtung inkubiert. Unabhängig davon, ob das ursprüngliche Pflanzenstück vom Stengel, vom Blattstiel oder der Blattspreite stammt, zeigt sich rasch ein sehr disperses kräftiges undifferenziertes Wachstum. Die undifferenzierte Zellsuspension wird durch überführung auf frisches flüssiges G-Medium nach jeweils 7 Tagen erhalten.

Beispiel 18

Wachstum von Catharanthus roseus als redifferenziertes Material

Ein Kolben mit einer 7 Tage alten undifferenzierten Suspensionskultur von Catharanthus roseus wird mit 50 ml frischem G-Medium versetzt, in dem 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure fehlt.

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Durch diese Maßnahme wird die ursprünglich in dem Kolben enthaltene Auxinaktivität auf die Hälfte ihres ursprünglichen Werts verdünnt. Die Hälfte der so vermehrten Zellsuspension wird verworfen, und die andere Hälfte wird für weitere 7 Tage auf die Rotationsschütte!vorrichtung gebracht. In dieser Zeit erfolgt ein kräftiger Neuwuchs. Es werden wiederum 50 ml auxinfreies G-Medium zugesetzt und vermischt, und die Hälfte der erhaltenen Suspension wird verworfen. Die andere Hälfte, die nunmehr höchstens ein Viertel der Ausgangsmenge an 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält, wird für eine weitere Zeit von 7 Tagen auf die Rotationsschüttelvorrichtung gebracht. Dieser Zyklus der Verdünnung mit auxinfreiem Medium und Inkubation wird noch dreimal wiederholt, so daß der Kolben schließlich nur 1/32 der ursprünglichen Menge an 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder in anderen Worten etwa 0,031 mg/1 dieser Auxinaktivität enthält. Bei dieser Konzentration .an Auxinaktivität erfolgt bei weiterer 4 Tage langer Inkubation eine offensichtliche Redifferenzierung des Catharanthus roseus-Materials mit Erscheinen von Wurzelprimordien. Catharanthus roseus ist die Quelle für die wichtigen Antitumormittel Vinblastin und Vincristin.

Beispiel 19 Wachstum von Phytolacca americana in Form undifferenzierter Zellen

in Suspensionskultur

Samen von Phytolacca americana werden im Handel erworben und 3 Monate bei 5 ⁰C zwischen Schichten von feuchtem Torfmoos gelegt. Dann wird der Samen durch 3 Minuten langes Eintauchen in Bromwasser oberflächensterilisiert, mit sterilem Wasser gewaschen und zum Keimen auf steriles Filterpapier in Petrischalen gelegt. Die Keimung erfolgt prompt, und die entwickelten Triebe werden in ihre Teile aus Wurzel-, Hypocotyl- und Cotyledonabschnitten zerschnitten, und diese Teile werden direkt in Anteile von 5 ml flüssigem G-Medium mit einem Gehalt von 6 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure in 2,5cmx2Ocm(l"x8")-Reagensgläser auf einer Pende!schüttelvorrichtung (Schüttelausschlag 2,5 cm, 100 Ausschläge pro Minute) bei 28 C gelegt. Nach 14 Tagen haben sich Kallüsmassen gebildet, es liegen abgebrochene Stammstücke vor, und es ist ein kräftiges undifferenziertes Wachstum im Gange.

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Beispiel 20 Redifferenzierung von Phytolacca americana

Die überführung von undifferenziertem Kallus aus dem vorhergehenden Beispiel auf G-Medium, das nur 0,5 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält, führt zur Redifferenzierung unter Erscheinung von cotyledonartigen Primordien.

Die überführung des undifferenzierten Kallus aus dem vorhergehenden Beispiel auf G-Medium, das 1 mg/1 1-Naphthalinessigsäure enthält, führt zu prompter Redifferenzierung, wie sich an der reichlichen Bildung von Wurzelprimordien zeigt. Phytolacca americana ist die Quelle für das Alkaloid Phytolaccin und für das Forschungsreagens Kermesbeeren-Mitogen.

Beispiel 21 Wachstum von Ficus elastica als undifferenziertes Material

in Suspensionskultur

Ein Blatt vom dritten Internodium einer im Topf gezogenen Ficus elastica-Pflanze wird abgeschnitten, durch Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und ein Teil von 5 cm χ 5 cm wird aseptisch entfernt. Dieser Teil wird in quadratische Stücke von lern geschnitten, die zum Inoculieren von Schüttelkolben mit G-Medium verwendet werden. Nach 21 Tage langer Inkubation auf dem Pendelschüttler wird ein kräftiges Wachstum von undifferenziertem Kallusmaterial beobachtet. Ficus elastica ist die Quelle für indischem Kautschuk.

°R'GiNAL INSPECTED 209849/0858

Beispiel 22

Wachstum von Ficus carica als undifferenziertes Material

in Suspensionskultur

Von einem Ficus carica-Baum wird ein junges Blatt abgeschnitten und oberflächensterilisiert. Teile des Blatts werden zum Inokulieren von Schalen mit Agar-G-Medium verwendet. In 15 Tagen treten kräftig wachsende Kallusklumpen auf. Diese werden auf flüssiges G-Medium in Schüttelkolben überführt, worauf weiteres Wachstum in gut zerstreuter Form erfolgt. Bei überführung auf G-Medium, das 0,5 mg/1 1-Naphthalinessigsäure enthält, findet Redifferenzierung mit dem Erscheinen von Wurzelprimordien statt. Ficus carica, die gewöhnliche Fruchtfeige, ist die Quelle für das milchcoagulierende Enzym Ficin.

Beispiel 23 Wachstum von Camptotheca acuminata in Suspensionskultur

Samen von Camptotheca acuminata werden durch 10 Minuten langes Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert, mit sterilem Wasser gewaschen und auf feuchtem Filterpapier in Petrischalen gekeimt. Die aufgelaufenen Schößlinge werden ganz in Schüttelkolben überführt, die G-Medium enthalten,und bei 28 C auf der Rotationsschüttelvorrichtung incubiert. Es erfolgt kräftiges Kalluswachstum und nach Überführung wird eine Zellkulturlinie erhalten, die die gewünschte disperse Wuchsform zeigt. Camptotheca acuminata ist die Quelle für Camptothecin, ein wichtiges Mittel gegen Krebs.

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Beispiel 24 Wachstum von Sassafras alibiduitt in disperser Suspensionskultur

Von einem im Wald gewachsenen Sassafras alibidum-Baum werden grüne neue Ruhetriebe entfernt und durch Eintauchen in 70-prozentiges Äthanol und dann in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert. Die Triebe werden in 2 bis 5 mm dicke Querschnitte zerschnitten und diese sterilen Abschnitte werden auf Agar-G-Medium gelegt, um Kallus zu erzeugen. Wenn sich Kallusklumpen gebildet haben, werden sie in flüssiges G-Medium in Schüttelkolben auf einer Rotationsschüttelvorrichtung überführt. Weitere Incubation führt zu dispersen Kulturen von undifferenzierten Zellen und Zellhaufen. Sassafras alibidum ist eine Quelle für den Aromastoff Sassafrasöl und für Safrol.

Beispiel 25 Wachstum von Artemesia absintfaliam ig gadifferenzierter Zellkultur

Sterile Samen von Artemesia absinthium werden gekeimt und die Schößlinge werden auf flüssiges G-Medium überführt und wie oben beschrieben incubiert. Es bildet sich Kallusgewebe, das nach überführung auf G-Medium kräftig in Form von dispersen Zellen und Zellhaufen wächst.

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Beispiel 26

Redifferenzierung von Artemesia absinthium

Gewaschene undifferenzierte Zellen aus dem vorhergehenden Beispiel werden zum Inokulieren von Kolben mit G-Medium verwendet, das nur 0,5 mg/1 1-Naphthalinessigsäure als Auxinaktivität enthält. Es erfolgt prompt Redifferenzierung, wie das Auftreten von Wurzelprimordien zeigt. Artemesia absinthium wird zur Aromatisierung in Wermutwein verwendet.

Beispiel 27 Wachstum von Nicotiana tabacum in undifferenzierter Zellkultur

Samen von Nicotiana tabacum werden oberflächensterilisiert und auf feuchtem Filterpapier gekeimt. Stengelteile der Schößlinge werden auf Agar-MS-Medium überführt, worauf sich Kallusmassen bilden. Diese werden auf flüssiges MS-Medium in Schüttelkolben überführt und selektioniert, wodurch eine dispers wachsende Zellkulturlinie von undifferenziertem Material erhalten wird.

Beispiel 28 Redifferenzierung von Nicotiana tabacum zu Triebprimordien

Gewaschene Zellen aus dem vorhergehenden Beispiel werden zum Inokulieren von Kolben mit auxinfreiem MS-Medium verwendet und nach 5 Wochen langer Inkubation in gedämpftem Licht auf einer langsam rotierenden Schüttelvorrichtung

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(60 UpM) zeigt sich kräftige Bildung von grünen Triebprimordien. Nicotiana tabacum ist eine Quelle für das Alkaloid Nicotin.

Beispiel 29

Erzeugung und Wachstum undifferenzierter Zellen von Lavandula officinalis in Suspensionskultur

Im Handel bezogene Samen von Lavandula officinalis werden durch Eintauchen in 1-prozentige Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und dann auf feuchtem Filterpapier gekeimt. Die aufgelaufenen Schößlinge werden in 1 cm Segmente geschnitten und diese Segmente werden auf die Oberfläche von Agar-MS-Medium gelegt, das 6 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält. Nach 6 Wochen werden die entstandenen Kallushaufen in einzelne Schüttelkolben mit flüssigem MS-Medium überführt und die Kolben, die eine stärker disperse Wuchsform zeigen, werden zur weiteren Überführung ausgewählt. Zehn solche aufeinanderfolgende Selektionen und Überführungen werden in Abständen von etwa 1 Woche durchgeführt und die kräftigste Zellkulturlinie wird dann auf LS-Medium, das 6 mg/1 2 ,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält, überführt, worin ein noch rascheres und kräftigeres Wachstum erfolgt.

LS-Medium	Komponente	Konzentration mg/1
Ammoniumnitrat Kaliumnitrat CalciumchlOi-iddihydrat	1650 1900 440

2 Π Tk O ■' ^r- .'" !■", *'■' '■

Magnesiumsulfatheptahydrat Kaliumdihydrogenphosphat Ferroäthylendiamintetraacetat Borsäure

Manganosulfattetrahydrat Zinksulfattetrahydrat Kaliumjodid

Natriummolybdatdihydrat Cuprisulfatpentahydrat Cobaltochloridhexahydrat Saccharose

Kinetin

Thi aminhydrochlorid meso-Inosit

Caseinhydrolysat Auxin

370 170 65 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 000,0

0,030 0,4 100 1000

Konzentration

von verwendeter auxin-aktiver Substanz und Zweck des Mediums abhängig»

In diesem LS-Medium besteht das Wachstum von Lavandula ©££icinalis völlig aus kleinen Haufen (Durchmesser etwa OpI mm) von völlig undifferenzierten Zellen, die mit einer Verdopplungszeit des Zellenvolumens von etwa 36 Stunden wachsen? bis die Zellenmasse 100 % des Volumens ausfüllt« Lavandula officinalis ist die Quelle für Lavendelöl.

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Claims (8)

-40- 222433S Patentansprüche

1. Verfahren zur Erzeugung von chemischen Pflanzenmetaboliten durch Suspensionskultur, dadurch gekennzeichnet, daß Organprimordien einer Pflanze, die den Metaboliten bekanntermaßen erzeugt, durch Verminderung der Konzentration an Auxinaktivität in einem wässrigen aeroben Nährmedium mit submers darin wachsenden undifferenzierten Zellen oder Zellhaufen der Pflanze erzeugt werden und (b) die entstandenen Organprimordien gezüchtet werden, bis beträchtliche Mengen des Metaboliten entstanden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß (a) ein wässriges Nährmedium mit kräftig wachsenden undifferenzierten Zellen einer Pflanze, die bekanntermaßen den Metaboliten erzeugt, inoculiert wird, (b) das Wachstum der undifferenzierten Pflanzenzellen in dem Medium einige Zeit unter submers-aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Substanz, die dem Medium Auxinaktivität verleiht, aufrechterhalten wird, (c) die Konzentration an Auxinaktivität in dem Medium vermindert und dadurch eine Redifferenzierung der Pflanzenzellen mit Auftreten von Pflanzenorganprimordien und gleichzeitiger Erzeugung des Metaboliten herbeigeführt wird, (d) das Wachstum der redifferenzierten Pflanzenzellen in dem Medium einige Zeit unter submers-aeroben Bedingungen unter Ansammlung des Metaboliten aufrechterhalten und dadurch eine reife Vollmaische erzeugt wird, und (e) der Metabolit aus der reifen Vollmaische gewonnen wird.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Substanz, die für Auxinaktivität sorgt, 3-Indolessigsäure, 3-Indolbuttersäure, 1-Naphthalinessigsäure, p-Chlorphenoxyessigsaure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Auxinaktivität in dem Medium durch Verdünnen des Mediums mit wenigstens einem Teil frischem Medium ohne Auxinaktivität je Teil des Mediums vermindert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Auxinaktivität in dem Medium durch Zusatz einer Antiauxinverbindung zu dem Medium vermindert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Auxinaktivität in dem Medium durch Abtrennen der undifferenzierten Pflanzenzellen von dem Medium und Resuspendieren der undifferenzierten Pflanzenzellen in frischem Medium mit verringerter Auxinaktivität vermindert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wässri«
gehalten wird.

daß das wässrige Nährmedium bei einer Temperatur von 15 - 35 ⁰C

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Nährmedium assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Kalium, Phosphor, Magnesium und Vitamine enthält.

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