DE2261561A1

DE2261561A1 - Verfahren zur durchfuehrung von auf konkurrenz-reaktionen beruhenden analysen

Info

Publication number: DE2261561A1
Application number: DE19722261561
Authority: DE
Inventors: John Stuart Glover; Bryan Peter Shepherd
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1971-12-16
Filing date: 1972-12-15
Publication date: 1973-07-12
Also published as: JPS5229956B2; SE390066B; GB1411382A; DE2261561B2; JPS4866892A; US3883738A; DE2261561C3; FR2167046A5

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Analysen, bei welchen ein radioaktives ^lement oder eine radioaktive'Verbindung 2?; i se...ei: zwei Phasen verteilt und der Anteil der Aktivität in .jeder Phase bestimmt v/ird. Typisch für derartige Analjsen sind Bewertungen oaer Bemessungen durch konkurrierende Reaktionen, wobei eine unbekannte Henge der Verbindung, die bewertet werdexj soll, sowie eine Stanäordrüenge einer rauioaktivi;arkierterj Version dieser Verbindung bei der Reaktion nit einer Standardmenge eines anderen Reagens in Konkurrenz miteinander treten. Diese Arbeitsweise ist in der Medizin sehr weit verbreitet zur Bestimmung von Hormonen und anderen Substanzen, wobei als das andere Reagens der Antikörper in Immens?;stehen oder ein anderer spezifischer lieaktionsportner in HicUtinjrnun- oder ITiohthoroionsjsteraen .verwendet viird.

"oder G-rad

„ 2 —

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BAD ORiGSNAL

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Das Prinzip dieser Arbeitsweise kann durch folgendes Reactions schema wiedergegeben werden:

0 ist die Verbindung, die bestimmt v/erden soll; C" ist die radioaktiv markierte Version dieser Verbindung; R ist der andere Reaktionspartner.

Die Menge R wird so bemessen, daß sie nicht ausreicht, um mit

videm gesamten C + C zu reagieren. Da die Reaktion zumindest im gewissen Ausmaß reversibel ist, stellt sich ein Gleichgewicht ein, bei welchem das Verhältnis von /c 17 / ßi'J -\- bestimmt wird durch die !!enge an vorhandener nicht markierter Verbindung G. Wird G von G -R getrennt und die Aktivität der beiden einzelnen voneinander getrennten Teile geraessen, so läßt sich die Heßzahl des Verhältnisses leicht errechnen. Die Menge an nicht markierter Verbindung C kann dann relativ oder absolut bestimmt v/erden indem ein Standardpräparat der Verbindung G zur Aufstellung einer Sichkurve verwendet wird.

Diese Arbeitsweise wird mit Beispielen in einer Zeitschrift von R.S. Yalow und S.A. Berson in IAEA-SIi-124/106, Seiten 455-481 beschrieben.

Die Trennung von C" von G-R wird allgemein in zwei Stufen

x- ·;<durchgeführt. In der ersten Stufe wird entweder G oder 0 - R zu einem Phasenwechsel veranlaßt, beispielsweise durch ausfällen aus einer Lösung, durch Absorption auf einem inerten Träger oder durch Übergang in eine mit Wasser nicht nischbare Phase. In der zweiten Stufe werden die beiden Phasen voneinander getrennt, beispielsweise durch Filtration oder - gebräuchlicher - durch Zentrifugieren und anschließendes Abgießen eier überstehenden Flüssigkeit. Sobald die beiden Phasen in zwei verschiedenen Behältern getrennt vorliegen

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ist es eine einfache Sache, den Aktivitätsgrad oder -spiegel in jedem Behälter zu bestimmen«,

Die Trennung beider Phasen durch Überführen der einen Phase aus dem Reaktionsröhrchen in einen anderen Bellälter ist jedoch seitraubend und sudem Anlass für ungenaue Messungen oder sogar Kessfehler. Insbesondere wird auch selten das gesamte Material aus einem Behälter in den anderen überführt. Aufgabe der Erfindung ist es daher, Überführungen dieser bekannten Art zu vermeiden.

Gelöst wild diese Aufgabe mit Hilfe des erf indungsgernäßen Verfahrens zur Durchführung von Analysen, bei welchen ein radioaktives Element oder eine radioaktive Verbindung zwischen zwei Phasen verteilt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Radioaktivitätsgrad oder -spiegel von mindestens einer dieser beiden Phasen mißt, während diese Phase mit der anderen Phase in Berührung steht.

Zumindest ein Teil des radioaktiven Materials in der einen Phase muß vor dem radioaktiven Material in der anderen Phase getrennt werden, um den Aktivitätsgrad der einen Phase bestimmen zu können. Es ist kennzeichnend für das erfindungsgeraäße Verfahren, daß die beiden Phasen selbst, nicht von-'einander entfernt v/erden, beispielsweise durch Überführen der einen Phase in ein anderes Gefäß, sondern während der Kessung des Aktivitätsgrades in der einen oder in beiden Phasen miteinander in Berührung bleiben.

Die Schwierigkeit beim Messen des Aktivitätsgrades in einer Phase, während die andere Phase mit dieser in Berührung steiit, liegt in der Schwierigkeit, die Vorrichtung zum Zählen üe:: Aktivität in dieser einen Phase vor den von der anderen PL.ose abgegebenen Mtraiiluugei] abzuschirmen. Jüas erfinüungsgemäße

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Verfahren sieht zwei Wege vor, diese Schwierigkeit au überwinden; beide Viege können entweder unabhängig voneinander oder - gebräuchlicher- in Kombination miteinander angewandt werden:

1) Das Reaktionsröhrchen kann besonders ausgeformt sein, beispielsweise wenn das radioaktive Element «wischen einer Flüssigkeit und einer schwereren/iesten Phase verteilt wird, beispielsweise als Zentrifugenröhrchen mit einer dünnen Kapillare ata Boden für die feste Phase, so daß diese feste Phase in einem merklichen Abstand von der Masse der flüssigen Phase im Hauptkörper des Röhrchens vorliegt. (Soll das radioaktive Element zwischen zwei flüssigen Phasen verteilt werden, so ist eine entsprechende Ausbildung des Röhrchens möglich).

2) Der Zähler kann genau als Kollimator ausgebildet sein oder dienen und sorgfältig von der Phase abgeschirmt werden, deren Aktivität nicht gemessen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders auf jene Fälle anwenden, in denen das beteiligte radioaktive Spurenelement ein weicher Garaaastrahler ist, so daß eine ziehalich dünne Bleischicht zur Abschirmung verwendet v/erden kann.

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Das gebräuchliche I ist besonders geeignet, weil seine v/eiche Gammastrahlung durch eine 3 ma starke Bleischicht bis auf einen unbedeutenden Rest abgeschwächt wird.

Wird als Reaktionsbehälter ein Zentrifugenröhrchen mit einer Kapillare am Boden verwendet, so läßt sich der AUtivitätsgrad der festen Phase messen, indem der Körper, d.h. Hauptteil des Röhrchens vor dein Zähler abgeschirmt wird, wobei sich. nur ein sehr kleiner Fehler durch Beimengung einer sehr kleinen !!enge flüssiger Phase in dem Kapillarrohr ergiut. Der Aktivitütsgrod der flüssigen Phase ivn Hauptköi'per des Reol:- tioiJGi'QhrcLeno wi..-ύ dann genessen, indeai da.o Kapillarröhrchen

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vor dem Zähler abgeschirmt wird, wobei sich.-nur ein sehr kleiner Fehler aus der Abwesenheit der sehr kleinen Menge flüssiger Phase ergibt, die in das Kapillarröhrchen übergegangen ist.

Bei zahlreichen Anwendungen ist eine ganz exakte Kessung der Radioaktivität in einer oder in beiden Phasen nicht erforderlich, vorausgesetzt, daß der prozentuale fehler nicht unnötig breit ist und zudem konstant bleibt. Ein solcher konstanter prozentualer Fehler kann beispielsweise beim noraalen Verfahren der iaaunologisehen Radioanalvse (radioiarriunoassay), bei der eine Eichkurve mit Bezug auf ein Standardpräparat aufgestellt wird zu annehmbaren guten Resultaten führen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung in einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht eines üblichen Zentrifugenglases mit konisch zulaufendem oder Spitzboden, das eine Flüssigkeit mit darin suspendiertem Festkörper enthält ;

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht des Zentrifugenröhrchens nach dem Zentrifugieren;

Fig. 3 eine perspektivische Ansicht eines teilweise abgeschirmten Halters; die Vertiefung für das Zentrifugenrohrchen ist gestrichelt angegeben;

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht des Halters mit darin befindlichem Zentrifugenröhrchen;

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer abgeschirmten Zählvorrichtung, teilweise ira Schnitt, um das darin angeordnete Rohr mi Ij Lösung und Feststoff sediment zu zeigen.

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Das in Pig. 1 und 2 gezeigte Zentrifugenröhrchen 10 besteht aus einem Kunststoff, hat einen Verschluß 11 und enthält eine flüssige Phase 12 sowie eine Peststoffphase 13, von denen eine radioaktiv ist oder die beide radioaktiv sind. In Fig. 2 ist die Peststoffphase 13 im konisch zulaufenden oder Spitzboden 14 des Röhrchens 10 durch das Zentrifugieren konzentriert worden.

Der in den Figuren 3 und 4 gezeigte, teilweise abgeschirmte Halter 15 besteht aus einer Bleibasis 16, die sit einem ringförmigen Oberteil 17 aus Kunststoff verbunden ist. Ein Zentrifugenröhrchen paßt so in den Halter hinein, daß der Spitzboden 14 und das darin befindliche Feststoffraaterial von dem aus Blei gefertigten Teil des Halters umgeben ist.

Die vollständige Einheit (Halter 15 + Zentrifugenrährclien 10) kann in die Vertiefung eines Natriurajodidscintillationskristalls eingepaßt sein, welcher Teil eines Instrumentes ζυω lie ssen der Radioaktivität ist (Kristallzähler). Abgeschirmt von dem Zäler durch die Bleibasis 16 des Halters ist die feste Phase 13 und ein geringer Teil der flüssigen Phase 12, der sich ira Spitzboden 14 des Zentrifugenroiirc befindet. Der Meßfehler, welcher sich daraus ergibt, d.sß nicht die gesamte flüssige Phase im Zäler sichtbar ist, kann allgemein vernachlässigt v/erden rait Ausnahme dort, wo ganz genaue Messungen benötigt werden; er ist in jeäea Falle unwesentlich, wenn die Radioaktivitätsgrade oder -spiegel von.Flüssigkeiten in verschiedenen Röhrchen der gleichen Ausbildung miteinander verglichen werden.

Das mit Bezug auf Fig. 1 bis 4 beschriebene 3.>3te;3 ict ünzvt vorgesehen, die Radioaktivität von praktisch eier gesamten flüssigen PLu ce Ur, Zentrifugenrohr zu messen. Ue η η jeüocvi unbekannte Proben gegen geeichte Standards gemessen wercieu,

-Y-

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BAD ORIQiNAL

so braucht nicht die gesarate Phase gernessen zu werden. Es genügt dann sicherzustellen, daß das Flüssigkeitsvolumen in den verschiedenen, im Versuch verwendeten Röhrchen dasselbe ist und die Radioaktivität eines konstanten Volumen der flüssigen Phase zu messen. Dieses konstante Volumen "braucht nicht bekannt zu sein; es muß jedoch einen konstanten Anteil der gesamten flüssigen Phase ausmachen wie beispielsweise bei verschiedenen, im gleichen Experiment verwendeten Röhrchen.

Diese Prinzip wird mit Bezug auf I¹Ig. 5 näher erläutert: die Zählvorrichtung umfaßt einen (nicht gezeigten) Satriumjodidscintiilationskristall, in dessen Vertiefung die Bleiabschirraung 18, 19 angeordnet oder eingebaut worden ist. Ein Rohr 20 mit einem Verschluß 21, das eine flüssige Phase 22 bis zum Spiegel (Oberfläche) 23 und eine sedimentierte feste Phase 24 enthält, paßt genau in die Bleiabschirmung hineien. Der obere und der untere Teil 18 und 19 der Bleiabschirmung begrenzt das Sichtfeld der Zählvorrichtung auf eine fixierte Säule 25 der flüssigen Phase 22. Vorausgesetzt, daß der Durchmesser der Säule 25 fixiert ist, d.h. vorausgesetzt, daß die Innendurchmesser der im Experiment verwendeten Röhrchen alle gleich sind und vorausgesetzt, daß die Oberfläche der Flüssigkeit 22 im Oberteil 19 der Bleiabechirmung in jedem Röhrchen stets auf derselben Höhe ist, mißt der Zähler die Radioaktivität eines konstanten Anteils der gesaraten flüssigen Phase, wie zwischen verschiedenen im gleichen Experiment verwendeten Röhrechen.

Dieses- Verfahren kann dahingehend abgewandelt werden, daß die Flüsoigkeitsoberflache 23, der Flüssigkeitsspiegel, sich innerhalb der fixierten Säule 25. im Sichtfeld der Zählvorrichtung befindet. Diese Alternative wird jedoch

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nicht bevorzugt, weil dabei die Oberfläche 23 stets garn; genau dieselbe Höhe bei verschiedenen im gleichen Experiment verwendeten Röhrchen aufweisen nuß.

Fehler treten dann auf, wenn die Röhrchen nicht alle genau den gleichen Innendurchmesser besitzen oder wenn das Gesamtvolumen der flüssigen Phase nicht genau das gleiche ist in jedem Röhrchen; diese Fehler sind jedoch in der Praxis nicht von Bedeutung, außer wenn extrem genaue Messungen angestrebt und benötigt werden.

Beispiel Allgemeine Methoden '? ·

Die Insulin Inraonoassay Kit Analyseneinheit hergestellt von The Radiochemical Centre und beruhend auf der Methode von Haies und Rändle (Lancet, i,200,1963;3iochera, J.,88, 137, 1963) wurde verwendet, um den Gebrauch des Heßsysteas zu erläutern. Ein allgemein anerkanntes beziehungsweise zugelassenes Serum wurde als "unbekannt" verwendet. Dieses Serum war 3-fach bei mehr als 15 Gelegenheiten unter Anwendung der üblichen Filtrationtnethode bewertet worden. Die Meßzahlen reichten von 43,0 bis 58,5 Millieinheiten je era rait einem Gesantmittelwert von 49,7.

Verfahrensweise

Das Verfahren wurde genauso durchgeführt, wie es in der der Anal;yseneinheit beigegebenen Gebrauchsanweisung dargelegt ist, mit Ausnahme der zur Herstellung der Inkubate verwendeten Volumina: es wurden 300 /Ul anstelle der angegebenen 100 yul geiJOüv.neD. Infolge dieses größeren Volu^cnu konnten die vorhandenen abgeschirmten Behälter, die für

indem

ein Nomina !volumen von 1 era⁵ angelegt sind, ohne Abänderun;

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ü C) SS

werfen*

is wurden Insulinstaidäris zu 250* 1ΌΟ> 5Ö» 25* "12*5

"null" Miksöeisheiten f/tiS)/"Gtä^ hergestellt, JeSe K©nzesträtioo wurde in 3-iSchif Ausführung bereitet, gleiche ΫώΙ^ώιώθ von ZQ&j&i in

4-fäch iieiegesiielliii itiäöffl Jeweils 500^ΐϊϊ Serial) In eiäeni gleicliartigen ESlilciieia vorgelegt

jeden) Röliiülien "wurtäea 3007^1 bindeiaäes Reagens gegeben das &ai3^:ze Te^:rt3i"söh%» Die EBUrekeü Wurdön Te-rsciilöBseiii und 6 Stunden bei 4-^ΘΘ geftäiten; darauf wurde in jedes Eöiirciien ein gleiclier iö1>eil von 300/ül 125-1>-ϊη3υ1ιή gegeben i Der Iniialii der Eöiirölien wurde getoisclit., die Röhrclien wurden verschlössen und weitere 18 Stunden Dei 4⁰C ge/ialten.

liacii "beendeter Inkubation wurden die Röhrchen 6 Hinuten lang in einer "Tinipaη 320" Zentrifuge toit 14 500 UpM (Η 000 g) geschleudert. Darauf wurden sie in die oben beschriebenen abgescliirsten Halter verbrächt und jedes Röhrchen 60 Sekunden läng in einetn Hucleär Sn-terprises Äutö-&admä3;ähler . Typ 83II ausgezählt, '

Ergebnisse: Zälilwerte erhalten in äbgescliirtaten Behältern.

insulinyuE/Gs ö/rnin 3 Messungen

"null"	43169	44325	Φ3391
12*5	SG2i6	5Ö96O	49519 i
.25	57H4	57108	56710
5Ö	6BI91	67349	^579 j
1ΟΘ	T6Ö45	76520	764Q9 \
250	8Ö559	80705	62078

10 -

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c/rain gefunden^ /uE/cö⁵Insulin Mittelwert für in·¹ unbekannten¹'Sera liestimerit ⁿWöbekaant"

€8914 54^0

68185

Das Ergebnis erhalten für die Insulinkoftsentration eines zugelassenen Serums unter Verwendung des abgesohirBten Meßsystems ist sehr günstig vergleichbar am Ergebnis» welches mit Hilfe der üblichen Metfibraufiltration erhalten

Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, ist die stoffliche Beschaffenheit der Analyse nicht, erfinuungsv/eöeir-liGii. Imtnunobewertung und ähnliche Messungen oder Bewertungen aufgrund konkurrierender Reaktionen» v/ie oben beschrieber!, sind Beispiele für geeignete Anal;ysenforcien» Das beteiligte radioaktive Element ist vorzugsweise ein weicher Öaeaastrahier, aber die Beschaffenheit der beiden Phasen und Sie ilethode, nach welcher das radioaktive Element zwischen den Piiasen verteilt wird, spielen keine wesentliche Rolle. In gleicher weise kann auch jedes geeignete Mittel aur Be&tiraaung des Aktivitätsgrades in einer der beiden Phasen oder Ia beiden Phasen angewandt werden»

Pa t;c_n ta n;sj? y üche

• 11 -

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Claims

P A 3} El·! T A H S PR Ü C H E

1.) Verfahren zur Durchführung von auf Konkurrenz-{eaktionen beruhenden Analysen "bei welchen ein radioaktives Element oder eine radioaktive Verbindung zwischen zwei' Phasen verteilt wird dadurch gekennzeichnet , daß man den G-rad der Radioaktivität von mindestens einer der "beiden Phasen bestimmt, während diese Phase mit der anderen Phase in Berührung steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung an zwei in einea einzigen Behälter vorliegenden Phasen vornimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß man die Radioaktivität der einen Phase mit einer Meßvorrichtung mißt, vor welcher ein Teil des Behälterinhaltes abgeschirmt ist.

4« Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekenn ζ ei,chn et, daß man mit einer flüssigen Phase und einer dichteren festen Phase arbeitet.

5.

Verfahren nach Anspruch 4 dadurch g ek e η .η —

zeichnet, daß man die feste Phase in einem entsprechend geformten Röhrchen während der Messung in aerklichera Abstand von der Ila-uptmenge der flüssigen Phase hält,

6.

Verfahren nach Anspruch 4 oder ρ dadurch g e k e η η ζ e i e Ii net, daß man die Heßvorrichtungen in

- 12 -

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cJerWeise als Kollimator ausbildet und abschirmt, daß man die Radioalitivität von praktisch der gesamten flüssigen Phase, jedoch nicht der festen Phase mißt.

7. Verfahren nacii Anspruch 4 oder 5 dadurch gekennzeichnet, daß man die Ileßvorrichtung derart als Kollimator ausbildet und abschirmt, daß aan die Radioaktivität nur eines ausge\vählten Bereiches der flüssigen Phase mißt.

8. Verfahren nach. Anspruch 4 oder 5 dadurch gekennzeichnet, daß man die Meßvorrichtung in der Weise als Kollioator ausbildet und abschirmt,, daß as η die Radioaktivität der festen Phase, jedoch nicht der flüssigen Phase mißt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei man

(a) in einem Röhrchen vorsieht:

1. Ein bekanntes Volumen einer Flüssigkeit enthaltend die zu bewertende Verbindung,

2. eine Standardrneage einer radioaktiv markierten Version der zu bewertendien Verbindung und

3. eine Standardmenge eines Reagens, welche ausreicht, υπ reversibel nit einem Teil der zu bewertenden Verbindung und mit einem Teil der radioaktiv markierten Version dieser Verbindung* wodurch die zu bewertende Verbindung und ihre radioaktiv markierte Version sv/isclien der flüssigen Phase und der festen Phase verteilt werden,

(b) die feste Phase ara Boden des Röhrchens lokalisiert und

(c) den Radioaktivitätsgrad von zumindest einem Teil der flüssigen Phase pißt, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Durchführung der 3tiue

zu reagieren _Λ~.

— λ j —

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(c) den ^adioaktivitätsgrad von zumindest einem Teil der flüssigen Phase mißt,- während diese flüssige Piiase in dem Behälter in Berührung mit der festen Piiase bleibt. ■ .

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ft

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