DE2261561C3

DE2261561C3 - Verfahren zur Durchführung von auf Konkurrenz-Reaktionen beruhenden Analysen

Info

Publication number: DE2261561C3
Application number: DE2261561A
Authority: DE
Inventors: John Stuart Glover; Bryan Peter Shepherd
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1971-12-16
Filing date: 1972-12-15
Publication date: 1980-09-04
Also published as: JPS5229956B2; SE390066B; GB1411382A; DE2261561B2; JPS4866892A; US3883738A; DE2261561A1; FR2167046A5

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Durchführung von auf Konkurrenzreaktionen beruhenden Analysen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Ein derartiges Verfahren ist aus der US-PS 36 15 222 bekannt.

Typisch für derartige Analysen sind Bestimmungen durch Konkurrenz-Reaktionen, wobei eine unbekannte Menge der Verbindung, die bestimmt werden soll, sowie eine Standardmenge einer radioaktiv markierten Form dieser Verbindung bei der Reaktion um eine Standardmenge eines anderen Reagenses in Konkurrenz miteinander treten. Diese Arbeitsweise ist in der Medizin sehr weit verbreitet zur Bestimmung von Hormonen und anderen Substanzen, wobei als das andere Reagens der Antikörper in Immunsystemen oder ein anderer spezifischer Reaktionspartner in Nichtimmun- oder Nichthormonsystemen verwendet wird.

C ist die Verbindung, die bestimmt werden soll; C* ist die radioaktiv markierte Form dieser Verbindung; R ist der andere Reaktionspartner.

ίο Die Menge R wird so bemessen, daß sie nicht ausreicht, um mit dem gesamten C+C* zu reagieren. Da die Reaktion zumindest im gewissen Ausmaß reversibel ist, stellt sich ein Gleichgewicht ein, bei welchem das Verhältnis von

[C*KC^#]+[C*-R]

bestimmt wird durch die Menge an vorhandener nicht markierter Verbindung C. Wird C* von C* - R getrennt und die Aktivität der beiden einzelnen voneinander getrennten Teile gemessen, so läßt sich das Verhältnis leicht errechnen. Die Menge an nicht markierter Verbindung C kann dann relativ oder absolut bestimmt werden, indem ein Standardpräparat der Verbindung C zur Aufstellung einer Eichkurve verwendet wird.

Diese Arbeitsweise wird mit Beispielen in einer Zeitschrift von RA. Yalow und SA. Berson in IAEA-SM-124/106, Seiten 455 -481 beschrieben.
Die Trennung von C* und C* - R wird allgemein in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wird entweder C* oder C*-R zu einem Phasenwechsel veranlaßt, beispielsweise durch Ausfällen aus einer Lösung, durch Absorption auf einem inerten Träger oder durch Übergang in eine mit Wasser nicht mischbare Phase. In der zweiten Stufe werden die beiden Phasen voneinander getrennt, beispielsweise durch Filtration oder — gebräuchlicher — durch Zentrifugieren und anschließendes Abgießen der überstehenden Flüssigkeit. Sobald die beiden Phasen in zwei verschiedenen Behältern getrennt vorliegen, ist es einfach, die Aktivität in jedem Behälter zu bestimmten.

Die Trennung beider Phasen durch Oberführen der einen Phase aus dem Reaktionsröhrchen in einen anderen Behälter ist jedoch zeitraubend und zudem Anlaß für ungenaue Messungen oder sogar Meßfehler. Insbesondere wird auch selten das gesamte Material aus ""einem Behälter in den anderen überführt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchführung von auf Konkurrenz-Reaktion beruhenden Analysen zu entwickeln, das schneller und einfacher durchführbar ist als die bekannten Verfahren und das trotzdem noch mit hinreichender Genauigkeit arbeitet.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch gekennzeichnete Verfahren gelöst.

Durch den Gegenstand des Patentanspruchs wird die Schwierigkeit beim Messen der Aktivität in einer Phase, während diese mit der anderen Phase in Berührung steht, die darin besteht, die Vorrichtung zum Zählen der

bo Aktivität in dieser einen Phase von der von der anderen Phase abgegebenen Strahlung abzuschirmen, überwunden.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders auf jene Fälle anwenden, in denen das beteiligte

hi radioaktive Markierungselement ein weicher y-Strahler ist, so daß eine ziemlich dünne Bleischicht zur Abschirmung verwendet werden kann. Das gebräuchliche ¹²⁵J ist besonders geeignet, weil seine weiche

y-Strahhmg bereits durch eine 3 mm starke Bleischicht bis auf einen unbedeutenden Rest abgeschwächt wird.

Wenn das radioaktive Element zwischen einer Flüssigkeit und einer schwereren festen Phase verteilt wird und als Reaktionsgefäß ein Zentrifugenröhrchen mit einer Kapillare am Boden verwendet wird, so läßt sich die Aktivität der festen Phase, die sich in der Kapillare in einem merklichen Abstand von der Phase der flüssigen Phase im Hauptteil des Röhrchens befindet, messen, indem der Hauptteil des Röhrchens vor dem Zähler abgeschirmt wird, wobei sich nur ein sehr kleiner Fehler durch Beimengung einer sehr kleinen Menge flüssiger Phase in dem Kapillarrohr ergibt Die Aktivität der flüssigen Phase im Hauptteil des Reaktionsröhrchens wird dann gemessen, indem das Kapillarröhrchen von dem Zähler abgeschirmt wird, wobei sich nur ein sehr kleiner Fehler aus der Abwesenheit der sehr kleinen Menge flüssiger Phase ergibt, die in das Kapillarröhrchen übergegangen ist Soll das radioaktive Element zwischen zwei flüssigen Phasen verteilt werden, so ist eine entsprechende Ausbildung des Röhrchens möglich.

Bei zahlreichen Anwendungen ist eine ganz exakte Messung der Radioaktivität in einer oder in beiden Phasen nicht erforderlich, vorausgesetzt, daß der prozentuale Fehler nicht zu breit ist und zudem konstant bleibt Trotz eines solchen konstanten prozentualen Fehlers können beispielsweise beim üblichen Radioimmunoassay, bei dem eine Eichkurve mit Bezug auf ein Standardpräparat aufgestellt wird, annehmbar gute Resultate erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun mit Bezug auf die Zeichnung in einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert In der Zeichnung zeigt

F i g. 1 eine perspektivische Ansicht eines üblichen Zentrifugenröhrchens, das eine Flüssigkeit mit darin suspendiertem Festkörper enthält,

F i g. 2 eine perspektivische Ansicht des Zentrifugenröhrchens nach dem Zentrifugieren,

Fig.3 eine perspektivische Ansicht eines teilweise abgeschirmten Halters; die Aussparung für das Zentrifugenröhrchen ist gestrichelt angegeben,

F i g. 4 eine perspektivische Ansicht des Halters mit darin befindlichem Zentrifugenröhrchen,

Fig.5 eine perspektivische Ansicht einer abgeschirmten Zählvorrichtung, teilweise im Schnitt, um das darin angeordnete Röhrchen mit Lösung und Feststoffsediment zu zeigen.

Das in Fig. 1 und 2 gezeigte Zentrifugenröhrchen 10 besteht aus Kunststoff, hat einen Verschluß 11 und enthält eine flüssige Phase 12 sowie eine feste Phase 13, von denen eine oder beide radioaktiv sind. In F i g. 2 ist die feste Phase 13 im konisch zulaufenden Beden 14 des Röhrchens 10 durch das Zentrifugieren konzentriert worden.

Der in den Fig.3 und 4 gezeigte, teilweise abgeschirmte Halter 15 besteht aus einer Bleibasis 16, die mit einem ringförmigen Oberteil 17 aus Kunststoff verbunden ist Ein Zentrifugenröhrchen paßt so in den Halter hinein, daß der Bod· .η 14 und das darin befindliche Feststoffmatenal von dem aus Blei gefertigten Teil des Halters umgeben ist.

Die vollständige Einheit (Halter 15+ Zentrifugenröhrchen 10) kann in die Vertiefung eines Natriumjodidszintillationskristalls eingepaßt sein, welcher Teil eines Instrumentes zum Messen der Radioaktivität ist (Kristallzähler). Abgeschirmt von dem Zähler durch die Bleibasis 16 des Halters 15 ist die feste Phase 13 und ein geringer Teil der flüssigen Phase 12, der sich im Spitzboden 14 des Zentrifugenröhxchens 10 befindet Der Meßfehler, welcher sich daraus ergibt daß nicht die gesamte flüssige Phase im Zähler sichtbar ist kann allgemein vernachlässigt werden mit Ausnahme dort wo ganz genaue Messungen benötigt werden; er ist in jedem Falle unwesentlich, wenn die Radioaktivität von Flüssigkeiten in verschiedenen Röhrchen der gleichen Ausbildung miteinander verglichen wird.

Das mit Bezug auf F i g. 1 bis 4 beschriebene System ist dazu vorgesehen, die Radioaktivität von praktisch der gesamten flüssigen Phase im Zentrifugenröhrchen zu messen. Wenn jedoch unbekannte Proben gegen geeichte Standards gemessen werden, so braucht nicht die gesamte Phase gemessen zu werden. Es genügt dann sicherzustellen, daß das Flüssigkeitsvolumen in den verschiedenen, im Versuch verwendeten Röhrchen dasselbe ist und die Radioaktivität eines konstanten Volumens der flüssigen Phase zu messen. Dieses konstante Volumen braucht nicht bekannt zu sein; es muß jedoch einen konstanten Anteil der gesamten flüssigen Phase ausmachen wie beispielsweise bei verschiedenen, im gleichen Experiment verwendeten Röhrchen.

Dieses Prinzip wird mit Bezug auf Fig.5 näher erläutert: die Zählvorrichtung umfaßt einen (nicht gezeigten) Natriumjodidszintillationskristall, in dessen Vertiefung die Bleiabschirmung 18, 19 angeordnet oder eingebaut ist. Ein Röhrchen 20 mit einem Verschluß 21, das eine flüssige Phase 22 bis zur Oberfläche 23 und eine sedimentierte feste Phase 24 enthält paßt genau in die Bleiabschirmung hinein. Der obere und der untere Teil 18 und 19 der Bleiabschirmung begrenzen das Sichtfeld der Zählvorrichtung auf eine fixierte Säule 25 der flüssigen Phase 22. Vorausgesetzt daß der Durchmesser der Säule 25 fixiert ist d.h. vorausgesetzt, daß die Innendurchmesser der im Experiment verwendeten Röhrchen alle gleich sind und vorausgesetzt, daß die Oberfläche 23 der Flüssigkeit 22 im Oberteil 19 der Bleiabschirmung in jedem Röhrchen stets auf derselben Höhe ist, mißt der Zähler die Radioaktivität eines konstanten Anteils der gesamten flüssigen Phase, bei verschiedenen im gleichen Experiment verwendeten Röhrchen.

Dieses Verfahren kann dahingehend abgewandelt werden, daß die Flüssigkeitsoberfläche 23 sich innerhalb der fixierten Säule 25 im Sichtfeld der Zählvorrichtung befindet. Diese Alternative wird jedoch nicht bevorzugt, weil dabei die Oberfläche 23 stets ganz genau dieselbe Höhe bei verschiedenen im gleichen Experiment verwendeten Röhrchen aufweisen muß.

Fehler treten dann auf, wenn die Röhrchen nicht alle genau den gleichen Innendurchmesser besitzen oder wenn das Gesamtvolumen der flüssigen Phase nicht genau das gleiche ist in jedem Röhrchen; diese Fehler sind jedoch in der Praxis nicht von Bedeutung, außer wenn extrem genaue Messungen angestrebt und benötigt werden.

Beispiel Allgemeine Methoden

C^;ne Insulin-Immunoassay-Analyseneinheit, beruhend auf der Methode von Haies und Rändle (Lancet, i, 200,1963; Biochem. J., 88,137,1963) wurde verwendet, um den Gebrauch des Meßsystems zu erläutern. Ein definiertes Serum wurde als »unbekannt« verwendet. Dieses Serum war 3fach bei mehr als 15 Gelegenheiten

unter Anwendung der üblichen Filtrationsmethode bewertet worden. Die Meßzahlen reichten von 43,0 bis 58,5 Millieinheiten je cm³ mit einem Gesamtmittelwert von 49,7.

Verfahrensweise

Das Verfahren wurde genauso durchgeführt, wie es in der der Analyseeinheit beigegebenen Gebrauchsanweisung dargelegt ist, mit Ausnahme der zur Herstellung der Inkubate verwendeten Volumina: es wurden 300 μΐ anstelle der angegebenen 100 μΐ genommen. Infolge dieses größeren Volumens konnten die vorhandenen abgeschirmten Behälter, die für ein Nominalvolumen von 1 cm³ angelegt sind, ohne Abänderung verwendet 15 68 werden. 67

Es wurden Insulinstandards zu 250, 100, 50, 25, 12,5 68 974 und »null« Mikroeinheiten (μΕ)/αη³ hergestellt. Jede 68 185 Konzentration wurde in 3facher Ausführung bereitet, «\ _c=Zählimpulse

indem gleiche Volumina von 300 μΐ in Zentrifugenröhrchen gegeben wurden. Die »unbekannten« Sera wurden 4fach hergestellt, indem jeweils 300 μΐ Serum in einem gleichartigen Röhrchen vorgelegt wurden.

Zu jedem Röhrchen wurden 300 μΐ bindendes Reagens gegeben und das Ganze vermischt. Die Röhrchen wurden verschlossen und 6 Stunden bei 4⁰C gehalten; darauf wurde in jedes Röhrchen ein gleicher Anteil von 300 μΐ von 125-l-InsuIin gegeben. Der Inhalt der Röhrchen wurde gemischt, die Röhrchen wurden verschlossen und weitere 18 Stunden bei 4° C gehalten.

Nach beendeter Inkubation wurden die Röhrchen 6 Minuten lang in einer Zentrifuge mit 14 500UpM (14 000 g) geschleudert Darauf wurden sie in die oben beschriebenen abgeschirmten Halter verbracht und jedes Röhrchen 60 Sekunden lang in einem y-Zähler ausgezählt

Ergebnisse: Zählimpulse, erhalten in abgeschirmten Behältern.

Insulin	c*)/min	3 Messungen	43 391
μΕ/cm³			49 919
»null«	43 169	44 325	56710
12,5	50 286	50 960	67 579
25	57 114	57 108	76 409
50	68 191	67 349	82 078
100	76 045	76 520	Mittelwert für
250	80 559	80 705	»unbekannt«
c*)/min	gefunden in	μΕ/cm³ Insulin
»unbekannten« Sera	bestimmt

52,5
50,5
54,0
52,0

Das Ergebnis, erhalten für die Insulinkonzentration eines definierten Serums unter Verwendung des abgeschirmten Meßsystems, ist sehr genau vergleichbar dem Ergebnis, welches mit Hilfe der üblichen Membranfiltration erhalten wird.

Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, ist die Art der Analyse nicht erfindungswesentlich. Immunoassays und ähnliche Bestimmungen aufgrund konkurrierender Reaktionen, wie oben beschrieben, sind Beispiele für geeignete Analysenformen. Das beteiligte radioaktive Element ist vorzugsweise ein weicher y-Strahler, aber die Beschaffenheit der beiden Phasen und die Methode, nach welcher das radioaktive Element zwischen den Phasen verteilt wird, spielen keine wesentliche Rolle. In gleicher Weise kann auch jedes geeignete Mittel zur Bestimmung des Aktivitätsgrades in einer der beiden Phasen oder in beiden Phasen angewandt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Durchführung von auf Konkurrenzreaktionen beruhenden Analysen, bei welchen in ein Röhrchen eingebracht werden: 1. ein bekanntes Volumen einer Flüssigkeit, enthaltend die Verbindung, deren Anteil bestimmt werden soll; 2. eine Standardmenge einer radioaktiv markierten Form der zu bestimmenden Verbindung und 3. eine Standardmenge eines Reagenses, welche ausreicht, um reversibel mit einem Teil der zu bestimmenden Verbindung und mit einem Teil der radioaktiv markierten Form dieser Verbindung unter Bildung einer anderen flüssigen oder festen Phase zu reagieren, wodurch die zu bestimmende Verbindung und ihre radioaktiv markierte Form zwischen der flüssigen Phase und der anderen flüssigen oder festen Phase verteilt werden, bei welchen die andere flüssige oder feste Phase am Boden des Röhrchens lokalisiert wird und der Radioaktivitätsgrad von zumindest einem Teil der flüssigen Phase oder der anderen flüssigen oder festen Phasen mit Hilfe einer Meßvorrichtung gemessen wird und zur Messung des unbekannten Anteils der Verbindung gegen geeichte Standardverbindungen die geometrischen Abmessungen des Röhrchens bei allen Messungen konstant gehalten werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung des Radioaktivitätsgrades an mindestens einem Teil der flüssigen Phase oder der anderen flüssigen oder festen Phase durchführt, während diese Phase (Meßphase) mit der anderen Phase in Berührung ist, und daß die Form des Röhrchens so ausgebildet wird, daß die Meßphase einen beträchtlichen Abstand vom Hauptvolumen der anderen Phase besitzt, und/oder eine Abschirmung so ausgebildet wird, daß diese sowohl im Bereich der anderen Phase als auch zumindest in einem unmittelbar an die Phasengrenze anschließenden Teilbereich der Meßphase die aus dem Röhrchen austretende Strahlung von der Meßvorrichtung abschirmt, die zudem so kollimiert ist, daß sie nur in Richtung aus der Meßphase kommende Strahlung aufnimmt.

Das Prinzip dieser Arbeitsweise kann durch folgendes Reaktionsschema wiedergegeben werden: