DE2219713A1 - Verfahren zur Herstellung von Glucose Isomerase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Glucose IsomeraseInfo
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Description
betreffend:
Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isome.rase
Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isome.rase
Ein neues Glucose-Isomerase-Enzyni, das zur Umwandlung von
Glucose in Fructose geeignet ist, kann hergestellt werden, indem man eine Kultur von Streptomyces olivaceus IiRRI 3916
in einem Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, züchtet und dann das Enzym hieraus gewinnt.
Süße Sirupe sind weitverbreitet und werden z. B. beim Backen, bei der Herstellung von Konditoreiwaren und in der Getränkeindustrie
verwendet. Diese Sirupe bestehen im allgemeinen aus Saccharose (Rohrzucker) .oder Dextrose enthaltenden Produkten,
die bei der Stärkehydrolyse erhalten werden, als Hauptsüßungsmittel. Y/enn ein Sirup benötigt wird, der süßer
ist als derjenige, der aus Saccharose erhalten wird, wird ein Invertzucker-Sirup verwendet. Dieser wird durch saure
Hydrolyse von Saccharose hergestellt, wobei ein Gemisch aus ungefähr 50 tfo Glucose (Dextrose) und ungefähr 50 ^
Fructose (Levulose) entsteht. Während Glucose etwas weniger süß ist als Saccharose, ist die Fructose süßer als Saccharose,
so daß die Gesamtsüße, verglichen mit Saccharose, zunimmt.
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Es ist bekannt, daß Dextrose unter alkalischen Bedingungen
in Fructose umgewandelt werden kann. Diese Umwandlung hat große patentielle Bedeutung für die Herstellung von süßem
Sirup. Die alkalische Umwandlung hat jedoch keinen kommerziellen Erfolg gehabt, da die alkalische Reaktion zu einem
unerwünscht hohen Gehalt von Aschen in dem entstehenden Sirup führt, der nur unwirtschaftlich zu entfernen ist. Der Sirup
kann, ohne daß diese Aschen entfernt werden, nicht verwendet werden.
Man wandte sich dann der enzymatischen Umwandlung von Glucose
in Fructose zu. Es zeigte sich dabei, .daß Arten von Pseudomonas
hydrqiiila, Streptomyces flavovireus, Streptomyces echinatur,
Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus und ähnlichen
in einem geeigneten Nährraedium gezüchtet werden konnten, wobei
Enzyme gebildet wurden, die Glucose-Isomerase-Eigenschaften
besaßen. Diese bekannten Verfahren setzten sich jedoch kommerziell nicht durch, da entweder die Ausbeuten an Enzymen
während des Enzymproduktionsprozesses oder die Ausbeuten an Fructosen, wenn das Enzym zur Umwandlung von Glucose verwendet
wurde, zu gering waren. Es ist außerdem bekannt, daß Streptomyces olivaceus NRRL 3583 verwendet werden kann zur Bildung
einer für den Handel geeigneten Glucose-Isomerase, wobei die Enzymausbeuten höher sind als diejenigen, die mit anderen
bekannten Organismen erhalten worden sind (Dt-OS 2 018 058).
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
unter aeroben Bedingungen eine Kultur von Streptomyces olivaceus KNRL 3916 in einem Medium, das geeignete Nährstoffe
enthält, züchtet und dann das Enzym hieraus gewinnt. Dieser Organismus führt zu noch höheren Ausbeuten an dem gewünschten
Enzym als die bekannten Organismen.
Der für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Organismus wird auf bekannte V/eise als Streptomyces olivaceus bezeichnet.
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Der spezielle Stamm von Streptomyces olivaceus, der für die
Herstellung der neuen Glucose-Isomerase geeignet ist, wurde bei der Northern Utilization Research and Development Division,
Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielt die
. Nummer NRRL 3916.
Der Stamm-Streptomyces olivaceus NRRL 3916 wurde durch ultraviolette
Mutation von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 nach "bekannten Verfahren hergestellt-. Es war jedoch unerwartet, daß
eine derartige Mutante zu höheren Ausbeuten an Glucose-Isomerase führen würde als die Stammkultur.
Der Streptomyces olivaceus IIBSL3916 -Organismus wird auf
Agarschrägen gehalten und kann in einem Medium gezüchtet v/erden, das geeignete Nährstoffe enthält. Das Medium enthält
vorzugsweise Xylose und eine Stickstoffquelle. Günstigerweise
enthält das Medium außerdem andere Kohlenhydrate und anorganische
Salze. Typische Kohlenhydrate sind Maisstärke, Dextrose," .Lactose, 7/eizenkleie u.a. Typische Stickstoff quellen sind'
Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Maiswasser u.a. Typische anorganische Salze sind Natriumchlorid,
Magnesiumsulfat u.a. Diese Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganischen Salze sind bekannt. Die in dem
Wachstunsmedium verwendete Xylose kann in gereinigter Fora oder in Form eines rohen xylosehaltigen Materials vorliegen. "
Der Organismus wird günstigerv:eise unter Bedingungen der
submersen Fermentation ungefähr 20 bis ungefähr 50 h bei
einer Temperaturvon ungefähr.15°C bis ungefähr 35°C gezüchtet.
Bei Temperaturen unterhalb ungefähr 150C und bei Temperaturen
oberhalb ungefähr 35°C wird die Ausbeute an dem-gewünschten
Ensyn ziemlich niedrig. Die bevorzugte Wachstumstempo ratur beträgt ungefähr 25°C bis ungefähr 35°C. Es wird
günütigervveise -Ataosphärendruck angewandt, aber Drucke oberhalb
und unterhalb von Atmosphärendruck können gegebenenfalls
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ohne besondere Vorteile oder Nachteile angewandt werden. Der Anfangs-pH-Wert des Wachstunsmediums sollte zwischen ungefähr
6,8 und 7*1 liegen. ' ... · ' ' ■ ■ '
Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase wird innerhalb der
Bakterienzellen gebildet, die während ihrer Produktion wachsen. Die Zellen können von der Gärbrühe 'abfiltriert und direkt . . .
als Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden. V/ahlweise können die Zellen durch Filtration gewonnen und dann
durch bekannte Verfahren aufgebrochen werden. Die entstehenden aufgebrochenen Zellen und ihr freigesetzter Zellinhalt
können als Quelle für Glucose-Isomerase verwendet v/erden. Außerdem können die Zellen auch z.B. durch Ultraschall
oder Homogenisierungsapparate aufgebrochen und die Trümmer können durch Zentrifugation entfernt·werden. Die überstehende
Flüssigkeit kann direkt als Quelle für die Glucose-Isomerase
verwendet v/erden oder sie kann zu einem feinen Pulver für spätere Verwendung lyophilisiert werden. Das Enzym kann aus
der oben beschriebenen überstehenden Flüssigkeit auch durch bekannte Ausfällmittel, wie Methanol oder Ammoniumsulfat ausgefällt
werden. ■ · · * .
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Glucose-Isomerase zur
Fructoseerzeugung kann durch die folgenden beiden Bestimmungsmothoden_
bestimmt werden. - ■ · ·
Es wurde, eine 62,5>;oige (Gew./Vol.) wäßrige Lösung von Glucose
hergestellt, indem man unter Rühren langsam 625 g v/asserfreie
Glucose zu 300 ml heißem destilliertem V/asser zugab.
Die Lösung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt und hierzu wurden 125 ml 1m wäßrige Lösung von Tris-(hy<Dro:cymeth7l)-an!ino-Eicthan
vom pH-V/ert 8,5,. 125 ^l 1m wäßrige Lorning von" Magnesiumsulfat
und 50 ml ö,O25m wäßrige Lösung von Kobaltchlorid zugesetzt.
Das entstehende Gemisch, wurde dann mit destilliertem Wasser auf 1 1 verdünnt.
2Ü9844/Π 19
BAD ORiGINAL
BAD ORiGINAL
• ■ 5 -.. ·
,10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25 ml-Meßkolben
gegeben. Es wurde eine ausreichende Menge des zu ; *
untersuchenden Enzyms zugegeben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rotation von ungefähr 2,9° bis ungefähr 7,5°
zu kommen, v/ie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt und
das entstehende Gemisch wurde 2 h bei 60° stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zusatz von 1 ml einer-0,5m
wäßrigen Lösung von Perchlorsäure abgebrochen.· Das Gemisch wurde dann mit 15 000 UpM 20 min -zentrifugiert und die
optische Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt. Es wurde eine Blindprobe
auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bestimmt. Die
spezifische Rotation /~<xJ7q der Probe bzw. der Blindprobe
betrug 2a oder den doppelten Wert der beobachteten optischen
Drehung. Die prozentuale Umwandlung von Glucose'in Fructose
wurde durch die folgende Formel berechnet:
Prozentuale Umwandlung = /~a 7™ ·' j -u — /~cc 7-,-, , ^™
& L -'Blindprobe - -Probe χ
" ' ' + 92 ■-■:■■
Blindprobe
Diese-Bestimmungsmethode wurde auch angewandt, um die Aktivität
in Glueose-Isomerase-Einheiteii zu berechnen, wobei eine
Glucose-Isomerase-Einheit die Menge"von Enzym bedeutet, die.
unter den angegebenen Bedingungen in 1 min 1 y\x Mol
Glucose in Fructose umwandelt. Die Enzymaktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten
(GIU) der untersuchten Enzyiaprobe wurde nach der folgenden Formel berechnet:
GIU/ oder GIU/ a /Ug gebildete Fructose-χ 0,046j
oder ml verwendetes Enzym
wobei die /Ug gebildete Fructose durch Multiplikation des
oben berechneten Wertes für die prozentuale Glueose-Umwandlung
mit dem Faktor 6,25 x 10 berechnet wurden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3916 wurden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 50 cm eines wäßrigen
Gemisches enthaltend 1 ,0 % Xylose, 0,3 i° Maisstärke, 1,0^
Pept'one, 0,5 $ Fleischextrakt, 0,05 #-Hefeextrakt, 0,5 $
Natriumchlorid und 0,05 % Magnesiumsulfat enthielt. Alle Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht pro Volumen.
Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolbeninhalt wurde dann auf einem
Rotationsschüttler 24 Stunden bei 300C bewegt. Nach Ablauf
■5 der 24stündigen Inkubationszeit wurde 1 cm der beimpften
Kultur in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben enthaltend 50 cm/ eines wäßrigen Gemisches enthaltend 0,7 % Xylose, 0,3 7& Maisstärke,
1,0 fo Peptone, 0,5 % Fleischextrakt, 0,25 "/>
Hefeextrakt, 0,5 cfo Natriumchlorid und 0,05 i° Magnesiumsulfat
(ebenfalls Gew./Vol.). Der pH-Wert wurde wiederum mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Der beimpfte Kolbeninhalt wurde
dann auf einem Rotationsschüttler 48 Stunden bei 30 C bewegt. Die Bakterienzellen wurden von der entstehenden Fermentationsbrühe abfiltriert und es zeigte sich, daß sie 2952 GIU pro
Liter enthielten. Das oben angegebene Verfahren wurde wiederholt, wobei der bekannte Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583
verwendet wurde. Man erhielt,2561 GIU pro Liter. Das zeigt, daß mit dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm eine höhere
Enzymausbeute erzielt wird.
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7 -
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, w-qbei eine
Kultur von Streptomyces olivaceus NRRl 3916 verwendet wurde
und man eine Enzymausbeute von 2937 G-IU pro' Liter erhielt und mit dem bekannten Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583
erhielt man eine Enzymausbeute von nur 2373 G-IU pro Liter. Auch hier erhielt man mit dem erfindungsgemäß verwendeten
Stamm eine höhere Enzymausbeute als mit dem bekannten.
Das erfindungsgemäß hergestellte Glucose-Isomerase-Enzym
auch
ist/geeignet zur Umwandlung ναι Glucose in Fructose unter anderen als den Bestimmungsbedingungen.
ist/geeignet zur Umwandlung ναι Glucose in Fructose unter anderen als den Bestimmungsbedingungen.
Eine wäßrige Glucoselösung enthaltend 49,2 c/o (Gew./Vol.)
Glucose wurden mit einigen Bakterienz-ellen vermischt, die
nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren gezüchtet worden
waren. Die Zellen wurden in einer Menge von ungefähr 4 G-IU pro Gramm Glucose in der Glucoselösung verwendet. Das
entstehende Gemisch wurde 20 Stunden bei 600C umgesetzt, wobei
der pH-Wert 7,7 bis 7,9 betrug. Die entstehende Lösung wurde auf den Pructosegehalt untersucht und es zeigte sich,
daß 40,2 fo Umwandlung von Glucose zu Fructose eingetreten
war.
Patentanspruch
62XXIV
209844/1119
Claims (1)
- DU. ING. F. WUESTHOFFBR.E.T. PECIIMANN »R. ING. T». IiKURENS DIPI,. ING. R. GOET2PAT E Ν' T AN WiM E8 MÜNCHEN SCHWEIOEHSTnASSE TELXFOK (0811) 66 20 TBZiXS S 24 OTOTELKOHAMME I PROTEOTPATEVT MCKCItEK■ U-4o 971PatentanspruchVerfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase durch Züchtung einer Kultur von Streptomyces olivaceus in einem Medium,das geeignete Hährstoffe enthält und Gewinnung des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces olivaceus den Stamm NRRI 3916 verwendet.62V209844/1119
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| US13656171A | 1971-04-22 | 1971-04-22 |
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| DE2219713C3 DE2219713C3 (de) | 1973-10-04 |
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