CH648059A5 - Verfahren zur herstellung von sirups mit fructosegehalt aus saccharose. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Sirups durch enzymatische Transfructo-sylierung von Saccharose. Dieses Verfahren liefert einen neuen enzymatischen Zugang für die Herstellung von Sirups mit hohem Fructosegehalt, welche einen beträchtlich höheren Fructosegehalt aufweisen, als bisher durch Glucoseisomeri-sierung von Stärkehydrolysaten erhältlich war, ohne die Notwendigkeit der physikalischen Trennung des resultierenden Fructoseendproduktes. Das Verfahren ist besonders geeignet für die Erzeugung von Fructosesirups, welche mehr als 55% Fructose enthalten. Es bedient sich bevorzugt eines neuen Transfructosylaseenzyms aus Kulturen der Hefe Pullularia pullulans, welches sich für diese Herstellung als nützlich erwies.

Der erfindungsgemäss erhaltene Sirup lässt sich mit oder ohne Abtrennung einzelner Komponenten zu Fructose oder fructosehaltigem Sirup verarbeiten.

Jedes dieser Produkte weist Eigenschaften von üblichen Zuckern und Sirup auf und kann in deren üblichen Anwendungen eingesetzt werden. Diese umfassen zum Beispiel die Verwendung als Süssmittel für Nahrungsmittel und als Rohmaterialien für die Herstellung von Pharmazeutika. Ausserdem können diese Produkte in den üblichen industriellen Anwendungen von Zuckern und Sirups eingesetzt werden. So können sie in der Herstellung von Klebstoffen, Anfeuch-tungsmitteln, Pergamentpapier, Gerbstoffen, elektrischen Isolatoren, Bindemitteln für Giessereikerne, Insektiziden, Farbstoffen und dergleichen oder allgemeiner als Weichmacher, Verdickungsmittel usw. verwendet werden. Kurz gesagt sind sie nützlich in dem ganzen breiten Anwendungsspektrum, in welchem analoge Produkte bereits verwendet wurden.

Da zahlreiche Bezeichnungen in Fachkreisen verwendet werden, dienen die folgenden Definitionen zur Festlegung der Bedeutung dieser Ausdrücke, wie sie hier verwendet werden:

Glucose und Dextrose:

Die Bezeichnungen «Glucose» und «Dextrose» werden in dieser Beschreibung austauschbar verwendet, um dieses Monosaccharid in jeder Form in Lösung oder trocken zu umfassen.

Saccharose:

Der Ausdruck «Saccharose» bezieht sich auf dieses Di-saccharid in raffinierter oder roher Form, in Lösung oder trocken, aus jeder Rohmaterialquelle für Saccharose, zum Beispiel Zuckerrohr oder Zuckerrüben. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird das Saccharose-Aus-gangsmaterial typischerweise in wässerigem Medium verwendet.

Fructose und Lävulose:

Die Ausdrücke «Fructose» und «Lävulose» werden allgemein in Fachkreisen austauschbar verwendet, und beziehen sich auf das Isomer von Dextrose, welches süsser ist als Dextrose selbst. Fructose wird in Honig und in Invertzucker gefunden, zusammen mit Dextrose, und ist wertvoll infolge seiner Süssigkeit. Die Bezeichnungen Lävulose und Fructose werden im folgenden austauschbar verwendet, und beziehen sich auf dieses Monosaccharid in jeder Form, in Lösung oder trocken.

Enzympräparat:

Der Ausdruck «Enzympräparat» wird hier verwendet, um jede Zusammensetzung zu bezeichnen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität aufweist. Der Ausdruck bezieht sich zum Beispiel auf lebende ganze Zellen, trockene Zellen, Zellextrakte, raffinierte und konzentrierte Präparate, welche aus den Zellen und aus Kulturflüssigkeiten gewonnen werden. Die Enzympräparate können entweder als Lösung oder in einer immobilisierten Form bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

648 059

Isomerase-Enzym :

Jedes Enzympräparat, welches Dextrose zu Lävulose iso-merisiert, wird im folgenden als ein «Isomeraseenzym» bezeichnet. Diese Enzyme sind in Fachkreisen bekannt und wurden als Dextroseisomerase, Xyloseisomerase und Gluco-seisomerase bezeichnet. Derartige Enzyme können aus einer Vielzahl von geeigneten Mikroorganismen gewonnen werden. Beispiele solcher Mikroorganismen sind solche der Gattungen Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Cur-tobacterium und andere.

Ein bevorzugtes Isomeraseenzym, welches sich für die Durchführung der vorliegenden Erfindung eignet, wird von Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 713, ATCC Nr. 21714 oder ATCC Nr. 21715 gewonnen, wobei das letztere ein Einzelkolonie-Isolat von ATCC Nr. 21713 ist, wie im US-PS 3 813 318 und im US-PS 3 957 587 beschrieben, insbesondere wenn es nach dem Verfahren hergestellt wird, welches im US-PS 3 770 589 oder 3 813 318 hergestellt ist.

Kürzlich wurden Verfahren bekannt, in welchen das Isomeraseenzym auf einem wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert wird. Das immobilisierte Enzym ist dann geeignet für die Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose zu einem Sirup mit hohem Fructosegehalt. Beispiele derartiger Verfahren sind in den US-PS 3 708 397, 3 788 945,3 850 751, 3 868 304, der BE-PS 819 859 und in der US-PS 3 960 663 (gleich BE-PS 810 480) beschrieben.

Isomerase-Einheit:

Eine «Isomerase-Einheit» ist definiert als diejenige Menge an Enzymaktivität, welche erforderlich ist, um ein Mikromol Lävulose pro Minute unter den im folgenden unter «Bestimmung der Isomerase-Aktivität» beschriebenen Isome-risierungsbedingungen zu erzeugen.

Bestimmung der Isomerase-Aktivität:

Dieser Ausdruck bezieht sich hier auf das Bestimmungsverfahren, welches eine spektrophotometrische Bestimmung der aus einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugten Ketose umfasst.

Eine Vorratslösung wird auf folgende Weise zubereitet:

Vorratslösung für Bestimmung

Bestandteil

Menge

0,1 M MgS04-7Hi0

1 ml

0,001 M CoCb-óHzO

1 ml

1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5

0,5 ml wasserfreie D-Glucose

1,44 g

Destilliertes Wasser wird zugesetzt bis zu einem Totalvolumen von 7,5 ml.

Das zu bestimmende Enzympräparat wird zunächst derart verdünnt, dass es 1 bis 6 Isomerase-Einheiten pro Milliliter enthält.

Eine enzymatische Isomerisierung wird durchgeführt durch Zusatz von 1 ml des Enzympräparates zu 3 ml der Vorratslösung und Inkubieren während 30 Minuten bei 60 °C. Am Ende der Inkubationszeit wird ein aliquoter Teil von 1 ml entnommen und in 9 ml 0,5 N Perchlorsäure gelöst. Der gelöste aliquote Teil wird sodann auf ein Totalvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle zu Vergleichszwecken wird ein Glucose-Blindversuch durchgeführt, in welchem 1 ml Wasser anstelle von 1 ml Enzympräparat in Lösung zu Beginn der Inkubationszeit zugesetzt wird.

Die Ketose wird sodann bestimmt durch eine Cystein-Schwefelsäure-Methode. Für die Zwecke dieser Bestimmung wird eine Isomerase-Einheit als diejenige Menge an Enzymaktivität definiert, welche erforderlich ist, um ein Mikromol Lävulose pro Minute unter den beschriebenen Isomerisie-rungsbedingungen zu bilden.

Transfructosylierung :

Diese Bezeichnung bedeutet hier den Übergang eines Fructosylrestes von einem Donator, z.B. Saccharose, zu einem Akzeptor, z.B. Polysaccharid.

Fructosyl-Transferase-Enzym :

Dieser Ausdruck bezieht sich hier auf jedes Enzym, welches die Transfructosylierung katalysiert und umfasst das Enzympräparat, welches aus Pullularia pullans ATCC 9348 (Synonym mit Aureobasidium pullulans) gewonnen wird.

Fructosyl-Transferase-Einheit:

Eine Fructosyl-Transferase-Einheit bedeutet hier diejenige Menge an Enzymaktivität, welche erforderlich ist, um ein Mikromol reduzierenden Zuckers, berechnet als Glucose, pro Minute unter den folgenden Bedingungen zu bilden: (a) p-H 5,5, (b) Temperatur 55 °C, und (c) Substratkonzentration von 60 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität pro 100 ml eines wässerigen Reaktionsgemisches.

Die Bestimmungen des reduzierenden Zuckers (berechnet als Glucose) werden durchgeführt unter Verwendung eines «Technicon Autoanalyzer II» (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). Die Analyse wird nach einer üblichen Alkaliferri-cyanid-Methode durchgeführt, wie sie in Analytical Bioche-mistry, 45, Nr. 2, Seiten 517 bis 524 (1972) beschrieben ist und für die die Verwendung im «Autoanalyzer II» angepasst ist. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden die Enzymaktivitätsbestimmungen durch kontinuierliche Überwachung eines Reaktionsgemisches durchgeführt, welches folgende Zusammensetzung aufweist:

7,5 ml 80%ige (Gewicht/Volumen) wässerige Lösung von

Saccharose von Nahrungsmittelqualität 2,3 ml 0,1 M Citratpuffer pH 5,5 0,2 ml Enzymprobe, welche jene Menge an

Fructosyl-Transferase-Enzym enthält, welche 5 bis 25 Mikrogramm reduzierenden Zucker (berechnet als Glucose) pro Minute pro Milliliter Reaktionsgemisch erzeugt.

Primäres Substrat:

Der Ausdruck «primäres Substrat» bedeutet hier jene Saccharide in geeigneter Form, welche einen für die Beteiligung bei der Transfructosylierung verfügbaren Fructosylrest besitzen, wie z.B. wässerige Lösungen von Saccharose.

Sekundäres Substrat:

Die Bezeichnung «sekundäres Substrat» bedeutet hier das Reaktionsprodukt, welches entsteht, wenn das primäre Substrat der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzymprä-parates, wie hier definiert, unterworfen wird.

Teile und Prozentangaben:

In der vorliegenden Beschreibung sind alle Teile Gewichtsteile und alle Prozentangaben Gewicht/Volumen,

sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.

Hochdruckflüssigkeitschromatographische Bestimmung :

Diese Bezeichnung bedeutet hier das Verfahren, in welchem Sirups gemäss der Erfindung analysiert werden unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemäss der folgenden Technik. Die Komponenten werden durch Eluierung mit Wasser aus einem Kationenaustauscherharz in Calciumform chromatographiert. Die eluierten Komponenten werden mit Hilfe eines Differential-Refraktometers festgestellt. Andere Kohlehydrate als Dextrose werden unter Verwendung eines elektronischen Integrators quantitativ bestimmt und Dextrose wird durch Bildung der Differenz erhalten. Das allgemeine Verfahren ist in «Analysis of Car-bohydrate Mixtures by Liquid Chromatography», in Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, Seiten 43 bis 46 beschrieben. Das verwendete Harz ist «Aminex Q» 15-5 in der Calciumform, von Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Sirups, wie in Patentanspruch 1 definiert.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648 059

4

Hierbei wird im wesentlichen Saccharose, der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzym-Präparates unterworfen, welches fähig ist, die Saccharose in ein Produkt umzuwandeln, welches eine Monosaccharidfraktion, welche im allgemeinen einen Hauptanteil an Glucose und einen geringeren Anteil an Fructose enthält, und Polysaccharide, welche im allgemeinen mindestens 66 Gewichtsprozent Fructosyl-Reste enthalten, umfasst. Diese Polysaccharide umfassen alle fruc-tosehaltigen Polymere, welche von Saccharose verschieden sind, mit zwei oder mehr Monosaccharidresten. Diese Polymere können ferner dadurch charakterisiert werden, dass sie Polysaccharide umfassen, welche Fructosylreste enthalten, die durch (2—>-l)-ß-Bindungen gebunden sind. Wie im folgenden beschrieben, können die Polysaccharide, welche aus gegebenen Bedingungen der Transfructosylierung entstehen, vorwiegend innerhalb eines vorbestimmbaren Bereiches liegt. So kann z.B. ein Substrat erzeugt werden, in welchem die meisten (z.B. mindestens 60% bezogen auf das Molverhältnis) des Polysaccharides Oligomere mit 2 bis 10 (d.h. DP 2-10), üblicherweise 3 bis 6 (d.h. DP 3-6) Monosaccharid-Resten sind. Die Glucose wird sodann durch die Einwirkung des Iso-meraseenzyms zu Fructose in Gegenwart der Polysaccharide isomerisiert, worauf die Hydrolyse der Polysaccharide in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym erfolgen kann. Die Hydrolyse kann enzymatisch durchgeführt werden unter Verwendung von Invertase oder durch saure Hydrolyse unter milden Bedingungen.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Polysaccharide im erhaltenen Produkt von der Glucose und der Fructose getrennt und anschliessend hydrolysiert werden, wie oben beschrieben, um einen Sirup mit besonders hohem Fructosegehalt zu erzeugen, z.B. mit einem Fructosegehalt von über 66 Gewichsprozent und vorzugsweise über 90 Gewichtsprozent, ohne die Notwendigkeit der Isomerisierung der Dextrose. Eine derartige Trennung kann mit Vorteil durchgeführt werden durch übliche physikalische Trennmethoden, basierend auf der Molekulargrösse, z.B. durch übliche Membrantechnologie, wie Ultrafiltration, Dialyse, Lösungsmittelausfällung, Absorption an Kohlenstoff und dergleichen. Beispiele solcher Membrantechnologien sind in den US-PS 3 173 867, Re 26097, 3 541 006 und 3 691 068 beschrieben.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren für die Herstellung von Sirups mit hohem Fructosegehalt, bei welchem Saccharose der Einwirkung eines Fructosyl-Transfe-rase-Enzympräparates unterworfen wird, wie es z.B. von Pullularia pullulans, wie ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 und ATCC 15 223 gewonnen wird. Das resultierende Produkt oder sekundäre Substrat kann der Einwirkung von Isomeraseenzym unterworfen werden. Anschliessend kann das isome-risierte Produkt in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert werden.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugte Substrat wird als neu betrachtet. Dieses Substrat ist hervorragend geeignet für die Isomerisierung und die Hydrolyse zur Erzeugung eines Sirups, welcher mehr als 55% Fructose enthält, und wird hergestellt, indem Saccharose der Einwirkung eines Fructosyl-Transferase-Enzympräparates unterworfen wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher erfindungsgemäss erhaltene Substrate, welche geeignet sind für die enzymatische Isomerisierung und anschliessende Hydrolyse zu Sirups, welche mehr als 55% Fructosesirup enthalten, welche Substrate (1) etwa 20 bis 60 Gewichsprozent Monosaccharide, die einen Hauptanteil an Glucose und einen geringeren Anteil an Fructose enthalten, und (2) etwa 70 bis 40% Polysaccharide, welche mehr als 55 Gewichtsprozent Fructosylreste enthalten, umfassen.

Besonders bevorzugt sind sekundäre Substrate, welche durch Transfructosylierung von Saccharose in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Fructosyl-Transferase-Enzym-präparates erhalten wurden, welches aus einem Stamm von Pullularia pullulans ATCC 9348 bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25 bis 65 °C und vorzugsweise von etwa 50 bis 60 °C, und bei einem pH von etwa 4,5 bis 6,5 und vorzugsweise etwa 5,4 bis 5,6 gewonnen wurde. Die Konzentrationen der verwendeten Ausgangssaccharose können bis hinunter auf 10 g pro 100 ml Wasser betragen. Vorzugsweise wird jedoch eine möglichst hohe Trockensubstanzkonzentration verwendet, vorzugsweise zwischen etwa 30 g bis etwa 60 g pro 100 ml (für maximale Reaktionsgeschwindigkeit) bis zum Sättigungspunkt der Saccharose (und höher, wie im folgenden beschrieben).

Ein Minimum von 0,5 Einheiten Fructosyl-Transferase pro Gramm Saccharose kann verwendet werden, um das neue erfindungsgemässe Substrat zu erzeugen. Im allgemeinen beträgt die Menge an verwendetem Enzym nicht mehr als 50 Einheiten pro Gramm Saccharose aus ökonomischen Überlegungen. Besonders bevorzugt zur Erzielung des gewünschten sekundären Substrates in wirtschaftlich annehmbarer Zeit und innerhalb der oben beschriebenen Verfahrensparameter ist im Bereich von etwa 2 bis etwa 30 Einheiten pro Gramm Saccharose.

Das Verfahren zur Herstellung der neuen Fructosyl-Transferase kann bekannte Fermentationstechniken verwenden, z.B. diejenigen, welche in den US-PS 3 565 756, 3 806 419,3 535 123, sowie im Artikel von S. Ueda et al., im «Applied microbiology», 11,211-215 (1963) beschrieben sind. Vorzugsweise werden gewisse neue Trenn- oder Reinigungsschritte, welche im folgenden näher beschrieben werden, angewandt. Die folgenden Präparation beschreibt ein typisches Fermentationsverfahren für die Erzeugung des Enzyms aus Pullularia pullulans ATCC 9348.

Präparation

Erzeugung von Fructoxyl-Transferase-Enzym Herstellung Celit-Träger

A) Das zur Erzeugung des Enzyms verwendete Fermentationsverfahren

Das Medium, welches zur Entwicklung des Inoculums und zur Fermentation zwecks Erzeugung des Enzyms verwendet wurde, ist das folgende:

0,5% Dibasisches Kaliumphosphat 0,1% Natriumchlorid 0,02% Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,06% Diammoniumsulfat 0,3% Hefeextrakt (Difco Laboratories) 7,5% Saccharose (Nahrungsmittelqualität)

pH des Mediums eingestellt auf 6,8.

Die Impfflaschen, 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, welche 100 ml sterilisiertes Medium enthielten, wurden mit Pullularia pullulans aus einer Schrägkultur beimpft. Der besondere Stamm der Hefe, welche verwendet wurde, ist im Katalog der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) als ATCC 9348 bezeichnet. Die Impfflaschen-Inhalte werden nach der Entwicklung auf einer Schüttelmaschine während 48 Stunden bei 32 ° C verwendet, um einlitrige Erlenmeyer-Fer-mentationskolben zu impfen, welche je 200 ml des oben genannten Mediums enthalten. Die verwendete Konzentration an Inoculum beträgt 0,5% (Gewicht/Volumen). Die Fermentation wird auf einer Schüttelmaschine bei 32 °C während 7 Tagen durchgeführt.

B) Gewinnung des Enzyms aus der Fermentierbrühe

Die Fermentierbrühen aus 40 Einliter-Schüttelkolben wurden vereint und die Kolben mit Wasser gespült, welches

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

648 059

ebenfalls zu den vereinten Brühen zugesetzt wird. Das Endvolumen der Brühe nach der Verdünnung beträgt 12 Liter. Das ursprüngliche Volumen der Brühe beträgt etwa 8 Liter. Die 12 Liter Fermentationsbrühe werden durch eine kontinuierliche Sharples-Zentrifuge geleitet, um die Hefezellen und die Zellbruchstücke zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit, welche eine schwarze viskose Lösung darstellt, wird sodann mit Calciumchlorid auf eine Konzentration von 0,5% Gewicht/ Volumen dosiert, und das pH der erhaltenen Lösung mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Ein zweiter Durchgang durch die Sharples-Zentrifuge wird sodann durchgeführt, um eine viskose überstehende Flüssigkeit zu erzeugen, welche nicht stark gefärbt ist. Das pH der entfärbten überstehenden Lösung wird mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf 1000 Einheiten (wie in der US-PS 3 806 419 definiert) Pullulanase zugesetzt wird. Die erhaltene Brühe wird mit Toluol, welches bis zur Sättigung zugesetzt wird, konserviert, und die Pullulanase bei Zimmertemperatur über Nacht reagieren gelassen. Nach der Digestion mit Pullulanase über Nacht wurde eine l%ige Konzentration an Grefco Nr. 503 Celite (Johns-Man-ville Products Corporation, Lompoc, California) in der Brühe aufgeschlämmt, gefolgt vom Zusatz von 2 Volumen (24 Liter) Aceton. Es bildet sich ein Niederschlag, weicher durch Filtration gewonnen wird, und der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der gesammelte Filterkuchen enthält das insolubilisierte Fructosyl-Transferase-Enzym.

In Beispiel 1 ist zu beachten, dass der Zusatz von Calciumchlorid zur Fermentationsbrühe unter Einstellung des pH der Brühe zur Entfernung des schwarzen Pigmentes und der vorhandenen sauren Polysaccharide führt. Für nähere Einzelheiten über diese sauren Polysaccharide wird auf Acta. Chem. Scand. 16, 615-622 (1962) verwiesen. Das Enzym-Endprodukt wird dadurch zu einem verhältnismässig reinen, farblosen Präparat. Dieses Raffinierverfahren stellt eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Methode dar und ermöglicht es, mit einfachen Raffinierungsoperationen, d.h. Zentrifugie-ren, Filtrieren oder Ausfällen, das Endprodukt zu erhalten. Gemäss dieser Ausführungsform wird daher ein Verfahren zum Abtrennen von sauren Polysacchariden und schwarzen Pigment-Nebenprodukten aus den Endfermentationsbrühen der Hefe Pullularia pullulans geliefert. Dieses Verfahren macht ein Endenzympräparat frei von unerwünschtem Pigment- und sauren Polysaccharid-Nebenprodukten, welche während der Fermentation gebildet werden. Diese Nebenprodukte werden zusammen mit dem Enzym bei dem Zusatz des Lösungsmittels zur Fermentationsbrühe ausgefällt, wenn sie nicht entfernt werden.

Als weiterer Raffinierungsschritt zur Gewinnung gereinigter Enzympräparate gemäss der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, das Pullulan-Polysaccharid, welches inherent in der Fermentationsbrühe zugegen ist, zu entfernen, weil auch dieses Produkt beim Zusatz von Lösungsmittel zur Fermentationsbrühe zusammen mit dem Fructosyl-Transferase-Enzym ausfällt. Die aus der Calciumchloridbehandlung und der pH-Einstellung erhaltene überstehende Flüssigkeit kann daher weiter mit dem bekannten hydrolysierenden Enzym Pullulanase behandelt werden. Pullulanase-Enzym hydrolysiert das Pullulan unter Bildung eines Polymers mit niederem Molekulargewicht, wodurch die Kopräzipitation und entsprechende Verunreinigung des Fructosyl-Transferase-Enzymprä-parates während der Lösungsmittelbehandlung (z.B. Aceton, Alkohol und dergleichen) verhindert wird. Die Reinigung des gewünschten Fructosyl-Transferase-Enzyms auf diese Weise ist ebenfalls neu.

Die erhaltenen Fructosyl-Transferase-Enzympräparate können ohne Entfernung des Pullulans verwendet werden. Das vorliegende Herstellungsverfahren kann daher durchgeführt werden ohne Hydrolyse des Pullulans mittels Pullulanase, in welchem Fall Pullulan als Träger für das Fructosyl-Transferase-Enzym dient.

Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung von Pullulan als Träger.

Beispiel 1

Herstellung von sekundärem Substrat unter Verwendung von Fructosyl-Transferase-Enzym auf Pullulan-Träger

Eine 20%ige Saccharose-Lösung, welche mit 0,05 M Citrat-Puffer vom pH 5,5 gepuffert ist, wird mit einer l%igen Konzentration an trockenem Pullulan versehen, welches gemäss dem Verfahren der Präparation hergestellt wurde, wobei jedoch das Pullulan nicht mit Pullulanase hydrolysiert wurde und daher als Träger dient und kein «Celit» verwendet wurde. Die Fructosyl-Transferase-Aktivität beträgt 677 Einheiten/Gramm Pullulan. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt, bis das Gemisch trüb wird. Eine Probe dieses Materials wird durch Hochdruckflüssigkeits-Chroma-tographie analysiert und ergibt folgende Resultate:

Saccharid-Verteilung durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie-Analyse

Fructose

Dextrose dpz

DP3 dp4+

6,9

40,6

6,2

11,1 35,2

Die folgenden Beispiele liefern weitere Einzelheiten über das in der Präparation erzeugte Enzym.

Beispiel 2

Produkte mit enzymatischer Wirkung und Wärmestabilität des Enzyms

In Reaktionsflaschen, welche mit Schraubenverschlüssen ausgerüstet sind, werden 60 g Saccharose von Nahrungsmittelqualität und ein Fructosyl-Transferase-Enzympräparat zugesetzt. Das Enzympräparat wird aus dem in der Präparation hergestellten Enzymprodukt durch Dispergieren geeigneter aliquoter Teile des festen Celit-Enzymproduktes in abgemessenen Mengen Wasser unter Bildung einer Enzymlösung von geeigneter Konzentration erhalten. Das Celit wird sodann durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird verwendet, um das Reaktionsgemisch mit 10, 20 bzw. 30 Einheiten Enzym pro Gramm Saccharosesubstrat zu versehen. Diese Gemische werden sodann jedes bis zu einem Endvolumen von 100 ml mit Wasser verdünnt. Die Umwandlungen erfolgen während 66 Stunden bei pH 5,5 und einer Temperatur von 55 bzw. 60 °C. Proben werden nach 24, 43 und 66 Stunden entnommen, um den reduzierenden Zucker zu bestimmen und die Gegenwart der enzymatischen Aktivität zu bestätigen. Nach der Durchführung der Bestimmung des reduzierenden Zuckers in den Proben werden die verbleibenden Reaktionsgemische gefroren, um die enzymatische Wirkung zu unterbrechen und die Proben der Bestimmung der Kohlehydratzusammensetzung durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatogra-phie unterworfen. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

648 059 6

Bestimmung des reduzierenden Zuckers1

Temperatur Einheiten reduzierender Zucker pH reduzierender Zucker pH reduzierender Zucker

°C Enzym2 mg/ml 24 Stunden (mg/ml 43 Stunden mg/ml 66 Stunden

0

-

5,80

-

5,80

-

10

191

5,40

231

5,25

268

20

192

5,40

270

5,25

301

30

246

5,35

334

5,15

390

0

0,7

5,75

1,5

5,80

2,1

10

200

5,10

243

4,70

270

20

219

5,15

288

4,90

346

30

282

5,20

360

4,95

420

1 Verwendete Methode ist unter der Definition der Fructosyl-Transferase-Einheit beschrieben.

2 Einheiten Enzym pro Gramm Saccharose.

Kohlehydrat-Zusammensetzung bestimmt durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie-Analyse

Reaktionstemperatur 55 °C

Enzym-Dosis

Reaktionszeit

Dextrose

Lävulose dp:

dpi dp4+

Einheit g Saccharose

Stunden

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

10

24

31,7

2,3

10,0

25,0

31,0

43

34,5

3,2

9,4

17,9

35,0

66

36,7

3,9

8,6

15,0

35,8

20

24

33,9

2,8

8,8

19,7

34,8

43

37,4

4,2

7,9

12,1

38,4

66

40,5

4,9

7,4

10,8

36,4

30

24

37,4

4,0

7,1

12,5

39,0

43

41,8

5,9

6,8

11,4

34,1

66

46,1

7,5

7,0

11,5

27,9

Reaktionstemperatur 60 °C

Enzym-Dosis

Reaktionszeit

Dextrose

Lävulose dp2

dpa dp4+

Einheit/g Saccharose

Stunden

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

10

24

32,2

2,8

6,1

24,3

30,6

43

35,0

4,0

9,8

18,2

33,0

66

36,7

5,4

9,4

16,0

32,5

20

24

35,5

3,8

8,4

17,1

35,2

43

38,4

5,0

8,0

12,3

36,3

66

41,3

6,6

7,9

11,1

33,1

30

24

39,0

5,5

7,1

12,1

36,3

43

43,7

7,1

7,3

11,0

30,9

66

47,8

9,2

7,4

11,1

34,5

Funktionalität des Enzyms in Gegenwart von hohen Glucose-55 konzentrationen.

Versuch 1

Wirkung der Temperatur auf die Enzym-Aktivität

Die Wirkung der Temperatur auf die Reaktionsgeschwin-60 digkeit von Fructosyl-Transferase-Enzym wird bestimmt unter Anwendung des «Technicon Autoanalyzer II» wie folgt:

Das Reaktionsgemisch besteht aus 7,5 ml 80%iger (Gewicht/Volumen) Saccharoselösung, 2,3 ml eines 0,1 M 65 Citratpuffers mit einem pH von 5,5 und 0,2 ml einer 2%igen (Gewicht/Volumen) Pullulan-Enzym-Lösung (Enzympräparat aus Beispiel 1). Die Endsaccharosekonzentration beträgt 60% (Gewicht/Volumen). Die Proben werden bei den folgenDie folgenden Versuche zeigen die Wärmestabilität in Gegenwart von Substrat des Enzyms bei 55 und 60 °C über eine Periode von 66 Stunden bei einem pH von 5,5, wodurch das wirtschaftliche Potential des Enzyms dargelegt wird. Ausserdem wird das sekundäre Substrat, welches durch die enzymatische Umwandlung von Saccharose mit dem neuen Fruc-tosyl-Transferase-Präparat durch die Kohlehydrat-Analyse als potentiell wertvolles Produkt bestätigt, welches für die Herstellung von Sirups mit vollem Fructose-Gehalt aus Saccharose geeignet ist, weil nachgewiesen wird, dass die vorherrschenden Bestandteile Dextrose und Polymere sind, welche bei einer folgenden Hydrolyse Fructose als vorherrschendes Monosaccharid ergeben. Diese Versuche zeigen auch, dass das neue Enzym in einer Saccharose-Konzentration von 60% (Gewicht/Volumen) wirksam ist. Sie zeigen ferner die

7

648 059

den Temperaturen gehalten und während 10 Minuten auf dem «Technicon Autoanalyzer II» untersucht. Die Resultate zeigen, dass die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit bei 40 °C, 1,89 mal so gross ist wie bei 30 °C; bei 50 °C 1,29 mal grösser als bei 40 °C und bei 60 °C 1,48 mal grösser als bei 50 °C. Dies beweist eine zunehmende Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Temperatur.

Versuch 2

Nachweis der Michaelis-Menten-Kontante (Km) des Fructo-syl-Transferase-Enzyms

Die Km eines Enzyms gibt die Substratkonzentration an, bei welcher die Geschwindigkeit der Bildung des Produktes die Hälfte von Vraax beträgt. Das folgende Verfahren wurde verwendet, um die Km des Fructosyl-Transferase-Enzyms zu erhalten.

Unter Verwendung einer 90%igen (Gewicht/Volumen) Saccharose-Stammlösung, welche mit 0,1 Citratpuffer auf pH 5,5 eingestellt war, wurden die richtigen Konzentrationen an Saccharose in 9,8 ml aliquoten Teilen zubereitet, um zu ergeben: 5, 10,30,40, 50, 60 und 70%ige Konzentrationen an Saccharose bei einem Endvolumen von 10 ml. Eine Enzymlösung von 0,2 ml, welche 1,1 Einheit Fructosyl-Transferase-Enzym enthielt, wird zu den Proben zugesetzt. Dann werden die Proben sofort bei 55 °C auf dem «Technicon Autoanalyzer II» wie zuvor beschrieben (siehe Fructosyl-Transferase-Einheit) untersucht. Ein Glucose-Standard (calibriert in ug/ml) ist als Kontrolle eingeschlossen.

Im folgenden ist die Geschwindigkeit der Glucosebil-dung, ausgedrückt als ug/ml pro Minute bei verschiedenen Substrat-Konzentrationen unter Verwendung einer konstanten Dosis (1,1 Einheit) des Fructosyl-Transferase-Enzym-Prä-parates aus der Präparation zusammengestellt.

»0 Substrat

[ig/ml Minuten

Ug/ml Minuten1

5

8,0

8,0

10

11,8

11,6

20

15,7

15,2

30

18,0

17,6

40

18,6

18,2

50

19,2

17,2

60

17,8

18,2

70

15,6

-

1 Am nächsten Tag wiederholt aus einer 60%igen Saccharose-Stammlösung.

Die Km beträgt 0,27 molare Saccharose-Konzentration. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erfolgte bei einer Substrat-Konzentration von 1,374 molarer Saccharose bei pH 5,5 und bei 55 °C.

Beispiel 3

Herstellung und Isomerisierung von sekundärem Substrat aus Saccharose

A) Herstellung des sekundären Substrates

Saccharose von Nahrungsmittelqualität, 600 g, wird in Wasser bis zu einem Volumen von 800 ml gelöst. Das pH dieser Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf 5,5 eingestellt. Ein trockenes Celit-Enzym-Präparat, 11 g, mit einer Aktivität von 550 Einheiten pro Gramm, hergestellt wie in der Präparation beschrieben, wird in 100 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird unter Vakuum auf einem Whatman-Fil-terpapier Nr. 1 in einem Büchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die 200 ml Filtrat werden sodann zur Saccharoselösung zugesetzt,

welche sich in einer 0,5 Gallon Flasche befindet, die mit einem Schraubverschluss versehen ist. Die Flasche wird sodann in ein Wasserbad von 58 °C gestellt und die Reaktion während 20 Stunden fortschreiten gelassen, worauf eine Probe des Reaktionsproduktes durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie untersucht wird, um die Kohlehydratzusammensetzung zu bestimmen, wobei folgende Resultate erhalten werden:

Kohlehydrat-Zusammensetzung Fructose 2,4%

Dextrose 32,8%

DPi 10,6%

DPj 22,9%

DP4+ 31,3%

Magnesiumchlorid wird zum verbleibenden Reaktionsprodukt (d.h. dem sekundären Substrat) bis zu einer 5 milli-molaren Konzentration zugesetzt und das pH mit verdünntem Natriumyhdroxid auf 8,4 gebracht.

B) Kontinuierliche Isomerisierung des sekundären Substrates

Glucoseisomerase, gewonnen aus Streptomyces olivo-chromogenes ATCC 21 715 (siehe US-PS Re 29152) wird auf porösem Aluminiumoxid (ein kontrollierter Porenträger hergestellt von Corning Glass Co., Corning, New York, siehe z.B. US-PS 3 992 329) wie folgt immobilisiert:

1) Der Träger wird zweimal mit Wasser gewaschen;

2) der Träger wird mit 0,1 M Natriumeitrat während 1 Stunde unter Bewegung inkubiert:

3) das Natriumeitrat wird vom Träger abgewaschen, bis die Leitfähigkeit der Waschlösung 1000 Mikroohms beträgt;

4) der Träger wird mit 0,05 M Magnesiumchlorid während 1 Stunde inkubiert und die Magnesiumchloridlösung dekantiert;

5) ein Volumen von 0,05 M Magnesiumchlorid wird sodann zugesetzt, um eine Endenzymkonzentration von 400 Einheiten/ml zu ergeben;

6) das Isomerase-Enzym-Konzentrat wird zu dem Träger in einer Menge von 14 Millionen Einheiten pro Kubikfuss zugesetzt;

7) der Träger und das Enzym werden während 22 bis 24 Stunden in Berührung gelassen und dann das ungebundene Enzym mit destilliertem Wasser vom Träger abgespült.

Eine mit Mantel versehene Glassäule (3x18 cm), ausgerüstet mit einer Pumpe, welche an einen Vorratsbehälter angeschlossen ist, wird sodann mit dem derart zubereiteten immobilisierten Enzym beschickt. Das Bettvolumen der Säule nach der Beschickung beträgt 45 ml. Die Säule wird bei 60 °C für alle Isomerisierungen betrieben. Die beschickte Säule wird mit einem Dextrosesirup (50% Gewicht/Gewicht Konzentration) mit 5 Millimol Magnesiumchlorid und auf pH 8,4 eingestellt, in Betrieb genommen, um zu zeigen, dass die Säule aktiv ist. Die Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule wird auf 292 ml/Stunde eingestellt. Die Säule wird sodann bis auf die Betthöhe ablaufen gelassen. Die Einführung des sekundären Substrates erfolgt von Hand bis 20 ml ausfliessende Flüssigkeit gesammelt sind, worauf die Durchflussgeschwindigkeit für das sekundäre Substrat auf 292 ml/ Stunde eingestellt wird. Die ersten 100 ml gesammelten Sirup werden verworfen, um die Änderung des Substrates zu berücksichtigen. Das verbleibende sekundäre Substrat (etwa 850 ml) wird sodann durch die Säule geführt. Nach 1 Stunde steigt die Durchflussgeschwindigkeit auf 570 ml/Stunde. Die Durchflussgeschwindigkeit wird auf 300 ml/Stunde eingestellt und bis zum Ende der Operation auf dieser Höhe gehalten. Nach vollendetem Durchfluss wird die Säule wieder mit Dextrose beschickt, um nachzuweisen, dass die Isomerase-Aktvität noch vorhanden ist. Die folgende Tabelle vergleicht die Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie-Analysen des

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648 059

8

ausgangssekundären Substrates mit denjenigen des Endprodukes aus der Isomerisiersäule:

Sekundäres Substrat (a) Endprodukt (B)

Fructose

2,4

15,7

Dextrose

32,8

18,9

DPz

10,6

11,0

DPs

22,9

22,9

dp4+

■ 31,3

31,5

Diese Resultate zeigen, dass 42,38% der freien Dextrose im sekundären Substrat in der Säule zu Fructose isomerisiert wurde. Auch die im sekundären Substrat vorhandenen Fruc-tosepolymeren scheinen nicht betroffen zu sein oder ihrerseits die Isomerisierung von Dextrose zu Fructose zu beeinträchtigen. Es ist bemerkenswert, dass die totale Monosaccharid-Teilung aus etwa 45% Fructose und 55% Dextrose besteht.

Im folgenden Beispiel wurden zwei Versuche unternommen, um die im sekundären Substrat vorhandenen Polysaccharide zu spalten und auch das Isomerisationsprodukt daraus. Der eine Versuch ist enzymatischer Natur während der andere eine milde saure Hydrolyse anwendet.

Beispiel 4

Herstellung von Sirup mit hohem Fructosegehalt durch Hydrolyse

A) Enzymatische Hydrolyse

100 ml Produkt B aus Beispiel 3 werden mit 10 mg einer gereinigten Invertase, welche aus Candida utilis gewonnen wurde, vermischt. Dieses Gemisch (mit Toluol konserviert) wird über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren gelassen, worauf eine Probe entnommen und mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert wird. Das verbleibende Produkt B wird während weiteren 6 Tagen reagieren gelassen und alsdann eine zweite Probe nach demselben Verfahren untersucht, wobei die folgenden Resultate erhalten werden:

Ausgangs

Nach Einwir

Nach weite

material kung der ren

(Produkt B)

Invertase

6 Tagen

Fructose

15,7%

41,9%

62,4%

Dextrose

18,9%

29,4%

36,2%

DP2

11,0%

1,9%

0

DPj

22,9%

12,9%

0,5%

dp4+

31,5%

13,9%

0,9%

Die verwendete Invertase ist ein Enzympräparat, welches von der Firma Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan, hergestellt wird und eine Aktivität von 123 Einheiten/mg aufweist, wobei 1 Einheit Invertase die Spaltung von Saccharose unter Bildung von 1 Mikromol Glucose und 1 Mikromol Fructose pro Minute unter den spezifizierten Bedingungen katalysiert.

B) Saure Hydrolyse von Produkt B

Die saure Hydrolyse einer Probe vom Produkt B aus Beispiel 3 wurde durch Zusatz von Schwefelsäure bis zu einer Konzentration von 0,05 N und Erhitzen auf 75 bis 80 °C durchgeführt. Proben wurden nach einer und nach zwei Stunden Hydrolyse entnommen und durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die Resultate sind die folgenden:

Ausgangsmaterial (Produkt B)

I Stunde

2 Stunden

Fructose

15,7

60,3

59,1

Dextrose

18,9

38,7

37,9

DP2

11,0

1,9

2,6

DP3

22,9

0,4

0,3

dp4+

31,5

0

0,2

Die obigen Resultate in Stufe A zeigen eine vorherrschende Zunahme der Fructose und eine geringere Zunahme der Glucose-Ausbeute mit einem entsprechenden Abfall der DPa-, DP3- und DP4+-Fraktionen, wodurch die Gegenwart eines Fructosepolymers bewiesen ist.

Die Resultate aus der Säurehydrolyse in Stufe B sind in Übereinstimmung mit denjenigen aus Stufe A, so dass ebenfalls die Spaltung der Fructosepolymere nachgewiesen ist.

Die obige Diskussion richtet sich auf die Transfructosylierung unter Verwendung eines primären Substrates, in welchem der Trockensubstanzgehalt der Ausgangssaccharose den Sättigungspunkt unter den gegebenen Reaktionsbedingungen nicht übersteigt. Das folgende Beispiel zeigt die Verwendung eines primären Substrates mit einer anfänglichen Saccharosekonzentration oberhalb der Sättigung und welches, wenn es der Einwirkung des Fructosyl-Transferase-Enzyms unterworfen wird, zu einem Produkt führt, welches erhöhte Mengen an DP3-Material (d.h. Fructosyl-Saccharose) und eine verminderte Konzentration an DP4+-Produkten aufweist. Ferner zeigt sich eine Zunahme der Trockensubstanzkonzentration (Gewicht/Gewicht) des sekundären Substrates über die Trok-kensubstanzkonzentration, welche in Abwesenheit der Wirkung des Fructosyl-Transferase-Enzyms erhalten wird. Ausserdem wird gezeigt, dass wenn die Trockensubstanzkonzentration des primären Substrates zunimmt, der Grad an Polymerisation des Fructosepolymers im sekundären Substrat abnimmt und das DP4+-Material in kleineren Mengen vorhanden ist.

Dies steht in deutlichem Widerspruch zu den Resultaten, welche in den früheren Beispielen unter Erwendung von Saccharosesubstraten unterhalb der Sättigung erhalten wurde. In jenen Beispielen ist das DP4+-Material das primäre Produkt.

Beispiel 5

Herstellung von sekundärem Substrat aus Saccharose-Auf-schlämmungen, die mehr als gesättigt sind

200-g-Portionen Saccharose von Nahrungsmittelqualität werden in 1-Pint-Gläser mit Schraubdeckeln verbracht. Als Kontrolle werden 50 ml Wasser in ein Glas eingefüllt, während alle anderen je 50 ml Wasser erhalten, welches zunehmende Mengen Fructosyl-Transferase-Enzym-Celit-Präparat (hergestellt gemäss Präparation), wie in der folgenden Tabelle angeführt, enthält. Jedes Glas wird mit dem Deckel verschlossen und in ein Schüttel-Wasserbad von 54 bis 55 °C gestellt. Die Gläser werden während 24 Stunden geschüttelt unter gelegentlichem Vermischen von Hand. Eine Probe der überstehenden Flüssigkeit wird aus jedem Glas entnommen und in ein Reagensrohr mit Schraubverschluss in ein siedendes Wasserbad gestellt, um das Enzym zu inaktivieren. Diese Proben werden sodann durch Hochdruckflüssigkeits-Chromato-graphie analysiert und die Trockensubstanzbestimmungen der überstehenden Flüssigkeit nach der Methode von K. Fischer durchgeführt, wobei folgende Resultate erhalten werden:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

648 059

Flasche Nr.

Saccharose (g)

Einzym-einheiten1

Trockensubstanz in

Überstehendem

(Gew./Gew.)

Zusammensetzung der Kohlehydrate in Lösung gemäss Hochdruckfliissigkeits-Chromatographie (%)

Fructose Dextrose

DP2

DP3

DP,

4+

1

200

100

74,5

0,6

9,6

80,9

8,9

ND2

2

200

200

75,6

0,7

12,7

72,2

13,7

0,7

3

200

300

76,3

1,0

14,5

66,8

16,6

1,1

4

200

400

77,1

0,9

15,7

62,6

19,0

1,8

5

200

500

77,7

1,1

17,3

58,5

21,0

2,1

6

200

600

78,1

1,3

18,0

56,0

21,9

2,8

7

200

700

78,1

1,1

18,8

53,9

23,1

3,0

8

200

800

80,0

1,0

19,3

52,2

24,1

3,4

9

200

900

79,0

1,3

19,9

50,0

25,0

3,7

10

200

1000

79,6

1,3

20,6

48,6

25,4

4,1

Kontr.

200

keine

72,7

0,3

ND2

99,7

ND2

ND2

1 = Totale Einheiten an Fructosyl-Transferase-Enzym in 50 ml Wasser

2 «none detected» — keines festgestellt

Es ist bemerkenswert, dass im obigen Beispiel die Kontrolle kristallisierte, wenn sie auf Zimmertemperatur (etwa 25 °C) gekühlt wurde, während die enzymatisch erzeugten sekundären Substrate in Lösung verblieben und ausgezeich- 25 nete Lagerstabilität ohne Kristallisation aufwiesen.

Obwohl Beispiel 5 200 g Saccharose pro 50 ml Wasser, d.h. 80% Gewicht/Gewicht, verwendet, kann die Trockensubstanzkonzentration des Saccharose-Ausgangsmaterials erhöht werden. 30

Das neue sekundäre Substrat gemäss dieser Ausführungsform kann als hochstabiler, nicht-kristallisierender Sirup für Nahrungsmittelanwendungen verwendet werden. Es ergibt ferner eine Zusammensetzung mit einmalig hohem Trockensubstanzgehalt, welche beständig ist gegen Mikrobenbefall 35 und Farbkörperbildung, welche verwendet werden kann, um den Zucker in bisher nicht-erzielbaren Konzentrationen in einer Form, welche die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, zu transportieren und/oder zu lagern. Dieses neue sekundäre Substrat mit hohem Trockensubstanzgehalt kann 40 ausserdem der Hydrolyse unterworfen werden, wie in Beispiel 4 gezeigt, um ein Invertzuckergemisch zu erzielen, welches eine wünschenswerte Süssigkeit aufweist. Das neue sekundäre Substrat gemäss der vorliegenden Erfindung weist einen Trockensubstanzgehalt (Gewicht/Gewicht) im Bereich 45 von etwa 70% bis etwa 82% auf und enthält eine Monosaccha-ridfraktion, welche im wesentlichen aus Dextrose und Poly-

saccharidpolymeren besteht, im Überschuss aus dp2, bestehend vorwiegend aus DPî-Produkten. Eine kleine Menge (4,1% und weniger) DP4+-Polymere ist ebenfalls vorhanden.

Obwohl die Transfructosylierungsstufe des vorliegenden Verfahrens anhand von chargenweisen Ansätzen dargelegt wurde, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass kontinuierliche Operationen ebenfalls verwendet werden können. Bei der Durchführung solcher kontinuierlicher Transfructosy-lierungen wird das Transfructosylase-Enzym mit Vorteil immobilisiert, unter Anwendung der oben unter der Definition des immobilisierten Enzyms beschriebenen Techniken, und der darin beschriebenen kontinuierlichen Verarbeitungsmethoden.

Alle in der vorstehenden Beschreibung und in den Patentansprüchen erwähnten Mikroorganismen sind bekannt und unter der angeführten Hinterlegungs-Nummer oder im Handel erhältlich.

NRRL= Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratory (ARS = NRRL), Peoria, Illinois 61604, USA.

ATCC = American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

G

Claims (15)

1. 648 059

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung eines Sirups, dadurch gekennzeichnet, dass Saccharose der Einwirkung einer wirksamen Menge eines Fructosyl-Transferase-Enzympräparates ausgesetzt wird, um ein Reaktionsprodukt zu bilden, welches Fructosepolysaccharid und Dextrose enthält.
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose, welche der Wirkung des Enzyms ausgesetzt wird, in einer Konzentration von mindestens 20% vorliegt.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fructosyl-Transferase-Enzympräparat von Pullularia pullulans abgeleitet ist.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose der Einwirkung von Fructosyl-Transferase-Enzym bei einer Temperatur von 25 bis 65 °C, einem pH von 4,6 bis 6,5 und einer anfänglichen Saccharosekonzentration von mindestens 10% (Gewicht/Volumen) ausgesetzt wird.
5. 5. Verwendung des nach Patentanspruch 1 erhaltenen Sirups zur Herstellung von Fructosesirup, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose des Reaktionsproduktes isomeri-siert wird.
6. 6. Verwendung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung unter Verwendung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzyms durchgeführt wird.
7. 7. Verwendung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose in Gegenwart des Polysaccharides zu Fructose isomerisiert wird.
8. 8. Verwendung nach Patentanspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextrose vor der Isomerisierung physikalisch vom Polysaccharid getrennt wird.
9. 9. Verwendung nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung durch Ultrafiltration erfolgt.
10. 10. Verwendung nach einem der Patentansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem das Polysaccharid des Reaktionsproduktes hydrolysiert wird, um Fructose zu bilden.
11. 11. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid in Abwesenheit von aktivem Isomeraseenzym hydrolysiert wird.
12. 12. Verwendung nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid, nach physikalischer Trennung von der Dextrose, hydrolysiert wird.
13. 13. Substrat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 4, und geeignet für die enzy-matische Dextrose-Isomerisierung und Hydrolyse zu Fruc-tose-Sirups, welche mehr als 55% Fructose enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass es (1) 20 bis 60% Monosaccharid, bestehend vorwiegend aus Dextrose und Fructose, und (2) 70 bis 40% Polysaccharide, bestehend vorwiegend aus Fructosylre-sten, enthält, wobei diese Prozentangaben sich auf das Gewicht des Substrates beziehen.
14. 14. Substrat nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid mindestens 66 Gewichtsprozent Fructosylreste enthält.
15. 15. Substrat nach Patentanspruch 13, welches einen Trok-kensubstanzgehalt (Gewicht/Gewicht) von 70 bis 82% aufweist und eine Monosaccharidfraktion enthält, welche vorwiegend aus Dextrose besteht, und eine Polysaccharidfrak-tion, welche verschieden von Saccharose ist, und vorwiegend aus einem Polysaccharid, welches ein Oligomer mit drei Monosacchariden enthält.