DE2101358A1

DE2101358A1 - Fotoanalysevorrichtung

Info

Publication number: DE2101358A1
Application number: DE19712101358
Authority: DE
Inventors: Mitchell Yorktown Heights; Kamentsky Louis A. Bnarcliff Manor Klinger Isaac Yorktwon Heights; N.Y Friedman (V.StA)
Original assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Current assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Priority date: 1970-01-14
Filing date: 1971-01-13
Publication date: 1971-07-22
Also published as: GB1284199A; IE34870L; IE34870B1; JPS544636B1; US3705771A; DE2101358C2

Description

WQ-In Esichel

DM-Ing. Wei:- anj Eslcliel

6 Franbxui a. M. I

Parksiraße 13 _Ct._ic

6546

ΒΙΟ/PHYSICS SYSTEMS, INC., Katonah, New York, VStA

Fotoanalysevorrichtung

Die vorliegende Erfindung "bezieht sich auf eine Fotoanalysevorrichtung zur gleichzeitigen optischen Messung verschiedener Eigenschaften jedes !Teilchens einer Gruppe von Teilchen, wie
Blutzellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, mit
einer Lichtquelle, einem Gehäuse, das aus einem Werkstoff besteht, der Licht der Lichtquelle durchläßt, und das eine optische Kammer bildet, mit einer Vorrichtung, die Flüssigkeit mit den suspendierten Teilchen in einem dünnen Strom durch das Gehäuse bewegt, damit die Teilchen in einer Folge eines nach dem andern durch den Strom bewegt werden und mit einer Lichtablenkvorrichtung, durch die das Licht von der Lichtquelle zu der g einen Seite des Gehäuses gelenkt wird, damit es den dünnen Strom der Teilchen mit einem gebündelten Strahl schneidet.

Es besteht ein großer Bedarf nach einer genauen Analyse für
die Eigenschaften von Gruppen kleiner Teilchen, beispielsweise bei der Analyse der Bedingungen bei der Luftverschmutzung und
der v'/acserverschmutzung. Ein besonders wichtiges Anwendungsgebiet xlir solche Analysen liegt ferner in der medizinischen For-Kohrmc und Diagnose. Bei solchen Anwendungen müssen Blutzellen und andere biologische Zellen analysiert werden.

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Gemäß der Erfindung wird die Analyse von kleinen Teilchen optisch dadurch durchgeführt, daß die Teilchen in einem sehr dünnen Flüssigkeitsstrom mitgerissen werden, so daß sie sich eines nach dem andern durch eine optische Abfrageeinrichtung bewegen. Es ist eine fotooptische Aufnahmevorrichtung vorgesehen, die die optische Wirkung jedes Teilchens auf die Beleuchtung durch einen Lichtstrahl feststellt. Die sich dabei ergebende Nachricht ist besonders wertvoll, wenn nach einem speziellen Verfahren gearbeitet wird, um die Teilchen zunächst aufzubereiten, beispielsweise durch die Anwendung von Farbstoffen, die von den Teilchen auf verschiedene Weise aufgenommen werden, was von den Unterschieden in den Teilchen, die untersucht werden, abhängt.

Ferner kann der Nachrichtengehalt, der fotooptisch abgeleitet wird, dadurch erheblich erhöht werden, wenn mindestens zwei verschiedene optische Wirkungen der Teilchen gleichzeitig mit Hilfe von optischen Aufnahmeelementen festgestellt werden, die unter verschiedenen Winkeln gegenüber der Richtung des Strahls, der* auf das Teilchen gerichtet ist, angeordnet sind. Beispielsweise ermöglicht die kombinierte Untersuchung der Absorption und einer anderen optischen Wirkung, beispielsweise der Streuung, eine sehr nützliche Nachrichtenkombination über die zu beobachtenden Teilchen. Man weiß, daß beispielsweise bei der Analyse von biologischen Zellenproben, beispielsweise Blutzellen, die toten Zellen den Farbstoff Trypani^blau absorbieren, während ihn die lebenden Zellen nicht absorbieren. Folglich ist es möglich, eine Probe solcher Zellen dadurch zu analysieren, daß die Probe zunächst einem solchen Farbstoff ausgesetzt wird und daß anschließend sowohl die Absorption als auch die Streuung optisch gemessen werden. Die toten Zellen, die den Farbstoff aufnehmen, werden dann optisch durch das Absorptionssignal festgestellt,und die lebenden Zellen werden durch optische Streusignale untersucht, wobei diese Analyseyorrichtung dann dazu verwendet werden kann, die Zahlen der toten und lebenden Zellen in der Probe festzustellen.

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Bei einer Fotoanalysevorrichtung der oben beschriebenen Art ändert sich der durch die zu beobachtenden Teilchen hervorgerufene Lichtstreueffekt mit den unterschiedlichen Eigenschaften der Teilchen, beispielsweise mit der Teilchengröße, dem Brechungsindex und dem Vorhandensein von brechenden und absorbierenden Stoffen in den Teilchen. Demgemäß läßt sich durch Untersuchung des von den Teilchen gestreuten Lichts ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Eigenschaften der Teilchen ableiten. Gemäß der Erfindung wird die Amplitude der Streustrahlung als eine Funktion der Winkel oder der Winkelbereiche gemessen, unter denen das gestreute Licht, welches eine bestimmte Nachricht enthält, auftritt.

Gemäß der Erfindung ist ferner eine neue Fotoanalysevorrichtung vorgesehen, die eine sehr ökonomische optische Kammer aufweist, die in ihren optischen Eigenschaften sehr zufriedenstellend arbeitet.

Gemäß der Erfindung ist eine Fotoanalysevorrichtung der eingangs erwähnten Art zur gleichzeitigen optischen Messung verschiedener Eigenschaften jedes Teilchens einer Gruppe von kleinen Teilchen, wie Blutzellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, mit einer Lichtquelle, einem Gehäuse, das aus einem Werkstoff besteht, der Licht der Lichtquelle durchläßt, und das eine optische Kammer bildet, mit einer Vorrich- g tung, die Flüssigkeit mit den suspendierten. Teilchen in einem dünnen Strom durch das Gehäuse bewegt, damit die Teilchen in einer Folge eines nach dem andern durch den Strom bewegt werden, und mit einer Lichtablenkvorrichtung, durch die das Licht von der Lichtquelle zu der einen Seite des Gehäuses gelenkt wird, daß es den dünnen Strom der Teilchen mit einem gebündelten Strahl schneidet, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei fotoempfindliche Aufnahmeelemente außerhalb des Gehäuses in verschiedenen Winkelstellungen gegenüber der Strahlrichtung vorgesehen sind, wenn von der Schnittstelle des Strahls mit dem Teilchenstrom aus gemessen wird, und daß die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente gleichzeitig verschiedene optische

Wirkungen jedes von dem Strahl beleuchteten Teilchens feststellen. 109830/1343

Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnungen beispielshalber beschrieben. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht, teilweise im Schnitt, der wesentlichen Teile einer Fotoanalysevorrichtung gemäß der Erfindung von oben,

Fig. 2 eine Seitenansicht,teilweise im Schnitt, eines Teils der Vorrichtung nach Fig. 1 mit zusätzlichen fotooptischen Aufnahmeelementen zur Bestimmung der Streustrahlung unter zusätzlichen Winkeln,

Fig. 2A eine Seitenansicht, teilweise im Schnitt, entsprechend Fig. 2 in vermindertem Maßstab einer abgewandelten Ausführungsform der Fotoanalysevorrichtung mit Vorrichtungen zur Aufnahme und Bestimmung der Fluoreszenz der Teilchen,

Fig. 3 eine vergrößerte Ansicht der optischen Kammer der Vorrichtung nach Fig. 1 von vorn, teilweise als Schnitt, durch dessen Mittellinie zusammen mit der Schnittstelle zwischen dem Lichtstrahl und den zu messenden Teilchen,

Fig. 4 eine Teilansicht einer Fotoanalysevorrichtung gemäß der Erfindung von vorn mit abgewandelten fotoelektrischen Aufnahmeelementen zur Bestimmung der Streustrahlung und

Fig. 5 eine Ansicht entsprechend Fig. 1 einer abgewandelten Ausführungsform von oben, bei der die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente derart angeordnet sind, daß voneinander getrennte Signale zur Anzeige der Intensität der Streustrahlung und des Winkels der Streustrahlung abgeleitet werden können.

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In Fig. 1 ist eine optische Kammer dargestellt, die aus einem Glasrohrabschnitt 10 gebildet ist, der zwischen Metallteile und 14 eingespannt ist, die flüssigkeitsdichte Ringdichtungen 16 bzw. 18 aufweisen. Eine Flüssigkeit 19* die die zu beobachtenden Teilchen enthält, tritt durch ein Rohr 20, welches zentrisch in dem Teil 12 angeordnet ist, in die Vorrichtung ein. .■ Eine weitere Flüssigkeit 23, die für die die Teilchen enthal- \ tende Flüssigkeit 19 eine Hülle bildet, tritt in das Teil 12 durch eine Einlaßöffnung 22 ein. Die Flüssigkeiten werden in dem konischen oder trichterförmigen Einlaßteil 24 der zentrischen Bohrung 26 des zylindrischen Glasrohrabschnitts 10 zu- λ sammengebraeht.

Die Geschwindigkeit und die Strömungsmenge der Teilchen enthaltenden Flüssigkeit 19, die durch das Rohr 20 eintritt und der anderen Flüssigkeit 23, die durch den Einlaß 22 eintritt, sind so groß, daß der Strom der Teilchen enthaltenden Flüssigkeit am Ende des Rohres 20, wie es bei 28 dargestellt ist, im Querschnitt in einen sehr dünnen Strom 29 verringert wird, dessen maximale Querschnittsabraessung in der gleichen Größenordnung wie die maximale Dimension der Teilchen, die durch den Strom befördert werden, liegt. Beispielsweise kann der Stromdurchmesser in der Größenordnung von 25 Mikron liegen. Die am meisten interessierenden Teilchen sind oft etwas geringer als ^ dieser Stromdurchmesser, und sie haben einen Durchmesser in der Größenordnung von 1 bis 10 Mikron. Die Flüssigkeit 23 kann im folgenden als "Hüllenstrom¹¹-Flüssigkeit bezeichnet werden, da sie eine Flüssigkeitshülle um den eingeengten Strom 29 bildet. Damit ein glatter und nicht turbulenter Strom der Hüllenflüssigkeit 23 entsteht, können zwei oder mehr radiale Einlaßöffnungen 22 mit der zentrischen Bohrung des Teils 12 verbunden sein. Der trichterförmige Einlaßteil 24 des zylindrischen Glasrohrabschnitts 10 hat vorzugsweise die Form einer besonderen Exponentialfunktion, damit eine glatte, nicht turbulente Strömung der Flüssigkeiten an der kritischen Stelle entsteht, an der der Strom der Teilchen enthaltenden Flüssigkeit

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im Querschnitt verringert wird. Insbesondere kann die Teilchen enthaltende Flüssigkeit eine wässerige Lösung sein, und die Hüllenflüssigkeit 23 kann Wasser sein.

Der Strom 29 der Teilchen wird durch einen Lichtstrahl beleuchtet, der von einer Lichtquelle 30 abgegeben wird, die vorzugsweise ein Laser ist. Ein geeigneter Laser ist beispielsweise ein Helium-Neon-Laser. Der Lichtstrahl des Lasers wird durch eine Kombination von sphärischen Linsen 32 und 34 im Durchmesser vermindert. Der sich ergebende Lichtstrahl von vermindertem Durchmesser ist parallelgerichtet. Dieser konzentrierte Lichtstrahl wird mit Hilfe einer Linse 36 im Querschnitt verringert, um einen Lichtstrahl mit sehr geringem Durchmesser an der Stelle 38 vorzusehen, an der der Lichtstrahl den Strom 29 mit den Teilchen, die beobachtet werden sollen, schneidet. Zu diesem Zweck ist die Linse 36 als zylindrische Linse ausgebildet, deren Zylinderachse in einer Ebene senkrecht zur Achse des Glasrohrabschnitts oder des Kammerzylinders 10 verläuft. Damit ist der Querschnitt des beleuchtenden Strahls an der Stelle 38, wo er auf den Strom der Teilchen auftrifft, eine sehr schmale Ellipse, die als eine dünne Lichtlinie quer zur Stromrichtung erscheint. Dies wird in weiteren Einzelheiten noch an Hand von Fig. 3 beschrieben.

Elektrische,fotoempfindliche Aufnahmeelemente sind an der Außenseite des zylindrischen Glasrohrabschnitts 10 angeordnet, die die verschiedenen optischen Wirkungen jedes Teilchens bei Beleuchtung mit dem Strahl durch die Linse 36 feststellen. Beispielsweise ist ein elektrisches, fotoempfindliches Aufnahmeelement 40 in einer direkten Linie mit dem Strahl angeordnet, um die Absorption bei der Beleuchtung Jedes Teilchens zu messen. Die sich ergebenden elektrischen Signale werden einem schematisch dargestellten Gerät 46 zur Verstärkung und Aufzeichnung oder Wiedergabe zugeführt. Wenn an der Schnittstelle mit dem Strahl kein Teilchen vorliegt, oder wenn keine wesentliche Absorption auftritt, dann trifft der Strahl auf das Aufnahmeeleraent 40,ohne daß er in seiner Stärke wesentlich vermindert ist.

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Es ist in der Zeichnung dargestellt, daß der Strahl um einen bestimmten Betrag divergiert, nachdem er "bis zu der Stelle 38 in der Mitte des Kammerzylinders konvergiert ist. Bei einer praktischen Ausführungsform ist die wirksame Divergenz auf etwa 1° auf jeder Seite der Mittellinie des Strahls begrenzt, wenn man von der Teilchenabtaststelle 38 in der Mitte des Kammerzylinders ausmißt. Die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente 42 und 44 sind auf gegenüberliegenden Seiten des direkten Strahls angeordnet, und sie können dazu verwendet werden, die Beleuchtungsstreuung außerhalb des direkten Strahls durch die Teilchen in einem ausgewählten Winkelbereich zu messen, der von einem Grad bis zu einem bestimmten Winkel reicht. g Dieser Winkelbereich reicht beispielsweise von 1° bis 9 . Die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente 42 und 44 können, so wie es in der Zeichnung dargestellt ist, elektrisch parallel geschaltet sein, so daß elektrische Signale, die von einer Beleuchtungsstreuung auf jeder Seite des Strahls herrühren, festgestellt werden und durch das schematisch dargestellte elektrische Gerät 46 aufgezeichnet werden können. Es können außerdem noch zwei fotoempfindliche Aufnahmeelemente zur Aufnahme von Streulicht in anderen Winkelbereichen vorgesehen sein, die in der Zeichnung mit 47 und 48 bezeichnet sind. Beispielsweise können diese zusätzlichen beiden Aufnahmeelemente Streuungen in einem Streuwinkelbereich von 9° bis 22° feststellen. Die Aufnahmeelemente 47 und 48 zum Feststellen von Weitwinkelstreuungen können i dazu verwendet werden, die optische Absorption der Teilchen anstelle der Absorptionsmessung durch das Aufnahmeelement 40 durchzuführen. Es ist bekannt, daß die Absorption eines einfallenden Lichtstrahls den Betrag des Lichts, der durch die Teilchen gestreut wird, vermindert. Diese Abnahme des Streulichts ist für Streuung unter weitem Winkel erheblicher als für Streulicht unter geringem Winkel, welches durch die Aufnahmeelemente 42 und 44 festgestellt wird. Daraus ergibt sich, daß es vorteilhaft ist, die Weitwinkel-Lichtstreumessungen an den Elementen 47 und 48 dazu zu verwenden, die Absorption festzustellen, da dabei die "Rausch"-Signale durch Intensitätsschwan-

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kungen der Lichtquelle und durch Schwingungen des Flüssigkeitsstroms für die Streulichtaufnahmeelemente viel geringer sind als für das Aufnahmeelement 40 zur direkten Absorptionsmessung, welches sich in dem direkten Lichtstrahl befindet.

Eine Streuung des auf die Teilchen auftreffenden Lichts in Rückwärtsrichtung, die sog. "Rückstreuung",kann ebenfalls durch fotoempfindliche Elemente 50 und 52 bestimmt werden, die sich auf der gleichen Seite des Kammerzylinders befinden wie die Lichtquelle 30 und die parallel mit einem elektrischen Aufnahme- und Aufzeichengerät 54 verbunden sind. Natürlich kann das elektrische Gerät 54 mit dem Gerät 46 verbunden sein, jedoch sind sie hier zur Vereinfachung der Zeichnung getrennt dargestellt.

Die Geräte 46 und 54 können Verstärker, logische Schaltungen, digitale Zähler und elektronische Sichtvorrichtungen aufweisen. Es ist eines der wesentlichen Merkmale der Erfindung, daß verschiedene optische Wirkungen jedes belichteten Teilchens gleichzeitig festgestellt, verarbeitet und aufgezeichnet werden können. Die Beziehungen zwischen diesen verschiedenen optischen Wirkungen können mit Hilfe von analogen und digitalen Schaltungen aufbereitet, wiedergegeben, aufgezeichnet und als Grundlage für eine ins Einzelne gehende Unterscheidung zwischen den Teilchen aufgetragen werden, wobei die Teilchen unterschiedlich klassifiziert werden können oder die Frequenz bestimmt werden kann, mit der bestimmte Eigenschaften in aufeinanderfolgenden Teilchen auftreten.

Die fotoempfindlichen Aufnähmeelemente, beispielsweise die Elemente 42 und 44 zum Feststellen der Streuung, sind in Fig. 1 so dargestellt, als ob sie an dem Kammerzylinder 10 befestigt . wären. Es sind jedoch Vorrichtungen vorgesehen, mit denen die Lage dieser Aufnahmeelemente gegenüber dem Strahl der Lichtquelle 30 genau eingestellt werden kann. Bei dieser Einstellung kann eine Verschiebung von einer Seite zur anderen vorgenommen werden oder es kann auch eine derartige Verschiebung vorgenommen werden, daß die Elemente näher an die oder weiter von der

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Teilchenabtaststelle 38 bewegt werden. Wenn man die Elemente von der Teilchenabtaststelle wegbewegt, dann können die Innenränder der Elemente genau gegenüber den äußeren Rändern des direkten Lichtstrahls für das Absorptionsaufnahmeelement 40 eingestellt werden. Damit können die Aufnahmeelemente 42 und 44, wenn sie so eingestellt werden, Streustrahlung unter dem engstmöglichen Winkel außerhalb des Strahlungsweges für die direkte Strahlung aufnehmen.

In Fig. 2 ist eine teilweise geschnittene genaue Seitenansicht des Geräts nach Fig. 1 dargestellt, welches den Kammerzylinder 10, die zylindrische Linse 36, die Absorptions- und Streuauf- ^ g nahmeelemen'te 40, 44 und 48 und das Rückstreuaufnahmeelement 52 enthält. Wie man in Fig. 2 sieht, wird durch die zylindrische Form des Kammerzylinders 10 eine Brechung auf den Lichtstrahl, der durch die zylindrische Linse 36 fällt, ausgeübt, wodurch der Lichtstrahl in Richtung auf die Mittelbohrung 26 des Kammerzylinders 10 konvergiert. Dies ist in Fig. 2 übertrieben dargestellt. Der Durchmesser des in die zylindrische Linse 36 eintretenden Strahls ist so gewählt, daß er etwa gleich dem Durchmesser der Mittelbohrung 26 ist. Dieser Durchmesser beträgt etwa 250 Mikron. Die Konvergenz des Lichtstrahls in der Ebene der Fig. 2 (senkrecht zur Achse des Kammerzylinders 10) ist kein Nachteil, da sie mit dazu dient, den Strahl auf den mittleren Teil der Mittelbohrung 26 zu konzentrieren, wo sich der ^j die Teilchen führende S'crom befindet. Da der die Teilchen führende Strom nur einen Durchmesser von etwa 25 Mikron hat, ist eine beträchtliche Konvergenz des Lichtstrahls erwünscht.

Wenn, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, größere Streuwinkel festgestellt werden sollen, dann können die Aufnahmeelemente um den Umfang des Kammerzylinders winkelmäßig verschoben werden. So können beispielsweise, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, zwei Auiη■:I',;:.ttele;t.'--rnte 56 und ^t-; am umfang angeordnet sein, die ein Ctreui.icivfc Ui ei^ri hart ich von etwa 45° von der Teilchenabtast-■•■■■·Λ;Γ.ι>"; J,u i'o;:!;stell&n. In ähnlicher Weise können Aufnahmeelemen-

1 G Π fc 3 0 /1 3 4 3

te 6O und 62 vorgesehen sein, die Streulicht in einem Bereich von etwa 90° feststellen. Diese Anordnung der Aufnahmeelemente ist natürlich nur wegen der einfachen Darstellung co gezeigt. Eine besondere Analyse erfordert die Untersuchung der Streuung in besonderen Winkelbereichen. Das wesentliche Prinzip, das .in den Figuren 1 und 2 dargestellt ist, besteht darin, daß Lich"c, welches durch zu analysierende Teilchen gestreut wird, unter bestimmten Streuwinkeln von etwa 1° bis zu 179° mit der dargestellten Analyseanordnung festgestellt werden kann. Alle Bauelemente, die in Fig. 2 dargestellt sind, mit Ausnahme der zylindrischen Linse 36, sind vorzugsweise an einem schematisch dargestellten Halterungsblock 55 befestigt und mit diesem bewegbar, der um ein feststehendes Halterungsteil 5Ί drehbar ist. Der Halterungsblock 55 kann durch Drehung um das einen Drehbolzen aufweisende Halterungsteil 57 mit Hilfe einer Stellschraube 59, die in den unteren Rand des Halterungsblocks ^ eingreift, vertikal eingestellt werden. Die Stellschraube 59 greift mit ihrem Gewinde in ein festes Halterungsteil 61 ein. Der Zweck dieser vertikalen Einstellung besteht darin, den Kammerzylinder 10 gegenüber dem Lichtstrahl genau einzustellen, der von der Lichtquelle abgegeben wird und durch die zylindrische Linse 36 fällt.

Bei der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführungsform der Erfindung ergibt sich unvermeidbar eine bestimmte Teilstrahlung, die radial von der Teilchenabtaststelle 38 in einen en°;en Ring nach außen reflektiert wird, der in Längsrichtung des Kammerzylinders 10 auf eine Abmessung begrenzt ist, die der Breite des eintretenden Lichtstrahls von der Lichtquelle 30 entspricht. Die Streustrahlungsaufnahmeeiemente sind immer in Längsrichtung gegenüber diesem Strahlungsring verschoben, und sie sind vorzugsweise paarweise auf gegenüberliegenden Seiten des direkten Strahls angeordnet, wie es an Hand der Aufnahmeelemente 42 ur..i ^t- in Fig. 1 dargestellt ist. In ähnlicher Weise bilden _t:..;:,;aß Fi;.;, 2 die Streustrahlungsaufnahmeeleinente 56, t)S, 60 und t:2 jeweils ein Paar von Aufnahmeeleraenten, aie vorzugsweise ; u^:>

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gegenüberliegenden Seiten des Strahlungsrings angeordnet sind.

Die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente, die bei der Ausführungsform gemäß der Erfindung, soweit sie bisgetzt beschrieben ist, bevorzugt verwendet werden, sind vorzugsweise SiIicium-Grenzschicht-Fotodioden. Diese Bauelemente sind Fotospannungsbauelemente, die im allgemeinen als Silicium-Sonnenzellen bezeichnet werden. Geeignete derartige Bauelemente sind im Handel allgemein erhältlich.

Die Fig. 2A entspricht allgemein der Fig. 2, jedoch zeigt die Fig. 2A eine andere Anordnung der Bauelemente, und sie zeigt ferner eine Anordnung zur Aufnahme und zum Feststellen der g

Fluoreszenz der Teilchen. Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung enthält das Streustrahlungsaufnahmeelement 44 einen optischen Reflektor, der aus einem Spiegel 44b bestehen kann und eine fotoelektrische Vorrichtung 44C, die so angeordnet ist, daß sie die Streustrahlung, die von dem optischen Reflektor 44B reflektiert wird, aufnimmt. Da diese beiden Teile zusammen die gleiche Wirkung haben wie das Streustrahlungsaufnahmeelement 44 in Fig. 2,kann die Kombination aus den beiden Elementen 44B und 44C zusammen als fotoempfindliches Aufnahmeelement bezeichnet werden. Wie schon im Zusammenhang mit Fig., 1 erklärt wurde, wird das Streustrahlungsaufnahmeelement 44 vorzugsweise zusammen mit einem weiteren Streustrahlungsaufnahmeelement 42 verwendet, wobei die I Kombination aus diesen beiden Streustrahlungsaufnahmeelementen dazu dient, die Streustrahlungen auf beiden Seiten des Lichtstrahls, der durch die Teilchenabtaststelle hindurchgeht, zu bestimmen. Mit Hilfe der Ablenkanordnung, die in Fig. 2A dargestellt und an Hand dieser Figur beschrieben ist, ist es möglich, zwei getrennte Reflektoren an gegenüberliegenden Seiten des Strahls zu verwenden, wobei beide Reflektoren Streustrahlung zu einem einzigen fotoelektrischen Bauelement, beispielsweise dem fotoelektrischen Bauelement 44C, lenken. Auf diese Weise müssen die Streustrahlungssignale von den bei-

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den Seiten des Strahls lichtelektrisch miteinander kombiniert werden. Sie werden stattdessen dadurch optisch miteinander kombiniert,daß sie von voneinander getrennten Reflektoren zu einem einzigen fotoelektrischen Bauelement hin gerichtet werden.

Die besondere Anordnung mit dem Reflektor 44B und einem möglichen zusätzlichen Reflektor, die bis/jetzt beschrieben worden ist und die Streustrahlungssignale zu einem einzigen fotoelektrischen Bauelement 44C reflektiert kann auch bei der Ausführungsform verwendet werden, die an Hand von Fig. 2 beschrieben wurde, und sie ist nicht notwendigerweise auf eine Kombination mit anderen Merkmalen beschränkt, die an Hand von Fig. 2A noch beschrieben werden.

Eines der am zweckmäßigsten Verfahren bei der optischen Messung, das bei der Fotoanalyse von Teilchen verwendet werden kann, ist die Messung der Fluoreszenz von Teilchen in Abhängigkeit von der Primärbestrahlung durch einen Lichtstrahl, der beispielsweise durch die zylindrische Linse 36 gerichtet ist. Die Teilchen können mit Farbstoff gefärbt sein, so daß sie dann, wenn sie durch Licht erregt werden, eine fluoresz.ente Strahlung bei einer oder mehreren Wellenlängen emittieren, die sich von der Wellenlänge des primären Lichtstrahls unterscheiden. Die Intensität der fluoreszierenden Strahlung bei verschiedenen Wellenlängen ist ein Zeichen für die Eigenarten und die Eigenschaften der Teilchen. Da die fluoreszierende Strahlung im wesentlichen in allen Richtungen von den Teilchen emittiert wird, wird sie durch Reflektoren 63 und 65 gesammelt und allegemein durch eine zylindrische Linse 67 zu einem dichroitischen Spiegel 69 abgelenkt. Der dichroitische Spiegel 69 ist, wie es allgemein bekannt ist, so ausge- ν bildet, daß er eine Strahlung, deren Wellenlänge geringer ist als ein bestimmter Grenzwert, beispielsweise von 5500 A , reflektiert und daß er eine Strahlung einer größeren Wellenlänge durchläßt. Die reflektierte Strahlung ist durch einen Filter

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auf eine erste Fotoelektronenvervielfacherröhre 73 gerichtet. ' Die durchgelassene Strahlung ist durch einen zweiten optischen Filter 75 auf eine zweite Fotoelektronenvervielfacherröhre gerichtet. Mit Hilfe der Kombination aus dem dichroitischen Spiegel 69 und den optischen Filtern 71 und 75 erhält jede der Fotoelektronenvervielfacherröhren 73 und 77 nur Licht einer bestimmten Wellenlänge, welches durch die entsprechenden Filter bestimmt ist. Es können auch zusätzliche dichroitische Spiegel vorgesehen sein, die die fluoreszente Strahlung in zusätzliche Spektralkomponenten aufteilen, damit man eine zusätzliche optische Analysenachricht erhält.

Die Reflektoren 63 und 65 sind axial zu dem Kammerzylinder angeordnet. Diese Reflektoren sind vorzugsweise ähnlich wie die Streustrahlungsaufnahmeelemente, so wie es in Fig. 1 dargestellt ist,aufgeteilt,damit eine Reflexion und eine Übertragung des Strahlungsrings, der weiter oben erwähnt wurde, verhindert wird. Es ist besonders wichtig eine Reflexion und Übertragung des Strahlungsrings dann zu vermeiden, wenn die Strahlung im grünen Ende des sichtbaren Spektrums liegt, weil es schwierig ist, wirksame optische Filter 71 und 75 an diesem Ende des Spektrums vorzusehen. Wenn jedoch fluoreszentes Licht am roten Ende des sichtbaren Spektrums verwendet wird, dann ist eine wirksame Filterung möglich, und es ist dann vorzuziehen, die Reflektoren 63 und 65 nicht von- | einander zu trennen und den Strahlungsring mit abzulenken, da er fluoreszente Signale bei der gewünschten Wellenlänge enthält.

Der Reflektor 63 ist vorzugsweise so aufgebaut, daß fluoreszierende Strahlung, die durch die untere Fläche des Kammerzylinders 10 emittiert wird, auf den oberen Reflektor 65 reflektiert wird. Der obere Reflektor 65 ist vorzugsweise so aufgebaut, daß die gesamte Strahlung, die auf diesen Reflektor gerichtet ist, schließlich zu dem linken Ende dieses Reflektors reflektiert und von diesem gesammelt wird und dann

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durch eine Linse 67 auf den dichroitischen Spiegel 69 gerichtet wird.

Wenn Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden, dann hat es sich als sehr wirksam erwiesen, als Lichtquelle 30 einen Argonlaser zu verwenden, der Licht in dem blauen Teil des Spektrums emittiert. Licht dieser Wellenlänge erzeugt eine starke fluoreszente Emission in biologischen Teilchen, die häufig beobachtet werden müssen. Da die Teilchen in "Vorwärts"-Richtung fluoreszieren, hat es sich als sehr wünschenswert erwiesen, einen Filter 79 vorzusehen, der nur die blaue Argon-Direktstrahlung zu dem Streustrahlungsaufnahmeelement 44B bis 44C und zu dem Absorptionsaufnahmeelement 40 durchläßt.

Die in Fig. 2k dargestellte Anordnung ist deshalb besonders nützlich, weil sie eine gleichzeitige Bestimmung von mindestens vier verschiedenen optischen Wirkungen eines einzigen Teilchens gleichzeitig zuläßt. Es wird die Absorption durch das Aufnahmeeleraent 40 festgestellt, es wird die Streustrahlung durch das Aufnahmeelement 44B bis 44C festgestellt und es werden zwei verschiedene Wellenlängen der fluoreszierenden Strahlung durch die Fotoelektronenvervielfacher 73 und 77 bestimmt. Es sind metachromatische oder kombinierte fluoreszierende Färbemittel bekannt, die, wenn sie zum Färben von Zellen verwendet werden, bei zwei Wellenlängen fluoreszieren, wobei jede fluoreszente Intensität proportional zu einem bestimmten Zellenbestandteil ist.

In Fig. 3 ist ein vergrößerter Schnitt durchden Teil der Vorrichtung nach Fig. 1 dargestellten dem der Lichtstrahl tatsächlich den Strom der Teilchen an der Stelle 38 in dem Kammerzylinder 10 trifft. Der Strom der Teilchen 29 enthält, wie man sieht, wirklich mitgerissene Teilchen 64, die nacheinander durch den elliptisch geformten Lichtstrahl an der Stelle 66 geführt werden.· Wegen der elliptischen Form des Lichtstrahls

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kann sich der Strom 29, der die Teilchen 64 mitführt, in seiner Lage in dem Kammerzylinder ändern, ohne daß sich der Strom aus dem Lichtstrahl "bewegt. Auf der anderen Seite ist durch die schmale elliptische Form des Strahls, wobei die Breite des Strahls im wesentlichen in der gleichen Größenordnung liegt wie der Durchmesser der Teilchen, bedingt, daß jedes Teilchen eine optimale optische Reaktion mit dem Strahl eingeht. Selbst wenn die Teilchen nur geringen Abstand voneinander haben,ist es eigentlich unmöglich, daß der Strahl zu einem Zeitpunkt auf mehr als' ein Teilchen einwirken kann.

In Fig. 4 ist ein Schnitt durch eine abgewandelte Ausführungsform einer Vorrichtung nach Fig. 1 dargestellt, bei der bogen- f förmige Aufnahmeelemente 42A, 44A und 46A, 48A verwendet werden. Die Ansicht stellt einen Schnitt längs der Schnittlinie "4-4" in Fig. 2 dar, wobei natürlich die Abwandlungen nach Fig. 4 in Fig. 2 nicht dargestellt sind. Die Streustrahlungsauf nähme elemente 42 und 44 und 46 und 48 nach Fig. 1 sind so angeordnet, daß sie Streustrahlungen in bestimmten Winkelbereichen auffangen, dadurch daß sie in ihrer Lage längs der Achse des Kammerzylinders 10 verschoben sind. Wie es in Fig. dargestellt ist, kann die Messung für größere Streuwinkel " dadurch durchgeführt werden, daß eine Verschiebung der Aufnahmeelemente am Umfang-des KammerZylinders erfolgt. Es ist jedoch auch eine Kombination dieser beiden Techniken möglich, ^ wobei sich ein hoher Wirkungsgrad mit Hilfe von halbbogenför- " migen Aufnahmeelementen erreichen läßt, wie sie bei 42A, 44A und 46a, 48A in Fig. 4 dargestellt sind. Folglich kann die Strahlung, die über einen besonderen Winkelbereich gestreut ist, innerhalb eines möglichen Streustrahlungskonus irgend v/ohin gestreut werden, wobei sie auf einer im wesentlichen kreisförmigen Strahlungsfläche endet, beispielsweise der Fläche, die durch die Aufnahmeelemente 46A und 48A gebildet ist. Damit sind halbkreisförmige Aufnahmeelemente besonders wirksam beim Auffangen der gesamten Streustrahlung in einem Bereich von Streuwinkeln, für den sie ausgebildet sind.

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Fig. 5, die der Fig. 1 entspricht, ist eine Ansicht einer abgewandelten Ausführungsform der Vorrichtung nach Fig. 1, bei der besondere vom Auftreffort des Lichts abhängige Fotodedektoren 68 und 70 verwendet werden, die sowohl die Intensität als auch die Winkellage der Streustrahlung bestimmen können. Es sind dies Silicium-Grenzschicht-Fotodioden, wie sie beispielsweise bei United Detector Technology in Santa Monica, Californien, USA unter der Bezeichnung Light Position Sensing Photo-Detector erhältlich sind. Die Fotodetektoren 68 und 70 werden von einer Gleichstromquelle 72 gespeist. Der Strom der Gleichstromquelle 72£üaßtüber mittlere Detektoranschlüsse 74 und 76 zu den Detektoren 68 bzw. 70. Der Strom fließt durch einen oder beide Detektoren und wird an den Endanschlüssen und 80 oder den Endanschlüssen 82 und 84 abgegeben, wobei das Verhältnis der Ströme durch die verschiedenen Endanschlüsse jedes Detektors von der Lage des Strahls, der auf das Bauelement auftrifft, abhängt. Wenn beispielsweise der Strahl auf den Detektor oder das Bauelement 70 auftrifft und wenn sich der Strahl näher an dem Anschluß 84 als an dem Anschluß 80 befindet, dann fließt ein größerer Strom durch den Anschluß 84 als durch den Anschluß 80. Die Ströme der Anschlüsse 82 und 84 werden dadurch zu der Gleichstromquelle 72 zurückgeführt, daß sie über einen Lastwiederstand 86 nach Masse und von Masse über einen Lastwiderstand 88 geführt werden. Entsprechend werden die Ströme der Anschlüsse 78 und 80 über einen Lastwiderstand 90 nach Masse und weiter über den Lastwiderstand 88 zur Gleichstromquelle 72 zurückgeführt. Die Widerstandswerte der Lastwiderstände 86 und 90 sind vorzugsweise gleich, und die relativen Werte der Lastströme durch diese Widerstände werden als'Spannungsabfälle in einem Differentialverstärker 92 gemessen, um ein Streustrahlwinkelsignal zu erzeugen, welches einer Bestimmungs- und Aufzeichenschaltung 46A zugeführt wird.

Entsprechend wird die Intensität der Streustrahlbeleuchtung durch den Spannungsabfall an dem gemeinsamen Lastwiderstand

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durch einen Verstärker 94 "bestimmt, dessen Ausgang auch mit der Schaltung 46A verbunden ist. Damit wird durch die Anordnung nach Fig. 5 nicht nur die Streustrahlung in bestimmten Bereichen der Streuwinkel festgestellt, sondern es wird auch die Intensität der Streustrahlung festgehalten und angezeigt, unter welchem Winkel die Streustrahlung auftritt. Damit ergibt sich eine besonders wertvolle Analysevorrichtung, wenn der bedeutende Bereich des Analysewinkels vorher nicht bekannt ist.

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Claims

Patentansprüche

1/ Fotoanalysevorrichtimg zur gleichzeitigen optischen Messung verschiedener Eigenschaften jedes Teilchens einer Gruppe von Teilchen, wie Blutzellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, mit einer Lichtquelle, einem Gehäuse, das aus einem Werkstoff besteht, der Licht der Lichtquelle durchläßt, und das eine optische Kammer bildet, mit einer Vorrichtung, die die Flüssigkeit mit den suspendierten Teilchen in einem dünnen Strom durch das Gehäuse bewegt, damit die Teilchen in einer Folge eines nach dem anderen durch den Strom bewegt werden, und mit einer Lichtablenkvorrichtung, durch die das Licht von der Lichtquelle zu der einen Seite des Gehäuses gelenkt wird, damit es den dünnen Strom der Teilchen mit einem gebündelten Strahl schneidet, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei fotoempfindliche Aufnahmeelemente (40 bis 52) außerhalb des Gehäuses in verschiedenen Winkelstellungen im Verhältnis zur Strahlrichtung vorgesehen sind, wenn von der Schnittstelle des Strahls mit dem Teilchenstrom aus gemessen wird, und daß die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente gleichzeitig verschiedene optische Wirkungen Jedes der von dem Strahl beleuchteten Teilchen feststellen.
2. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das die¹ optische Kammer bildende Gehäuse (10) einen zylindrischen Rohrteil und daß die verschiedene Winkelstellung der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente (40 bis 52) in bezug auf die Richtung des Strahls durch eine relative Verschiebung zwischen den fotoempfindlichen Aufnahmeelementen in Richtung parallel zur Achse des Gehäuses erreicht wird.

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3. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtablenkvorrichtung (32,34,36) zu einer Seite des Gehäuses (10) abgelenkt wird, derart mit der Seite des Gehäuses zusammenwirkt, daß ein Lichtstrahl mit einem im wesentlichen elliptischen Querschnitt (66, Fig. 3) in einer Ebene senkrecht auf dem Lichtstrahl an der Schnittstelle mit dem dünnen Strom der Teilchen entsteht, und daß die Hauptachse des elliptischen Querschnitts des Strahls im wesentlichen senkrecht auf der Richtung des dünnen Stroms der Teilchen steht.
4. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 3, dadurch | gekennzeichnet , daß die Lichtablenkvorrichtung (32 bis 36),durch die der Lichtstrahl abgelenkt wird, den Lichtstrahl so umformt, daß er im wesentlichen einen elliptischen Querschnitt (66, Fig. 3) aufweist, so daß die Länge der kleineren Achse in derselben Größenordnung ist, wie die maximale Abmessung der Teilchen (64), die beobachtet werden sollen, und daß die Länge der größeren Achse des elliptischen Strahlquerschnitts wesentlich größer als die maximale Abmessung der zu beobachtenden Teilchen'(64) ist, um dadurch Änderungen der Bahnwegung der Teilchen gegenüber dem Lichtstrahl auszugleichen, wenn sich die Teilchen durch den Lichtstrahl bewegen.
5. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtablenkvorrichtung eine zylindrische Linse (36, Fig. 1) aufweist, deren Achse senkrecht auf dem Lichtstrahl und in einer Ebene senkrecht auf dem Strom (29) der Teilchen durch das Gehäuse (10) angeordnet ist.
6. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadvrch gekennzeichnet, daß die maximale Querabmessung des dünnen Stroms (29) der Flüssigkeit mit suspendierten Teilchen die gleiche Größenordnung aufweist wie die maximale Dimension der Teilchen (64, Fig. 3).

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7. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (20, 22), die die Flüssigkeit mit den suspendierten Teilchen in einem dünnen Strom (29) durch das Gehäuse bewegt, eine Vorrichtung zur Erzeugung einer Hülle (23) aus Flüssigkeit enthält, die ringförmig durch das Gehäuse fließt und den dünnen Strom umgibt, um dadurch den dünnen Strom der Flüssigkeit mit suspendierten Teilchen auf eine Abmessung zu begrenzen, die geringer ist als die Innenquerabmessung des Gehäuses.
8. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse (10) eine im wesentlichen einheitlich begrenzte Mittelbohrung (26) enthält, daß die Mittelbohrung am Einlaßende (24) erweitert ist, und daß die Form der erweiterten Mittelbohrung am Einlaß derart ist, daß die Änderung im Durchmesser im wesentlich eine Exponentialfunktion in Richtung längs der Achse der Bohrung an ihrem erweiterten Endteil entspricht.
9. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eines (40) der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente (40 bis 52) mit dem Lichtstrahl auf einer Seite des Gehäuses (10) gegenüber der Lichtquelle (30) ausgerichtet ist, wodurch es nichtgestreutes Licht von der Lichtquelle aufnimmt, wodurch der Betrag des von jedem Teilchen absorbierten Lichts gemessen wird.
10. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwei (42, 47) der fotoempfindlichen Aufnahme elemente (40 bis 52) jeweils unter einem bestimmten Winkel, angeordnet sind, die Licht in verschiedenen Winkelbereichen gegenüber der Richtung des Lichtstrahls aufnehmen, damit die relativen Intensitäten des durch jedes Teilchen in den betreffenden Winkelbereichen gestreuten Lichts bestimmt werden kann.

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11. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines (50) der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente (40 bis 52) auf der gleichen Seite des Gehäuses (10) wie die Lichtquelle (30) zur Bestimmung des von den Teilchen rückgestreuten Lichts angeordnet ist.
12. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines (56, Fig. 2) der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente unter einem großen Winkel gegenüber der Strahlrichtung angeordnet ist, so daß die Absorption mit Hilfe eines * durch einen weiten Streuwinkel entstehenden. Signals gemessen
13. Fotoanalysevorrichtung nach einem, der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines (42) der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente (40 bis 52) so eingestellt und angeordnet ist, daß es von den Teilchen über einen bestimmten Winkelbereich gestreutes Licht feststellt, wobei der Winkelbereich von der Schnittstelle des Strahls mit dem Teilchenstrom in einer zu dem Lichtstrahl entgegengesetzten Richtung verläuft und durch die Mittellinie des Lichtstrahls und die Mittellinie des Teilchenstroms bestimmt ist. I
14. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 13,

dadurch gekennzeiOh.net, daß mindestens zwei fotoempfindliche Aufnahmeelemente (42, 44) zum Feststellen des durch die Teilchen über einen bestimmten Winkelbereich gestreuten Lichts vorgesehen sind, und daß die fotoempfindlichen Aufnahmeelemente symmetrisch auf gegenüberliegenden Seiten des Lichtstrahls angeordnet sind, und damit durch die Teilchen über den gleichen Winkelbereich auf -beiden Seiten des Lichtstrahls gestreutes Licht aufnehmen.

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15. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Paare (42, 44; 47, 48) für Streulicht fotoempfindliche Aufnahmeelemente symmetrisch auf gegenüberliegenden Seiten des Lichtstrahls angeordnet sind, so daß durch Jedes Paar Licht, welches über verschiedene bestimmte Winkelbereiche gestreut ist, festgestellt werden kann, daß jedes Paar der fotoempfindlichen Aufnahmeelemente elektrisch zur Erzeugung eines kombinierten elektrischen Signals verbunden sind und daß die Teile Jedes Paares zur Aufnahme von über den gleichen Winkelbereich auf den gegenüberliegenden Seiten des Lichtstrahls gestreuten Lichts angeordnet ist.
16. Fotoanalysevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der fotoempfindlichen Aufnahme elemente (68, Fig. 5) ein für den Strahlungsort empfimdliches Bauelement enthält, welches ein elektrisches Ausgangssignal (an 92) abgibt, das der Lage des auf seine Oberfläche auftreffenden Lichtstrahls entspricht und das ein anderes elektrisches Signal (an 94) abgibt, welches der Intensität des Lichtflecks entspricht, und daß die Lageabtastachse dieses Bauelements in einer Ebene angeordnet ist, die senkrecht auf der Hauptachse des Lichtstrahls und parallel zur Lichtübertragungsrichtung des Lichtstrahls angeordnet ist, so daß das die Lage bestimmende Signal des Bauelements in Abhängigkeit von dem gestreuten Licht eine Anzeige für den Winkel ermöglicht, unter dem ein Maximum der verteilten Streustrahlung für Jedes Teilchen auftritt,
17. Fotoanalysevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (30) eine Quelle für monochromatisches kohärentes Licht ist.

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18. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, quelle (30) ein Laser ist.
19. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, (30) ein Helium-Neon-Laser ist.

daß die Lichtdaß der Laser
20. Fotoanalysevorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet (30) ein Argonlaser ist.

daß der Laser
21. Fotoanalysevorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein Spektralfilter (71) derart angeordnet ist, daß er das von dem einen fotoelektrischen Aufnahmeelement (73) aufgenommene Licht filtert, daß der Spektralfilter so ausgewählt ist, daß er Licht mit der Wellenlänge der Lichtquelle nicht durchläßt, während er Licht einer Wellenlänge, mit der die zu untersuchenden Teilchen fluoreszierende Strahlung bei Vorliegen einer das Teilchen kennzeichnenden, zu untersuchenden Eigenschaft abgeben, durchläßt, und daß eine optische Einfangvorrichtung (63, 65, 67) zum Sammeln der fluoreszenten Strahlung der Teilchen und zum Ausrichten dieser fluoreszenten Strahlung über das Spektralfilter (71) auf das fotoempfindliche Aufnahmeelement vorgesehen sind.

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