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Verfahren zur Herstellung sowie zur diagnostischen und the-rapoutischen
Anwendung von Zellextrakten zur Samenzellen und Mizellen Vorliegendes Verfahren
dient zur Herstellung sowie diagnestischen und therapeutischen Anwendung besonderer
Zellextrakte aus Samenzellen und Eizellen. Es ist gekennzeichnet durch die Verwendung
korpuskulärer Zellbestandteile (-Organellen) und von hochmolekularen Fraktionen
solcher Zellen bzw. den aus ihnen gewonnen Abbauprodukten. -Die Herstellung solcher
Präparate geschieht nach bekannten Verfahren der Organaufarbeitung und -Extraktgewinnung.
Das Verfahren bezieht sich demnach auf die Verwendung besonderer Ausgangsstoffe.
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Unter korpuskulären Zellbestandteilen bzw. -Organellen sind insbesondere
zu verstehen, der Zellkern und seine Bestandteile, ebenso zytoplasmatische Zellbestandteile
in Art der Mitochondrien, Ribosomen, Goligiapparat und ihre Membranen. Diese korpuskulären
Zellbestandteile bestehen aus SonglomoratXen von Molekülen; jedoch sind unter den
hochmolekularen Fraktionen auch freie lösliche Moleküle zu verstehen Insbesondere
die verschiedenartigen Ribonuclein-Säuren, dann aber auch DNS, Proteine, Proteine,
Fermente, Lipide und Polysaccaride.
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Abbauprodukte können als Metabolite in den Zellextrakten enthalten
sein oder aus den genannten hochmolekularen Stoffen nach bekannten chemischen oder
fermentchemischen Verfahren gewonnen werden.
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Als Ausgangsgewebe können sowohl Spermien von Saugetieren, als auch
von Fischen Verwendung fixen und als mizellen in besonderem Maße Rogen von Fischen,
z.B. von Forellen und Karpfen. Zur Beseitigung von Begleitstoffen werden die bekannten
Methoden einschließlich der Trypsinbehandlung eingesetzt. Die Aufschließung der
Zellen erfolgt. nach dem bekannten Homogenisierung- und Mahlverfahren, ggfs. auch
in tiefgefrorenem Zustand. Die Trennung der Zellorganellen geschieht durch Zentrifugtation
ggfs. unter Verwendung eines Gradienten, z.B. aus Fruktose.
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Danach erfolgt ggfs. die weitere chemische Aufschließung nach den
bekannten Methoden der Herstellung für Organ- und Zellantigene, bzw. - Extrakte.
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Die Auftrennung von Molekülen kann durch Gelfiltration, chromatographisch
und elektrophoretisch erfolgen (vergl. C.Steffen: Allgemeine und experimentelle
Immunologie und Immunpathologie: Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart; H.M. Rauen: Biologisches
Taschenbuch, Springer-Verlag sowie einschlägige Einzelveröffentlichungen in Fachzeitschriften.)
Es hat sich gezeigt, daß die beanspruchten Wirkstoffe aus Zellen mit haploldem Chromosomensatz
als Plischung wie auch zum Teil isoliert, den Stoffwechsel von normalen Gewebezellen
unspezifisch in besonderem Maße aktivieren und Synthese und Prolieferationsvorgänge
auslösen. Diese Wirkung ist nicht organspezifisch und übertrifft die Wirkung von
Gewebeextrakten aus anderen Organarten. Die therapeutische Anwendung kann nach allen
üblichen Anwendungsarten der Organo-Therapie erfolgen.
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Eine Kombination oder chemische bzw. adäsive Konjugation mit andersartigen
Organextrakten oder zytotropen Zellfraktionen ist ebenso möglich wie die Kombination
bzw.
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Konjugation mit den verschiedensten natürlichen und synthetischen
Hormonen, insbesondere aus Schilddrüse, Nabenniere, den Keimdrüsen und deren Derivaten,
dann auch mit Spurenelementen, von z. B. mit Salzen von Zink, Mangan, Magnesium,
Eisen, Calcium.
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r'ine besondere Art der weiteren Verwendung, insbesondere der Antigenbestandteile
des X- bzw Y-Chromosoms aus haploiden Zellen liegt in der aktiven Immunisierung
von antikörperbildenden Individuen. Auch diese erfolgt nach den bekannten immunologischen
Methoden, ggfs.
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unter Mitverwendung von Adjuvantien, z.B. dem Freund'sche Adjuvans
oder einer kolloidalen Komplexverbindung nach Aluminium-Hydroxyd und Kieselsäure.
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Die Gewinnung von Antikörperseren mit Immunglobulinen gelen des Y-Chromosom
muß iiber die Herstellung eines ntikörperscrums gegen das X-Chromosom erfolgen.
Man kann dabei von Säugetier zellen mit zwei X-Chromosomen z.H. aus Ovar, ausgehen
und die Zellkerne bzw. während der Mitose auch Yf-Chromosome isolieren und als Antigen
verwenden oder aber Antigene aus den haploiden Zellkernen von Fischrogen verwenden.
Dieser muß von Begleitstoffen befreit werden, bevor die Zellkerne isoliert werden,
die dann als Antigen wiederholt parentaral einem antikörperbildenden Individum eingespritzt
werden.
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Das davon erhaltene Antikörperserum mit Immunglobulinen gegen X-Chromosome
wird nun bei optimalen Bedinungem Samenzellen von Säugern oder auch Vögeln bzw.
Fischen zugesetzt, wobei die Samenzellen ebenfalls von Begleitstoffen der Sexualdrüsen
vorher befreit werden müssen. Nach eingetretener Agglutination der Samenzellen mit
X-Chromosom werden die nicht agglutinlerten Zellen mit R-Chromosom isoliert und
erneut dieser Isolierungsprozedur unterworfen. Die daraus gewonnen Zellkerne werden
nun in analoger Weise der aktiven Immunisierung und Herstellung eines Antiserums
mit Immunglobulinen
gegen Y-chromosome verwendet. Mit diesem Serum
kann man dann in entsprechender Weise ein Antikörperserum gegen artgleiche homologe
X-Chromosome gewinnen.
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Die Trennung der mit Immunglobulin beladenen Zellen kann durch Zell-Elektrophorese,
wie auch durch Schwerkrafttrennung, ggfs. unter Mitverwendung eines Gradienten erfolgen.
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Die Antikörperseren gegen Zellkernfraktionen mit X-Chromosom bzw.
Y-Chromosom können zur Geschlechtsbestimmung benutzt werden. Dabei kann das Sperma
vor der Insemination bei erwünschter Knabengeburt mit dem Immunglobulin->egen
das X-Chromosom und erwünschter Mädchengeburt mit dem Antikörperserum gegen Y-Chromosome
behandelt werden. Bekanntlich hängt das genetische Geschlecht vom Besitz des t-Chromosoms
ab.
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Ein Chromosom stammt jeweils von der Mutter, das andere vom Vater.
Die Muter hat nur X-Chromosome, der Vater X- sowie Y-Chromosome. Zwei X-Chromosome
bedeuten deshalb weiblich, X- und Y-Chromosome männlich. Die Ausschaltung des Y-Chromosoms
im Sperma führt also zu weiblichen Individuen, während die Ausschaltung des X-Chromosoms
zu-m.annlichen führen muß.
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Vor der Behandlung des Spermas muß dieses von den Begleitsekreten
der Geschlechtsdrüsen befreit werden.
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Diese Sekrete müssen dann nachträglich aber wieder zugesetzt werden.
Auch die Mutter insbesondere gegen Y-Chromosom behandelt werden.
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Dosisabhängig wird hier mit Verdünnungen des Serums gegen Y-Chromosome
die Aufnahme von Y chromosomhaitigen 'Spermien erleichtert und bei höheren Konzentrationen
dieses Sereums die Konzeption mit dem y chromosomhaltigen Sperma verhindert.
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Die Antikörperseren gegen das X- bzw. Y-Chromosom können diagnostisch
für die Bestimmung des Kerngeschlechts ggfs.
unter Mitverwendung
von Immunfluoreszenz- und Traser methoden angewandt werden.
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Präwarte aus korpuskulären Bestandteilen oder hochmolekularen Extrakte
aus haploiden Zellen finden besonders Anwendung bei Organerkrankungen zur Förderung
von Regeneration und Zellproliferation,
zur Förderung des Haarwuchses und der Behandlung von Fertilität und Sterilität.
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Bislang wurden keine korpuskulären oder hochmolekularen Zellbestandteile
aus Zellen mit haploidem Chromosomensatz prophylaktisch, therapeutisch oder diagnostisch
verwendet. Es wurde lediglich versucht aus den Sexualsekreten hormonähnliche Stoffe
zu extrahieren. Diese haben jedoch keine Beziehung zu dem vorliegenden Verfahren.
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Beispiele 1. Herstellung eines Antikörperserums mit Immunglobulinen
gegen Y-Chromosome des Rindes.
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Nicht denaturierter Rogen von Forellen wird in gepufferter Tyrode-Salzlösung
bei ph 7,4 durch vorsichtiges Zentrifugieren wiederholt gewaschen. Danach werden
die Eizellen mit einer isotronen Trypsinlösung angedaut und anschließend von der
Lösung freigespült, mit flüssigem Stickstoff tiefgekühlt. In diesem Zustand gemahlen,
wieder aufgetaut und die Zellkerne-durch vorsichtiges Zentrifugieren in einem Sacchrosegradienten
gewonnen. Die Homogenisierung kann aber auch im frischen Zustand erfolgen.
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Die gewonnenen Zellen werden nun gefriergetrocknet und können durch
Bedampfung mit Säure-dämpfon im Vakuums chemisch nach DBP Nr. 1090 821 aufgeschlossen
werden.
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werden nun Kaninchen im Abstand von 8 Tagen, 3 x abwechselnd s.c.,
i.m. und i.p. aktiv immunisiert mit einer Suspension von lo Partikel pro ml Lösungsmittel.
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8 Tage nach der letzten Boosterung wird das Tier entblutet und der
Agglutinationstiter des Serums gegenüber dem Antigen getestet, Es wird nun frisches
Stiersperma von Beglcitselrreten aus prostata und den Sexualdrüsen befreit und mit
dem Antikörperserum inkubiert. Nach eingetretener Agglutination werden die nicht
agglutinierten Spermazellen isoliert durch Gradientenzentrifugation oder Zellelektrophorese.
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Diese Prozedur wird 1 - 2 mal wiederholz um die mit Immunglobulin
beladenen Spermien mit X-Chromosomen zu beseitigen. Die isolierten Spermien mit
Y-Chromosomen werden nun in ähnlicher Weise wie die Einzellen auTgearbeitet und
die daraus gewonnenen Zellkerne zur aktiven Immunisierung eines Kaninchens oder
Hammels verwendet.
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Auf diese Weise werden Immunglobuline gegen die Y-Chromosome gewonnen.
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Vor der künstlichen Besamung werden die Samenzellen zunächst aus der
Spermaflüssigkeit isoliert und wieder holt gewaschen. Danach wird das Anti-Y-Serum
zugesetzt und die nicht agglut-inierenden Zellen isoliert und wieder mit der Samenflüssigkeit
aufgenommen. Diese Samen zellen enthalten das X-Chromosom und werden nun zur Be
samung verwendet, um ein weibliches Tier als Nachkommen zu erhalten.
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2. Gewinnung von aufgeschlossenen Totalextrakten aus Rindersperma
mit Y-Chromosomen Hier agglutiniert man die gewaschenen Samenzellen des Rindes mit
dem Antikörperserum, das nach Beispiel 1 gegen Y-Chromosome gewonnen wurde, Nach
erfolgter Agglutination isoliert man nun die nicht egglutinierten Samenzellen. Diese
enthalten das X-Chromesom. Damit kann ggfs. ein Antiserum gegen die gleiche Spezies
gewonnen werden.
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Beispiele für die Herstellung der korpuskulären Zel'lhestandteile
mit hochmolekularen Extrakten, bzw. daraus gewonnenen Abbauprodukte dürften sich
erübrigen, weil die Herstellungsmethoden denen entsprechen, wie
sie für die Herstellung von Gewebeextrakten und -Antigenen aus anderen Organen verwendet
werden.
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Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung sowie diagnostischen
und therapeutischen Anwendung von Zellextraktion aus Samenzellen und Eizellen mit
hapleidem Chromosomensatz, gekennzeichnet durch die Verwendung von korpulkulären
und hochmolekularen Fraktionen (Nucleinsäuren, Proteinen, Proteiden, Lipiden und
Dolysaccariden) sowie deren Abbauprodukten, die nach bekannten Verfahren der Gewebeestraktion
und .ntigenisollerung gewonnen werden.
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2. Verfahren nach Anspruch l, gekennzeichnet durch die Konjugation
oder komibinierte Anwendung mit andersartigen Gewebeextrakten, zytotropen Schlepperstoffen,
nativen und künstlichen Hormonen und bzw. oder Spurenelementen.
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3. Verfahren nach Anspruch 1, zur Isolierung von Spermien mit Y- bzw.
mit X-Chromosomen, gekennzeichnet durch die Herstellung eines Antikörperserums mit
Immunglobulinen gegen Zellkerne aus Ovarien oder Eizellen mit dem @-Chromosom als
Antigen nach bekannten immunologischen Verfahren. Agglutination von Spermien mit
diesem Serum und Trennung des agglutinierten vom nicht agglutinierten Sperma.