DE1945251A1 - Verfahren zur Beeinflussung der quantitativen Antikoerperbildung bei der aktiven Immunisierung und der Desensibilisierung - Google Patents

Description

• Verfahren zur Beeinflussung der quantitativen Antikörperbildung bei der aktiven Immunisierung und der Desendibilisierung.
• Vorliegendes Verfahren ermöglicht es die Antikörpersynthese nach der aktiven Immunisierung quantitativ zu beeinilussen und insbesondere die Bildung zirkulierender und zellulärer Antikörper zu aktivieren, sowie bei etwa bestehender Immuntoleranz diese zu durchbrechen. Andererseits kann dieses Verfahren immunologische Toleranz speziiisch für ein bestimmtes Antigen erzeugen oder bei bestehender Sensibilisierung eine Desensibilisierung bewirken, deren Effekt besser ist als bei den bisherigen Methoden der Desensibilisierung. Das Verfahren beruht auf der Verwendung besonderer Adjuvantien für die jeweiligen Antigenpräparate, die zur aktiven Immunisierung oder Desensibilisierung verwendet werden.
• Als Adjuvantien werden embryonale und bzw. oder foetale hochmolekulare Zellextrakte aus verschiedenen Organarten verwendet, ebenso auch Extrakte aus invanilen oder adulten lymphatischen Geweben, so z.B. aus Milz, Thymus, Lymphknoten und Lymphozyten, die iniolge von Krankheit oder nach Sensibilisierung die Spenders mit einem Antigen bzw. Antigengemisch, hyper.rgisch reagieren. Zur Aktivierung der Antikörperbildung Müssen dabei höhere Konzentrationen des Antigens und dieser Adjuvantien verwendet werden, d.h. bis zu einer Verdünnung von lo g Trockensubstanz (vom Antigen und dem Adjuvans), während zur Desensibilisierung darüberliegende Verdünnungen bis über io g Trockensubstanz pro ml Lösungsmittel verwendet werden.
• Bs hat sich gezeigt, daß in imbryonalen und foetalen hochmolokularen Zellextrakten, die nach besonders schonenden Verfahren möglichst ohne Denaturierung gewonnen worden, Faktoren enthalten sind, die, wenn sie den Antigen oder dem Antigengemisch zugesetzt werden, die Antikörperproduktion bei der aktiven Immunisierung weit höher steigern, als dies bisher durch andere Adjuvantien und Immunisierungsmethoden möglich war. Es werden dabei Organvollextrakte, insbesondere aus embryonaler und bzw. oder foetaler Weber Lunge, Herzmuskel, Milz, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, mesenchymalem Bindegewebe, Eihäuten und Gehirn verwendet, die nach dem Verfahren des DBP 1090 821 chemisch aufgeschlossen sein können. Dabei werden pulverförmige Substrate, die durch Einfrierung, Pulverisierung und Lyophilisation von Frischgeweben gewonnen wurden, bei Normaltemperatur den Dämpfen geeigneter Reagenzien wie z.B. Schwefelsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Mercaptoäthanol oder Diätylamin ausgesetzt, deren Siedepunkt bei atmosphärischem Druck Über der Normaltemperatur liegt, sodaß im Vakuum die Überführung des aufschliessenden Mittels in die dampfförmige Phase ermöglicht wird und nachdem der gewünschte Aufschluß des Substrats erreicht ist, das nicht verbrauchte Reagenz wieder entfernt werden kann.
• Organextrakte aus juvenilen oder adulten Geweben werden besonders aus Operationspräparaten von Patienten gewonnen, die an hyperergisch-allergischen Erkrankungen wie z.B. an Sarkoidose leiden. Man verwendet dazu besonders Milz, Lymphknoten, Lunge sowie Lymphozyten, die man aus dem Blut oder der Lymphe gewihnt.
• Es können jedoch auch Gewebeextrakte dieser Organe und Zellen von gesunden Individuen verwendet werden, die vorher mit Antigenen sensibilisiert wurden, für die das besondere Adjuvans, das man hier vorwiegend aus den Lymphozyten und evt. aus Lymphknoten gewinnt, verwendet werden soll. In Krankheitsfällen, bei denen sich z.B. gegen bestimmte Mikroorganismen oder auch gegen Krebsantigene eine Immuntoleranz entwickelt hat, die bei Bakterien zu Dauerausscheidung führt und bei der Krebskrankheit zum Bortschreiten des Tumorwachstums und der Metastaslerung, iind solche Gewebeextrakte als Adjuvantien für die Antigene bei der aktiven Ixzunisierung besonders wichtig. Man gewinnt diese Präparate nach aktiver Immunisierung von freiwilligen Spendern mit den entsprechenden Mikroorganismen bzw. Tumorantigenen.
• Durch Verwendung der beschriebenen Adjuvantien kann man auch Antikörperbildung gegen homolge und heterologe Immunglobuline auslösen und verstärken. Besondere Indikationen sind hierfür die Blutinkompatibilitäten zwischen Mutter und Kind, die auf einer ABO-Unverträglichkeit und besonders auf dem Rh-Faktor beruhen.
• Die Adjuvantien aus Organextrakten können in gleicher Weise wie andere Adjuvantien und insbesondere das Freund'sche Adjuvans bei allen Arten von Antigenen und Allergenen verwendet werden, so z.B. bei mikrobiellen Antigenen, Viren, Gewebeantigenen, Pollen- und Stauballergenen usw. Die Wirkung dieser Adjuvantien ist zum Teil dosisabhängig, d.h.
• daß zwischen hohen Ronzentrationen und hohen Verdünnüngen ein Umkehreffekt der Wirkung zustandekommt und daß z.B. mit sehr hohen Verdünnungen von einem Extrakt aus dem foetalen Anteil der Placenta in der Konzentration von 10-18g pro ml Lösungsmittel ein Hemmeffekt auf die Antikorperbildung erzielt wird, während höhere Konzentrationen um lo 3 bis lo 9 die Antikörperbildung verstärken. Bei den Extrakten aus dem maternen Anteil der Placenta ist die Dosisabhängigkeit umgekehrt. Hier aktivieren höhere Verdünnungen während höhere Konzentrationen eine Hemmwirkung auslösen. Diese Präparate können deshalb bei geeigneter Dosierung mithelfen eine spezifische immunologische Toleranz gegen ein bestimmtes Antigen bzw. Antigengemisch wie z.B. bei Transplantationsantigenen zu erzeugen. Vor einer Organtranspantation können dabei Spender und Empfänger wechselseitig mit Antigenen aus Haut, Lymphgewebe oder Organgewebe vorbehandelt werden, denen als Adjuvans ein Extrakt aus dem foetalen Anteil der Placenta in Verdünnung von lo 16g Trockensubstanz pro ml Lösungsmittel zugesetzt ist.
• Bei allergischen Erkrankungen werden die durch Testung ermittelten Allergene in einer für die Xrankheitsauslösung unterschwelligen Verdünnung zusammen mit dem Organadjuvans, in üblicher Weise wie bei der Hyposensibilisierung wiederholt injiziert. Bei der Anwendung von Auto- und Mischvaccinen oder uto- und Fremdnosoden muß das Adjuvans ebenfalls entsprechend der gewünschten Wirkung dosiert werden.
• Die Herstellung der Antigene in Form von Impfstoffen gegen Pilze Bakterien oder Viren sowie von Mischvaccinen, Autovaccinen, Nosoden und Autonosoden, ebenso auch von Organ- und Gewebeantigenen sowie Immunglobulinen und Allergenen ist bekannt, desgleichen auch die Herstellung der beschriebenen embryonalen und foetalen Organextrakte; jedoch ist die kombinierte Verwendung von Antigenen und Adjuvantien aus embryonalen und foetalen Organextrakten sowie die Verwendung von lymphatischen Geweben aus hyperergischen natürlich erkrankten Patienten oder spezifisch vorsensibilisierten Spendern bisher nicht erfolgt.
• Hierbei handelt es sich um keine einfache Zusammenmischnung, weil die hochmolekularen Bestandteile beider Komponenten chemische bzw. adsorptive Bindungen eingehen. Diese Reaktionen werden verstärkt durch vorherige Aktivierung der Bestandteile durch Erwärmung bzw. Schütteln oder Ultraschalleinwirkung und anschließende Inkubation bei Temperaturen um 4 ° Celsius.
• Die Mitverwendung einer kolloidalen Komplexverbindung aus Auluminiumhydroxyd und Kieselsäure mit Zusatz von Phenol, wie sie in dem Präparat Serum Activator der VITORGAN-ARZNEIMITTEL-FABRIK, RUIT vorliegt, verstärkt die adsorptive Bindung mit dem Antigen und aktiviert zusätzlich die Antikörperbildung.
• Tierexperimentell ließ sich zeigen, daß diese Komplexverbindung im Gegensatz zum Freundtschen Adjuvans besonders die Antikörperbildung gegen Globeline verstärkt. Diese Komplexverbindung kann jedoch allein, dem Antigen zugesetzt, die Antikörperbildung nicht in gleicher Weise steigern oder beeinflussen, wie die beschriebenen Adjuvantien aus Organextrakten, Mit diesen zusammen sind kolloidale Komplexverbindungen aus Aluminiumhydroxyd und Kieselsäure jedoch in der Lage, den Effekt der Organextrakte noch weiter zu steigern. Körpereigene Immunglobuline werden durch die kolloidale Komplexverbindung in vitro zum Antigen umgewandelt, dessen antigene Wirkung dann durch den Zusatz des Adjuvans aus Organextrakten noch verstärkt werden kann.
• BeispieL l Es soll die Wirkung von Organextrakten aus foetalem Herzmuskel, foetaler Leber und foetaler Placenta in verschiedenen Verdünnungsstufen auf die Antikörperproduktion, bei Verwendung von Schaferythrozyten als Antigen untersucht werden. Dabei werden 0,1 ml einer 20 %-igen Suspension der Schaferythrozyten mit 0,5 ml einer Zubereitung der genannten Organpräparate versetzt und am Tage O intraperitonal an eingezüchtete Mäuse (Charles River) injiziert.
• 5 Tage danach wird die Antikörperproduktion der Milzzellen dieser Tiere in vitro im Haemolyse-Gel-Test bestimmt. Die Ergebnisse werden mit einer positiven Kontrolle mit Antigen allein und einer Kontrolle ohne Antigen verglichen. Die Präparationen der Organ-Trockensubstanzen bestehen in einer Suspension von 15 mg der jeweiligen Trockensubstanzen in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Die Dilution Stärke III besteht in einer Verdünnung von 10-6 g der Trockensubstanzen in pysiologischer Kochsalzlösung, die der Dilution 3t. II in einer Verdünnung von lo physiologischer Kochsalzlösung.
• ErSebnisse: Plaaues-1O6 Milzzellen 1. Kontrolle: kein Antigen 1 2. Lösungsmittel 1 3. Pos. Kontrolle: Antigen allein 368 4. Antigen + Cor-Trochensubstanz + Lösungsmittel 2 895 5. Antigen + Cor-Dilution St. III 412 6. Antigen + Jtepar-Trockensubstanz + Lösungsmittel 3 215 7. Antigen + Placenta foetalis-Dilution St. III i IM 8. Antigen + Placenta foetalls-Dilution St. II 198 Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Antikörperbildung durch Adjuvantien aus foetalen Organtrockensubstanzen am stärksten stimmuliert werden und bei den Dilutionen durch Stärke III mehr als durch Stärke II. Foetale Plazenta hemmt hingegen bei Dilution St. II die Antikörperbildung, während sie in Stärke III die Antikörperbildung noch über 100 % stimuliert.
• Beispiel 2.
• Herstellung eines kombinierten Impfstoffes gegen Typhus und Paratyphus. Es werden dabei 1 000 Millionen abgetötete Typhus und 500 Millionen abgetötete Paratyphus A, B und C Bakterien in 1 ml einer Verdünnung 10-6 6 g eines hochmolekularen Organextraktes aus foetalem Rinderdarm aufgenommen.
• Beispiel 3.
• Herstellung eines Impfstoffes gegen Poliomyelitis. Dazu wird ein käuflicher, abgetöteter Poliomyelitis-Impfstoff 1:1 mit einem Organextrakt aus dem maternen Anteil der Plazenta in einer Verdünnung 10 4 g Trockensubstanz pro ml physiologischer Kochsalzlösung inkubiert.
• Beispiel 4.
• Herstellung von Autovaccine bzw. von Mischvassinen. Die nach bekannten Veriahren hergestellten Vaccinen werden im Verhältnis 1:1 mit einer Mischung foetaler Organextrakte aus foetaler Lunge, foetaler Haut, foetalen Schleimhäuten, jeweils in Verdünnung 10-9 pro ml NaCl-Lösung inkubiert.
• Beispiel 5.
• Herstellung einer Autonosode. Die fertig-bereite Autonosoda wird im Verhältnis 1:1 mit einem Organextrakt aus foetaler Leber in einer Verdünnung von 10-12 g pro ml Kochsalzlösung gemischt Beisniel 6.
• Herstellung einer Allergenmischung zur Hyposensibilisierung bei Allergie. Zur Behandlung des Asthma Bronchiale wird aus den getesteten Allergenen bæw. Bakterienantigenen in üblicher Weise der Impfstoff gewonnen, z.B. aus Pneumokokken, Streptokokken,Staphylokokken unter Zusatz-von Tuberkulin, und daraus eine Mischung von 10-5 5 g der Trockensubstanzen pro ml Lösungsmittel hergestellte Diese Verdünnung wird im Verhältnis 1:1 mit einem Organextrakt aus dem foetalen Anteil der Plazenta in der Verdünnung 10-12 inkubiert und in üblicher Weise wie bei der Hyposensibilisierung therapeutisch verwendet.
• Beispiel 7.
• erstellung von Impostoffen aus Operationspräparat von Malignomen: Das Tumorgewebe wird isoliert, tief gefroren, pulverisiert und lyophilisiert, sodann nach Patent Nr.
• 1090821 im Vakuum bei Normaltemperatur durch Schwefelsäuredämpfte aufgeschlossen. Von dem erhaltenen Trockenpulver werden 30 mg + 15 mg eines in ent.sprechender Weise gewonnenen Trockenpulvers aus dem Operationspräparat einer Sarkoidmilz (Morbus Boeck) zusammengebracht und 4 ml des käuflichen Präparates "Serum-Activator" (VITORGAN ARZ-NEIMITTELFABRIK GMBH Ruit bei Stuttgart) zugesetzt. Es wird nun in einem hochturigen Momogenisator 10 Sekunden homogenisiert, dann werden 16 ml einer 0,5 %igen Phenollösung in physiologischer Kochsalzlösung zugemischt und erneut 10 Sekunden homogenisiert. Anschliessend wird die Mischung 1 Minute lang mit Ultraschall behandelt.
• Beispiel 8.
• Herstellung von Impfstoffen aus Operationspräparaten von Malignomen: Das nach Beispiel 7 hergestellte Tumorpraparat wird ohne Zusatz des Präparates aus Sarkoidmilz in entsprechender Weise weiterbehandelt bei alleiniger Verwendung der kolloidalen Kompexverbindung aus Aluminiumhydroxyd und Kieselsäure mit Phenolzusatz als Adjuvans.
• Dieses Präparat wird einem Freiwilligen wiederholt s.c.
• u. i.m. im Abstand von 3, 5 und 8 Tagen sowie nach 4 Wochen injiziert. 8 Tage nach der letzten Injektion wird dem Freiwilligen 200 ml Venenblut entnommen. Aus diesem wird das Serum isoliert und andererseits werden die Lymphozyten nach bekannten Methoden abgetrennt und nach der Methode des Bei spieles 7 zu pulverisierten Dauerpräparaten verarbeitet. Zur Immunisierung des Patienten wird nun anstatt des im Beispiel 7 verwendeten Extraktes aus Sarkoidmilz, der Extrakt aus den Lymphozyten als Adjuvans verwendet.
• Das Präparat wird in gleicher Weise wie im Beispiel 7 hergestellt.
• Beispiel 9.
• Herstellung von Transplantations-Antigenen für prophylaktische Erzeugung einer spezifischen Immuntoleranz: Durch Probee-zzission etnnommene Haut und Lymphknoten werden zusammen mit Lymphozyten des Blutes sowohl vom Spender als auch vom späteren Empfänger eines Organtransplantates wie im Beispiel 7 zu Dauerpräparaten verarbeitet. Aus den Trockenpräparaten werden Homogenate in physiologischer Kochsalzlsöung in einer VerdÜnnung von 10-6 g Trockensubstanz pro ml Lösungsmittel hergestellt und diese jeweils im Verhältnis 1:1 mit Organextrakten aus dem foetalen Anteil der Plazenta in einer Verdünnung g Trockensubstanz pro ml Lösungsmittel zusammengebracht und durchgeschüttelt. Diese Präparate werden dann mit physiologischer Kochsalzlösung stufenweise im Hunderterschritt, bezogen auf die Antigenmischungen, über 10-11, 10-13 auf 10 t5 und ggSsO noch höher weiterverdünnt. Diese Präparate werden dann in Art einer prophylaktischen Hyposensibilisierung wechselseitig, in ansteigender Dosierung wiederholt injiziert, d.h. der Spender erhält die vom Empfänger gewonnenen Präparate und der Empfänger die vom Spender gewonnenen Präparate injiziert.
• Beispiel 10.
• Herstellung von Präparaten gegen Rh-Sensibilisierung von werdenden Müttern. Man gewinnt und reinigt nach bekannten immunologischen Methoden Rh-Antikörper von sensibilisierten Rh-negativen Frauen oder Männern, möglichst der Blutgruppe 0. Dieses Serum wird im Verhältnis 1:1 mit einem Extrakt aus foetaler Leber in einer Konzentrat ion von 10-3 g Trockensubstanz pro ml physiologischer Kochsalzlösung inkubiert. Dann wird entsprechend Beispiel 7 von der kolloidalen Komplexverbindung aus Aluminium-Hydroxyd und Kieselsäure mit Phenolzusatz je 1 ml zu 4 ml des Kombinationspräparates aus Serum und Organ-Adjuvans zugesetzt. Dadurch erfolgt eine weitere Verstärkung der Antigenität der Serumglobuline.
• Danach werden ebenfalls im Hunderterschritt stufenweise Verdünnungen über 10-2, 10 4, 1016 bis 10-12 und evtl.
• höher hergestellt. Wie im Beispiel 8 erfolgt auch hier die Anwendung in Art einer Hyposensibilisierung in ansteigender, jedoch unterschwelliger Dosierung. Diese Behandlung kann vor oder auch während einer Gravidität bei Rh-negativen Frauen, die bereits gegen das Rh-Antigen sensibilisiert sind, durchgeführt werden. Frauen, die noch nicht gegen Rh-Antigene sensibilisiert sind, können mit höheren Konzentrationen behandelt werden, als bereits vorsensibilisierte Frauen. Während einer inkompatiblen Gravidität kann in Art einer Hyposensibilisierung eine Dauerbehandlung erfolgen.

Claims (8)

1. Patentansorüche: 1. Verfahren zur Beeinflussung der quantitativen Antii körperbildung bei der aktiven Immunisierung und der Desensibilisierung sowie zur Durchbrechung und andererseits zur Erzeugung von spezifischer Immuntoleranz, dadurch gekennzeichnet, daß embryonale und bzw. oder footale, hochmolekulare Zellextrakte aus verschiedenen .rganarten und bzw. oder Extrakte aus infolge

   Krankheit oder nach vorheriger Sensibilisierung hyperergisch reagierenden juvenilen oder adulten lymphatischen Geweben als Adjuvans mit dem jeweiligen Antigen konjugiert werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene aus Mikroorganismen und Viren sowie Auto- und Mischvaccine sowie Auto- und Freidnosoden hergestellt werden.
3. 3. Veriahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Allergene verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Tumorantigene mit Extrakten aus lymphatischen Organen und Lymphozyten, die aus Operationspräparaten oder aus e Blut oder Lymphe von an Sarkoidose (Morbus Boeck) oder an anderen hyperergischen Krankheiten leidenden Patienten gewonnen wurden, inkubiert werden.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Tumorantigene zur aktiven Immunisierung von Freiwilligen verwendet werden, von denen man danach aus den Lymphozyten aus e}idierten Lymphknoten und evtl. Thymus oder der Milz ein Adjuvans für Tumorantigene gewinnt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß homologe und bzw. oder heterologe Immunglobuline,z.B.

   Rh-Antikörper als Antigen verwendet werden.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Extrakte aus den isolierten maternen oder den foetalen Anteil der Plazenta als Adjuvans verwendet werden.
8. 8. Veriahren nach Anspruch 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Adjuvans zusätzlich eine kolloidale Komplexverbindung aus Aluminiumhydroxyd und Kieselsäure mit Phenolzusatz verwendet wird.