DE19850049A1 - Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeit und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeit und Organ- oder Gewebeproben mittels DurchflußzytometrieInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrazellulären Zytokinfärbung und durchflußzytometrischen Einzelzellanalyse Zytokin-produzierender Zellen in Proben des peripheren Blutes, anderer Körperflüssigkeiten und der lymphatischen Organe und Gewebe. DOLLAR A Für den intrazellulären Zytokinnachweis werden erfindungsgemäß restimulierte mononukleare Zellen in einem Einschrittverfahren unter Verwendung von ORTHO PermeaFix·TM·-Reagens fixiert und permeabilisiert. Nach dem Waschen mit einem auf ORTHO PermeaFix·TM· abgestimmten Waschpuffer werden die mononuklearen Zellen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Rinderserumalbumin und Dimethylsulfoxid eingefroren und bei etwa -70 DEG C gelagert. Neben der höheren Testempfindlichkeit besteht der Vorteil des beschriebenen Verfahrens darin, daß sich nach raschem Auftauen der Zellen im Wasserbad Zelloberflächenmarker und intrazelluläres Zytokin ebenfalls in einem Einschrittverfahren mit den entsprechenden Farbstoff-konjugierten monoklonalen Antikörpern anfärben lassen. Zur intrazellulären Bestimmung proinflammatorischer und antiinflammatorischer Zytokine werden die restimulierten mononuklearen Zellen bei der vorliegenden Methode erst unmittelbar vor der Inkubation mit den konjugierten monoklonalen Antikörpern auf die einzelnen Testansätze verteilt, wodurch sich Arbeitsaufwand und Reagenzienverbrauch gegenüber bekannten Verfahren wesentlich reduzieren. Alternativ können die restimulierten Zellen ohne vorheriges Einfrieren sofort nach der ...
Description
Die Erfindung umfaßt ein effektives Verfahren zur Bestimmung diagnostisch und
pathogenetisch relevanter Zytokine in menschlichen und tierischen Immunzellen aus
dem Probengut des peripheren Blutes, anderer biologischer Körperflüssigkeiten und
Organ- und Gewebeproben auf Einzelzellebene mit Hilfe der Durchflußzytometrie
und kommt als Labormethode bei der medizinischen Immundiagnostik und beim
Immunmonitoring zur Anwendung.
Zytokine werden vorzugsweise von den Zellen des Immunsystems gebildet. Da die
Zytokine eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Immunantwort einnehmen,
stellen Verschiebungen der Zytokinbalance einen wesentlichen Faktor bei der
Immunpathogenese einer Reihe von Erkrankungen dar. Dazu zählen u. a. die
systemischen und organspezifischen Autoimmunerkrankungen, die atopischen
Erkrankungen sowie die Transplantat-Abstoßungsreaktion.
Zu den häufig angewendeten Zytokin-Bestimmungsmethoden gehören der Zytokin-
ELISA zur Quantifizierung sezernierter Zytokine in Zellkulturüberständen, die
Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription der RNS und der Zytokin-
ELISPOT-Assay. Neben dem hohen Zeitbedarf, großem Arbeitsaufwand und hohen
Kosten weisen diese Methoden eine Reihe weiterer Nachteile auf.
Beim Zytokin-ELISA können die Ergebnisse durch Abbau eines Teils der
sezernierten Zytokine während der 3-10 Tage dauernden Zellkultur erheblich
beeinflußt werden.
Beim Nachweis von Zytokin-mRNS bleibt ungeklärt, ob die genetische Information in
biologisch und damit immunregulatorisch wirksames Zytokin umgesetzt wird.
Darüber hinaus gibt keines dieser Verfahren Auskunft über den zellulären Ursprung
der sezernierten Zytokine. Stattdessen werden lediglich Summeneffekte von
Mischzellpopulationen erfaßt.
Bei der durchflußzytometrischen Methode sind mehrere Vorteile bekannt. So
gestattet nur dieses Verfahren, die Zytokin-produzierenden Zellen auf Einzellebene
zu detektieren. Bei gleichzeitiger Anfärbung der CD-Oberflächenmarker ist eine
Zuordnung Zytokin-produzierender Zellen zu spezifischen Monozyten- bzw.
Lymphozytensubpopulationen möglich. Mehrere Zytokine pro Zelle können erfaßt
und über die Fluoreszenzintensität des Zytokinsignals quantitative Aussagen zur
Menge der pro Zelle gebildeten Zytokine getroffen werden. Normalerweise liegen die
intrazellulären Zytokinkonzentrationen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze der
durchflußzytometrischen Methode. Auch durch Stimulation der Zytokinsynthese wird
die Nachweisgrenze nicht überschritten, da die synthetisierten Zytokine sehr schnell
in das umgebende Medium sezemiert werden.
Durch Jung, T., et al.: Detection of intracellular cytokines by flow cytometry, in J.
Immunol. Methods 1993, 159, S. 197-207, ist erstmals eine geeignete intrazelluläre
Zytokinfärbung für die Durchflußzytometrie beschrieben worden. Das Problem der zu
geringen intrazellulären Zytokinkonzentrationen wurde dadurch überwunden, daß
während der Restimulation der mononukleären Zellen durch kombinierte Behand
lung mit Phorbot 12-myristat 13-azetat und Ionomycin der Proteintransportinhibitor
Monensin zugesetzt wurde. Bei dieser Vorbehandlung steigen die intrazellulären
Zytokinkonzentrationen durch Akkumulation auf solche Werte an, die eine Detektion
über die Durchflußzytometrie zulassen.
Durch Jung, T. et al.: Interleukin-13 is produced by activated human CD45RA+ and
CD45RO+ T cells: modulation by interleukin-4 and interleukin-12, in Eur. J. ImmunoL
1996, 26, S. 571-207, ist die Verwendung von Brefeldin A als Protein
transportinhibitor bekannt, eine Substanz, die den intrazellulären Proteintransport
noch wirksamer hemmt und dabei eine geringere Zytotoxizität als Monensin zeigt.
Nach Prussin, C. und Metcalfe, D. D.: Detection of intracytoplasmic cytokine using
flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies, in J. Immunol.
Methods 1995, 188, S. 117-128, erweisen sich direkt mit Fluorochromen konjugier
te monoklonale Zytokin-Antikörper bei der intrazetlulären Zytokinfärbung für die
Durchflußzytometrie als am besten geeignet. Auf Grund der Undurchlässigkeit der
Zellmembranen für solche Antikörper müssen die restimulierten Zellen vor der
Anfärbung in einem kritischen Verfahrensschritt fixiert und permeabilisiert werden.
Während die bekannten Formaldehyd- und Paraformaldehydmethoden bei der
Zellfixierung sehr zuverlässig sind, resultieren die erheblichen Probleme bei den
meisten der bisher angewendeten intrazellulären Protokolle aus der Verwendung
Saponin enthaltender Permeabilisierunsreagenzien.
Nach Fast Immune Cytokine System, Applikation von Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, 1996, S. 5, wird Saponin aus Pflanzen gewonnen und
führt auf Grund seiner heterogenen Zusammensetzung und der Verwendung
unterschiedlicher Ausgangsmaterialien zu einer erbeblichen Variabilität bei der
intrazellulären Zytokinfärbung.
Durch IC ScreenTM lntracellular Staining Kit, Applikation von BioSource International,
Inc., S. 4-19, sind Kits zur intrazellulären Zytokinfärbung bekannt, die deshalb eine
Permeabilisierungskontrolle zur Überprüfung des Saponin-Effektes enthalten.
Dieses bedeutet, daß bei nachgewiesener erfolgloser oder partieller Saponin-Perme
abilisierung mit diesem Test-Kit zum intrazellulären Zytokinnachweis erhobene
Befunde nicht verwertbar sind. Darüber hinaus ist die Membranpermeabilisierung mit
Saponin reversibel, so daß dieses Reagens zusätzlich zum eigentlichen Perme
abilisierungsschritt bei der nachfolgenden Inkubation der Zellen mit monoklonalen
Zytokin-Antikörpern und den Waschschritten zur Eliminierung nicht gebundener
Antikörper ebenfalls zugegen sein muß. Ein weiterer Nachteil nahezu aller
bekannten Verfahren besteht darin, daß die Fixierung und Permeabilisierung
nacheinander in zwei getrennten Arbeitsschritten durchgeführt werden.
Als geeignete Produkte zur Fixierung und Permeabilisierung nach dem Zweistufen
verfahren sind Fix & Perm®, Applikation der Caltag Laboratories, Inc., 1998, S. 12;
Cytodetect Reagent E und F, Cytodetect™ Kit, Applikation von lmmuno Quality
Products, 1997, S. 1-11; IC-Fix™ und IC-PERM™ der Bio-Source GmbH;
IntraStain, Applikation der DAKO Diagnostika GmbH, 1998, S. 1-4; sowie lntra-
Prep™ Permeabilization Reagent, Applikation der Coulter Immunotech Inc., 1998,
S. 1-4 bekannt geworden.
Das einzige Reagens, mit dem bisher Fixierung und Permeabilisierung beim
intrazellulären Zytokinnachweis in einem Schritt durchgeführt worden sind, ist das Kit
Cytofix/Cytoperm™, welches in Research Products Catalog von Pharingern, 1998,
S. 744-749 beschrieben ist. Die Verwendung von Cytofix/Cytoperm™ ist jedoch an
die Bedingung geknüpft, daß die nachfolgende Anfärbung der intrazellulären
Zytokine in dem zur Aufrechterhaltung der Membranpermeabilisierung mitgelieferten
Perm/Wash™-Puffer erfolgt. Es ist erforderlich, die Anfärbung der Zelloberflächen
marker in einem zusätzlichen Arbeitsschritt vor der Umsetzung mit
Cytofix/Cytoperm™ vorzunehmen.
Bei allen bisher bekannten Fixierungs- und Permeabilisierunsverfahren für den
intrazellulären Zytokinnachweis wird in der Regel die Bindung der Zelloberflächen-
Antiköper beeinflußt, so daß sich insgesamt vier Arbeitsschritte in folgender
Reihenfolge ergeben: Fluoreszenzmarkierung der Zelloberflächenantigene mit
Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpern, Zellfixierung, Zellpermeabili
sierung und Anfärbung der intrazellulären Zytokine mit Fluorochrom-konjugierten
monoklonalen Zytokin-Antikörpern.
Die Erhebung diagnostisch relevanter Befunde setzt die Bestimmung mehrerer
proinflammatorischer und antünflamatorischer Zytokine voraus, die sowohl in der
Population der CD4+ T-Helferzellen als auch in den CD8+ zytotoxischen/T-
Suppressorzellen erfolgen sollte. Bei der bisherigen Verfahrensweise müssen die
vom Probanden oder vom Versuchstier gewonnenen Zellproben schon nach der
Restimulation auf eine Vielzahl von Testansätzen verteilt werden, die in den
nachfolgenden Schritten einzeln zu handhaben sind. Daraus ergeben sich ein
entsprechend hoher Arbeitsaufwand und ein großer Reagenzienverbrauch bei der
Fixierung und Permeabilisierung.
Die Aufgabe der Erfindung ist ein effektives Verfahren, mit dem unter der
Anwendung der Durchflußzytometrie in den Immunzellen pathogenetisch und
diagnostisch relevanter Zytokine auf Einzelzellebene qualitativ und quantitativ
nachgewiesen werden können. Durch einen wesentlich verringerten technischen
Aufwand, einer höheren Testempfindlichkeit im Vergleich zu den bekannten
Verfahren und eine dadurch bedingte verbesserte Diskriminierung zwischen Zytokin
positiven und Zytokin-negativen Immunzellen soll erreicht werden, daß das
erfindungsgemäße Verfahren zum intrazellulären Zytokinnachweis als Routine-
Labormethode bei der Immundiagnostik und beim Immunmonitoring Anwendung
findet.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur durchflußzytometrischen
Analyse Zytokin-produzierender Immunzellen aus dem Probengut des peripheren
Blutes, anderer Körperflüssigkeiten und der Organe und Gewebe sowohl die
Zellfixierung und Permeabilisierung als auch die Anfärbung von Zellober
flächenantigenen und intrazellulären Zytokinen unter Verwendung Fluorochrom
konjugierter monoklonaler Antikörper in zwei aufeinander folgenden Einschritt
verfahren erfolgen, wobei die Zellfixierung und Permeabilisierung sowie die
nachfolgende Fluoreszenzmarkierung von Zelloberflächenantigenen und
intrazellulären Zytokinen jeweils in einem einzigen Verfahrensschritt durchführbar
sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im einzelnen darin, daß zunächst durch
Dichtegradientenzentrifugation über Histopaque-1077, FicoII/Urografin oder CellSep
Lymphocytes aus dem Probengut die mononukleären Zeilen nach bekannten
Standardverfahren gewonnen werden. Die mononukleären Zellen werden
anschließend in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum durch
Behandlung mit dem Proteinkinase C-Liganden Phorbol 12-myristat 13-azetat und
dem Antibiotikum Ionomycin in Gegenwart des Proteintransport-Inhibitors Brefeldin A
über 4 Stunden unter Kulturbedingungen restimuliert. Die dabei verwendeten
Substanzen und Konzentrationen sind mit denen bekannter Verfahren identisch. Die
Nachteile bei der bekannten Verfahrenstechnik zum intrazellulären Zytokinnachweis
werden erfindungsgemäß durch die Anwendung von ORTHO PermeaFix™ bei der
Fixierung und Permeabilisierung der restimulierten mononukleären Zellen
ausgeschlossen.
Erfindungsgemäß erfolgt bei der gesamten Probe der restmulierten Zelle mit dem
ORTHO PermeaFix™-Reagens die Fixierung und Permeabilisierung in einem
Einschrittverfahren, wobei dieses Reagens die Expression lymphozytärer
Oberflächenmarker wie CD2, CD3, CD4, CD8, CD16 und CD19 nicht beeinträchtigt.
Deshalb ist es möglich, nach Behandlung der Zellen mit ORTHO PermeaFix™
Zelloberflächenmarker und intrazelluläre Antigene ebenfalls in einem Einschritt
verfahren anzufärben. Dies führt zu einer höheren Empfindlichkeit des Tests, da bei
vorgeschalteter Oberflächenmarkierung die Zytokine auf Grund der reversiblen
Wirkung des Proteintransportinhibitors Brefeldin A teilweise aus den Zellen
austreten.
Unvollständige Permeabilisierungen, die bei der Verwendung konventioneller
Saponin enthaltender Reagenzien beobachtet werden und in bekannter Weise zum
Abfall der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) bei der durchflußzytometrischen
Zytokinbestimmung führen können, treten durch Behandlung der Zellen mit ORTHO
PermeaFix™ nicht auf. Nach der Umsetzung mit ORTHO PermeaFix™ werden die
Zellen gewaschen, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 1% Rinderserum
albumin und 10% Dimethylsulfoxid eingefroren und bei -70°C gelagert.
Verfahrensgemäß muß die restimulierte mononukleäre Zellprobe erst nach raschem
Auftauen bei 37°C auf die einzelnen Testansätze verteilt werden. In diesen
Einzelproben lassen sich Zelloberflächenantigene und intrazelluläre Zytokine
ebenfalls in einem Einschrittverfahren mit konjugierten monoklonalen Antikörpern
anfärben, wobei das zur Permeabilisierung verwendete Reagens nicht zugegen sein
muß. Da ORTHO PermeaFix™ die Antikörperbindung an lymphozytären
Oberflächenmarkem wie CD3, CD4 und CD8 nicht beeinträchtigt, wird mit diesem
Reagens die aufwendige separate Markierung der Oberflächenantigene vor der
Fixierung oder Permeabilisierung umgangen. Bei gleichzeitiger Senkung des
Reagenzien-Verbrauchs entfällt dadurch die vorzeitige Aufteilung des
Untersuchungsgutes auf die einzeln zu handhabenden Testansätze. Die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Zellproben sind zur durchfluß
zytometrischen Bestimmung Zytokin-produzierender Zellen geeignet. Bei erhöhter
Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit wird verfahrensgemäß der technische Aufwand
beim intrazellulären Zytokinnachweis soweit verringert, daß das Verfahren als
Routine-Labormethode bei der Immundiagnostik und beim Immunmonitoring
angewendbar ist.
Nachstehend soll das erfindungsgemäße Verfahren zum intrazellulären Zytokinnach
weis anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
In dem Beispiel wird die Bestimmung der Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α),
lnterleukin(IL)-2, Interferon gamma (IFN-γ) und IL-4 produzierenden CD4+- und
CD8+-T-Lymphozyten im peripheren Blut eines Probanden mit Autoimmun-Typ 1-
Diabetes beschrieben.
In konischen 15 ml Zentrifugenröhrchen werden zunächst 3 ml einer 1 : 1 mit
Hank'scher Lösung verdünnten Blutprobe über 3 ml Histopaque-1077 in einer
Zeitdauer von 30 Minuten mit 400 xg zentrifugiert und die mononukleären Zellen
PBMC aus der lnterphase gewonnen.
Nach dem Waschen werden die mononukleären Zellen PBMC in Kulturmedium
RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penicillin und 100 µgg/ml
Streptomycin in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. In die
Vertiefungen einer 24-Lochplatte in Flachbodenausführung werden jeweils 1.5 × 106
Zellen in 750 µl komplettem Kulturmedium pipettiert und nochmals 750 µl
Kulturmedium mit der doppelten Konzentration der zur Restimulation der
mononukleären Zellen PBMC verwendeten Substanzen zugegeben. Durch Mischen
der beiden 750 µl Aliquote werden die Endkonzentrationen von 10 ng/ml Phorbol
12-myristat 13-azetat, 1 µg/ml Ionomycin und 10 µg/ml Brefeldin A erreicht. Ein
parallel mitgeführter Kontrollansatz enthält 10 µg/ml Brefeldin A ohne Phorbol 12-
myristat 13-azetat und Ionomycin.
Nach 4-stündiger Restimulation unter Kulturbedingungen bei 37°C und 5% CO2-
Atmosphäre werden die Zellen in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt,
zweimal in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum gewaschen und
in 50 µl Kulturmedium RPMI 1640 resuspendiert.
Zur Fixierung und Permeabilisierung werden die ZeHproben in 1 ml ORTHO-
PermeaFix™ aufgenommen, gründlich durchmischt und über 40 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 5% letalem
Kälberserum (FCS), 1,5% Rinderserumalbumin und 0,0055% EDTA (PBS-
Waschpuffer) sind die Zellproben in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 1,0%
Rinderserumalbumin und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren und bei -70°C
lagerfähig.
Nach raschem Auftauen bei 37°C im Wasserbad werden die Zellproben in PBS-
Waschpuffer gewaschen und bei der Überführung in 1 ml Micronic-Röhrchen auf die
einzelnen Testansätze verteilt. Zu jeweils 5 × 104 Zellen in 50 µl PBS-Waschpuffer
werden 5 µl des 1 : 10 verdünnten PE-konjugierten anti-Human IFN-γ-Antikörpers
sowie 2,5 µl FITC-konjugierter anti-CD4- oder 2,5 µl FITC-markierter anti-CD8-
Antikörper gegeben und über 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert.
Nach Entfernung nichtgebundener Fluorochrom-markierter Antikörper durch
zweimaliges Waschen werden die Zellen zur Analyse, die vorzugsweise am
COULTER EPiCS XL-Durchflußzytometer erfolgt, in 350 µl PBS-Waschpuffer
resuspendiert und in 12 × 75 mm Probenröhrchen überführt.
Zur Analyse TNF-α-, IL-2-, IFN-γ- und IL-4- produzierender Zellen in den CD4+- und
CD8+ T-Lymphozyten-Populationen haben sich folgende Geräteeinstellungen als
geeignet erwiesen:
Als Kontrollen eignen sich mit Phorbol 12-myristat 13-azetat und Ionomycin in
Gegenwart von Brefeldin A stimulierte Zellen, die
- a) entweder mit PE- und FITC-konjugierten isotypischen Kontrollantikörpern oder
- b) vor der Anfärbung mit PE-markiertem Zytokin-Antikörper mit einem 20-fachen Überschuß des gleichen nicht markierten Zytokin-Antiköpers vorinkubiert wurden. Die Ergebnisse dieser Kontrollen entsprechen der intrazellulären Zytokin-Färbung bei weiter monukleären Kontroll-Zellen, die
- c) in Gegenwart von Brefeldin A ohne Zusatz von Phorbol 12-myristat 13-azetat und Ionomycin kultiviert wurden.
In Analogie zu diesem erläuterten Beispiel können nach dem gleichen
erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung PE- und FITC-markierter Zytokin-
Antikörper bei gleichzeitiger Anfärbung der Zelloberflächenmarker mit PE-Cy5-
konjugierten monoklonalen Antikörpern zwei der vorgenannten Zytokine pro CD4+-
bzw. pro CD8+-T-Zelle nachgewiesen werden.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit umfaßt den Nachweis Zytokin-produzierender
Zellen in spezifischen Lymphozyten(sub)populationen, wie z. B. den CD4+
Gedächtniszellen, wobei neben intrazellulärem Zytokin zwei CD-Zellober
flächenmarker, in diesem Fall CD4 und CD45RO, anzufärben sind.
Claims (5)
1. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in
biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durch
flußzytometrie, dadurch gekennzeichnet, daß in vitro nach Restimulation der
mononukleären Zellenfraktion, die durch Dichtegradientenzentrifugation gewon
nen werden können, vor der durchflußzytometrischen Analyse zuerst die
Fixierung und Permeabilisierung der Immunzellen unter Verwendung von
ORTHO PermeaFix™-Reagens und daran anschließend die Anfärbung von
Zelloberflächenantigen und intrazellulärem Zytokin mit Farbstoff-konjugierten
monoklonalen Antikörpern erfolgen.
2. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in
biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels
Durchflußzytometrie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl
Fixierung und Permeabilisierung der Immunzellen unter Verwendung von
ORTHO PermeaFix™-Reagens als auch die Anfärbung von Zelloberflächen
antigen und intrazellulärem Zytokin mit Farbstoff-konjugierten monoklonalen
Antikörpern in einem Einschrittverfahren erfolgen können.
3. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in
biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels
Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß die
mit ORTHO PermeaFix™ fixierten und permeabilisierten mononuklearen Immun
zellen in einer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Rinderserumalbumin
(RSA) und Dimethylsulfoxid (DMSO) oder anderen geeigneten Medien
eingefroren und bei etwa -70°C oder -193°C lagerbar sind und erst unmittelbar
vor der durchflußzytometrischen Analyse nach dem Auftauen mit Farbstoff
konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen Zelloberflächenantigen und
intrazelluläres Zytokin in einem Einschrittverfahren umgesetzt werden.
4. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in
biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels
Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Bestimmung über eine adaptierte Vollblutmethode unter Verwendung von
ORTHO PermeaFix™ als Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Erythrozyten-
Lyse-Reagens erfolgt.
5. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in
biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels
Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es
zum Nachweis von Monokinen und Lymphokinen in Monozyten- bzw.
Lymphozyten(sub)populationen und auch bei anderen Species anwendbar ist.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE1998150049 DE19850049A1 (de) | 1998-10-30 | 1998-10-30 | Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeit und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie |
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| DE1998150049 Ceased DE19850049A1 (de) | 1998-10-30 | 1998-10-30 | Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeit und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie |
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| Country | Link |
|---|---|
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