DE19529698A1 - Caledothricine - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue physiologisch aktive
Substanzen, nämlich die Caledothricine A, B, C, D, E, F, G, H
und I und Salze davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der
physiologisch aktiven Substanzen Caledothricin A, B, C, D, E,
F, G, H und I, oder ihrer Salze bei der Herstellung von
Medikamenten zur Behandlung mykotischer Erkrankungen;
pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend die
Caledothricine A, B, C, D, E, F, G, H oder I;
Mikroorganismen, die in der Lage sind, Caledothricine zu
produzieren; und ein Verfahren zur Herstellung von
Caledothricinen.
Tiefe Mykosen durch opportunistische Pilze haben bei
immunokompromittierten Patienten aufgrund einer Vielzahl von
prädisponierenden Faktoren wie AIDS, Krebstherapie,
Organtransplantation, Zunahme der alten Bevölkerung und die
zunehmende Verwendung von Antibiotika zugenommen. Bei diesen
immunokompromittierten Patienten verhält sich eine Anzahl von
Pilzen, die bei gesunden Menschen nicht pathogen sind, als
virulente Pathogene. Als eine Folge gibt es ein rasch
steigendes medizinisches Bedürfnis nach gut verträglichen
Antimykotika. Allerdings sind Antimykotika bislang noch nicht
voll entwickelt worden. Es sind nur wenige Antimykotika für
systemische Mykosen auf dem Markt. Darüber hinaus treffen die
Eigenschaften dieser Antimykotika nicht die praktischen
Bedürfnisse in vollem Ausmaß. Diese Situation veranlaßte die
Erfinder, nach neuen Antimykotika, die breite Spektren
aufweisen, zu suchen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß
einige bestimmte Mikroorganismen neue Antimykotika mit
breiten fungiziden Spektren produzieren, wie hierin im
folgenden genauer beschrieben wird.
Die physikochemischen Eigenschaften der physiologisch aktiven
Substanzen Caledothricin A, B, C, D, E, F, G, H und I, die in
Übereinstimmung mit der Erfindung erhalten wurden, sind wie
folgt:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Spezifisches Drehvermögen: [α]²⁴D-50,8°±6,4° (c = 0,10, in Pyridin)
- 3) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1401 (M+H)⁺, 1423 (M+Na)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1399 (M-H)-, 1417 (M+H₂O-H)- - 4) Molekülformel: C₆₅H₁₀₀N₁₂O₂₂
- 5) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H):
Gefunden: 1401, 7117
Ber.: für C₆₅H₁₀₀N₁₂O₂₂: 1401,7143 - 6) UV-Spektrum: in Methanol (vgl. Abb. 1)
λmax 203±5 (ε 4300), 224±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 280 sh) (in Methanol)
λmax 203±5 (ε 3500), 220±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 315 sh) (in N/10 HCl-Methanol)
λmax 204±5 (ε 7200), 225±5 (ε 2600 sh), 245±5 (ε 1600 sh), 295±5 (ε 200 sh) (in N/10 NaOH-Methanol) - 7) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 2).
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt:
3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000 - 8) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 3)
- 9) ¹³C-NMR-Spektrum: 100 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 4)
- 10) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 11) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 12) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: YMC-Pack A303, hergestellt von Yamamura Chemical Laboratories
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) = 45 : 55
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. Rt = 16,3±0,5 min - 14) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 15) Aminosäureanalyse: Caledothricin A wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1223 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1221 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₅₉H₉₀N₁₂O₁₆
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 5)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 1130-1060 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 6)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 22,4±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin B wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1239 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1237 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₅₉H₉₀N₁₂O₁₇
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 7)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3368, 2926, 2855, 1740, 1671, 1518, 1204, 1138 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 8)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 22,2±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin C wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1355 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1353 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₄H₉₈N₁₂O₂₀
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 9)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 10)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 18,2±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin D wurde in 6N HCl für 4 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1371 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1369 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₄H₉₈N₁₂O₂₁
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 11)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 12)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 17,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin E wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1517 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1515 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₇₀H₁₀₈N₁₂O₂₅
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 13)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, 1260, 1100-1000 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 14)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 16,3±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin F wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1373 (M+H)⁺ - 3) Molekülformel: C₆₃H₉₆N₁₂O₂₂
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 15)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3350, 2926, 2855, 1739, 1659, 1518, 1265, 1120-1030 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 16)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 15,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin G wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1343 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1341 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₂H₉₄N₁₂0₂₁
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 17)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 18)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 12,3±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin H wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1327 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1325 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₂H₉₄N₁₂O₂₀
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 19)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, 1140 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 20)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 12,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin I wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den.
Die Caledothricine A, B, C, D, E, F, G, H und I zeigten
ziemlich ähnliche ¹H-NMR-Spektren wie in Abb. 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18
und 20 wiedergegeben und IR-Spektren wie in
Abb. 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und 19 wiedergegeben. Dies
weist jeweils darauf hin, daß Caledothricine
Depsipeptidhomologe sind. Die Aminosäureanalysen der
Caledothricine ergaben, daß sie dieselben Aminosäurereste
aufwiesen, diese sind Threonin, Glycin, Glutamin, Histidin
und Tyrosin. Die Gegenwart von Fettsäureeinheiten wurde durch
ihre ¹H-NMR-Spektren angezeigt (ein Signal bei 0,95 ppm, das
einer Methylgruppe zugeordnet werden kann, und Signale bei
1,2-1,4 ppm, die Methylengruppen zugeordnet werden können).
Gemäß dem durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung
gestellten Verfahren werden die Caledothricine A, B, C, D, E,
F, G, H und I durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zur
Gattung Pseudomonas gehört, unter aeroben Bedingungen in
einem wäßrigen Nährmedium und Isolierung derselben
hergestellt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus
schließt alle zur Gattung Pseudomonas gehörende Stämme,
funktionellen Äquivalente, Subkulturen, Mutanten und
Varianten des Mikroorganismus ein, die in der Lage sind, die
physiologisch aktiven Substanzen Caledothricin A, B, C, D, E,
F, G, H und I zu erzeugen.
Bevorzugte Stämme sind Pseudomonas spp. BA 7399 und BA 8429,
die aus einer Bodenprobe isoliert wurden. Die als Pseudomonas
spp. BA 7399 und BA 8429 bezeichneten Stämme sind am 2.
August 1994 am National Institute of Bioscience and Human-
Technology, Japan, nach dem Budapester Vertrag unter den
Hinterlegungsnummern
Pseudomonas sp. BA7399 (FERM BP-4766)
Pseudomonas sp. BA8429 (FERM BP-4767)
Pseudomonas sp. BA8429 (FERM BP-4767)
hinterlegt worden.
Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften von
Pseudomonas spp. BA 7399 und BA 8429 sind wie folgt:
Die Stämme BA 7399 und BA 8429 waren Gram-negativ, nicht
sporenbildend, stäbchenförmig, aerob und mit mehreren (mehr
als 6) polaren Geißeln beweglich. Die Farbe der Kolonien war
blaßgelb. Die Oxidase- und Katalasebildung war positiv. Der
OF-Test des Stammes BA 7399 war oxidativ, aber der Stamm BA
8429 war negativ. Wachstumsfaktoren wurden nicht benötigt.
Diese Eigenschaften zeigen eindeutig, daß die zwei Stämme, BA
7399 und BA 8429, zu der Gattung Pseudomonas Migula gehörten.
Daher wurden diese Stämme als Pseudomonas spp. BA 7399 und BA
8429 identifiziert.
Die Züchtung gemäß dem von der vorliegenden Erfindung zur
Verfügung gestellten Verfahren kann in einem Nährmedium
ausgeführt werden, das übliche Nährstoffe enthält, die von
dem gezüchteten Mikroorganismus verwendet werden können. Als
Kohlenstoffquellen können zum Beispiel Glucose, Levulose,
Galactose, Mannose, Sorbose, Arabinose, Xylose, Sucrose,
Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin und Mischungen davon
erwähnt werden. Stickstoffquellen sind zum Beispiel
Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Fleischextrakt,
Pepton, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Maisquellwasser,
Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen davon. Darüber
hinaus können zu dem Nährmedium andere organische oder
anorganische Substanzen zugegeben werden, um das Wachstum des
Mikroorganismus zu unterstützen und die Produktion von
Caledothricinen zu erhöhen. Beispiele für solche Substanzen
sind anorganische Salze, zum Beispiel Calciumkohlenhydrat,
Natriumchlorid, Natriumthiosulfat, -phosphate und
dergleichen.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen
Medium, bevorzugt bei submerger Fermentation, ausgeführt. Die
Züchtung wird geeigneterweise bei einer Temperatur von 20°C-35°C
ausgeführt, die optimale Temperatur ist 27°C. Die
Züchtung wird bevorzugt bei einem pH von 3 bis 9 ausgeführt.
Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen, unter denen die
Züchtung ausgeführt wird, ab. Im allgemeinen ist es
ausreichend, die Züchtung bei 24°C für 200 Stunden
auszuführen.
Zum Ernten der angestrebten Caledothricine aus den Kulturen
können Abtrennungsverfahren geeignet verwendet werden, die
normalerweise dazu eingesetzt werden, um von Mikroben
produzierte Metabolite aus ihren Kulturen zu isolieren. Zum
Beispiel ist Caledothricin A, das eine n-Butanol
extrahierbare amphotere Substanz ist, hauptsächlich im
Mycelialkuchen enthalten, und es wird vorteilhafterweise
durch die folgenden Verfahren gewonnen. Das heißt, die
gesamte Kulturlösung wird einer Filtration oder
Zentrifugation unterworfen, um die Zellen zu sammeln, und der
resultierende Mycelialkuchen wird mit einem geeigneten
Lösungsmittel extrahiert, um die gewünschten Produkte zu
erhalten. Die Lösungsmittel, die für die Extraktion verwendet
werden können, schließen wasserlösliche organische
Lösungsmittel oder wäßrige Lösungen wasserlöslicher
organischer Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Aceton,
wasserhaltiges Aceton und wasserhaltige Alkohole ein.
Salze, wasserlösliche Substanzen, etc. können vorteilhaft von
dem resultierenden Extrakt durch Auftrennung zwischen Wasser
und nicht-wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wie n-
Butanol, Methylethylketon, etc. entfernt werden. Zur
Entfernung färbender Substanzen, fettlöslicher Substanzen
oder dergleichen von dem Extrakt können Silicagel (Wako
Chemicals Co. Ltd., Japan), molekularsiebartige Harze wie
Sephadex (Pharmacia, Schweden) und Toyopearl (Toyo Soda
Manufacturing Co., Japan) etc. verwendet werden.
Für eine vollständige Reinigung der Verbindungen wird
vorteilhaft die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) verwendet. Träger, die bei solcher HPLC verwendet
werden können, schließen ein Harz vom "reverse phase"-Typ wie
YMC-Gel (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) oder Capcel
pak-Gel (Shiseido, Co. Ltd., Japan) ein. Als mobile Phase
werden Lösungsmittelsysteme bestehend aus einer Mischung aus
einer wäßrigen Pufferlösung und einem geeigneten
wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie Methanol,
Acetonitril, etc. vorteilhaft verwendet.
Die wie oben gereinigte und fraktionierte Eluatfraktion kann
einer Aufkonzentration, Gefriertrocknung oder Kristallisation
unterworfen werden, um Caledothricine zu pulverisieren oder
kristallisieren.
Zur Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze (z. B.
Kaliumsalz, Calciumsalz und Salzsäuresalz etc.) von
Caledothricinen (freie Form) können herkömmliche Methoden
verwendet werden.
Minimale inhibierende Konzentrationen (MIKs) von
Caledothricin A, B, C, D, E, F, G, H und I gegen ausgewählte
pathogene Pilze werden in Tabelle 1 gezeigt. MIK ist
definiert als die minimale Konzentration an Testverbindung,
bei der kein sichtbares Wachstum festgestellt wird. Die zur
Messung der MIKs eingesetzten Nährmedien waren Hefe-Stick
stoff-Basis (Difco) ergänzt mit 1% Glucose, 0,2% Agarose
mit niedrigem Schmelzpunkt und 0,25% K₂HPO₄ (pH 7,0). Die
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt wurde weggelassen, als die
antimykotische Aktivität gegen Candida albicans und
Cryptococcus neoformans gemessen wurde. Die Nährmedien wurden
mit Pilzzellen mit einer Endkonzentration von 10 000 cfu/ml
angeimpft. Die Platte wurde für 1-12 Tage bei 27°C
inkubiert. Alle MIK-Werte in Tabelle 1 sind als µg/ml der
Testverbindungen ausgedrückt.
Eine akute Toxizität der Caledothricine A bis I wurde nicht
beobachtet.
Für die therapeutische Verwendung können Caledothricine in
medizinische Zusammensetzungen verschiedener Formen in
Übereinstimmung mit bekannten Formulierungstechniken
eingearbeitet werden.
Für die Verwendung von Caledothricinen in der Therapie von
Candidiasis kann zum Beispiel Caledothricin A intravenös,
subkutan oder intramuskulär als eine Lösung in
physiologischer Kochsalzlösung, normalerweise bei einer Dosis
von 0,1 bis 50 mg/kg/Tag, bevorzugt 0,5 bis 20 mg/kg/Tag
verabreicht werden. Zur oralen Verabreichung wird
Caledothricin A bevorzugt als Kapseln oder Zucker-ummantelte
Tabletten durch herkömmliche Verfahren formuliert und bei
einer Dosis von normalerweise 0,1 bis 100 mg/kg/Tag,
bevorzugt 1 bis 50 mg/kg/Tag verabreicht.
Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Caledothricine
können auch als ein Desinfektionsmittel zur örtlichen
Anwendung verwendet werden. Zum Beispiel kann Caledothricin A
zur Sterilisation und Desinfektion der Haut oder Schleimhaut
von Menschen und Tieren durch Auftragen als eine flüssige
Zusammensetzung verwendet werden, die durch Auflösen von
Caledothricin A in zum Beispiel destilliertem Wasser bei
einer Konzentration von normalerweise 0,1 bis 10
(Gew./Vol.)%, bevorzugt 0,5 bis 5 (Gew./Vol.)% hergestellt
wird oder als eine Salbe unter Verwendung von Vaseline oder
Lanolin als eine Basis, enthaltend normalerweise 0,2 bis 100
mg, bevorzugt 1 bis 20 mg Caledothricin A pro Gramm.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die
vorliegende Erfindung. Die gegebenen Prozentangaben sind in
Gewicht/Volumen.
Die Zellsuspension eines gut gewachsenen Ansatzes von
Pseudomonas sp. BA 7399 wurde in einen 500-ml-
Erlenmeyerkolben eingeimpft, der 100 ml des Mediums bestehend
aus Dextrin 3%, Ajipron E3 (Ajinomoto) 1,5%, Polypepton
(Wako) 0,2%, Mais-Glutenmehl (Shouwasangyou) 1,5%, Na₂S₂O₃
0,1% und Entschäumungsmittel 1 Tropfen/Kolben (Nissan)
enthielt. Der Kolben wurde bei 220 Upm für 1 Tag bei 27°C
geschüttelt. Jeweils 0,2 ml der erhaltenen Kultur wurden in
fünfzig 500-ml-Kolben enthaltend das gleiche Medium wie oben
überführt. Die Fermentation wurde auf einem
Rotationsschüttler bei 220 Upm bei 27°C durchgeführt. Nach
zweitägiger Züchtung wurde die Nährlösung dem unten
beschriebenen Isolationsverfahren unterworfen.
Die so erhaltene Nährlösung (5 l) wurde einer
kontinuierlichen Zentrifugation unterworfen, um den
Mycelialkuchen zu erhalten. Der Mycelialkuchen wurde zu
Ethanol (1,3 l) zugegeben und die Mischung wurde gerührt. Die
Mischung wurde filtriert und das Ethanolextrakt (1,4 l) wurde
unter reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Der
Rückstand (6,4 g) wurde in Wasser (2 l) gelöst und die so
erhaltene Suspension wurde auf pH 2 eingestellt. n-Butanol (2 l)
wurde zugegeben und die Mischung wurde gerührt, gefolgt
von der Entfernung der Wasserschicht. Wasser (2 l) wurde zu
der so erhaltenen organischen Schicht zugegeben und die
Mischung wurde auf pH 9 eingestellt. Die Mischung wurde
gerührt gefolgt von der Entfernung der Wasserschicht. Die so
erhaltene organische Schicht wurde unter reduziertem Druck
bis zur Trockne konzentriert und der Rückstand (4,5 g) wurde
dann einer Säulenchromatographie an Silicagel (1 l)
unterworfen. Die Säule wurde zuerst mit einer Mischung aus
Dichlormethan und Methanol (1 : 1) eluiert. Danach wurden die
Antibiotika mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol
(1 : 1) und dann Methanol eluiert. Die Fraktionen, die die
Antibiotika enthielten, wurden zusammengegeben und unter
reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Der so
erhaltene Rückstand (1,4 g) wurde einer Säulenchromatographie
an Sephadex LH20 (1,5 l) unterworfen. Die Elution wurde mit
Methanol ausgeführt. Die Fraktionen, die die Antibiotika
enthielten, wurden zusammengegeben (205 ml) und dann unter
reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Die in
Pyridin gelösten, rohen Antibiotika wurden einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) an einer
YMCpack C₁₈-Säule (20 mmf X 250 mm) unterworfen, wobei mit
einem Lösungsmittelsystem aus Acetonitril: 10 mM
Natriumhydrogenphosphatpuffer (pH 3,4) (45 : 55) zur
Fraktionierung eluiert wurde. Die Fraktionen, die die
einzelnen Caledothricine A bis I enthielten, wurden
vereinigt, gefolgt von einer Aufkonzentration. n-Butanol
(30 ml) wurde zu dem Konzentrat (30 ml) zugegeben, für 5 min
gerührt, gefolgt von der Entfernung der Wasserschicht. Die so
erhaltene organische Schicht wurde mit Wasser (15 ml X 2)
gewaschen und unter reduziertem Druck bis zur Trockne
konzentriert. Der Rückstand wurde in Pyridin gelöst und
wieder unter reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert,
um weißes, pulvriges Caledothricin A (30 mg), B (7,8 mg), C
(3,7 mg), D (2,1 mg), E (1,0 mg), F (1,4 mg), G (1,1 mg),
H (1,6 mg) und I (3,0 mg) zu erhalten.
Nach einer analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Art und
Weise, außer daß Pseudomonas sp. BA 8429 anstelle von
Pseudomonas sp. BA 7399 verwendet wurde, wurden weiße,
pulvrige Caledothricine A (12,5 mg), B (2,6 mg), C (Spur), D
(Spur), E (Spur), F (0,3 mg), G (5,6 mg), H (Spur) und I
(3,2 mg) erhalten.
Injizierbare Lösungen, die jeweils die folgenden
Inhaltsstoffe enthielten, wurden in herkömmlicher Art und
Weise hergestellt:
| Caledothricin A|20 mg | |
| Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei | 7,6 mg |
| Natriumdiphosphatdihydrat | 2,0 mg |
| Ethylalkohol | 150 mg |
| Destilliertes Wasser, deionisiert, steril | 850 mg |
| Gesamt | 1029,6 mg |
Claims (25)
1. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin A mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Spezifisches Drehvermögen: [α]²⁴D-50,8°±6,4° (c = 0,10, in Pyridin)
- 3) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1401 (M+H)⁺, 1423 (M+Na)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1399 (M-H)-, 1417 (M+H₂O-H)- - 4) Molekülformel: C₆₅H₁₀₀N₁₂O₂₂
- 5) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H):
Gefunden: 1401,7117
Ber.: für C₆₅H₁₀₁N₁₂O₂₂: 1401,7143 - 6) UV-Spektrum: in Methanol (vgl. Abb. 1)
λmax 203±5 (ε 4300), 224±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 280 sh) (in Methanol)
λmax 203±5 (ε 3500), 220±5 (ε 2900 sh), 275±5 (ε 315 sh) (in N/10 HCl-Methanol)
λmax 204±5 (ε 7200), 225±5 (ε 2600 sh), 245±5 (ε 1600 sh), 295±5 (ε 200 sh) (in N/10 NaOH-Methanol) - 7) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 2)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt:
3298, 2925, 2854, 1745, 1657, 1517, 1262, 1100-1000 - 8) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 3)
- 9) ¹³C-NMR-Spektrum: 100 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 4)
- 10) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 11) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 12) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: YMC-Pack A303, hergestellt von Yamamura Chemical Laboratories
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) = 45 : 55
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. Rt = 16,3±0,5 min - 14) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 15) Aminosäureanalyse: Caledothricin A wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
2. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin B mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1223 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1221 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₅₉H₉₀N₁₂O₁₆
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 5)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3304, 2926, 2854, 1741, 1657, 1518, 1261, 1130-1060 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 6)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 22,4±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin B wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
3. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin C mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1239 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1237 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₅₉H₉₀N₁₂O₁₇
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 7)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3368, 2926, 2855, 1740, 1671, 1518, 1204, 1138 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 8)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 22,2±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin C wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
4. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin D mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1355 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1353 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₄H₉₈N₁₂O₂₀
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 9)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3342, 2910, 2830, 1740, 1655, 1527, 1204, 1140 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 10)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 18,2±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin D wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
5. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin E mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1371 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1369 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₄H₉₈N₁₂O₂₁
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 11)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3354, 2920, 2850, 1740, 1678, 1530, 1262, 1150-1050 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 12)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 17,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin E wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
6. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin F mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1517 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1515 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₇₀H₁₀₈N₁₂O₂₅
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 13)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3356, 2926, 2855, 1740, 1657, 1518, 1260, 1100-1000 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 14)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 16,3±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin F wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
7. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin G mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1373 (M+H)⁺ - 3) Molekülformel: C₆₃H₉₆N₁₂O₂₂
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 15)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3350, 2926, 2855, 1739, 1659, 1518, 1265, 1120-1030 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 16)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 15,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin G wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
8. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin H mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1343 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1341 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₂H₉₄N₁₂O₂₁
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 17)
Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3386, 2925, 2850, 1745, 1670, 1520, 1210, 1140 - 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 18)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 12,3±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin H wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
9. Physiologisch aktive Substanz Caledothricin I mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Äußere Erscheinung: weißer Feststoff
- 2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode):
Positiver Ionenmodus: m/z 1327 (M+H)⁺
Negativer Ionenmodus: m/z 1325 (M-H)- - 3) Molekülformel: C₆₂H₉₄N₁₂O₂₀
- 4) IR-Spektrum: in KBr-Tablette (vgl. Abb. 19) Die Hauptabsorptions-Wellenzahlen (cm-1) sind wie folgt: 3347, 2920, 2850, 1679, 1540, 1205, 1140
- 5) ¹H-NMR-Spektrum: 400 MHz, in einer Mischung aus Di methylsulfoxid-d₆ und Trifluoressigsäure (25 : 1) (vgl. Abb. 20)
- 6) Löslichkeit:
Löslich: Pyridin, Trifluoressigsäure
Schwach löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol - 7) Farbreaktion:
Positiv: Anisaldehyd-Schwefelsäure, HBr-Ninhydrin, Iod dampf, Molybdatophosphorsäure, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz
Negativ: Bromcresolgrün, Eisenchlorid, 2,4-Dinitrophe nylhydrazin-Schwefelsäure, Sakaguchi-Reagenz, Silber nitrat - 8) Dünnschichtchromatographie (DSC):
- 9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):
Träger: MCI-Gel ODS, hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.
Mobile Phase: Acetonitril: 10 mM Natriumhydrogenphos phatpuffer (pH 3,4) Lösungsmittelgradient
Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Rt = 12,6±0,5 min - 10) Klassifikation der Substanz: Amphotere Substanz
- 11) Aminosäureanalyse: Caledothricin I wurde in 6N HCl für 24 Stunden auf 120°C erhitzt, gefolgt von der Durch führung einer Aminosäureanalyse, wobei Tyrosin, Threo nin X2, Glutamin, Glycin und Histidin nachgewiesen wur den,
und sein physiologisch annehmbares Salz.
10. Verwendung der physiologisch aktiven Substanzen
Caledothricin A, B, C, D, E, F, G, H und I oder ihrer Salze
wie in Ansprüchen 1 bis 9 definiert als aktiver Inhaltsstoff
bei der Herstellung von Medikamenten.
11. Verwendung der physiologisch aktiven Substanzen
Caledothricin A, B, C, D, E, F, G, H und I oder ihrer Salze
wie in Ansprüchen 1 bis 9 definiert als aktiver Inhaltsstoff
bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von
mykotischen Erkrankungen.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Caledothricin
A, B, C, D, E, F, G, H oder I oder dessen Salz wie in
Ansprüchen 1 bis 9 definiert und gewöhnliche pharmazeutische
Hilfsmittel.
13. Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM BP-4766).
14. Pseudomonas sp. BA 8429 (FERM BP-4767).
15. Verfahren zur Herstellung der aktiven Substanzen
Caledothricin A, B, C, D, E, F, G, H und I, das die Züchtung
eines Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört,
unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium und
Isolierung derselben umfaßt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Mikroorganismus
Pseudomonas sp. BA 7399 (FERM BP-4766) oder Pseudomonas sp.
BA 8429 (FERM BP-4767) ist.
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| EP94112790 | 1994-08-17 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4062943A (en) * | 1974-11-20 | 1977-12-13 | Board Of Supervisors Louisiana State University A & M | Antibiotic produced from the microorganism (Pseudomonas lindbergii), its preparation and method of use |
| DE3043535A1 (de) * | 1979-11-19 | 1981-09-17 | Endowment and Alumni Foundation at Montana State University, Bozeman, Mont. | Verfahren zur bekaempfung des ulmensterbens, dafuer geeignetes antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung |
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| GB1040278A (en) * | 1963-10-15 | 1966-08-24 | Analyses Et De Rech S Biolog M | Bacterial compositions for the regeneration of the intestinal microflora |
| US4277462A (en) * | 1979-11-19 | 1981-07-07 | Endowment And Research Foundation At Montana State University | Method for treating Dutch elm disease using P. syringae |
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1995
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- 1995-08-16 FR FR9509831A patent/FR2723748A1/fr active Pending
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Also Published As
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| IT1275575B (it) | 1997-08-07 |
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