DE3881821T2 - Verbindung WF 2015 A und B, deren Herstellung und Verwendung. - Google Patents
Verbindung WF 2015 A und B, deren Herstellung und Verwendung.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die neuen Verbindungen WF 2015 A und B. Insbesondere betrifft sie die neuen Verbindungen WF 2015 A und B, die immunsuppressive Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit haben, ein Verfahren zur Herstellung von WF 2015 A und B durch Kultivierung eines WF 2015 A und/oder B-produzierenden Stammes, der zur Gattung Scolecobasidium gehört, in einem Nährmedium, und sie betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diese enthält.
- WF 2015 A und B, wie sie in den nachfolgend aufgeführten Beispielen erhalten werden, haben die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- a) Molekulargewicht:
- 410 [FAB-MS : m/z 411 (M+H)]
- b) Elementaranalyse:
- C 64,55; H 8,06; O 27,39 (durch Differenz)
- c) Optische Drehung:
- [α]²³D = -52º (C = 1,0, CH&sub3;OH)
- d) UV-Absorptionsspektrum:
- Endabsorption (in CHCl&sub3;)
- e) IR-Absorptionsspektrum
- νCHCl&sub3; max: 3450, 2960, 2920, 1710, 1650, 1440, 1370, 1300, 1260, 1200, 1170, 1120, 1100, 1070, 1050, 1000, 980, 920, 880, 830 cm&supmin;¹.
- f) ¹H NMR Absorptionsspektrum : (CDCl&sub3;)
- δ : 6.95 (1H, dd, J=15.5 und 4.5Hz), 6.20 (1H, dd, J=15.5 und 2Hz), 5.70 (1H, breit s), 5.20 (1H, breit t, J=7Hz), 4.31 (1H, m), 3.90 (1H, m), 3.68 (1H, dd, J=11 und 3Hz), 3.44 (3H, s), 2.98 (1H, d, J=4.2Hz), 2.62 (1H, dd, J=6.5 und 6Hz), 2.56 (1H, d, J=4.2Hz), 2.36 (1H, m), 2.16 (1H, m), 2.10 (1H, m), 2.00 (1H, m), 1.98 (1H, d, J=11Hz) 1.87 (1H, m), 1.74 (3H, d, J=1Hz), 1.66 (3H, d, J=1Hz), 1.21 (3H, s), 1.14 (3H, d, J=6.5Hz), 1.07 (1H, m)
- g) ¹³C NMR Absorption spektrum : (CDCl&sub3;) δ: 165.8 (s), 146.6 (d), 135.0 (s), 121.8 (d), 118.3 (d), 79.4 (d), 74.5 (d), 69.9 (d), 66.3 (d), 61.1 (d), 59.4 (s), 58.9 (s), 56.7 (q), 50.7 (t), 48.2 (d), 29.2 (t), 27.2 (t), 25.6 (q), 25.6 (t), 17.9 (q), 17.1 (q), 13.7 (q).
- h) Löslichkeit:
- löslich: Chloroform, Methanol, Aceton, Ethanol
- unlöslich: n-Hexan, Wasser
- i) Farbreaktion:
- positiv: Reaktion mit Iod-Dampf
- negativ: Ninhydrin-Reaktion, Molish-Reaktion, Eisen(III) chlorid-Reaktion
- j) Eigenschaft der Substanz:
- neutrale Substanz
- a) Molekulargewicht:
- 447 [FAB-MS: m/z 469 (M+Na)]
- b) Elementaranalyse:
- C 58,03; H 7,94; Cl 7,31; O 26,72 (durch Differenz)
- c) Optische Drehung:
- [α]²³D = -248º (C = 2,0, CHCl&sub3;)
- d) UV-Absorptionsspektrum:
- Endabsorption (in CHCl&sub3;)
- e) IR-Absorptionsspektrum:
- νCHCl&sub3; max = 3570, 3400, 2960, 2940, 2870, 2820, 1710, 1660, 1560, 1460, 1440, 1400, 1380, 1360, 1340, 1300, 1270, 1220, 1170, 1120, 1080, 1020, 980, 960, 940, 910 cm&supmin;¹
- f) ¹H NMR (400MHz, CDCl&sub3;)
- δ: 6.99 (1H, dd, J=5, und 15.5Hz), 6.20 (1H, dd, J=2 und 15.5Hz), 5.55 (1H, m), 5.18 (1H, m), 4.36 (1H, m), 3.98 (1H, dq, J=4 und 6Hz), 3.87 (1H, d, J=11Hz), 3.49 (1H, d, J=11Hz), 3.31 (1H, m), 3.30 (3H, s), 2.97 (1H, t, J=6.5Hz), 2.50-2.40 (2H, m), 2.17 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.90-1.75 (2H, m), 1.73 (3H, s), 1.66 (3H, s), 1.49 (3H, s), 1.40 (1H, breit d, J=14Hz), 1.20 (3H, d, J=6Hz)
- g) ¹³C NMR (100MHz, CDCl&sub3;)
- δ: 165.7 (s), 146.3 (d), 134.8 (s), 122.4 (d), 118.2 (d), 78.7 (d), 76.2 (s), 74.5 (d), 70.0 (d), 66.1 (d), 64.0 (s), 62.3 (d), 56.7 (d), 50.5 (t), 43.3 (d), 29.1 (t), 27.5 (t), 25.8 (q), 23.5 (t), 22.2 (q), 17.9 (q), 17.6 (q).
- h) Löslichkeit:
- löslich: Chloroform, Methanol, Aceton, Ethanol
- unlöslich: n-Hexan, Wasser
- i) Farbreaktion:
- positiv: Reaktion mit Iod-Dampf
- negativ: Ninhydrin-Reaktion, Molish-Reaktion, Eisen (III)chlorid-Reaktion
- j) Eigenschaft der Substanz:
- neutrale Substanz
- WF 2015 A und B können hergestellt werden durch Kultivieren eines WF 2015 A und/oder B-produzierenden Stammes, der zur Gattung Scolecobasidium gehört, wie Scolecobasidium arenarium F-2015 und ähnliche in einem Nährmedium und Rückgewinnung von WF 2015 A und B aus der Kulturbrühe. Unter den WF 2015 A und/oder B-produzierenden Stämmen, die zur Gattung Scolecobasidium gehören, wurde Scolecobasidium arenarium F-2015 neu isoliert aus zehnjährigen Holzbruchstücken, die an der Küste der Stadt Uchinada, Präfektur Ishikawa, Japan, durch die vorliegenden Erfinder gesammelt wurden. Eine lyophilisierte Probe von Scolecobasidium arenarium F-2015 wurde in einer internationalen Hinterlegungsstelle gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt, beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1- chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun Ibaraki-ken, 305, Japan, unter der Annahmenummer FERM BP-1520 am 13. Oktober 1987.
- Es ist festzustellen, daß die Herstellung der neuen Verbindungen, WF 2015 A und B, nicht auf die Verwendung des hier beschriebenen speziellen Organismus beschränkt ist, der allein zur Erläuterung aufgeführt wird. Die Erfindung schließt ebenfalls ein die Verwendung beliebiger Mutanten, die in der Lage sind, WF 2015 A und B zu produzieren einschließlich spontaner Mutanten sowie künstlicher Mutanten, die aus dem beschriebenen Organismus durch übliche Methoden hergestellt werden können, wie Röntgenbestrahlung, Ultravioletstrahlung, Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 9-Aminopurin und ähnlichen.
- Scolecobasidium arenarium F-2015 hat die folgenden morphologischen, Kultur- und physiologischen Eigenschaften.
- Dieser Organismus wächst schnell auf verschiedenen Kulturmedien und bildet dunkel-olivfarbene und filzige Kolonien. Während zweier Monate wurde dessen Teleomorph nicht beobachtet, während conidiale Strukturen reichlich produziert wurden. Die Conidiogenese war holoblast und die Conidia waren dunkel, septiert und ellipsiodal. Die Conidiophoren waren kurz, einfach oder verzweigt und in sympodialer Folge entwickelt. Auf Basis dieser Eigenschaften scheint der Stamm F-2015 zur Hyphomyceten-Gattung Scolecobasidium Abbot 1927 zu gehören. Dessen mykologischen Eigenschaften waren wie folgt.
- Die Kulturmerkmale auf verschiedenen Agar-Medien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Kulturen auf Maismehlagar wuchsen schnell, erreichten 4,5 bis 5,5 cm Durchmesser nach einer Woche bei 25ºC. Die Kolonieoberfläche war eben, dünn, filzig und gelblich-grau. Die Gegenseite war ebenso. Es wurden conidiale Strukturen beobachtet. Die Kolonien auf Malzextraktagar wuchsen mit ähnlicher Geschwindigkeit auf Maismehlagar. Die Oberfläche war eben, filzig, sektoriert, dunkelgrün und olivbraun. Die Gegenseite war dunkelgrün. Die Conidia wurden reichlich produziert. Auf Malzextraktagar mit 3,5 % NaCl breitete sich dieser Stamm schneller aus als auf anderen Medien, erreichte 8,0 cm Durchmesser unter den gleichen Bedingungen. Sie waren eben, pulvrig bis filzig, nicht-sektorierend und oliv bis dunkeloliv. Die Gegenseite war grünlich-schwarz. Es wurden reichlich conidiale Strukturen gebildet.
- Die Conidiophoren waren mononematös, fahlbraun, glatt, septiert, einfach oder verzweigt, gerade oder gekrümmt, (8-)12-35(-70) µm lang und 2-4 µm dick. Die Enden jeder der Verzweigungen waren gequollen und bildeten Conidiatragende verzahnte Abschnitte, die 4-5 µm im Durchmesser betrugen. Manchmal setzte sich das Conidiophorenwachstum von der gequollenen Apex fort und bildete ein zweites fertiles Material. An den gequollenen Abschnitten wurden 2 bis 12 Conidia in Clustern produziert. Die Conidia waren braun, obovoid, elliptisch bis zylindrisch, mit einem markierten Vorsprung an der Basis, für Minuten jedoch ausgeprägt verukulös, 1-3(-5) septiert, oft mit dunklen Septen und einem dunklen Fleck an beiden Enden, (9-)12-25(-30) µm lang und 4-7 µm dick. Die vegetativen Hyphaen waren septiert, hyalin, glatt und verzweigt. Die hyphalen Zellen waren zylindrisch und 2-6 µm dick. Die Chlamydosporen waren nicht vorhanden.
- Der Stamm F-2015 war in der Lage, bei Temperaturen im Bereich von 5 bis 37ºC zu wachsen mit einem Wachstumsoptimum bei 23 bis 25ºC. Diese Temperaturdaten wurden auf Kartoffel-Dextrose-Agar bestimmt. Der Stamm konnte bei pH 4 bis 10 wachsen und hatte ein Wachstumsoptimum bei pH 6 bis 7 in YM-Brühe (Difco). Der Stamm tolerierte bis zu 20% NaCl, während ein gutes Wachstum mit bis zu 5% Salzhaltigkeit auftrat.
- Nach den taxonomischen Kriterien der Gattung Scolecobasidium ist der Stamm F-2015 Scolecobasidium arenarium (Nicot) M.B. Ellis 1976 ähnlich. Die oben genannten Eigenschaften stimmen mit denen der Beschreibung Ellis ohne Ausnahme überein (Ellis, M.B. More Dematiacedus Hyphomycetes, S. 194, C.M.I. Kew, 1976). Anschließend identifizierten wir den Stamm als Scolecobasidium arenarium und nannten ihn Scolecobasidium arenarium F-2015. Tabelle 1 Kulturmerkmale des Stammes F-2015 Medium Kulturmerkmale1) Czapeck Dox-Agar Maismehl-Agar G: schnell, S: olivbraun, flach, filzig, sektorierend R: schwärzlich-blau G: ziemlich schnell, S: gelblich-grau, flach, dünn, filzig R: gelblich-grau Medium Kulturmerkmale1) Malzextrakt-Agar Kartoffel-Dextrose-Agar YpSs-Agar Sabouraud-Agar Weizenmehl-Agar MY20-Agar Malzextrakt-Agar mit 3,5 % NaCl ziemlich schnell, dunkelgrün, olivbraun, flach, filzig, sektorierend grünlich-schwarz dunkelbraun, filzig bis wollig, bläulich-grau gelblich-braun, faltig olivfarben-schwarz oliv, erhaben bis flach, wollig, mäßig schnell, olivfarben-schwarz pulvrig bis filzig grünlich-schwarz Abkürzungen G: Wachstum, Messung der Koloniegrößen als Durchmesser, S: Kolonieoberfläche, R: Gegenseite Bemerkung: 1) diese Eigenschaften wurden beobachtet nach 7 Tagen Inkubation bei 25ºC. Die Farbbeschreibungen basierten auf dem Methuen-Farbenhandbuch (A. Kornerup und J.H. Wanscher, Methuen Handbook of Colour, 3.Aufl., Methuen, London, 1983).
- Im allgemeinen können WF 2015 A und B hergestellt werden durch Kultivieren eines WF 2015 A und/oder B produzierenden Stammes in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen (z.B. Schüttelkultur, Submerskultur usw.).
- Die bevorzugten Quellen für Kohlenstoff in dem Nährmedium sind Kohlehydrate wie Glucose, Fructose, Glycerin und Stärke. Andere Quellen, die dazu gehören können, sind Lactose, Arabinose, Xylose, Dextrin, Melassen und ähnliche.
- Die bevorzugten Quellen für Stickstoff sind Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maiseinweichflüssigkeit, Trockenhefe usw., sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.), Harnstoff, Aminosäuren und ähnliche.
- Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, obwohl sie vorteilhaft in Kombination angewandt werden, müssen nicht in ihrer reinen Form verwendet werden, da weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen an mineralischen Nährstoffen enthalten, ebenso für die Verwendung geeignet sind. Gewünschtenfalls können dem Medium solche Mineralsalze, wie Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumiodid, Magnesiumsalz, Kobaltchlorid und ähnliches hinzugesetzt werden. Erforderlichenfalls, insbesondere wenn ein ungewöhnliches Kulturmedium gebildet wird, kann ein Deformierungsmittel, wie flüssiges Paraffin, ein höherer Alkohol, Pflanzenöl, Mineralöl und Silicone hinzugefügt werden.
- Als Bedingungen für die Produktion in großen Mengen sind aerobe Tauchkulturbedingungen bevorzugt für die Herstellung von WF 2015 A und B. Für die Herstellung kleiner Mengen wird eine Schüttelkultur oder eine Oberflächenkultur in einem Kolben oder in einer Flasche angewandt. Weiterhin ist bevorzugt, wenn das Wachstum in großen Tanks durchgeführt wird, die vegetative Form des Organismus für die Inokulierung in den Produktionstanks einzusetzen, um eine Wachstumsverzögerung beim Herstellungsverfahren von WF 2015 A und B zu vermeiden. Daher ist es wünschenswert, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen durch Inokulierung einer relativ kleinen Menge des Kulturmediums mit Sporen oder dem Mycel des Organismus und Kultivierung des inokulierten Mediums, und anschließend Übertragung des kultivierten vegetativen Inokulums in aseptischer Weise auf große Tanks. Als Medium, in dem das vegetative Inokulum produziert wird, kann im wesentlichen das gleiche oder ein etwas von dem Medium unterschiedliches Medium verwendet werden, das für die Hauptproduktion von WF 2015 A und B verwendet wird.
- Rühren und Belüftung des Kulturgemisches kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Rühren kann mittels eines Propellers oder einer ähnlichen mechanischen Rühreinrichtung erfolgen, durch Umdrehung oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpausrüstungen oder mittels Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium. Die Belüftung kann mittels Hindurchleiten steriler Luft durch das Fermentationsgemisch bewirkt werden.
- Die Fermentation wird üblicherweise bei einer Temperatur von etwa zwischen 20ºC und 40ºC durchgeführt, vorzugsweise um etwa 25ºC, für einen Zeitraum von 50 Stunden bis 100 Stunden, was je nach Fermentationsbedingungen und Maßstab variiert werden kann.
- Die so hergestellten WF 2015 A und B können als dem Kulturmedium durch übliche Maßnahmen entfernt werden, die üblicherweise für die Rückgewinnung anderer Fermentationsprodukte, wie Antibiotika, eingesetzt werden.
- Im allgemeinen findet sich das meiste an hergestellten WF 2015 A und B in dem Kulturfiltrat, und dementsprechend können WF 2015 A und B aus dem Filtrat isoliert werden, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe mittels eines üblichen Verfahrens erhalten wird, wie Konzentration unter vermindertem Druck, Lyophilisierung, Extraktion mit einem üblichen Lösungsmittel, pH-Einstellung, Behandlung mit einem üblichen Harz (z.B. Anion- oder Kation-Austauschharz, nicht-ionisches Adsorptionsharz), Behandlung mit einem üblichen Adsorptionsmittel (z.B. Aktivkohle, Kieselsäure, Silicagel, Cellulose, Aluminiumoxid), Kristallisation, Umkristallisation und ähnliche.
- Einige biologische Eigenschaften von WF 2015 A und B werden im Detail in den folgenden Tests eläutert.
- WF 2015 A und B können voneinander getrennt und isoliert werden, indem das Rohmaterial, das WF 2015 A und B enthält, einer Silicagel-Säulenchromatografie unterzogen wird, wie in den Beispielen ausgeführt.
- Die Antitumor-Aktivität von WF 2015 A wurde experimentell in einem Tumorsystem bei Mäusen bestimmt.
- Das Maus-Fibrosarkom Meth A wurde intradermal in Balb/c-Mäusen (weiblich, 8 Wochen alt) mit einer Inokulumgröße von 1 x 10&sup5;Zellen pro Maus implantiert. 24 Stunden nach der Implantation der Tumorzellen wurden abgestufte Dosen von WF 2015 A den Mäusen intravenös verabreicht.
- Die Behandlungen war einmal am Tag am Tage 1, 2, 3, 4 und 7, 8, 9, 10 nach der Tumor-Inokulation. Die Kontrolltiere erhielten intravenöse Dosen von physiologischer Kochsalzlösung. Das Injektionsvolumen betrug 0,2 ml bei allen Versuchen. Fünf Mäuse wurden für jede Versuchsgruppe eingesetzt.
- Das Tumorgewicht 14 Tage nach der Verabreichung, wie es durch Tastermessungen von Länge und Breite der Tumore ermittelt wurde, wurde nach der Formel berechnet:
- Tumorgewicht (mg) = ½ x a x b²
- worin a die Länge und b die Dicke (mm) darstellen.
- Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Dosis von WF 2015 A (mg/kg) Tumorgewicht (mg) nichts (Kontrolle) (Mittel ± S.E., n = 5)
- Bei dieser Untersuchung wurden menschliche Adenokarzinom A549-Lungenzellen und Maus EL-4-Lymphomzellen verwendet. Die A549-Zellen wurden als Monoschichtkultur in Dulbecco's-Medium vermehrt, ergänzt durch 10% Wärmeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Penicillin G (60 µg/ml) und Streptomycin (20 µg/ml) und durch Trypsinisierung geerntet. Die EL-4-Zellen wurden in RPMI- Medium gehalten, das mit 10% FBS und den Antibiotika ergänzt wurde in Kulturflaschen.
- Exponentiell wachsende Zellen von A549 oder EL-4, die aus den Kulturen geerntet wurden, wurden in einem Kolben mit dem entsprechenden Medium suspendiert (Dulbecco's oder RPMI-Medium ergänzt durch 10% FBS und Antibiotika) bei einer Konzentration von 2 x 10&sup4;Zellen/ml oder 2 x 10&sup5;Zellen/ml. Die Zellen wurden mit den abgestuften Dosismengen an WF 2015 in Plastik-Gewebekulturschalen behandelt.
- Die Konzentration der Substanz, die erforderlich war für eine 50%ige Inhibierung des Zellwachstums (IC&sub5;&sub0;-Wert, µg/ml) wurde durch Plotten des Logarithmus der Arzneimittelkonzentration gegenüber der Wachstumsrate (Prozentsatz der Kontrolle) der behandelten Zellen nach 120 Stunden Inkubation für A549-Zellen und 48 Stunden Inkubation für EL-4-Zellen bei 37ºC in feuchter Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid bestimmt.
- Die Ergebnisse waren folgende:
- (1) WF 2015 A IC&sub5;&sub0;-Wert: A549 3,0 x 10&supmin;&sup4; µg/ml
- EL-4 6,5 x 10&supmin;&sup4; µg/ml
- (2) WF 2015 B IC&sub5;&sub0;-Wert: A549 1,4 x 10&supmin;&sup4; µg/ml
- EL-4 5,1 x 10&supmin;&sup4; µg/ml
- Physiologische Kochsalzlösung von WF 2015 A oder B (100 mg/kg) wurde an 5 Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 5 Wochen alt) einmal am Tag für fünf Tage verabreicht. Die Ergebnisse zeigen, daß kein abnormales Symptom bei den Mäusen beobachtet wurde.
- Die MLR-Tests wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt, wobei jede Vertiefung eine spezielle Konzentration von WF 2015 A und 5 x 10&sup5; C57BL/6- Responderzellen (H-2b), 5 x 10&sup5; mit Mitomycin C behandelte (25 µg/ml Mitomycin C bei 37ºC für 30 Minuten) Balb/C-Stimulatorzellen (H-2d) in 0,2 ml RPMI 1640- Medium enthielt, ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 3 x 10&supmin;&sup5;M 2- Mercaptoethanol, 24 mM Natriumhydrogencarbonat, Penicillin (50 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 µg/ml). Die Zellen wurden bei 37ºC in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO&sub2;:95 % Luft für 68 Stunden inkubiert und mit ³H-Thymidin (0,5 µCi) gepulst vier Stunden bevor die Zellen gesammelt wurden. Die Radioaktivität der Zellen wurden mittels B-Zähler gemessen. Aus den erhaltenen Daten wurde die MLR-Suppression (%) berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Konzentration von WF 2015A (ng/ml) MLR-Suppression (%)
- Menschliches MX-1-Brustgewebe (jedes Fragment 3 x 3 x 3 mm), das s.c. durch serielle Passage in weiblichen Balb-c nu/nu-Mäusen (6 Wochen alt), gehalten wurde, wurde s.c. weiblichen Balb-c- nu/nu-Mäusen am Tage 0 implantiert, und WF 2015 A oder ein Vehikel wurden i.v. den Mäusen einmal am Tag an den bestimmten Tagen (Tag 0 T 4, Tag 7 T 11 und Tag 14 T 18) gegeben.
- Das Tumorgewicht wurde wie folgt berechnet: (Tumorlänge und -breite wurde mit Taster gemessen.)
- Tumorgewicht (mg) = ½ x a x b², worin a die Länge und b die Breite (mm) darstellen).
- Die Tumorgewichte (anfänglich) und (letztes) wurden am ersten Injektionstag (unmittelbar vor der Dosierung) und am Tag 21 (am letzten Evaluierungstag) entsprechend berechnet.
- Für jede Testgruppe wurden acht Mäuse verwendet und eine entsprechende Vehikel-behandelte Kontrollgruppe.
- Die Arzneimittelwirksamkeit wurde als Tumorwachstumsinhibierung (%) ausgedrückt.
- Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Dosierung von WF 2015 A (mg/kg) Tumorwachstumsinhibierung (%) (Kontrolle)
- WF 2015 A und/oder B der vorliegenden Erfindung im Gemisch mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern können oral oder parenteral verabreicht werden als immunsuppressives oder Antitumormittel für Säuger, einschließlich des Menschen, in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie Kapseln, Tabletten, Granulate, Pulver, bukkale Tabletten, sublinguale Tabletten und Lösungen.
- Zu pharmazeutisch annehmbaren Trägern können gehören verschiedene organische oder anorganische Trägermaterialien, die üblicherweise für pharmazeutische Zwecke verwendet werden, so als Exzipient (z.B. Saccharose, Stärke, Mannit, Sorbit, Lactose, Glucose, Cellulose, Talkum, Calciumphosphat, Calciumcarbonat usw.), Bindemittel (Cellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Polypropylpyrolidon, Gelatine, Gummi arabicum, Polyethylenglycol, Saccharose, Stärke usw.), Verteilungsmittel (z.B. Stärke, Carboxymethylcellulose, das Calciumsalz der Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylstärke, Natriumglycolstärke, Natriumhydrogencarbonat, Calciumphosphat, Calciumcitrat usw.), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Aerosil, Talkum, Natriumlaurylsulfat usw.), Geschmacksmittel (z.B. Zitronensäure, Menthol, Glycin, Orangepulver usw.), Schutzmittel (Natriumbenzoat, Natriumbisulfit, Methylparaben, Propylparaben usw.), Stabilisierungsmittel (Zitronensäure, Natriumcitrat, Essigsäure usw.), Suspendierungsmittel (z.B. Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Aluminiumstearat usw.), Dispergiermittel (z.B. oberflächenaktive Mittel usw.), wäßrige Verdünnungsmittel (z.B. Wasser), Öle (z.B. Sesamöl usw.), Grundwachs (z.B. Kakaobutter, Polyethylenglycol, weiße Rohvaseline usw.).
- Eine Dosierung der Zielverbindungen wird variiert in Abhängigkeit verschiedener Faktoren, wie Art der Krankheit, Gewicht und/oder Alter eines Patienten und weiterhin durch die Art des Verabreichungsweges.
- Die bevorzugte Dosierung von WF 2015 A oder B wird üblicherweise aus einem Dosierungsbereich von 0,01 bis 10 mg/kg/Tag im Falle der Injektion ausgewählt und von 0,5 bis 50 mg/kg/Tag im Falle der oralen Verabreichung.
- Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
- Ein wäßriges Medium (160 m), das 2% lösliche Stärke, 1% Maisstärke, 1% Glucose, 1% Baumwollsamenmehl, 1% Trockenhefe, 0,5% Maiseinweichflüssigkeit und Calciumcarbonat (pH 6,0) enthielt, wurde in jeden von 19 Erlenmeyerkolben von 500 ml gegossen und bei 120ºC für zwanzig Minuten sterilisiert. Eine mit Schleifen belegte Schrägkultur von Scolecobasidium arenarium F-2015 wurde in jedes der Medien geimpft und kultiviert unter Schütteln bei 25ºC für drei Tage. Die erhaltene Kultur wurde in ein wäßriges Medium (120 l) geimpft, das 3% lösliche Stärke, 1% Glucose, 1% Weizenkeime, 0,5% Baumwollsamenmehl und Calciumcarbonat in einem 200 l Gefäßfermenter enthielt, der bei 120º für zwanzig Minuten vorher sterilisiert worden war, und wurde bei 25ºC für drei Tage kultiviert.
- Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wurde mit Hilfe von Diatomeen- Erde (20 kg) filtriert. Das Filtrat (95 l) wurde mit Ethylacetat (95 l) extrahiert. Dieses Extraktionsverfahren wurde zweimal durchgeführt, und die Extrakte wurden miteinander vereinigt. Nach der Dehydratisierung mit wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Ethylacetatschicht im Vakuum aufkonzentriert.
- Das Konzentrat wurde auf eine Silicagel-Chromatografiesäule (1 l) gegeben. Die Säule wurde mit n-Hexan (3 l) gewaschen und mit einem Gemisch n-Hexan- Ethylacetat (1 : 1; 3 l). Die aktive Fraktion wurde mit Ethylacetat (4 l) eluiert und anschließend im Vakuum aufkonzentriert. Das Eluat wurde weiterhin auf eine Silicagelsäule (400 ml) gegeben. Nach dem Waschen mit Chloroform (1,2 l) und einem Gemisch von Chloroform-Methanol (100 : 1; 1,2 l) wurde die Säule mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol (75 : 1, 50 : 1 und 25 : 1) schrittweise eluiert. Die aktive Fraktion wurde im Vakuum aufkonzentriert, und der Rückstand wurde einer ODS (YMC)-Säulenchromatografie unterworfen. Nach dem Waschen mit einem Gemisch aus Methanol-Wasser (1 : 1, 300 ml) wurde die Säule mit einem Gemisch aus Methanol-Wasser (3 : 2 und 7 : 3, 300 ml jeweils) stufenweise entwickelt. Die aktive Fraktion wurde bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft, um gereinigtes farbloses öliges WF 2015 A (92 mg) zu erhalten.
- Ein mit Schleifen belegte Schrägkultur von Scolecobasidium arenarium F- 2015 wurde in jedes der sterilen Keimmedien (160 ml) inokuliert, das 2% lösliche Stärke, 1% Maisstärke, 1% Glucose, 1% Baumwollsamenmehl, 1% Trockenhefe, 0,5% Pepton, 0,5% Maiseinweichflüssigkeit, 3% NaCl und 0,2% CaCO&sub3; (pH 6,0) enthielt, in jeweils 20 Erlenmeyerkolben von 500 ml gegossen und bei 25ºC für 72 Stunden bei 250 U/Min unter Verwendung eines Rotationsschüttlers kultiviert.
- Die erhaltene Keim-Kulturbrühe wurde in 160 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem 200-Liter Fermenter aus rostfreiem Stahl übertragen, der mit 200 U/Min bei 25ºC für 48 Stunden gerührt wurde. Weiterhin wurden 90 Liter der so erhaltenen Keim-Kultur in 3000 Liter des Produktionsmediums inokuliert, das 3% lösliche Stärke, 1% Glucose, 0,5% Baumwollsamenmehl, 1% Weizenkeime, 3% NaCl und 0,2% CaCO&sub3; in einem 4000 Liter Stahlfermenter enthielt. Die Kultur wurde bei 25ºC für 72 Stunden hinter Belüftung von 3000 Liter/Minute und Rühren bei 130 U/Min durchgeführt.
- Die Kulturbrühe (2850 Liter) wurde mit Hilfe von 65 kg Diatomeen-Erde filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Säule aus Aktivkohle (600 Liter) gegeben. Die Säule wurde mit 180 Liter deionisiertem Wasser gewaschen und eluiert mit 80% wäßrigem Aceton (180 Liter). Das Eluat wurde im Vakuum auf ein Volumen von 15 Litern aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde mit 18 Litern Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und bis zur Trockne verdampft, um zu einem Pulver zu gelangen (61,3 g). Das rohe Pulver wurde mit 0,3 l Silicagel vermischt. Das Gemisch wurde einer Säulenchromatografie unter Verwendung von Silicagel (3 l) unterzogen. Nach Entwicklung der Säule mit 10 Litern Hexan und anschließend 10 Litern Hexan-Ethylacetat (1 : 1) wurde die Säule mit 10 Litern Ethylacetat eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und bis zur Trockne eingedampft, um ein Pulver zu ergeben. Das Pulver wurde mit Silicagel vermischt. Das Gemisch wurde einer Säulenchromatografie unter Verwendung von Silicagel (1 l) unterzogen. Die Säule wurde mit 3 Litern Chloroform entwickelt und anschließend mit 2 Litern Chloroform-Methanol (100 : 1) und mit 3 Litern Chloroform-Methanol (75 : 1) eluiert. Das Eluat wurde bis zur Trockne verdampft, um zu einem Pulver zu gelangen (16,4 g), und das Pulver wurde mit 30 ml eines Umkehrphasen-Silicagel-ODS vermischt. Das Gemisch wurde auf eine ODS-Säule gegeben und mit 2,4 Litern Methanol-Wasser (1 : 1) entwikkelt. Die Säule wurde eluiert mit Methanol-Wasser (3 : 2 ). Aktive Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um zu WF 2015 B (305 mg) zu gelangen.
Claims (5)
1. Verbindungen WF 2015 A und B, erhältlich durch Scolecobasidium arenarium
F-2015 (FERM BP-1520) und mit den folgenden Eigenschaften:
(1) für WF 2015 A:
a) Molekulargewicht:
410 [FAB-MS : m/z 411 (M+H)]
b) Elementaranalyse:
C 64,55; H 8,06; O 27,39 (durch Differenz)
c) Optische Drehung:
[α]²³D = -52º (C = 1,0, CH&sub3;OH)
d) UV-Absorptionsspektrum:
Endabsorption (in CHCl&sub3;)
e) IR-Absorptionsspektrum
νCHCl&sub3; max : 3450, 2960, 2920, 1710, 1650,
1440, 1370, 1300, 1260, 1200,
1170, 1120, 1100, 1070, 1050,
1000, 980, 920, 880, 830 cm&supmin;¹.
f) ¹H NMR Absorptionsspektrum : (CDCl&sub3;)
δ: 6.95 (1H, dd, J=15.5 und 4.5Hz),
6.20 (1H, dd, J=15.5 und 2Hz),
5.70 (1H, breit s),
5.20 (1H, breit t, J=7Hz),
4.31 (1H, m),
3.90 (1H, m),
3.68 (1H, dd, J=11 und 3Hz),
3.44 (3H, s),
2.98 (1H, d, J=4.2Hz),
2.62 (1H, dd, J=6.5 und 6Hz),
2.56 (1H, d, J=4.2Hz),
2.36 (1H, m),
2.16 (1H, m),
2.10 (1H, m),
2.00 (1H, m),
1.98 (1H, d, J=11Hz)
1.87 (1H, m),
1.74 (3H, d, J=1Hz),
1.66 (3H, d, J=1Hz),
1.21 (3H, s),
1.14 (3H, d, J=6.5Hz),
1.07 (1H, m)
g) ¹³C NMR Absorptionsspektrum : (CDCl&sub3;)
δ : 165.8 (s),
146.6 (d),
135.0 (s),,
121.8 (d),
118.3 (d),
79.4 (d),
74.5 (d),
69.9 (d),
66.3 (d),
61.1 (d),
59.4 (s),
58.9 (s),
56.7 (q),
50.7 (t),
48.2 (d),
29.2 (t),
27.2 (t),
25.6 (q),
25.6 (t),
17.9 (q),
17.1 (q),
13.7 (q).
h) Löslichkeit:
löslich: Chloroform, Methanol, Aceton, Ethanol
unlöslich: n-Hexan, Wasser
i) Farbreaktion:
positiv: Reaktion mit Iod-Dampf
negativ: Ninhydrin-Reaktion, Molish-Reaktion, Eisen(III)chlorid-Reaktion
j) Eigenschaft der Substanz:
neutrale Substanz
2) für WF 2015 B:
a) Molekulargewicht:
447 [FAB-MS: m/z 469 (M+Na)]
b) Elementaranalyse:
C 58,03; H 7,94; Cl 7,31; O 26,72 (durch Differenz)
c) Optische Drehung:
[α]²³D = -248º (C = 2,0, CHCl&sub3;)
d) UV-Absorptionsspektrum:
Endabsorption (in CHCl&sub3;)
e) IR-Absorptionsspektrum:
νCHCl&sub3; max = 3570, 3400, 2960, 2940, 2870, 2820,
1710, 1660, 1560, 1460, 1440, 1400,
1380, 1360, 1340, 1300, 1270, 1220,
1170, 1120, 1080, 1020, 980, 960,
940, 910 cm&supmin;¹
f) ¹H NMR (400MHz, CDCl&sub3;)
δ : 6.99 (1H, dd, J=5 und 15.5Hz),
6.20 (1H, dd, J=2 und 15.5Hz),
5.55 (1H, m),
5.18 (1H, m),
4.36 (1H, m),
3.98 (1H, dq, J=4 und 6Hz),
3.87 (1H, d, J=11Hz),
3.49 (1H, d, J=11Hz),
3.31 (1H, m),
3.30 (3H, s),
2.97 (1H, t, J=6.5Hz),
2.50-2.40 (2H, m),
2.17 (1H, m),
2.05 (1H, m),
1.90-1.75 (2H, m),
1.73 (3H, s),
1.66 (3H, s),
1.49 (3H, s),
1.40 (1H, breit d, J=14Hz),
1.20 (3H, d, J=6Hz)
g) ¹³C NMR (100MHz, CDCl&sub3;)
δ = 165.7 (s)
146.3 (d)
134.8 (s),
122.4 (d),
118.2 (d),
78.7 (d),
76.2 (s),
74.5 (d),
70.0 (d),
66.1 (d),
64.0 (s),
62.3 (d),
56.7 (d),
50.5 (t),
43.3 (d),
29.1 (t),
27.5 (t),
25.8 (q),
23.5 (t),
22.2 (q),
17.9 (q),
17.6 (q).
h) Löslichkeit:
löslich: Chloroform, Methanol, Aceton, Ethanol
unlöslich: n-Hexan, Wasser
i) Farbreaktion:
positiv: Reaktion mit Iod-Dampf
negativ: Ninhydrin-Reaktion, Molish-Reaktion, Eisen(III)chlorid-Reaktion
j) Eigenschaft der Substanz:
neutrale Substanz
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen WF 2015 A und B nach Anspruch
1, gekennzeichnet durch Kultivieren eines WF 2015 A und/oder B-produzierenden
Stammes, der zur Gattung Scolecobasidium gehört, in einem Nährmedium und
Gewinnung von WF 2015 A und B aus der erhhaltenen Kulturbrühe.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als einen wirksamen Bestandteil
WF 2015 A oder B von Anspruch 1 und pharmazeutisch annehmbaren Träger.
4. WF 2015 A oder B nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Antitumor-Mittel.
5. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Scolecobasidium arenarium F-2015
(FERM BP-1520).
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