DE1695498C3

DE1695498C3 - Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus N-Acylaminocarbonsäuren

Info

Publication number: DE1695498C3
Application number: DE1967M0075855
Authority: DE
Inventors: Jean Valentin Paris Morelle
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1966-10-13
Filing date: 1967-10-12
Publication date: 1980-07-31
Also published as: BE704363A; FR1518665A; DE1695498A1; DE1695498B2; JPS5113121B1; NL6713780A; NL132126C; GB1153408A

Description

In den FR-PS 14 31698 und 14 27 125 werden bestimmte N-Acylaminocarbonsäuren, wie die Palmitoylkollagensäure. als Kosmetika beschrieben.

Es wurde nunmehr gefunden, daß bestimmte N-Acylierungsprodukte von Gemischen von Hydrolysaten von Kollagen. Keratin oder Casein, deren Aminocarbonsäure-Zusammensetzung weitgehend den in den Ausgangsproleinen vorliegenden Aminocarbonsäure-Sequenzen entspricht, eine günstige therapeutische Wirkung ergeben. Acylierungsprodukle der bei üblichen Hydrolyseverfahren anfallenden Protein-Nebenprodukte ergeben diese therapeutische Wirkung nicht.

Nun wird aber in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie. 1958, Bd. XI/2, Seite 298, beschrieben, daß bei der chemischen Hydrolyse von Proteinen nicht sämtliche Aminosäuren erhalten bleiben. In Advances in Protein Chemistry, 1965, Bd. 4, Seite 40 wird versucht, eine milde Hydrolyse mit Salzsäure bei 40⁰C durchzuführen, wobei man jedoch Dipeptide erhält.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus N-Acylaminocarbonsäuren, deren Aminocarbonsäure-Zusammensetzung weitgehend den in den Proteinen Kollagen, Keratin oder Casein vorliegenden Aminocarbonsäure-Sequenzen entspricht, durch saure Hydrolyse dieser Proteine und Acylierung der Hydrolyseprodukte mit Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder ölsäure und einem Chlorameisensäureester, oder mit einem Überschuß an einem gemischten Anhydrid aus Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Ölsäure und einem Chlorameisensäureester, oder an Laurinsäurechlorid, Palmitinsäurechlorid, Stearinsäurechlorid bzw. Ölsäurechlorid in alkalischem Milieu bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch beschriebene Verfahren gelöst, das den Gegenstand der Erfindung darstellt
In den erfindungsgemäß hergestellten N-Acylaminocarbonsäure-Gemischen sind sämtliche basische Funktionen durch die Acylreste blockiert, wodurch die Carboxylgruppen der Aminosäuren in Freiheit gesetzt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Gemische sind

ίο wasserunlöslich, jedoch fettlöslich. Sie eignen sich zur therapeutischen, dermatologischen und kosmetischen Anwendung, da sie fettlösiich sind und ferner eine den Lipoproteiden der Haut sehr ähnliche Struktur aufweisen, so daß sie die Fähigkeit besitzen, sehr leicht durch das Hautgewebe hindurchzudringen und dabei gleichzeitig die Stoffe zu liefern, die für die Regenerierung der Haut notwendig sind, nämlich die verschiedenen Aminosäuren in Form bestimmter N-Acylierungsprodukte, die bei der Biogenese der Proteine eine wichtige Rolle spielen. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäß hergestellten Gemische bei Dermatosen eine Cortisonpräparaten überlegene Wirkung aufweisen, bei Wunden beispielsweise eine Randkontraktion verhindern und in der klinischen Anwendung den in der FR-PS 14 31 698 beschriebenen kosmetischen Salben auf der Basis von Palmitoylkollagensäure überlegen sind. Sie eignen sich daher vorteilhaft als Substitutionspräparate für Cortisonsalben.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-

JO fahrens kann man beispielsweise wie folgt vorgehen:

A + B) Herstellung des von Peptiden befreiten
Hydrolysats

Man hydrolysiert das jeweilige Protein bei 95 bis Ji 105°C für einen Zeitraum von 10 bis 40 Stunden mit 6N bis 8N Salzsäure.

Dann wird das Reaktionsgemisch, z. B. mit Aktivkohle, entfärbt und anschließend filtriert, um das Entfärbungsmittel und verschiedene organische Rücken stände zu entfernen. So erhält man eine klare, blaßgelbe Lösung, die Aminosäuren und ein kurzkettiges Peptid (mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen) enthält.

Diese Lösung wird auf ein Mehrfaches verdünnt und dann durch ein Ionenaustauschharz geleitet.
4) Das Ionenaustauschharz wird mit einer normalen ammoniakalischen Lösung eluiert, wobei man eine von Peptiden befreite I- bis 20%ige Aminosäurelösung mit einem pH-Wert zwischen 8 und 11 auffängt, während die Peptide an dem Harz adsorbiert bleuen.
V) Die Menge des zu verwendenden Acylierungsmittels wiit! durch Bestimmung des Arninostickstoffs nach der Methode von Sö;'ensen ermittelt.

C) Acylierung des Hydrolysats

v> Hierfür werden nachstehend zwei Methoden beschrieben:

a) Acylierung mit einem Säurechlorid

Je nach der Menge der in der Flüssigkeit enthaltenen

wi Aminosäuren setzt man langsam unter Rühren bei 20 bis 60°C das Säurechlorid in der 1,4- bis l,8fachen stöchiometrischen Menge zu, wobei man durch Zusatz von Natronlauge den pH-Wert oberhalb 9 hält. Nach beendetem Zusatz — d. h. nach etwa 30 Minuten —

h> rührt man noch 30 bis 60 Minuten bei der gleichen Temperatur. Diese Reaktion führt zur Blockierung der NH2-Gruppen, der alkoholischen und phenolischen OH-Gruppen und der Imidazol-NH-Gruppen.

Diese Acylierungsreaktion verläuft nach der folgenden Gleichung:

R'
NH₂-CH-COOH + RCOCl

R'

> R—CO—NH-CH-COOH + HCl

Um aber die Reaktion im Sinne des Pfeiles verlaufen zu lassen, muß die Salzsäure in dem gleichen Ausmaße, wie sie sich bildet, neutralisiert werden. Dies ist der Grund für den gleichzeitigen Zusatz der Natronlauge; dieser Zusatz führt jedoch zu der folgenden Nebenreaktion:

RCOCI + 2 NaOH - RCOONa + NaCI + H₂O

die einen Teil des Säurechlorides RCOCl verbraucht. Daher ist im Endeffekt ein Überschuß an Säurechlorid erforderlich, um dieser Nebenreaktion Rechnung zu tragen, und außerdem, um das Gleichgewicht der normalen Acylierungsreaktion nach rechts zu verschieben.

Um das Acylatgemisch der allgemeinen Formel

R'

R-CO -NH-CH-COOH

in Freiheit zu setzen, wird das Reaktionsprodukt mit Salzsäure angesäuert, worauf sich das wasserunlösliche Acylat als obere Schicht ansammelt.

Das Gemisch wird dekantiert und die obere Schicht, die das Acylat sowie die beim Ansäuern in Freiheit gesetzte Fettsäure RCOOH enthält, mehrmals zunächst mit Wasser gewaschen und dann mit Benzol behandelt, welches den größten Teil der Fettsäure j_n Lösung bringt. An Stelle des Benzols kann man auch andere Lösungsmittel, wie z, B, Methanol, verwenden.

Das Produkt wird dann im Vakuum bei 50⁰C mit Wasserdampf destilliert, wobei man ein Destillat auffängt, das maximal 20% (im allgemeinen etwa 5 bis 10%) Wasser enthält

b) Acylierung mittels der freien Fettsäure und
Chlorameisensäureäthylester

Das Hydrolysat wird mit so viel konzentrierter Natronlauge versetzt, daß es an Natronlauge 2normal wird, und auf - 5° C bis -10° C gekühlt

Andererseits stellt man eine Lösung der stöchiometrischen Menge der betreffenden Fettsäure in dem lOfachen Volumen Tetrahydrofuran her und setzt je Raumteil Fettsäure 0,5 Raumteile Chlorameisensäureäthylester und 0,7 Raumteile Triethylamin zu.

Die letztgenannte Lösung wird ebenfalls auf —5° C bis —ιO⁰C gekühlt und langsam unter Rühren in das Hydrolysat gegossen, wobei man das Gemisch kühlt, um einen Temperaturanstieg zu vermeiden. Die Gewinnung des Acylatgemisches erfolgt, wie oben beschrieben.

Man kann das Produkt dehydratisieren, indem man es mehrere Minuten auf 1OO°C hält. Hierbei erhält man einen Stoff mit einem scharfen Schmelzpunkt, der von dem Schmelzpunkt des Rohproduktes abweicht. Bei dieser Trocknung muß man sich jedoch vergewissern,

jo daß die Substanzen sich nicht zu zersetzen beginnen; denn es handelt sich ja schließlich um biologische Produkte, die ihrer Struktur zufolge eine gewisse Menge sogenanntes »gebundenes« Wasser zurückhalten müssen, das für ihre Beständigkeit unentbehrlich ist.

Jj Nachstehend werden Beispiele für Schmelzpunkte einiger N-Acylaminocarbonsäuren angegeben, die aus den durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Gemischen isoliert wurden.

N-Acylaminocarbonsäure

Palmitoylcaseinsäure

Palmitoylkollagensäure

Palmitoylkeratinsäure

Lauroylkollagensäure

Lauroylkeratinsäure

Stearoylkollagensäure

Stearoyl kerati nsäu re

Oleoylkollagensäurc

Schmelzpunkt des	Schmelzpunkt des
trockenen Produkts	Rohproduktes
C	C
46 bis 49
69 bis 71	50 bis 52
47 bis 49	48 bis 50
	20 bis 22
	22 bis 24
	52 bis 54
	54 bis 56
	5 bis IO

Claims

Patentanspruch;

Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus N-Acylaminocarbonsäuren, deren Aminocarbonsäure-Zusammensetzung weitgehend den in den Proteinen Kollagen, Keratin oder Casein vorliegenden Aminocarbonsäure-Sequenzen entspricht, durch saure Hydrolyse dieser Proteine und Acylierung der Hydrolyseprodukte mit Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder ölsäure und einem Chlorameisensäureester, oder mit einem Oberschuß an einem gemischten Anhydrid aus Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder ölsäure und einem Chlorameisensäureester, oder an Laurinsäurechlorid, Palmitinsäurechlorid, Stearinsäurechlorid bzw. ölsäurechlorid in alkalischem Milieu, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die Hydrolyse von Kollagen, Keratin oder Casein mit 6N bis 8N Salzsäure bei 95 bis !05⁰C während 10 bis 40 Stunden durchführt,

B) aus den /lach der Hydrolyse vorliegenden Gemischen von Aminocarbonsäuren und Peptiden die Peptide an Ionenaustauschern in an sich bekannter Weise abtrennt,

C) das jeweilige Aminocarbonsäuregemisch in an sich bekannter Weise acyliert, anschließend ansäuert, die obere Schicht abdekantiert und mehrmals mit Wasser wäscht und daraus die Fettsäuren mit einem Lösungsmittel extrahiert.