DE69801867T2

DE69801867T2 - Verfahren zur Herstellung von N-Acylaminosäuren

Info

Publication number: DE69801867T2
Application number: DE69801867T
Authority: DE
Inventors: Jacques Artaud; Jean Luc Clamou; Laurent Dencausse; Georges Lacroix
Original assignee: ASEPTA MONACO LAB
Current assignee: ASEPTA MONACO LAB
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2018-05-21
Also published as: MC2440A1; EP0882702B1; ES2165138T3; DE69801867D1; EP0882702A1; FR2763942B1; FR2763942A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung eines Herstellungsverfahrens für N-Acylaminosäuren ausgehend von Proteinen, die durch Hydrolyse in Aminosäuren transformiert werden, die anschließend alkyliert werden.
Die Acylaminosäuren, insbesondere die Lipoaminosäuren, die durch Alkylierung einer Fettkette auf Aminosäuren oder kurzen Peptiden durch Hydrolyse von Tier- oder Pflanzenproteinen hergestellt werden, waren bereits Gegenstand zahlreicher Arbeiten.
Das Dokument FR-A-2.503.144 schlägt neue Derivate von Aminosäuren vor, die durch Alkylierung ihrer alkylierbaren Funktionen mit der Butyryl-Kette erhalten werden und Butyryl-Aminosäuren ergeben. Die Aminosäuren, die zur Herstellung der Butyrylaminosäuren verwendet werden, können einzeln verwendet oder aus Gesamt- Hydrolysaten beliebiger Proteine gewonnen werden. Die Erfindung erstreckt sich auch auf Produkte, die durch Salzbildung von Carboxylfunktionen dieser Butytylaminosäuren hergestellt wurden, wobei von mineralischen, organischen oder biologischen Grundsubstanzen oder Metallen der Spurenelement-Gruppe ausgegangen wird.
Gegenstand des Dokuments FR-A-2.503.151 sind neue Derivate schwefelhaltiger Aminosäuren, die durch Alkylierung der Amino-Funktion durch eine Butytyl-Kette hergestellt werden; wobei die Carboxylgruppe der aktivierten Aminosäure in freier Form oder durch mineralische, organische oder biologische Grundsubstanzen oder Metalle der Spurenelement-Gruppe als Salz vorliegen kann.
Das Dokument FR-A-2.676.741 betrifft die Herstellung neuer Lipopolyaminosäuren und Lipopeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Aminosäuren oder kurzen Peptide, die durch Hydrolyse von Pflanzenproteinen entstanden sind, an Fettketten mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen alkyliert wurden. Die auf chemischem oder enzymatischem Wege hydrolysierten Pflanzenproteine sind Unterprodukte der Pflanzenölindustrie und werden vorwiegend in Form von Pressrückständen, Konzentraten oder Isolaten verwendet, beispielsweise aus dem Soja-, Raps-, Erdnuss-, Sonnenblumen oder Lupinienanbau. Die unter Verwendung von Pflanzenprotein-Hydrolysaten gewonnenen Acylate führen zu Strukturen, deren Carboxylfunktionen frei sind oder durch alkalische Substanzen als Salz, um Detergenzien herzustellen, oder auch durch Metalle gebunden werden können.
Das Dokument FR-A-2.698.869 beschreibt die Herstellung von Akylaminosäuren die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch Akylierung eines Gesamt-Hydrolats der von BOMBYX MORI sekretierten Polypetid-Ketten entstanden. Die so erhaltenen Acylaminosäuren besitzen Ketten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, die entweder mit Glycin, Alanin und Serin alkyliert sind, die 90% der insgesamt in Seidenfasern vorhandenen Aminosäuren ausmachen.
Die beschriebenen Synthesen finden in wässerigem Milieu statt. Beteiligt sind ein Tier- oder Pflanzenprotein-Hydrolysat, dem ein akylierendes Mittel (Säurechlorid, Säureanhydrid usw.) zugesetzt wird. Der pH-Wert wird durch Zusatz einer wässerigen alkalischen Lösung (Natronlauge, Pottasche...) auf 10 bis 11 eingestellt.
Die chromatographische Analyse in flüssiger Phase (Trennsäule: Quarz 100 RP 18, mobile Phase: Methanol/Wasser, 92/8, vlv) der Mischungen nach der Alkylierung zeigt, dass:
- die Zusammensetzung der erhaltenen N-Acylaminosäuren nicht der ursprünglichen Zusammensetzung der Protein-Aminosäuren entspricht und
- dass das hydrolysierte Alkylierungsmittel in großer Menge vorhanden ist.
Die Ausbeute bei der Reaktion liegt unter 50% und die relativen Anteile der einzelnen N-Acylaminosäuren entsprechen nicht den Gehalten der ursprünglich vorhandenen Protein-Aminosäuren.
Diese Unterschiede hängen von der Art der in den Ausgangs-Proteinen vorhandenen Aminosäuren ab.
Im übrigen haben Versuche gezeigt, dass die Reaktivität der Aminosäuren gegenüber dem Alkylierungs-Mittel starke Unterschiede aufweist. Die Reaktivität der Aminofunktion gegenüber der Carbonylgruppe des Alkyüerungsmittels hängt von dessen Nukleophilie ab und hält die Reihenfolge Glycin > Alanin > Serin ein.
Die gleiche Synthese wurde bei einem Hydrolysat von Seidenfibroin (Bombyx mori) angewandt, in dem die vier wichtigsten Aminosäuren mit folgenden mittleren Molmassenanteilen enhalten sind: Glycin 43%, Alanin 32%, Serin 15%, Tyrosin 12% (Chemistry and structure of silk, K. Komatsu, Jpn. Agric. Res. Q., (1979), Vol. 13, Nr. 1, 64-72). Die Ausbeute an N-Palmitoyl-Aminosäuren beträgt weniger als 50%. Die mittlere Zusammensetzung der N-Palmitoyl-Aminosäuren und Palmitinsäure wurde in flüssiger Phase im Chromatographen unter den oben angegebenen Bedingungen ermittelt: N-Palmitoyl-Glucin 30%, N-Palmitoyl-Alanin 10%, N-Palmitoyl-Serin + Tyrosin < 1% und Palmitinsäure 60%. Diese Ergebnisse zeigen, dass die N-Palmitoyl- Aminosäuren eine deutlich andere Zusammensetzung aufweisen, insbesondere die hydroxylierten Aminosäuren (Serin und Tyrosin, als die Aminosäuren im ursprünglichen Hydrolysat und dass sie zusammen mit einer großen Menge Palmitinsäure auftreten, was auf die Hydrolyse des Palmitoylchlorids zurückzuführen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von N-Acylaminosäuren auf Basis von Tier- oder Pflanzenprotein-Hydrolysaten, deren Zusammensetzungen der Aminosäuren der Ausgangs-Proteine entsprechen und die außerdem frei von Hydrolyseprodukten des alkylierenden Mittels sind.
Die Strategie dieser Synthese besteht darin, in wasserfreier Lösung zu arbeiten, um eine Hydrolyse des alkylierenden Reagenz auszuschließen und in organischen Lösungen lösliche Derivate von Aminosäuren (Ester) zu verwenden, um eine Kondensation des alkylierenden Mittels zu bewirken.
Zu diesem Zweck betrifft die Erfindung ein Herstellungsverfahren für N- Acylaminosäuren, die zu Aminosäuren hydrolysiert werden, das durch folgende Reaktionen gekennzeichnet ist:
1. Veresterung jeder Aminosäure in Gegenwart von Alkohol,
2. Acylierung des Esters in Gegenwart eines Säurehalogenids und
3. Verseifung des N-Acylaminosäure-Esters in Gegenwart einer Base zur Bildung der N-Acylaminosäure.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Herstellungsverfahren für N-Acylaminosäure- Ester auf Basis von Proteinen, die hydrolysiert werden und Aminosäure bilden, das durch folgende Reaktionen gekennzeichnet ist:
1. Veresterung jeder Aminosäure in Gegenwart von Alkohol und
2. Acylierung des Esters in Gegenwart eines Säurehalogenids.
In jedem Fall erfolgt die Alkylierung in einem wasserfreiem Milieu.
Bei einer N-Acylaminosäure-Synthese laufen folgende Reaktionen ab:
in denen R, R' und R" gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder nicht substituierte Alkyl- oder Arylradikale sind, B ein Alkali- oder Erdalkali-Ion und X ein Schwefel- oder Phosphat-Halogenanion ist.
Bei einem N-Acylaminosäure-Ester laufen folgende Reaktionen ab:
Die Veresterung erfolgt in alkoholischer Lösung mit 1,2 bis 1,8 Salzsäure- Äquivalenten oder anderem.
Die Acylierung erfolgt stöchiometrisch zwischen der Säurechlorid und der Aminfunktion jeder veresterten Aminosäure.
Die Acylierung findet in Gegenwart aller aprotischen Lösungsmittel statt, wie Dichlormethan oder Chloroform, Aminosäure-Estern und Säurechloriden und/oder in Gegenwart von zwei bis drei Äquivalenten von Triethylamin oder Pyridin oder einer organischen Base.
Die Acylierung findet bei einer Temperatur zwischen 0 und 5ºC unterständigem Rühren innerhalb von 1 bis 2 Stunden statt, dann wird die Reaktionsmischung bis zur Neutralität gewaschen, um die organische Base zu beseitigen.
Die organische Phase der Alkylierungs-Reaktion wird getrocknet und unter Vakuum verdampft.
Die Verseifung erfolgt in Gegenwart einer Base, zum Beispiel Natronlauge oder Pottasche, in einer Konzentration von 0,5 bis 4 M in wässeriger Lösung im Kolben mit Rückflusskühler innerhalb von 1 bis 2 Stunden.
Die Reaktionsmischung wird bei der Verseifung mit konzentrierter Salzsäure, 6 M, auf einen pH-Wert zwischen 2 und 3 eingestellt.
Nach der Verseifung wird der Niederschlag von N-Acylaminosäure ausgefiltert, gewaschen und getrocknet.
Die N-Acylaminosäuren sind Lipoaminosäuren.
Die N-Acylaminosäure-Ester sind Lipoaminosäure-Ester
Die Proteine bestehen aus Seidenfibroin (Bombyx mori)
in einer Abwandlung stammen die Proteine aus Rosshaar (Equus caballus) Die Synthese läuft in vier Schritten ab.

1. Hydrolyse der Proteine

Die Proteine werden innerhalb mehrerer Stunden durch konzentrierte Salzsäure (10 - 12 M) im Kolben mit Rückflusskühler hydrolysiert bis zum Erhalt einer negativen Biuretreaktion. Die Reaktionsmischung wird mit konzentrierter Natronlauge (ca. 10 M) neutralisiert (pH = 5 bis 7). Bei Färbung wird sie in der Wärme (75-80ºC) eine Stunde lang mit Aktivkohle behandelt.

2. Synthese der Aminosäure-Ester des Hydrolysats

Die neutralisierten und gebleichten Hydrolysate werden trocken verdampft. Das erhaltene Pulver ist eine Mischung aus Aminosäuren und Salz. Die Anzahl Mole der Aminosäuren wird durch Analyse des Amino-Stickstoffs nach Sörensen bestimmt. Diese Mischung wird in alkoholischer Lösung (Alkohol) mit 1,2 bis 1,8 Salzsäure- oder Thionyl-Äquivalenten, oder ganz allgemein mit allen Reagenzien (HX) behandelt, die geeignet sind, die Aminosäure-Ester gemäss der Reaktion 1 aufzubereiten:
Die Ausbeute dieser Reaktion liegt bei 96 bis 98%.

3. Synthese der veresterten N-Acylaminosäuren

Das Acylierungsmittel, das zum Beispiel aus Säurechloriden besteht, reagiert stöchiometrisch nach der Reaktion 2 mit den Aminfunktionen der veresterten Aminosäuren. Die Reaktion läuft in Dichlormethan oder Chloroform ab oder ganz allgemein in allen aprotischen (Lösungsmittel) Lösungsmitteln der Aminosäure-Ester und dem Acylierungsmittel in Gegenwart von 2 bis 3 Äquivalenten Triethylamin oder Pyridin oder einer organischen Base (Base), um die freigesetzte Säure zu neutralisieren.
R" ist eine Fettkette mit 3 bis 29 Kohlenstoffatomen.
Die Reaktion erfolgt bei einer Temperatur von 0 bis 5ºC. Die Mischung wird anschließend ein bis zwei Stunden bei dieser Temperatur gerührt und dann bis zur Neutralität gewaschen um die organische Base zu eliminieren. Die organische Phase wird getrocknet und dann unter Vakuum verdampft.
Die Ausbeute dieser Reaktion liegt bei 90 bis 95%.

4. Synthese der N-Acylaminosäuren

Die N-Acylaminosäure-Ester werden anschließend (Reaktion 3) durch Einwirkung einer Base (BOH), 0,5 bis 4 M, (Natronlauge, Pottasche usw.) in wässeriger Lösung unter einem Rückflusskühler innerhalb von ein bis zwei Stunden verseift.
Die Reaktionsmischung wird mit einer konzentrierter Salzsäure, ca. 6 M, auf pH 2 bis 3 eingestellt (Reaktion 4). Der Niederschlag der N-Acylaminosäuren wird ausgefiltert, gewaschen und getrocknet.
Die Ausbeute dieser Reaktion liegt bei 97 bis 99%.
Die chromatographische Analyse in flüssiger Phase (Trennsäule: Quarz 100 RP 18; mobile Phase: Methanol/Wasser, 92/8, v/v) der N-Acylaminosäuren in veresterter Form zeigt, dass:
- die Zusammensetzung der ursprünglichen Zusammensetzung der Protein-Aminosäuren entspricht
- kein hydrolysiertes Acylierungsmittel mehr vorhanden ist.
Beispiele für die Synthese erfindungsgemäßer N-Acylaminosäuren

Beispiel 1: Synthese von N-Palmitoyl-Aminosäuren aus Seidenfibroin

1. Aufbereitung des Seidenfibroins

Der Rohstoff besteht aus Abfällen von Seidenraupenkokons aus der Seidenindustrie. Diese Kokons werden zunächst sortiert, um eventuell vorhandene restliche Puppen auszusondern.
Die leeren Kokons (100 g) werden anschließend durch aufeinanderfolgendes Waschen in einer 10 prozentigen Natriumkarbonatlösung und Seifenwasser (10 g/l) degummiert. Die Lösungen werden in beiden Fällen eine Stunde lang gekocht. In den beiden aufeinanderfolgenden Waschungen wird das Serizin (Seidenleim), das das Fibroin umgibt und dem Kokon seine Struktur verleiht, entfernt. Auf diese Weise werden 65 g Fibroin erhalten.
Die Ausbeute dieser Behandlung liegt bei 65%.

2. Hydrolyse des Seidenfibroins

In einem 1 l-Doppelhalskolben werden 50 g Seidenfibroin und 400 ml konzentrierte Salzsäure (12 M) gegeben. Die Mischung wird im Kolben mit Rückflusskühler 4 Stunden lang (negative Biuretreaktion) erwärmt und dann mit Natronlauge, 12 M, auf pH 6-7 neutralisiert.
Die dunkelbraune Mischung wird anschließend in Gegenwart von Aktivkohle (8%, m/m) eine Stunde auf 75-80ºC erwärmt.
Das Hydrolysat wird durch Filterung bei reduziertem Druck über einen Millipore-Filter von der Aktivkohle und den Unreinheiten getrennt. Auf diese Weise wird die wässerige Lösung mit den Aminosäuren und dem Natriumchlorid aufgehellt (Farbe hellbeige).
Das Wasser wird bei 50ºC unter reduziertem Druck eliminiert. Das Hydrolysat wird im Vakuum getrocknet. Die erhaltene Masse beträgt 218 g. Diese Mischung enthält (Sörensen) 0,436 Mol Aminosäuren.

3 Veresterung des Hydrolysats

In einen 1 l-Doppelhalskolben werden die 218 g Hydrolysat und 400 ml Methanol gegeben. Tropfenweise werden unter Rühren 1,5 Äguivalente (0,65 Mol) Thionylchlorid (48 ml oder 78,5 g) mit Hilfe eines Tropftrichters zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 15 bis 20ºC gehalten. Wenn die gesamte Menge an Thionylchlorid zugegeben wurde, wird die Mischung noch eine Stunde lang unter dem Rückflusskühler gehalten. Die Mischung wird unter Vakuum abgefiltert und das Methanol verdampft. Die Mischung wird im Vakuum 12 Stunden lang getrocknet.
Die Aminosäure-Ester liegen in Form einer hellbraunen pastösen Masse vor. Es wird eine Masse von 57 g erhalten.
Die Ausbeute in bezug auf die Aminosäuren beträgt 96%.

4. Synthese der N-Palmitoyl-Aminosäure-Ester des Seidenfibroins

Die 57 g Aminosäure-Ester in Form von Chlorhydraten werden zusammen mit 500 ml Dichlormethan und 146 ml Triethylamin (2,5 Äquivalente/veresterte Aminosäuren) in einen 1 l-Doppelhalskolben gegeben.
Die Mischung wird auf 0 bis 5ºC abgekühlt und 114,5 ml (126,5 g) Palmitoylchlorid (0,9 Äquivalent/veresterte Aminosäuren), das in 30 ml Dichlormethan gelöst ist, hinzugefügt. Nach Zusatz des Palmitoylchlorids hat die Mischung ein milchiges Aussehen, sie wird eine Stunde gerührt und dann in einen Trenntrichter gefüllt. Die organische Phase wird 4 mal in 250 ml gesäuertem Wasser gewaschen, um das überschüssige Triethylamin zu entfernen, und dann getrocknet auf wasserfreiem Magnesiumsulfat. Die getrocknet organische Phase wird anschliessend gefiltert und unter Vakuum verdampft. Man erhält 122,5 g veresterte N-Palmitoyl-Aminosäuren des Seidenfibroins (Tf = 69-70ºC) die eine hellbeige Farbe haben.
Die Ausbeute der Synthese liegt bei 86%.

5. Synthese der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Seidenfibroins

Die 122,5 g Methylester der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Seidenfibroins werden in einen 1 l-Kolben gegeben und 400 ml einer wässerigen Natronlauge, 1 M (1,2 Äquivalente oder 0,4 Mol) hinzugefügt. Die Mischung wird eine Stunde unter einem Rückflusskühler erwärmt. Die klare, wässerige Lösung, welche die Natriumsalze der N-Palmitoyl-Aminosäuren enthält, wird in einen 2 l-Erlenmeyerkolben gegeben und mit einer Salzsäurelösung, 8 M, auf pH 1,5 eingestellt. Die Mischung wird mit einem mechanischen Rührwerk homogenisiert, dann werden 500 ml Eiswasser (0ºC) zugegeben, um das Absetzen der N-Palmitoyl-Aminosäuren zu fördern. Die N- Palmitoyl-Aminosäuren werden über eine Büchner-Nutsche gefiltert, mit Eiswasser gespült und unter Vakuum getrocknet. Es wird eine Masse von 104 g erhalten. Der Schmelzpunkt der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Seidenfibroins liegt bei 92 bis 98 ºC.
Die Ausbeute liegt bei 88%.
Die chromatographische Analyse in flüssiger Phase (Trennsäule: Quarz 100 RP 18, mobile Phase: Methanol/Wasser, 92/8, v/v) der N-Palmitoyl-Aminosäuren in veresterter Form zeigt, dass
- die ursprünglich Zusammensetzung der anfangs vorhandenen Protein- Aminosäuren erhalten blieb: 50% N-Palmitoyl-Glycin, 25% N-Palmitoyl-Alanin, 21% N-Palmitoyl-Serin + Tyrosin, 2% N-Palmitoyl-Valin, 2% N-Palmitoyl- Threonin und
- keine Palmitinsäure (hydrolysiertes Acylierungsmittel) vorhanden ist.

Beispiel 2: Synthese von N-Palmitoyl-Aminosäuren aus Rosshaar

1. Aufbereitung des Rosshaars

Als Rohstoff wird Rosshaar verwendet, das mit Hexan entfettet wird.
100 g Rosshaar werden mit Hexan in einem Soxhlet-Apparat in 6 Stunden extrahiert. Die Ausbeute beträgt 98%.

2. Hydrolyse des Rosshaars

Die 62 g Rosshaar werden in einen 1 l-Doppelhalskolben gegeben und 400 ml konzentrierte Salzsäure (12 M) hinzugegeben.
Die Mischung wird unter einem Rückflusskühler 4 Stunden lang erwärmt (negative Biuretreaktion) und dann mit Natronlauge (12M) auf pH 5 neutralisiert.
Die dunkelbraune Mischung wird anschließend in Gegenwart von Aktivkohle (8%, m/m) eine Stunde lang auf 75 bis 80ºC erwärmt.
Das Hydrolysat wird von Unreinheiten und der Aktivkohle durch Filterung über einen Millipore-Filter bei reduziertem Druck gereinigt. Das Wasser wird bei 50ºC unter reduziertem Druck entfernt. Das Hydrolysat wird unter Vakuum getrocknet. Es wird eine Masse von 221 g erhalten. Diese Mischung enthält (Sörensen) 0,335 Mol Aminosäuren.

3. Veresterung des Hydrolysats

Die 221 g Hydrolysat werden zusammen mit 400 ml Methanol in einen 1 l- Doppelhalskolben gegeben. Tropfenweise werden unter Rühren 1,5 Äquivalente (0,5 Mol) Thionylchlorid (36,7 ml oder 59,8 g) mit Hilfe eines Tropftrichters hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird auf 15 bis 20ºC gehalten. Wenn die gesamte Menge an Thionylchlorid zugegeben wurde, wird die Mischung noch eine Stunde lang unter dem Rückflusskühler gehalten. Die Mischung wird unter Vakuum gefiltert und das Methanol verdampft. Die Mischung wird unter Vakuum 12 Stunden lang getrocknet.
Die Aminosäure-Ester liegen in Form einer hellbraunen pastösen Masse vor. Die erhaltene Masse beträgt 85,4 g.

4. Synthese der N-Palmitol-Aminosäure-Ester des Rosshaars

Die 86,5 g in Form von Chlorhydraten vorliegenden Aminosäure-Ester werden in Gegenwart von 500 ml Dichlormethan und 112 ml Triethylamin (2,5 Äquivalente/veresterte Aminosäuren) in einen 1 l-Doppelhalskolben gegeben.
Die Mischung wird auf 0 bis 5ºC abgekühlt und mit 89,5 ml (81 g) Palmitoylchlorid (0,9 Äquivalente/veresterte Aminosäuren) versetzt, das in 30 ml Dichlormethan gelöst ist. Nach Zusatz des Palmitoylchlorids hat die Mischung ein milchiges Aussehen, sie wird eine Stunde gerührt und dann in einen Trenntrichter gefüllt. Die organische Phase wird 4 mal in 250 ml gesäuertem Wasser gewaschen, um das überschüssige Triethylamin zu entfernen, und dann getrocknet auf wasserfreiem Magnesiumsulfat. Die getrocknete organische Phase wird gefiltert und unter Vakuum verdampft. Man erhält 136 g veresterte N-Palmitoyl-Aminosäuren des Rosshaars (Tf = 44-45ºC), die eine hellbeige Farbe besitzen.
Die Ausbeute der Synthese liegt bei 86%.

5. Synthese der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Rosshaars

Die 136 g Methylester der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Rosshaars werden in einen 1 l-Kolben gegeben und 400 ml einer wässerigen Natronlauge, 1 M (1,2 Äquivalente oder 0,4 Mol) hinzugefügt. Die Mischung wird eine Stunde im Kolben mit Rückflusskühler erwärmt. Die klare, wässerige Lösung, welche die Natriumsalze der N-Palmitoyl-Aminosäuren enthält, wird in einen 2 l-Erlenmeyerkolben gegeben und mit einer Salzsäurelösung, 8 M, auf pH 1,5 eingestellt. Die Mischung wird mit einem mechanischen Rührwerk homogenisiert, dann werden 500 ml Eiswasser (0ºC) zugegeben, um das Absetzen der N-Palmitoyl-Aminosäuren zu fördern. Die N- Palmitoyl-Aminosäuren werden über eine Büchner-Nutsche gefiltert, mit Eiswasser gespült und unter Vakuum getrocknet. Es wird eine Masse von 112 g erhalten. Der Schmelzpunkt der N-Palmitoyl-Aminosäuren des Rosshaars liegt bei 60 bis 68ºC.
Die Ausbeute liegt bei 88%.
Die chromatographische Analyse in flüssiger Phase (Trennsäule: Quarz 100 RP 18, mobile Phase: (1) Methanol/Wasser, 9218, v/v; (2) Methanol zur Analyse des N- Palmitoyl-Cystein) führt zu nachfolgender Zusammensetzung der N-Palmitoyl- Aminosäuren in veresterter Form:
- 33% N-Palmitoyl-Glycin + Asparaginsäure + N-Palmitoyl-Glutaminsäure, 26% N-Palmitoyl-Serin + Tyrosin, 9% N-Palmitoyl-Leucin, 8% N-Palmitoyl-Cystein, 7% N-Palmitoyl-Alanin, 5% N-Palmitoyl-Threonin, 2% N-Palmitoyl-Valin.
Diese Zusammensetzung entspricht näherungsweise den mittleren Anteilen an Aminosäuren des Rosshaars (Studies on the amino acid compositions of the equine bodyhair and the hoof, T. Samata unt M. Matsuda Jpn. J. Vet. Sci., (1988), 50, 330- 340).
Es fehlt die Palmitinsäure (hydrolysiertes Alkylierungsmittel).
Die vorliegende Erfindung hat zum Zweck, Lipoaminosäure-Strukturen zu erzeugen, die in wasserfreien Medien bei einer Temperatur zwischen 0 und 5ºC hergestellt werden können, wobei eine Ausbeute an Lipoaminosäuren von mehr als 70% in bezug auf das Ausgangs-Protein erreicht wird.
Ein anderes wesentliches Merkmal im Vergleich zum Stand der Technik ist die Tatsache, dass das erhaltene Produkt keine freien Fettsäuren enthält.
Das interessanteste aller Basis-Proteine für diese Reaktionen ist das Keratin.
Daher ist das Seidenfibroin, das ein -Keratin ist und vier wichtige Aminosäuren enthält (Glycin, Analin, Serin, Tyrosin), von ganz besonderem Interesse.
Das gleiche gilt für Rosshaar, ein -Keratin, das rieben den obengenannten Aminosäuren auch Cystein und Cystirl enthält.
Das Keratin ist vor allem deshalb interessant, weil es einen großen Anteil hydroxylierter Aminosäuren enthält (Serin und Tyrosin), da die hydroxylierten N- Acylaminosäuren einen sehr positiven Einfluss auf die Hydratation der Haut haben.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von N-Acylaminosäuren, ausgehend von Proteinen, durch Hydrolyse dieser Proteinen, um Aminosäuren zu ergeben, Veresterung jeder Aminosäure in Anwesenheit von Alkohol, Acylation des Esters in Anwesenheit eines Säurehalogenids, und Verseifung der Ester-N-Acylaminosäure in Anwesenheit einer Base, um die N-Acylaminosäure zu ergeben, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylation in wasserfreiem Medium erfolgt.

2. Verfahren zur Herstellung von Ester-N-Acylaminosäuren, ausgehend von Proteinen, durch Hydrolyse dieser Proteinen, um Aminosäuren zu ergeben, Veresterung jeder Aminosäure in Anwesenheit von Alkohol, Acylation des Esters in Anwesenheit eines Säurehalogenids, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung in wasserfreiem Medium erfolgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen die folgenden sind:

wobei R, R' und R" gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder nicht substituierte Alkyl- oder Arylradikale sind, B ein alkalisches oder erdiges Kation, und X ein Halogen-, Sulfat- oder Phosphat-Anion ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen die folgenden sind:

5. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Veresterung in alkoholischem Medium mit 1,2 bis 1,8 äquivalenter Chlorwasserstoff- oder sonstiger Säure erfolgt.

6. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylation stöchiometrisch zwischen dem Säurechlorid und der Aminfunktion jeder veresterten Aminosäure erfolgt.

7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylation in Anwesenheit von jeglichem aprotischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder Chloroform, von Aminosäure-Estern und von Säurechloriden, und/oder in Anwesenheit von zwei bis drei Äquivalenten von Triäthylamin oder von Pyridin oder einer organischen Base abläuft.

8. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylation bei einer Temperatur zwischen 0 und 5ºC unter konstantem Rühren während 1 bis 2 Stunden erfolgt, dann die reaktionelle Mischung zu Neutralität gewaschen wird, um die organische Base zu eliminieren.

9. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Phase der Acylationsreaktion getrocknet und dann in Vacuum verdampft wird.

10. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verseifung in Anwesenheit einer Base, wie z. B. Soda oder Kaliumkarbonat, mit einer Konzentration zwischen 0,5 und 4 M in wasserigem Medium mit Rücklauf während 1 bis 2 Stunden erfolgt.

11. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 3 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktionelle Mischung bei der Verseifung mittels einer zu ca. 6 M konzentrierten Hydrochlorsäure-Lösung zu einem pH zwischen 2 und 3 sauer gemacht wird.

12. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 3, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Verseifung der Niederschlag von N-Acylaminosäure gefiltert, gewaschen und dann getrocknet wird.

13. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 3 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die N-Acylaminosäuren Lipoaminosäuren sind.

14. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ester-N-Acylaminosäuren Ester-Lipoaminosäuren sind.

15. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine aus natürlichen, tierischen oder pflanzlichen, Quellen gebildet werden.

16. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine von Seide-Fibroin (Bombyx mori) gebildet werden.

17. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine aus Roßhaar (Equus caballus) stammen.