DE2252157B2

DE2252157B2 - Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten

Info

Publication number: DE2252157B2
Application number: DE2252157A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl.-Chem. Dr. 6000 Frankfurt Geiger
Original assignee: Hoechst AG; Farbwerke Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1972-10-25
Filing date: 1972-10-25
Publication date: 1975-07-24
Also published as: JPS528835B2; CH602597A5; DE2252157A1; IL43474A0; SE7314471L; DE2252157C3; HU173215B; FR2204616A1; IL43474A; AU6171773A; GB1453454A; US3883496A; JPS4980090A; AT329780B; ATA901073A; CA1011734A; DD109214A5; FR2204616B1; BE806522A; NL7314433A

Description

—CH- W—CH

I I

NH₂ NH₂

steht und W die obengenannte Bedeutung besitzt, und aus dieser Verbindung die-CO-R'-CO-Brücke durch Edman-Abbau herausspaltet.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

3. Verbindungen der allgemeinen Formel III, in der R', X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

10

(D 15

20 Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur

in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe 25 Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Deri- und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit 1 bis vaten, das dadurch gekennzeichnet isCdaß man eine 4 C-Atomen, einen Phenyl-alkanoylrest mit 1 bis Verbindung der allgemeinen Formel I 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralkyl-oxycarbonylrest, wobei der Alkylteil 1 bis 4 C-Atome enthält, 30 einen Amino-acylrest, der sich von den natürlich vorkommenden α- oder /3-Aminosäuren oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoacylrest bedeutet und R einen Rest der allgemeinen Formel II 35

—CH-W—CH-

NH
Ac

NH

Ac

(H)

40

darstellt, in der Ac eine protonensolvolytisch abspaltbare N-Schutzgruppe ist und W für (CH₂J₂ 45 bis (CH₂)₄, CH₂-S-CH₂, CH₂-S-CH₂-CH₂ und für deren Sulfone steht, durch Abspaltung von Ac und X und Dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen Formel III

50

	O=C-	GIy	CO	' —	Lys	B-Kette
		SX SX I I
	A-Kette
	I I SX SX SX SX I I

—R

	in	1} '	O I	CO-	1	Lys	B-Kette	benee	nanr
	¹K				Y die 0	ite Bed

	GIy	3
		A-Kette
		I S 5 S «
O=C-	der

Y-
überführt

55 in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, einen Phenyl-alkanoylrest mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralkyl-oxycarbonylrest, wobei der Alkylteil 1 bis 4 C-Atome enthält, einen Amino-acylrest, der sich von den natürlich vorkommenden a- oder ß- Aminosäuren oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoacylrest bedeutet und R einen Rest der allgemeinen Formel II

(HI)

-CH-W—CH-

60 NH

Ac

NH

Ac

(ID

darstellt, in der Ac eine protonensolvolytisch abspaltbare N-Schutzgruppe ist und W Wr (CH₂)₂ bis (CH₂J₄. CH₂-S-CH₂, CH₂-S-CH₂-CH₂ und für deren Sulfone steht, durch Abspaltung von Ac und X

end Dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen Formel III

	η	S S I I	Lys	B-Kette
		A-Kette
	GIy

		I I S S S S I I
O=C-

Y-

I Uli)

'5

überführt, in der Y die obengenannte Bedeutung besitzt und R' für

—CH-W—CH

I i

NH₂ NH₂

steht und W die obengenannte Bedeutung besitzt, und aus dieser Verbindung die—CO — R' —CO-Brücke durch Edman-Abbau herausspaltet.

üegenstand der Erfindung sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formeln I und III, in denen R. R', X und Y die oben angegebent Bedeutung besitzen.

Die intramolekulare Vernetzung des Insulins über die beiden Aminogruppen Ν^σΑ1 und N^tB29 i>; schon aus Z. Makromol, Chem. 26 (1958), S. 153 bis 166 bekannt. Mit der Aufklärung der Tertiärstruktur des Insulins wurde der kurze, durch bifunktionelle Reagentien überbrückbare Abstand der beiden Aminogruppen bestätigt. Es gelang seither auch, die beiden Aminogruppen durch eine Succinoyl- bzw. Adipinoylbrücke zu verbinden.

Man erhielt dadurch neue Insulinderivate, die jedoch nicht mehr in Insulin zurückverwandelt werden können.

Demgegenüber bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, Insulin aus einem solchermaßen intramolekular vernetzten Molekül zu regenerieren, da die Brücke — CO — R' — CO — durch beiderseitigen Edman-Abbau leicht zu eliminieren ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Insulin-Derivate der allgemeinen Formel III erhalten ihren Wert dadurch, daß sie in guter Ausbeute aus getrennt synthetisierten A- und B-Ketten hergestellt werden können. Sie übernehmen bei der Kombination der beiden Ketten in hoher Verdünnung die Funktion, die bei der Biosynthese des Insulins das C-Peptid hat, nämlich, eine formelgerechte Kombination herbeizuführen.

Das gelingt zwar nicht in dem Maße und mit derselben Ökonomie, mit der bei der Biosynthese des Insulins die beiden Ketten kombiniert werden, doch ist die Ausbeute merklich höher als dies bei den bisherigen Verfahren der Kettenkombination der Fall ist.

Die heute fast ausschließlich angewandte Methode der Kettenkombination nach Seientia Sinica 10 (1961), S. 84, liefert unter günstigen Umständen etwa 10% Ausbeute. Hiervon können etwa 40% in kristalliner Form erhalten werden. Gelegentliche Angaben über höhere Ausbeuten waren nie reproduzierbar. Die Kombinationsausbeute konnte bisher nur gesteigert werden, wenn die Α-Kette ia etwa 5fachem molarem Überschuß eingesetzt wurde. Diese Reaktionsbedingungen sind aber nicht mehr wirtschaftlich (Advances Enzymology 33 [1970], S. 455), und die Ausbeute an kristallisierbarem Material bleibt auch hier noch gering.

Demgegenüber liefert das ernndungsgemäße Verfahren Ausbeuten von mehr als 25% bei einem Kettenverhältnis 1:1. Darüber hinaus lassen sich falsch kombinierte Produkte nach Reduktion erneut der Kombination unterwerfen, da hier A- und B-Kette zunächst unverändert über die erfindungsgemäße Brücke miteinander verbunden bleiben.

Das ernndungsgemäße Verfahren stellt somit einen auch technisch gangbaren Weg zur Synthese von Insulin dar.

Außer Insulin selbst können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Insulin-Analoga und -Derivate hergestellt werden. Unter Insulin-Analoga werden Verbindungen verstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren gegen andere, vorzugsweise einfachere Aminosäuren ausgetauscht sind, ferner Insuline mit veränderter, vorzugsweise verkürzter Ketter.länge.

So können, wie bereits aus der Literatur bekannt ist. z. B. in der Α-Kette GIn⁵ und GIn¹⁵ durch GIu, ier¹². Tyr¹⁴. Asn¹⁸ und Asn²¹ durch Ala. VaI¹⁰ durch Leu oder eine andere hydrophobe Aminosäure, ferner Tyr¹⁹ durch Phe ersetzt sein.

In der B-Kette ist der Ersatz von Phe¹, VaI², Asn³. Gin⁴, His⁵. Ser⁹, His¹⁰, Thr²⁷ und Pro²⁸ durch einfachere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin, möglich. Die Aminosäuren 1 bis 3 und 30 können auch elirfiiniert sein. Selbst der Ersatz von Cys^A7 und Cys^B ist durch AIa möglich.

Als Aminosäure-Derivate gelten Verbindungen, die substituierte funktionell Gruppen tragen. So kann z. B. die u-Aminogruppe der B-Kette durch einen Acylrest analog DT-OS 2042 299 substituiert sein. Dasselbe gilt für die oben definierten Insulin-Analoga.

Voraussetzung ist stets, daß durch Austausch oder Substitution die biologische Wirkung der Insuline nicht oder nicht wesentlich verringert wird.

Die für die bifunktionelle Brücke verwendeten Ausgangsverbindungen

HOOC-R'-COOHmitR' = — CH-W—CH -

NH,

NH₂

und W = (CH₂I₂ bis (CH₂J₄, CH₂-S-CH₂ oder CH₂-S-CH₂-CH₂ sind bekannt. Die Sulfone werden vorteilhaft aus den N-acylierten Verbindungen in bekannter Weise mit H₂O₂ oder z. B. Benzoepersäure hergestellt. Da diese Verbindungen 2 Asymmetriezentren besitzen, treten mehrere Stereoisomere auf, die aber hinsichtlich des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht kritisch sind. Die Kette bleibt beweglich genug.

Zur vorübergehenden Maskierung der NH-Gruppen werden Acylreste Ac verwendet. Ac kann eine in der Peptidchemie gebräuchliche Aminoschutzgruppe sein; bevorzugt verwendet man protonensolvolytisch abspaltbare Reste, bevorzugt den tert.-Butyloxycarbonylrest (Boc).

Wenn die B-Kette mit N-terminalem Phenylalanin endet (Y = H), so erhält man im Zuge der Eliminierung der Brücke —CO—R' — CO— durch 5dman-Abbau (vgL zum Beispiel Acta Chem. Scand. [!95G], S. 283 bis 293) unter gleichzeitiger Abspaltung des N-terminalen Phe Des-Phe^B1-InsuJin. Soll Phe erhalten bleiben, so stellt man eine B-Kette her. in der Y für einen Aminoacylrest, z. B. GIy, steht, der beim Edman-Abbau eliminiert wird. Y kann auch ein leicht abspaltbarer Acylrest wie ι B. der Trifluoracetylrest (TFA) sein, der nach beendete Insulinsynthese durch verd. NaOH entfernt wird, ferner ein anderer Acylrest analog DT-OS 2042 299, der nach der Synthese erhalten bleibt und ein entsprechendes Insulin-Derivat liefert.

Als S-Schutzgruppe X dienen die bereits bekannten Reste wie z. B. der Trityl-, Diphenylmethyl-, Acetamidomethyl- oder Tetrahydropyranyl-rest, ferner Alkylmercaptogruppen wie Äthyl-, Isopropyl- oder tert.Butylmercaptoreste und Aminoäthylcarbamoylschutzgruppen analog DT-OS i9 30 330, ferner der Äthylcarbamoylrest. Auch die Sulfogruppe kann vorübergehend zum Schutz der SH-Gruppen dienen; sie wird bekanntlich durch Einwirkung überschüssiger Mercaptoverbindungen entfernt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man beispielsweise so vor, daß man ein nach bekannten Methoden hergestelltes Insulin-A-Ketten-Sulfonat mit überschüssigem Aktivester, z. B. 4-Nitrophenylester der nachstehenden Formel umsetzt

NpO-CO-CH - CH₂- S -CH₂-CH - COONp
NH NH

Boc Boc

Man erhält nach etwa 30 bis 120 Minuten bei Raumtemperatur als Reaktionsprodukt eine schwerlösliche Verbindung der Formel ! mit

X = SO₃-

R = -CH-CH₂-S-CH₂-CH-

35

Geeignete Lösungsmittel sind Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Man fällt das Reaktionsprodukt mit einem organischen Lösungsmittel wie Äther oder Essigester aus und erhält als Zwischenprodukt z.B.

NpO-CO-CH-CH₂- S -CH₂-CH- C< · A-NH NH

i I

Boc Boc

45

-Kettensulfonat

55

Nun löst man wieder, bevorzugt in Dimethylformamid, Phosphorsäure -tris-dimethylamid oder Dimethylsulfoxid, und bringt mit einer etwa äquimolaren Menge B-Ketten Sulfonat in Anwesenheit von einer für die Neutralisation der sauren Gruppen hinreichenden Menge N-Äthylmorpholin oder Triäthylamin bei etwa pH 8 bis 10 und von etwa 1 Äquivalent 1 - Hydroxybenzotriazol zur Reaktion. Die f-Aminogruppe in Lys^B29 der eingesetzten B-Ketle ist frei, die a-Aminogruppe von Phe^B1 kann z. B. durch einen Boc-Gly-Rest geschützt sein. Die Herstellung einer solchen Kette ist im Beispiel 1 b) beschrieben.

NH

Boc

Y = Boc—GIy.

NH

Boc

Die beschriebene Verknüpfung von A- und B-Ketten kann auch in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden.

Nun spaltet man durch 30 bis 60 Minuten Behandeln mit Trifluoressigsäure die Boc-Gruppen ab, fällt das Reaktionsprodukt mit Äther und nimmt die getrocknete Substanz in so viel Wasser von pH 5 bis 8 auf, daß eine etwa 0,1- bis 0,5%ige Lösung entsteht. Man versetzt unter Stickstoff bei 0 bis 60 C mit einem 10- bis 200fachen Überschuß an Thioglycol, extrahiert nach 5 bis 100 Minuten Reaktionszeit bei Raumtemperatur mit Essigester, trennt ab und vertreibt restlichen Essigester mit Stickstoff Dann stellt man das pH auf etwa 10.6 ein und rührt über Nacht bei 0 bis 20 C im langsamen Luftstrom. Anderntags stellt man mit I n-HCl auf pH 5.5 und lyophilisiert oder dampft im Vakuum zur Trockne ein.

Zur Reinigung wird in 1 bis 2n-Essigsäure über Sephadex*G-50 oder G-75 in einer Säule von 1 bis

2 m Länge Chromatographien. Der »Insulinpeak« (40%) wird wie folgt weiterverarbeitet, falsch kombiniertes Produkt (etwa 30%l nach Reduktion erneut der Rekombination zugeführt.

Das vernetzte Roh-Insiilin der allgemeinen Formel 111 wird in der etwa 20fachen Menge 95%iges Pyridin aufgenommen. Nach Filtration setzt man mit 8 bis 16 Moll. Phenylisothiocyanat während

3 Stunden bei etwa 10 bis 30⁰C um, destilliert das Lösungsmittel teilweise im Vakuum ab. fällt mit Äther und läßt den Niederschlag etwa 2 Stunden mit der 5- bis lOfachen Menge Trifluoressigsäure bei etwa 25 C stehen. Das rohe Insulin wird mit Äther ausgefällt, in 1 bis 2n-Essigsäure über eine Säule Sephadex *G-50 oder G-75 von 1 bis 2 m Länge chromate graphiert und in üblicher Weise direkt aus der Lösung unter Zusatz von Zn-Ionen bei pH 5,4 bis 5.5 kristallisiert. Ausbeute an kristallisiertem Material 15 bis 25% der Theorie (erneut reduziertes, falsch kombiniertes Material nicht eingerechnet).

Das kristallisierte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin besitzt bei der Bestimmung der biologischen Wirkung durch Messen der Blutzuckersenkung am Kaninchen 23 I.E./mg. Die Aminosäureanalyse ist korrekt. Es wird an Stelle des aus Pankreas gewonnenen Materials zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt.

An Stelle der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Synthesen von A- und B-Ketten mit Hilfe der Festkörpertechnik können auch die bekannten Methoden der Fragmentkondensation, wie z. B. Carbodiimid-Methode, gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid. 1-Hydroxybenzotriazolen,

3 - Hydroxy - 3 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2.3 - benzotriazin oder der Azid-Methode zur Herstellung der jeweils als Ausgangsmaterial benützten A- und B-Ketten herangezogen werden.

Beis piel 1

Rinder-Insulin
a) A-Kette-S-Tetrasulfonat (Rind)

Die Rinder-lnsulin-A-Kette wird analog Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 352 (1971). S. 419 bis 429, nach der Festkörpermethode, ausgehend von Polystyrolharz mit 1% Vernetzung, hergestellt. Die erste Aminosäure, Asparagin, wird als Boc-Asn(Mbh)-OH (hergestellt aus H-Asn(Mbh)-OH [Chem. Ber. 103 (1970), S. 2041 bis 2051] mit Boc-azid) mit den Hydroxygruppen des Harzes in bekannter Weise verestert.

Alle folgenden Aminosäuren werden als Boc· Aminosäure-4-nitrophenylester eingesetzt. Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen als Benzylester vor. Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzyläther Die SH-Gruppe des Cysteins wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides 1969, North Holland Publishing Comp.. Amsterdam 1971, S. 30).

Jeder Kondensationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der DT-OS 2202 613 vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern.

Nach beendeter Synthese wird die Α-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz abgespalten und durch Sulfitolyse der asymmetrischen Disulfide analog Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem 352 (1971). S. 419 bis 429. in das S-Tetrasulfonat übergeführt und gereinigt. Das auf diese Weise hergestellte und gereinigte A-Keiten-Sulfonat (Ausbeute der Synthese 65%. Ausbeute der Sulfitolyse 28%) ist von einer aus natürlichem Insulin hergestellten Verbindung elektrophoretisch nicht zu unterscheiden.

b) N'-Boc-Gly-B-Kette-S-disulfonat

Die Rinder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 348 (1967). S. 1355 und 352 (1971). S. 419. nach Merri field (Biochemistry 3 [1964]. S. 1385). ausgehend von Polystyrolharz mit I⁰O Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(PhO-ONp eingesetzt, alle weiteren Aminosäuren ebenfalls als Boc-Nitrophenylester. weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen analog der Vorschrift von Merri field als Benzylester vor. Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzyläther. Die SH-Gruppe des Cysteins wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides 1969. North Holland Publishing Comp.. Amsterdam 1971. S. 301.

Jeder Kondensationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der DT-OS 2202 613 vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität /u steigern

Nach beendeter Synthese Mrd die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz .tbccspalten. Ausbeute 55%. bezogen auf die erste Aminosäure AIa^BVl 3.6 ε (1 rnMol) der noch S-gesehüt/len N-Pht-B-Kette werden nun in 100ml Dimethvlformamid mit 370 mg H.ZniMoli Βικ-GU-ONp in Anwesenheit von 135 mc 1 lUdroxxhcnzotria/ol w:ihrend einer Stunde bei Raumtemperatur umaoct/t Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g Boc-Gly-S-tert.-butylmercapto - N' - Pht - B - Kette. Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80%igem Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40'C. Dann fallt man mit 1 1 lsopropanol-äther (1 + 5) 3,3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus. Die überführung in das Disulfonat erfolgt analog Beispiel 1 a), Ausbeute 3,0 g.

c) Herstellung von Brückenreagenzien
α) Di-Boc-L-Lanthionin

3.5 g L-Lanthionin werden in 30 ml Wasser und 20 ml Dioxan mit 7 ml Boc-azid versetzt. Man stellt auf pH IO ein und hält dieses pH mittels pH-stat während 4 Stunden bei 55 C. Nun extrahiert man mit Essigester, kühlt auf etwa 4^rC, säuert mit konzentrierter Citronensäure an und extrahiert mit Essigester. Die F.ssigesterlösung wird gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in heißem Essigester, versetzt mit Petroläther bis zur beginnenden Trübung und kühlt langsam ab. Dabei fallen 2,3 g Boc₂-L-Lanthionin aus. Schmp. 142 bis 144C (Zers.).

ß) Di-Boc-L-Lanthionin-bis-4-nitrophenylester

1 g Di-Boc-Verbindung aus Beispiel 1 c. n) wird mit 0.8 g 4-Nitrophenol in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst. Man gibt 1,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert ausgefallenen Harnstoff ab und engt das Lösungsmittel im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus Isopropanol umkristallisiert. Ausbeute 1,2 g Schmp. 161 bis 163 C (Zers.).

;·) Di-Boc-L-Lanthionin-bis-N-hydroxysuccinimidester

Man erhält analog /i) aus 1 g Di-Boc-Aminosäure. 0.61 g N-Hydroxysuccinimid und 1,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in Tetrahydrofuran nach Auskochen mit Isopropanol 1,01 ε des Di-Aktivesters vom Schmp. 178 bis 179 C (Zers.).

Λ) Di-Boc-iLf-diamino-meso-pimelinsäurebis-4-nitrophenylester

0.95 g Di - Boc - tw - diamino - meso - pimelinsäure. hergestellt nach Bull. Soc chim. France 1965. S. 1813. werden analog /f) mit 0.8 g 4-Nitrophenol und 1.1 g Dicyclohexylcarbodiimid in Tetrahydrofuran 1.0 g Di-Aktivester vom Schmp. 160 bis 165 C (Zers.) erhalten.

dl Rinder-Insulin

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonuis werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthyl-morpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2.0 g des nach c. ,1) hergestellten Nitrophenylester gerührt. Nach 20 Stunden wird mil Essigsäure gefällt. Man erhält 2.7 g Mono-A-Kettenteirasulfonat des Di-Boc-1 anthionin-mononitrophenylesters (89%l Nun nimmt man wieder in 100 mi Dimethylformamid auf. gibt 3.0 e des nach Beispiel 1 b hergestellten N'-Boc-Gly-B-Kcttendisulfonats. 120 mj I-H\droxyben7Otria/ol und etwas Triethylamin (bi> pH "I /u und rührt I Munde bei Raumtemperatur

509 530/42

Dann wird mit Essigester gelallt. Ausbeute 5,5 g. Das nahe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsaure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5,0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' = — CH₂ — S — CH₂ — an Stelle von R, X = SCV und Y = GIy.

Das Produkt wird in 0,5 1 Wasser von pH 7,5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol z:u, bewahrt I Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf etwa 40⁰C, kühlt wieder auf etwa 2O⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 51 und stellt mit 1 n-NaOH auf pH 10,6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10" C. gibt 1 n-HCl bis pH 5,5 zu und lypholisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%ige Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex ®G-75. (ine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin (»seicht. Nach einem Vorpeak (1,6 g) erscheint der Insulinpeak (2,7 g). Der Vorpeak wird nach J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971), S. 3080) mit 1,4-Dithiothreitol in fluss. Ammoniak reduziert und in 1,5 1 Wasser wie oben bei pH 10,6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2,6 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95%igem Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0,7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,4 g Phenylthiocarbainoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2,2 g Rohinsulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie iiber Sephadex *G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₂ und Einstellen des pH auf 5,4 amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab. wiederholt die Kristallisation und erhält 1,15 g (19%, bezogen auf eingesetzte Α-Kette) mit 23 bis 24 I.E.'mg.

Beispiel 2

Des-(Phe-Val)^{B1 2}-des-Ala^BV1-[Ala^AI21418-²¹]-Insulin (Schwein)

a) Ala'-^141R21-lnsulin-A-Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

Man stellt analog Beispiel la) nach der Festkörpermethode die Schweine-Insulin-A-Kette her, wobei als erste Aminosäure (A 21) Boc — AIa — OH mit den Hydroxygruppen des Harzes verestert wird. In den Positionen 18,14 und 12 werden Boc-Ala-ONp an Stelle der in der natürlichen Kette hier stehenden Aminosäuren eingeführt. Der weitere Synthesegang und Aufarbeitung folgt Beispiel 1 a). Ausbeute der Synthese 69%, der Sulfitolyse 34%.

b) N"-Boc-des-Phe^B1-des-Ala^BJ0-lnsulin-B-Kette-S-disulfonat (Schwein)

Die Rmder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 348 (1967», S. 1355 und 352 (1971). S. 419, nach M erri field (Biochemistry 3 [1964], S. 1385). ausgehend von PoIystyrolharz mit 1% Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(Pht)-ONp eingesetzt, alle weiteren Aminosäuren ebenfalls als Boc-Nitrophenylester. weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten lagen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzylester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzyläther. Die SH-Gruppe des Cysteine wurde durch die S - tert. - Butylmercaptogruppe geschützt

(Peptides 1969, North Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971, S. 30). Die Synthese endet mit Boc-Val-ONp^(B2).

Jeder Kondensalionsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol analog dem Verfahren

ίο der DT-OS 2202 613 vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifitäl zu steigern.

Nach beendeter Reaktion spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 55%, bezogen auf die erste Aminosäure

,5 AIa ^B3°.

3.6 g (1 mMol) der noch S-geschützten N'-Pht-B-Kette werden nun in 100 ml Dimethylformamid mit 300 mg (1,2 mMol) Boc-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während einer Stunde

bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g der entsprechenden Boc-S-tert.-butylmercapto-N^£-Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80%igem Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40 C. Dann fällt man mit 1 1 Isopropanoläther (1+5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten

Verbindung aus. Die überführung ins Disulfonat erfolgt analog Beispiel la). Ausbeute 3.1 g.

c) Des-(Phe-Val)^B1 -²-des-Ala^B-¹⁰-[Ala^A121418-²¹> Insulin (Schwein)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2 g des nach 1 c. fi) hergestellten Nitrophcnylestcrs gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,4 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters (80%). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf. gibt 2.9 g des nach Beispiel 2b) hergestellten B-"kettendisuifonats. 120 mg

1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.0 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther. 4.9 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' =

-CH — CH₂- S -CH₂- CH — NH, NH,

an Stelle von R. X = SO, .Y = H und um B¹ unc B³⁰ verkürzter B-Kette.

Das Produkt wird in 0.5 1 Wasser von pH 7.5 auf genommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu. bewahr 1 Stunde unter Stickstoff auf. erwärmt noch 1 Stundi auf etwa 40 C. kühlt wieder auf etwa 20 C ab. um extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigsäure. De Essigester wird abgetrennt, der kest durch einei Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man au 51 und stellt mit 1 n-NaOH auf pH 10.6 rühr 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10 C. gib 1 n-HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%ige Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100cm Sephadex *G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1,4 g) erscheint der Insulinpeak (2,4 g) der Vorpeak wird nach J. Am. Chem. Soc. 93 (1971), S. 3080, mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 1 Wasser wie oben bei pH 10,6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2,4 g vernetztes Rohinsulinderivat werden in 60 ml 95%igem _]0 Pyridin 3 Stunden bei 26° C mit 0,7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Diese wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2,0 g Roh-»lnsulin« aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex ®G-7 5 wie oben erhält man eine »Insulin«-Fraktion von 1,4 g (17%), bezogen auf eingesetzte Α-Kette mit etwa 20 I.E./mg. 20;

Beispiel 3

Des-Phenylalanin⁸¹-Insulin (Rind)
a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Rind) ^2S

Die Verbindung wird analog Z. Naturforschung 24b (1969), S. 1127 bis 1139. mit den in Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 352 (1971). S. 2, beschriebenen Verbesserungen hergestellt. Die Abspaltung der Schutzgruppen, auch der S-Tritylgruppen, erfolgt durch Lösen des Peptids in Trifluoressigsäure und Eingießen in Wasser nach einer Stunde. Nach Filtration und Extraktion mit Äther wird gefriergetrocknet und analog Z. Naturforschung 24 b (1969). S. 1138. ins S-Tetrasulfonat übergeführt.

b) N'-Boc-B-Kette-S-disulfonat (Rind)

Synthese der B-Kette erfolgt nach Beispiel 1 b).

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 55%, bezogen auf die erste Aminosäure Ala^B3(1. 3,6 g (ImMoI) der noch S-geschützten N^c-Pht-B-Kette werden nun in 100 ml Dimethylformamid mit 300 mg (1.2 rnMol) Boc-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während einer Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Rest^volumen von 10 ml und Versetzen mit Essigsäure erhält man 3.5 g N*-Boc-S-tert.-butylmercapto-N'-Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst rrnn die Verbindung in 100 ml 80%igem Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40 C. Dann fällt man mit 1 I Isopropanol Äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus: überführung ins Disulfonal analog Beispiel la). Ausbeute 3.0g.

c) Des-Phe^B1-lnsulin (Rind)

60

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2 g des nach Beispiel Ic. ö) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.65 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-a.<-diamino-mesopipelinsäure-mononitrophenylesters.

Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3,0 g des nach Beispiel 1 b) hergestellten N^a-Boc-B-Kettendisulfonats, 120mg 1-Hydroxybenzotriazol und wenig Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5,5 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5,0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit

R' = /CH-(CH₂)J-CH-

NH₂

NH,

an Stelle von R, X = SO₃" und Y = H.

Das Produkt wird in 0,5 1 Wasser von pH 7,5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf etwa 40⁰C, kühlt wiedei auf etwa 20⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 1 und stellt mit In-NaOH auf pH 10,6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10"C. gibt 1 n-HCl bis pH 5,5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%iger Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100cm Sephadex *G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1,4 g) erscheint der Insulinpeak (2.5 g). Der Vorpeak wird nach J. Am. Chem. Soc. 93 (1971), S. 3080, mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 1 Wasser wie oben bei pH 10,6 oxydiert. Die nach Chromatographie erhaltenen 2,5 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95%igem Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0,7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25" C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Roh-»Insulin« aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex *G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₂ und Einstellen des pH auf 5,4 amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab. wiederholt die Kristallisation und erhält 1.21 g Des-Phe^B1-Insulin (Rind) (20%. bezogen auf eingesetzte A-Kette) mit 23 bis 24 I.E. mg.

Beispiel 4

B 1-Acetyl-Insulin <Schwein)

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 a) unter Berücksichtigung des Aminosäuresequenz der Schweine-Insulin-A-Kette. Ausbeute der Synthese 68%. der Sulfitolyse 32%.

b) B 1-Acetyl-B-Kette-S-disulfonat

Die Synthese der Kette erfolgt analog Beispiel 1 bl man set?t jedoch Lys als

Z-(Cl)

Boc-Lys-ONp
und Phe^B1 als N-Acetyl-Phe-ONp ein.

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 59%, bezogen auf die erste Aminosäure AIa^B3°. Die überführung ins Disulfonat erfolgt analog Beispiel 1 a).

c) B 1-Acetyl-lnsulin (Schwein)

2,8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 2,4 g des nach 1 c, ß) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.65 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3,0 g des nach b) hergestellten N - Acetyl - B - Ketten - disulfonats. 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und wenig Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5,38 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5,06 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R'

-CH — CH₂- S -CH₂-CH

NH,

an Stelle von R, X = SO₃" und Y = Acetyl.

Das Produkt wird in 0,5 1 Wasser von pH 7,5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf etwa 40" C, kühlt wieder auf etwa 20 C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 1 und stellt mit In-NaOH auf pH 10,6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10° C, gibt In-HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%iger Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex * G-75, fine, Chromatographien. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.55 g) erscheint der Insulinpeak (2,75 g). Der Vorpeak wird nach J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971), S. 3080, mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 1 Wasser w'e oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.7 g vcrnetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95%igem Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0.7 ml Phenylsenfol gerührt Das PyriJin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,4 g Phenylthiocarbamo\!verbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 12 g Rohinsulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex*G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion. die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCI₂ und Einstellen des pH auf 5.4 amorph ausfallt, aber im Verlauf von einigen Tagen kristallin wird Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhalt 1.14 g (19%). bc/ogen auf eingesetzte Λ-Kettc mit 22 bis 24 IH. mg.

Beispiel 5

Human-lnsulin

a) A Kette-S-tetrasulfonat (human)

Herstellung analog den Beispielen la) und 4a). Ausbeute der Synthese 55%, der Sulfitolyse 33%.

b) N'-Boc-Gly-B-Kette-S-disulfonat (human)

Synthese analog Beispiel 1 b). Als erste Aminosäure wird jedoch Boc-Thr-OH mit den Hydroxygruppen des Harzes verestert. Ausbeute 62%.

Nach beendeter Reaktion spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 58%, bezogen auf die erste Aminosäure Thr^B3°. 3,6 g (ImMoI) der noch S-geschützten N-Pht-B-Kette wurden nun in 100 ml Dimethylformamid mit 370 mg (l,2mMol) Boc-Gly-ONp in Anwesenheit von 135 mg l-Hydroxybenzotriazol während einer Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvclumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g Boc-Gly-S-tert.-bulylmercapto-N-Pht-B -Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löste man die Verbindung in 100 ml 80%igem Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 4OC. Dann fällt man mit 1 1 Isopropanol Äther (1+5) 3,3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus: überführung ins Disulfonat analog Beispiel la): Ausbeute 3.0 g.

1:) Human-lnsulin

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2,8 g des nach Beispiel lc. ,^) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefallt. Man erhall 2,63 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3,0 g des nach Beispiel 1 b) hergestellten N'-Boc-Gly-B-Ketten-disulfonats. 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.43 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird ir 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5.0 g Verbindung dei allgemeinen Formel 1 mit R' =

-CH — CH₂- S CH₂-CH - j

NH₂ NH₂ )

an Stelle von R. X ^ SO, und Y = GIy.

Das Produkt wird in 0.5 1 Wasser von pH 7.5 aul genommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu. bewahi 1 Stunde unter Stickstoff auf. erwärmt noch 1 Stund auf etwa 40 C, kühlt wieder auf etwa 20 C ab un extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Dt Essigester wird abgetrennt, der Rest durch eine

6> Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man ai 5 1 und stellt mit In-NaOH auf pH 10.6. ruh 18 Standen im leichten Luftstrom bei 10 C. gil In-HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%iger Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100cm Siphadex * G-75, fine, Chromatographien. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1,53 g) erscheint der Insulinpeak (2,62 g) nach Eindampfen im Vakuum. S Der Vorpeak wird nach J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971). S. 3080, mit Dithiothreitoi in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 1 Wasser wie oben bei pH 10,6 oxydien.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2,6 g Rohinsurin-Derivate werden in 60 ml 95%igem Pyridin 3 Stunden bei 26"C mit 0,7 ml Phenylsenfol gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,5 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2,2 g Rohinsulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Scphadex*G-75 wie oben erhält man eine insulinfraktion. die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₂ und Einstellen des pH auf 5,4 amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1,28 g (21,5%), bezogen auf eingesetzte A-KeUe mit 23 bis 24 I.E./mg.

Beispiel 6

B1 -Acetyl-Human-Insulin

a) S-Tetra-tert.-butylmercapto-A-Kelte (human)

Herstellung der geschützten Α-Kette analog Beispiel 1 a). Die S-Schutzgruppen werden jedoch nicht abgespalten. Ausbeute 62%.

b) N-Acetyl-S-di-terl.-butylmercapto-B-Kette (human)

Herstellung der B-Kette analog Beispiel 4b) unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz wie bei Beispiel 5 b). Die überführung ins Sulfonat entfällt (Ausbeute 64%).

c) Bl-Acetyl-Human-Insulin

2,7 g des nach a) hergestellten A-Ketlen-derivals werden in 100 ml 90%igem Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 1.8g des nach Beispiel Ic, /■') hergestellten Nitrophenylcsters gerührt Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,6 g Mono-A-Kettentetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in UX) ml Dimethylformamid auf, gibt 2,9 g des nach b) hergestellten N^I-Acet)l-B-Keiten-derivuts. 120 mg 1-Hydroxybenzotria7ol und etwas Triälhylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigestcr gefallt. Ausbeute 5,40 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fallt man mil 400 ml Äther 5.0 g Verbindung der allgemeinen Formel 1 mit R' =

-CH- CH, -S-CH₂- CH —

NH,

an Stelle von R, X = S-terl.-Butylmeircapto und Y = Acetyl.

Das Produkt wird analog J. Amer. Chem. Soc. 93 (1971). S. 3080, in Il flüssigem Ammoniak gelöst. Man gibt 15 g Dilhiothreitol zu und rührt 1 Stunde bei -33 C. Dann wird Ammoniak verdampft, der Rückstand mit Essigester extrahiert. Nun löst man den Rückstand in 5 1 Wasser und stellt mil I n-NaOH auf pH 10.6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10 C, gibt In-HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisieri.

Der Rückstand wird in 50 ml 10%iger Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100cm Sephadex * G-75. fine, Chromatographien. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.28 g) erscheint der Insulinpeak (2.81 g). Der Vorpeak wird wie oben mit Dithiothreitoi in flüssigem Ammoniak reduzier! und in 1.5 1 Wasser bei pH 10.6 oxydiert

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.81 g Rohinsulin-Derivat werden in 60 ml 95%igem Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0,7 ml Phenylsenfol gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2,4 g Phenjlthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt Man fällt mit 200 ml Äther 2,2 g Rohinsulin aus. Na₁.1 erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex* G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₂ und Einstellen des pH auf 5.4 amorph ausfallt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichlkrisiallisiertem Material ab. wiederholt die Kristallisation und erhält 1.31 g (22%). bezogen auf eingesetzte A-Kette. Bl-Acetyl-Human-Insulin mit 23 bis 24 I.E/mg.

50953W423

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin- \nalogen und -Derivaten, dadurch gekenn- 5 zeichnet, daß man eiae Verbindung der allgemeinen Formel I

—R SX
I SX
I Lys B-Kette GIy 1 I
A-Kette I I
SX
SX SX
SX
I O=C- Y-

besitzt und R' fur