DE1518440B2

DE1518440B2 - Verfahren zur herstellung eines salzes eines sulfomethylderivates von polymyxin b oder e

Info

Publication number: DE1518440B2
Application number: DE19631518440
Authority: DE
Inventors: Samuel London Wilkinson
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1962-12-13
Filing date: 1963-12-10
Publication date: 1973-03-01
Also published as: FR1605453A; DE1518440C3; AT249266B; ES294436A1; BE641002A; FR3405M; CH438579A; BR6355349D0; LU44997A1; US3317506A; GB1062895A; DK107559C; DE1518440A1

Description

Verhaltens von Proben, welche auf pH 5,0 gebracht wurden, verfolgt werden kann; die Alterung ist beendet, wenn eine Probe nicht länger eine Ausfällung erbringt. Der Alterungsablauf kann ebenso durch Beobachten des pH-Wertes der Lösung verfolgt werden; -5 die Alterung ist beendet, wenn der pH-Wert auf zwischen 7,3 und 7,5 gestiegen ist. Die erforderliche Zeit steht in umgekehrtem Verhältnis zur Temperatur; geeigneterweise wird die Lösung auf ungefähr 50 bis 55° C ungefähr 30 Minuten lang erwärmt, aber es kann ebenso eine längere Zeit bei einer geringeren Temperatur verwendet werden. Gefriertrocknung der Lösung, wenn der Alterungsablauf beendet ist, ergibt ein SuIf omethylpolymyxin der gewünschten Qualität.

Die antibakterielle Wirksamkeit des Sulfomethylpolymyxins ist dem Polypeptid zuzuschreiben, und die Natur des mit den anionischen Sulfomethyl-aminogruppen verbundenen Kations ist unwesentlich, vorausgesetzt, daß es therapeutisch und pharmakologisch geeignet ist. Geeignete Kationen schließen Natrium und Kalium ein. Die Verwendung von Natriumbisulfit bei dem erfindungsgemäßen Verfahren führt unmittelbar zur Herstellung von Natriumsulfomethylpolymyxin.

Obgleich dieser durch die Erfindung geschaffene neue Typus von SuIf omethyl-polymyxin in erster Linie zur parenteralen Anwendung vorteilhaft ist, machen es seine Zuverlässigkeit und Standardeigenschaften ebensogut zur oralen wie örtlichen Verwendung geeignet.

Ein für pharmazeutische Zwecke annehmbares Salz von Sulfomethyl-polymyxin kann vorteilhafterweise in getrennten Einheiten, welche für die parenterale oder orale Anwendung geeignet sind, oder in einem Trägerstoff, der zur oralen oder örtlichen Anwendung geeignet ist und welcher eine vorausbestimmte Konzentration des Wirkstoffes enthält, angewendet werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel!.

Natrium-sulfomethyl-polymyxin B Stufe 1

'40

Wäßrige 30%ige Gewichtsvolumen Fiormaldehydlösung (200 ml), vorausgehend auf pH 7,0 durch Zugäbe von gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung gebracht, wurde auf einmal unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von Polyniyxin-B-neutral-.. Sulfat (200 g, 0,138 Mol, 0,691 Äquivalent) in Wasser (2000 ml) zugegeben, worauf sofort gesättigte wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (1000 ml), welche ■ vorher auf pH 8,5 durch Zugabe von festem Natriumcarbonat gepuffert wurde, zugegeben wurde. Das schäumen wurde durch Zugabe von Wasser (1000 ml) unter Kontrolle gehalten. Die flockige Ausfällung wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und so vollständig wie möglich auf der Filterfiäche getrocknet.

Stufe 2

Solange die obige Ausfällung noch feucht ist, wurde sie in Wasser (900 ml) suspendiert und heftig gerührt, bis eine dicke Paste erhalten wurde. Eine Lösung von Natriummetabisulfit (96,6 %; 81 g, 0,412 Mol, 0,824 Äquivalent) in Wasser (100 ml) wurde dieser Paste während einer Zeitdauer von 5 Minuten zugegeben. Nach weiteren 5 Minuten würde das Gemisch schüttelfähig und ergab dann schnell eine klare Lösung. Von dem Augenblick an, an welchem das Gemisch beweglich wurde, wurde der pH-Wert mittels pH-Messer fortwährend geprüft und zwischen 6,4 und 6,7 (vorzugsweise auf 6,6) durch gelegentliche Zugabe kleiner Mengen von Natrium-metabisulfitlösung eingestellt. Nach einer Gesamtreaktionsdauer von 30 Minuten bei ungefähr 20° C wurde das Rühren eingestellt.

Am Ende dieser Stufe wurde gefunden, daß die Zugabe von 0,04 M Acetatpuffer, pH 5,0 (0,8 ml) zu einem Teil (0,2 ml) Lösung, eine reichliche Ausfällung ergab. In gleicher Weise ergaben Versuche, den pH-Wert durch Zugabe von Mineralsäure zu senken, eine Ausfällung. Darüber hinaus ergab das Gefriertrocknen bei dieser Stufe ein Produkt mit LD₅₀ beträchtlich unter 100 mg/kg, welches Schmerzen bei Injektion verursachte.

Stufe 3

Unmittelbar auf die Stufe 2 folgend wurde die Lösung für eine Gesamtdauer von 30 Minuten auf 55°C durch Eintauchen des Reaktionsgefäßes in ein konstantes Temperaturbad erwärmt. Nach zeitlichen Abständen wurden Proben entnommen und die Menge der durch Zugabe von Acetatpuffer gebildeten Ausfällung, wie oben beschrieben, festgehalten. Proben, welche nach 15 bis 20 Minuten entnommen wurden, bildeten keine Ausfällung mehr. Die Lösung wurde schnell gekühlt und sofort gefriergetrocknet. Das Produkt war ein gekörntes weißes Pulver. Dessen 2%ige wäßrige Lösung hatte einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,0 und bildete keine Ausfällung, wenn sie auf pH 5,0 angesäuert wurde.

Die Masse gefriergetrocknetes Produkt wurde geprüft und so in ausreichend Wasser gelöst, daß es 0,25 Milliori-Einheiten/ml ergab. Die Lösung wurde Seitz-filtriert, in 2 ml Mangan, in 15 ml Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet, mit sekundärem Trocknen über Phosphorpentoxyd, um den Wassergehalt auf weniger als 2 % zu verringern.

Die Eigenschaften der verschiedenen Proben der oben beschriebenen Herstellungsweise sind in der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt.

Natrium-sulfomethyl-polymyxin B Lösung in Wasser bei 22,8 mg/kg

pH

Frisch

LD₅₀

Nach 23 Stunden bei 37° C
pH I LD₅₀ (95% Gewährsgrenze)

1
2
3
4
5

7,90
7,65
7,75
7,60
7,65

172 (142 bis 202) 135 (112 bis 165) 150 (127 bis 165) 115 ( 95 bis 135) 150 (127 bis 165) 3,5
3,4
5,5
3,4

3,5

191 (169 bis 225)

127 (112 bis 150)

172 (142 bis 202)

180 (157 bis 214)

150 (112 bis 165)

Die obige Tabelle zeigt, daß diese Produkte ziemlich stabil sind; sogar nach 24 Stunden in Lösung bei 37°C wurde die LD₅₀ nur geringfügig verändert, obgleich der pH-Wert etwas angestiegen war.

Die Änderung der Eigenschaften eines einzelnen Ansatzes während des Alterungsverfahrens wird·in der nachfolgenden Tabelle erläutert. Während der Alterung der Lösung der Stufe 2 wurden die Proben zur Überprüfung der Toxizität gefriergetrocknet, und der pH-Wert der Lösung und ihr Verhalten bei pH 5,0 wurden"Während der Zeit des Probenent-,nehmens^beqbachtet. , _L

Alterung	pH	Ausfällung bei pH 5,0	LD₅₀ (95 % Gewährsgrenze)
Keine 15 Minuten bei 55° C 30 Minuten bei 55° C 60 Minuten bei 55⁰C 110 Minuten bei 55⁰C 48 Stunden bei 20° C	6,7 7,1 7,4 7,6 7,6 7,5	+ + +	54 ( 47 bis 64) 100 ( 85 bis 110) 157 (135 bis 187) 236 (202 bis 281) 236 (202 bis 281) 287 (253 bis 338)

Diese Tabelle zeigt, daß das Altern in 30 Minuten bei 55° C und in weniger als 48 Stunden bei 20⁰C stattfindet. Bei 55° C war es leichter, den Alterungsprozeß durch Untersuchen von Proben bei pH 5,0 als durch Messen des pH-Wertes der Lösung zu überwachen, aber bei 20° C (besonders bei Arbeiten in einem weiten Bereich) kann der Ablauf leichter durch einen aufzeichnenden pH-Messer überwacht werden, der anhält, wenn der pH-Wert 7,4 erreicht wird.

Beispiel 2
Natrium-sulfomethyl-polymyxin E

Wäßrige 30%ige Gewichtsvolumen Formaldehydlösung (75 ml), vorausgehend auf pH 7,0 durch Zugabe von gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gebracht, wurde zu einer Lösung von Polymyxin-E-neutral-sulfat (75 g) in Wasser (750 ml) zugegeben, worauf unmittelbar die Zugabe von gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung (375 ml), die vorher auf pH 8,5 durch Zugabe von festem Carbonat gebracht wurde, erfolgte. Das Schäumen wurde durch Zugabe von Wasser (375 ml) unter Kontrolle gehalten. Die Ausfällung wurde abgefiltert, mit Wasser gewaschen und so gründlich wie möglich auf der Filterfläche getrocknet.

Solange sie noch feucht war, wurde die obige Ausfällung in Wasser suspendiert (300 ml) und kräftig gerührt. Zu der Paste wurde, während einer Zeitdauer von 5 Minuten, eine Lösung von Natrium-metabisulfit (30 g) in Wasser (50 ml) zugegeben. Eine klare Lösung wurde schnell erhalten und der pH-Wert auf 6,6 durch Zugabe.von kleinen Mengen von Natrium-bisulfitlösung gehalten.

Nach einer Gesamtreaktionsdauer von 30 Minuten wurde die Lösung 30 Minuten lang auf 55° C erwärmt. Die Lösung ergab dann keine Ausfällung bei pH 5,0, wurde gefriergetrocknet und ergab ein körniges Pulver, das in 2°/oiger wäßriger Lösung einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 hatte. Die Eigenschaften der beiden, wie oben beschrieben, hergestellten Chargen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt.

Natrium-sulfomethyl-polymyxin E Lösung in Wasser bei 22,8 mg/ml

Frisch
pH I LD₆₀ (95 % Gewährsgrenze)

Nach 24 Stunden bei 37° C
pH I LD₆₀ (95,% Gewährsgrenze)

7,4
7,7

157 (135 bis 187)
150 (127 bis 165)

8,25
8,5

236 (202 bis 181)
191 (169 bis 225)

Claims

1 2 Patentansprüche: Stunden nach Anwendung durch die Nieren aus-

1. Verfahren zur Herstellung eines Salzes eines geschieden wird. Augenscheinlich ist, je höher der Sulfomethylderivates von Polymyxin B oder E LD₅₀-Wert, umso geringer die Umwandlung des leicht durch Umsetzung eines Polymyxinsalzes in wäßri- ausscheidbaren Sulfomethyl-polymyxins in Polymyxinger Lösung mit Formaldehyd und Aufnehmen 5 Grundstoff, welcher extrem langsam ausgeschieden des gefällten Formaldehydderivates mit Bisulfit- wird.

Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß Zur parenteralen Anwendung ist es daher wünschens-

die Formaldehydbehandlung bei einem pH-Wert wert ein Sulfomethyl-polymyxin mit LD₅₀ (intra-

zwischen 6,6 und 6,8 durchgeführt wird, diehier- venös bei Mäusen) zwischen ungefähr 100 und unge-

durch gebildete Ausfällung mit ungefähr 1,2 Äqui- 10 fähr 250 mg/kg Körpergewicht zu haben. Das Sulfo-

valent eines Bisulfits, bei einem pH-Wert zwischen methyl-polymyxin soll diese LD₅₀ in trockenem Zu-

6,4 und 6,7 in Lösung gebracht, in Lösung gehalten stand eine lange Zeitdauer beibehalten und sollte was-

wird, bis der pH-Wert auf einen pH zwischen serlöslich sein, um eine beinahe neutrale und annehm-

7,3 und 7,5 angestiegen ist und dann ohne Ver- bare Lösung zu ergeben,

zug gefriergetrocknet wird. 15 Dies war nach dem Stand der Technik nicht möglich.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch ge- Gemäß dem Verfahren der USA.-Patentschrift2 599 950 kennzeichnet, daß die BehandlungmitFormaldehyd wurden Sulfomethylderivate mit einer LD₅₀ oberhalb in Gegenwart eines wäßrigen Alkalihydrogen- 500 mg/kg Körpergewicht, nach dem Verfahren der carbonat/Carbonatpuffersystems von ungefähr 2 N USA.-Patentschrift 3 044 934 solche mit einer LD₅₀ von erfolgt. 20 unterhalb 100 mg/kg Körpergewicht erhalten.

Es wurde nunmehr gefunden, daß ein Sulfomethylpolymyxin der gewünschten Qualität in gleichblei-

Die Polymyxine sind eine Gruppe von basischen bender Weise erhalten werden kann durch sorgfältiges

Polypeptid-Antibiotica, welche gegen Gram-negative Einstellen der Reaktionsbedingungen während seiner

Bakterien wirksam sind. Polymyxin B und Polymyxin E 25 Herstellung, besonders bei der Reaktion des PoIy-

(ebenso als Kolistin bekannt) sind für die chemo- myxin-formaldehyd-Derivats mit Bisulfit.

therapeutische Anwendung bevorzugte Polymyxine. Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb dadurch

In dieser Beschreibung wird die Bezeichnung Poly- gekennzeichnet, daß die Formaldehydbehandlung

myxin sowohl für Polymyxin B als auch für Polymyxin unter nahezu neutralen Bedingungen, vorzugsweise bei

E verwendet. 30 einem pH-Wert zwischen 6,6 und 6,8 durchgeführt

Bei Injektionen verursachen diese Polymyxine wird, die hierdurch gebildete Ausfällung mit ungefähr Schmerzen und unerwünschte lokale Wirkungen an 1,2 Äquivalent eines Bisulfits bei einem pH-Wert zwider Injektionsstelle. Zur systematischen Behandlung sehen 6,4 und 6,7 in Lösung gebracht, in Lösung bakterieller Infektionen wird daher vorgeschlagen gehalten wird, bis der pH-Wert auf einen pH zwischen Sulfomethyl-polymyxine zu verwenden, bei welchen 35 7,3 und 7,5 angestiegen ist und dann ohne Verzug geSchmerzen und lokale Wirkungen bei Injektion gering- friergetrocknet wird. Vorzugsweise erfolgt die Behandfügig sind. Ein Sulfomethyl-polymyxin ist ein Derivat lung mit Formaldehyd in Gegenwart eines wäßrigen eines Polymyxins, bei welchem die Aminogruppen NH₂- Alkalihydrogencarbonat/Carbonatpuffersystems von in dem Polypeptid in anionische Sulfomethylamino- ungefähr 2 N. Ein Alkalimetallhydrogencarbonat kann gruppen NH · CH₂ · SO₃- umgewandelt werden durch 40 allein verwendet werden, es ergibt aber einen pH-Wert, Behandeln einer wäßrigen Lösung eines Salzes (wie welcher etwas unter dem bevorzugten Wert liegt. Die eines Sulfats oder Hydrochloride) des Polymyxin mit Verwendung eines Alkalimetall-hydroxyds, wie dies in Formaldehyd und wäßrigem Alkali und Lösen des aus- der USA.-Patentschrift 2 599 950 und den ausgelegten gefällten Polymyxin-formaldehyd-Derivats durch Reak- Unterlagen des japanischen Patents 4898/57 betion.mit einer Bisulfitlösung. Sulfomethyl-polymyxine, 45 schrieben istjdst nicht zufriedenstellend, da sie einen welche aus Polymyxin D beziehungsweise aus den zu hohen pH-Wert ergibt und schließlich zu einem Polymyxinen A, B und E hergestellt werden, sind in den SuIfomethylpolymyxin führt, welches nur uner-USA.-Patentschriften 2 599 950 und 3 044 934 und den wünscht geringe antibakterielle Wirksamkeit aufweist, ausgelegten Unterlagen des japanischen Patents .. Bei der nächsten Reaktionsstufe soll das Polymyxin-4898/57 beschrieben. 50 formaldehydderivat mit ungefähr 1,2 Äquivalent Bi-

Es wurde nunmehr gefunden, daß, SuIf omethyl-poly- sulfit behandelt werden. Es ist nicht zufriedenstellend,

myxine, welche sehr unterschiedliche Toxizitäten und die errechnete äquivalente Menge oder die minimale

antibakterielle Wirksamkeiten aufweisen, aus einem Menge, welche erforderlich ist, um das Derivat in Lö-

gegebenen Polymyxin durch kleine Abänderungen der sung zu bringen, zu verwenden, wie dies in den USA.-

Reaktionsbedingungen hergestellt werden können. 55 Patentschriften 2 599 950 und 3 044 934 und den aus-

Durch Versuche der akuten Toxizität der Polymyxine gelegten Unterlagen des japanischen Patents 4898/57 be-

bei Mäusen durch Bestimmen der intravenösen Dosis, schrieben ist. Es ist erforderlich, den pH-Wert des

die erforderlich ist, um die Hälfte der Mäuse einer Reaktionsgemisches sorgfältig unter Kontrolle zu hal-

Gruppe zu töten (LD₅₀), wurde gefunden, daß die ten; er sollte fortlaufend überprüft und zwischen 6,4

Sulfomethyl-polymyxine mit LD₅₀ unter ungefähr 60 und 6,7, vorzugsweise bei ungefähr 6,6, gehalten wer-

100 mg/kg Körpergewicht bei Injektion unerwünschte den. Der pH-Wert kann geeigneterweise auf diesem

Schmerzen verursachen und diejenigen mit LD₅₀ Wert durch Zugabe weiterer kleiner Mengen von Bi-

über ungefähr 250 mg/kg Körpergewicht eine uner- sulfit gehalten werden.

wünscht geringe antibakterielle Wirksamkeit haben und Bei dieser Stufe hat die Alterung des in Lösung be-

damit eine unnötig vergrößerte Dosismenge erfordern. 65 findlichen Produkts zu erfolgen, wenn ein Sulfo-

Zusätzlich wurde gefunden, daß wenn der LD₅₀- methyl-polymyxin mit den gewünschten Eigenschaften

Wert höher als dieser Optimalbereich ist, ein wesent- erhalten werden soll. Es wurde gefunden, daß der Alte-

licher Teil des Sulfomethylderivats innerhalb weniger rungsablauf erfahrungsgemäß durch Beobachten des