-
Verfahren zur Herstellung injizierbarer Insulinpräparate mit verzögerter
Wirkung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung inj izierbarer
Insulinpräparate mit verzögerter Wirkung.
-
Es sind klinisch verwendbare, injizierbare Insulinzubereitungen bekannt,
die als aktiven Bestandteil amorph gefälltes Zinkprotamininsulin in wäßriger Suspension
enthalten (pH etwa 7). Auf dem Markt befindliche Präparate dieser Art enthalten
etwa 2 mg Zink und entweder 8,5 oder 12,5 mg Protamin auf iooo Insulineinheiten.
Da die zur Insulinfällung notwendige Menge Protamin durchweg etwa 6 bis 7 mg auf
iooo Insulineinheiten beträgt, enthalten die in Rede stehenden Zubereitungen einen
wesentlichen Über schuß an Protamin. Zwar ist in der Literatur die Herstellung von
wäßrigen Zink-Protamin-Insulin-Präparaten beschrieben, die keinen Überschuß an Protamin
enthalten. Solche Präparate, bei deren Herstellung jedoch Phosphatpuffer verwendet
werden, haben aber infolge fehlender Stabilität in der Praxis keine Verwendung finden
können. Ein Überschuß an Protamin ist deshalb stets für notwendig gehalten worden,
um sicher zu sein, daß keine wechselnden Mengen Insulin im gelösten Zustand vorhanden
sind, da dies zu einer Änderung der biologischen Wirkung der Präparate führen würde.
-
Diese Zubereitungen haben eine sich über mehr als 2q. Stunden erstreckende
Wirkung und sind in ausgedehntem Maße verwendet worden. Es wurde
aber
gefunden, daß die Wirkung in vielen Fällen stärker als gewünscht verzögert wurde,
so daß der Blutzuckerspiegel der Diabetiker zur Tageszeit zu hoch und zur Nachtzeit
zu tief wird. Es ist deshalb versucht worden, die Wirkung der Präparate durch Beimischung
von Insulin in gelöstem Zustand zu beeinflussen. Diese Beimischung ist industriell
ausgewertet worden, so daß Ampullen oder Flaschen mit der amorphen Zinkprotamininsulinsuspension
auch Insulin in gelöstem Zustand enthalten. Man hat auch das gelöste Insulin in
getrennte Ampullen gebracht, so daß es durch die Injektionsspritze zusammen mit
der Zink-Protamin-Insulin-Suspension aufgenommen werden mußte. Das gewöhnlich verwendete
Mischungsverhältnis betrug 2 Volumteile Insulinlösung auf i Volumteil Zink-Protamin-Insulin,
womit in solchen Fällen eine sich von 18 bis 24 Stunden erstreckende Wirkung erzielt
worden ist.
-
Indessen besitzen die so hergestellten Zubereitungen nicht die notwendige
chemische und biologische Haltbarkeit, vor allem wenn sie über einen ausgedehnten
Zeitraum aufbewahrt werden. Außerdem bietet das Mischen des gelösten Insulins mit
der Zink-Protamin-Insulin-Suspension. in der Injektionsspritze leicht Anlaß zu Irrtümern
bei der Dosierung, vor allem, wenn es durch die Patienten selber ausgeführt wird.
-
Die vorliegende Erfindung beruht nun auf der Erkenntnis, daß der Mangel
an Stabilität bei den bisher ohne Überschuß an Protamin hergestellten Suspensionen
von amorph gefälltem Zinkprotamininsulin lediglich dem verwendeten Phosphatpuffer
zuzuschreiben ist, der bei neutraler Reaktion eine hohe Bindungskraft für Zinkionen
aufweist. Für die Beständigkeit der Suspension ist es nämlich entscheidend, daß
freie Zinkionen die Löslichkeit des Insulins bei neutraler Reaktion unterdrücken.
Wenn nun die Herstellung der Präparate ohne die Stoffe erfolgt, die an sich bei
den Reaktionsbedingungen in der Lage wären, eine Reaktion zwischen Insulin und Zink
zu verhindern, beispielsweise durch Bildung schwer löslicher komplexer Zinkverbindungen,
so lassen sich beständige Zubereitungen, ohne daß dazu ein Überschuß an Protamin
notwendig ist, nur dann erzielen, wenn die angewandte Zinkmenge ausreichend ist,
die Löslichkeit des Insulins zu unterdrücken, was zahlenmäßig durch einen Gehalt
von über i/4 mg auf iooo internationale Insulineinheiten erreicht wird.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird dadurch gekennzeichnet, daß Protamin,
Insulin und eine Zinkverbindung zusammen mit Hilfsstoffen, wie Puffersubstanzen,
Isotonica, Konservierungsmittel, und das pH korrigierenden Stoffen in einem wäßrigen
Medium unter Erzielung einer sterilen Suspension von amorph gefälltem Zinkprotamininsulin
zusammengebracht werden, die einen pH-Wert von 6 bis 8, einen Protamingehalt von
2 bis 5 mg und einen Zinkgehalt von über o,25 mg auf iooo internationale Insulineinheiten
aufweist. Man verwendet bei der Herstellung der Suspension solche Hilfsstoffe, die
unter den angewendeten Reaktionsbedingungen keine schwer löslichen und bzw. oder
komplexen Zinkverbindungen bilden, die das Ausfällen des Insulins mittels Zink bei
neutraler Reaktion verhindern.
-
Es ist bekannt, daß Zink-Insulin mit Natriumacetat als Hilfsstoff
bei einem pH-Wert von 7 kaum noch gelöstes Insulin enthält, daß also ein solches
Insulin-Präparat eine außerordentlich starke retardierende Wirkung besitzt. Da nun
das Bindungsvermögen von Protamin gegenüber Insulin ebenfalls bekannt ist, so wird
man annehmen, daß bei Zusatz von Protamin zu Zink-Insulin-Natriumacetat eine verstärkte
retardierende Wirkung zu verzeichnen ist, auch wenn das Protamin im Unterschuß zugegeben
wird.
-
Es war somit nicht vorauszusehen, daß bei Zugabe von 2 bis 5 mg auf
i ooo internationale Insulineinheiten, also einem Unterschuß, trotz des Vorliegens
von Natriumacetat als Puffer, eine zunehmende Lösung an Insulin eintritt, d. h.
eine gemäßigte retardierende Wirkung zu verzeichnen ist und daß bei Vorliegen von
Natriumacetat-Puffer und trotz des Vorliegens einer bestimmten Menge gelösten Insulins
eine genügende Stabilität zu verzeichnen ist.
-
Nach der Erfindung ist es angemessen, einen Zinkzusatz von i bis 5
mg auf iooo internationale Insulineinheiten zu verwenden, doch lassen sich indessen
auch beträchtlich größere Zinkzusätze anwenden. Zum Beispiel kann man einen Zinkzusatz
von 2o mg oder mehr auf iooo internationale Insulineinheiten sehr wohl verwenden,
vorausgesetzt, daß die zugesetzte Zinkmenge nicht so groß ist, daß unerwünschte
Erscheinungen erhalten werden, z. B. Schmerzen an der Injektionsstelle.
-
Die hergestellte Suspension 'weist ferner am zweckmäßigsten einen
pH-Wert von etwa 7 auf, da hierdurch die beste Stabilität erreicht wird.
-
Wenn ein Zusatz von Pufferstoffen verwendet wird, sind Acetat-, Barbiturat-,
Borat- und Maleat-Puffer geeignet. Andererseits ist ein Citratpuffer ungeeignet,
da Citrationen mit Zink komplexe Verbindungen bilden.
-
Mittels der vorliegenden Erfindung wird es nicht allein möglich, auf
der Basis von amorph gefälltem Zinkprotamininsulin Präparate mit 18 bis 24 Stunden
Wirkung herzustellen, sondern es wird auch möglich, die Wirkung gewünschtenfalls
nach unten abzustufen, indem der Protamingehalt der Zubereitungen vermindert wird,
ohne daß die Stabilität derselben leidet, da das vorhandene Zink die Beständigkeit
sichert. Schon aus diesem Grunde bedeutet die vorliegende Erfindung einen beträchtlichen
Fortschritt, da sie die Möglichkeit eröffnet, eine gesteigerte klinische Anwendbarkeit
von Insulinpräparaten zu erzielen, die auf amorph gefälltem Zinkprotamininsulin
aufgebaut sind, was lange Zeit vergeblich gesucht worden ist.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich ausführen, indem die angewendeten
Ausgangsmaterialien (amorphes Insulin, Protamin, Zinkverbindung, destilliertes Wasser
und gewünschtenfalls Puffer, ein Isotonicum und ein Konservierungsmittel
)
in jeder beliebigen Reihenfolge gemischt werden und dann nötigenfalls der pH-Wert
der erhaltenen :Mischung auf 6 bis 8, vorzugsweise etwa 7, eingestellt wird. Hierbei
wird unter aseptischen Bedingungen gearbeitet, wenn die Ausgangsmaterialien in steriler
Form vorliegen, z. B. als sterile Lösungen, wobei man sich versichern muß, daß im
Fall, daß nach dem Verfahren eine nicht sterile insulinhaltige Mischung erhalten
wird, das Insulin in gelöstem Zustand vorliegt und eine Sterilisation, z. B. eine
Keimfiltration, eingeschaltet wird, bevor das Insulin unter aseptischen Bedingungen
gefällt wird und die nachfolgenden Zusätze in steriler Form ausgeführt werden.
-
Als Zinkverbindung läßt sich ein anorganisches oder organisches Salz
verwenden, beispielsweise das Chlorid, Sulfat, Nitrat oder Acetat, ferner das Hydroxyd
oder Oxyd.
-
An Stelle von amorphem Insulin läßt sich auch kristallisiertes Insulin
als Ausgangsmaterial verwenden, doch ist in diesem Fall Bedingung, daß das kristalline
Insulin in einer der Stufen des Verfahrens in Lösung gebracht wird.
-
Außerdem ist es zweckmäßig, das Insulin in Form einer sauren Lösung
von amorphem oder kristallinem Insulin zu verwenden, so daß die Ausfällung des amorphen
Insulins während der Zubereitung selbst stattfindet, wodurch die günstigsten physikalischen
Bedingungen für die Ausfällung geschaffen werden.
-
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird eine saure
Insulinlösung mit einer Lösung der anderen Ausgangsstoffe gemischt, ausgenommen
den Pufferstoff, wonach eine Keimfiltration ausgeführt wird und dann unter aseptischen
Bedingungen eine sterilisierte Lösung des Pufferstoffes, gegebenenfalls zusammen
mit pH einstellenden Stoffen, zugesetzt wird, um einen pH-Wert zwischen 6 und 8,
vorzugsweise etwa 7, zu erhalten.
-
Amorphes Insulin läßt sich mit verschiedenen Zinkmengen kombinieren.
Demzufolge ist es auch möglich, bei der Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung
amorphes Insulin mit einem solchen Zinkgehalt zu verwenden, daß der Zinkgehalt der
Endsuspension ganz oder teilweise von dem angewandten amorphen Insulin herrührt.
-
An Stelle von amorphem Insulin läßt sich auch kristallines Insulin
mit einem entsprechenden Zinkgehalt verwenden, doch muß in diesem Fall das kristalline
Insulin in gelöstem Zustand vorliegen oder während der Herstellung für die nachfolgende
Ausfällung in amorphem Zustand in Lösung gebracht werden.
-
Um eine isotonische Lösung zu erhalten, können Substanzen, wie Glucose,
Natriumchlorid und Glycerin verwendet werden. Beispiele geeigneter Konservierungsmittel
sind Methyl-p-oxybenzoat, Propyl-p-oxybenzoat und Phenylmercuriacetat.
-
Um das erfindungsgemäße Verfahren näher zu veranschaulichen, wird
auf die entenstehenden Beispiele Bezug genommen, die verschiedene Ausführungsformen
zeigen. Zur Ausführung der Erfindung lassen sich folgende sterile Stammlösungen
verwenden: Stammlösung 1: 2,2 g umkristallisiertes Insulin werden in 25 ccm o, i
n-Salzsäure gelöst und mit destilliertem Wasser auf 125 ccm aufgefüllt.
-
Stammlösung 2: 5oo mg Protaminsulfat werden in Wasser unter Erhalt
eines Volumens von iooccm gelöst.
-
Stammlösung 3 : 20 ccm einer wäßrigen Zinkchloridlösung mit i '°/o
Zink werden mit destilliertem Wasser auf 125 ccm aufgefüllt.
-
Stammlösung q.: 1,36 g Natriumacetat mit 3 Mol Kristallwasser werden
in destilliertem Wasser unter Erhalt eines Volumens von ioo ccm gelöst.
-
Stammlösung 5: 1,16 g Maleinsäure werden in destilliertem Wasser unter
Erhalt eines Volumens von ioo ccm gelöst.
-
Stammlösung 6: 2,o6 g barbitursaures Natrium werden in destilliertem
Wasser unter Erhalt eines Volumens von ioo ccm gelöst.
-
Stammlösung 7: 0,95 g Borax werden in destilliertem Wasser
unter Erhalt eines Volumens von wo ccm gelöst. Beispiel i 1,3 ccm Glycerin werden
mit o,5 ccm einer 25o/oigen Lösung von Methyl-p-oxybenzoat in Äthanol gemischt,
worauf So ccm destilliertes Wasser zugefügt werden. Zu dem erhaltenen Gemisch werden
nach sterilem Filtrieren io ccm Stammlösung i, i ccm Stammlösung 2, 2,5 ccm Stammlösung
3 und io ccm Stammlösung q. zugesetzt, worauf 3 ccm einer sterilen o, i n-NaOH zugefügt
werden und die Mischung mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von ioo
ccm aufgefüllt wird.
-
Durch den Zusatz von NaOH wird das Zinkprotamininsulin amorph ausgefällt,
und die erhaltene Suspension zeigt den pH-Wert 7. Sie enthält etwa i mg Zink und
1,25 mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten. Beispiel 2 Die
Verfahrensweise ist dieselbe wie im Beispiel i, jedoch wird die Menge der verwendeten
Stammlösungen 2 und 3 verdoppelt mit dem Ergebnis, daß die erzielte Suspension etwa
2 mg Zink und 21/z mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten enthält.
-
Beispiel 3 Die Verfahrensweise ist dieselbe wie im Beispiel 2, doch
wird die Menge (q. ccm) der Stammlösung 2 verdoppelt mit dem Ergebnis, daß die Endsuspension
etwa 2 mg Zink und 5 mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten enthält.
Beispiel q.
-
Die Verfahrensweise ist dieselbe wie im Beispiel 3 mit der Ausnahme,
daß 2o ccm anstatt von 5 ccm der Stammlösung 3 verwendet werden. Die
Endsuspension
enthält darauf 8 mg Zink und 5 mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten.
Beispiel 5 i,3 ccm Glycerin werden mit o,5 ccm einer 2511/oigen Lösung von Methyl-p-oxybenzoat
in Äthanol gemischt, worauf 50 ccm destilliertes Wasser zugesetzt werden.
Zum erhaltenen Gemisch werden nach sterilem Filtrieren io ccm der Stammlösung i,
5 ccm der Stammlösung 3, 4 ccm der Stammlösung 2 und io ccm der Stammlösung 5 hinzugesetzt,
worauf 21,5 ccm einer sterilen o,i n-NaOH zugesetzt werden und das Gemisch mit Wasser
bis auf ein Volumen von ioo ccm verdünnt wird. Die erhaltene Suspension von amorphem
Zinkprotamininsulin besitzt einen pH-Wert von 7 und enthält etwa 2 mg Zink und 5
mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten. Beispiel 6 Die Verfahrensweise
ist dieselbe wie im Beispiel 5, mit der Ausnahme, daß io ccm der Stammlösung 6 an
Stelle von io ccm der Stammlösung 5 verwendet und darüber hinaus 4,5 ccm einer sterilen
o, i n-HCl verwendet werden an Stelle von 2,4 ccm einer o,i n-NaOH. Die erhaltene
Suspension enthält 2 mg Zink und 5 mg Protamin auf iooo internationale Insulineinheiten.
Beispiel -7 Die Verfahrensweise ist dieselbe wie im Beispiel 6 mit der Ausnahme,
daß io ccm der Stammlösung 7 an Stelle von io ccm der Stammlösung 6 verwendet werden
und weiterhin o,9 ccm einer 5 sterilen o,i n-HCl an Stelle von 4,5 ccm verwendet
werden.