DE10001377A1

DE10001377A1 - bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 und diesen enthaltendes Arzneimittel

Info

Publication number: DE10001377A1
Application number: DE2000101377
Authority: DE
Inventors: Andre Bahr; Thomas Hankeln; Erwin Robert Schmidt; Andreas Winterpacht; Bernhard Zabel
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2001-08-02

Abstract

Beschrieben werden ein bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 und dazu verwandte Proteine, sowie für diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Beschrieben werden ferner an diesen Traskriptionsfaktor bzw. dazu verwandte Proteine bindende Antikörper sowie gegen die Expression des Transkriptionsfaktors gerichtete Antisense-RNAs bzw. Ribozyme, wobei diese Verbindungen als Arzneimittel oder in Diagnoseverfahren von Nutzen sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen bHLH-Transkriptions faktor ASCL3 und dazu verwandte Proteine, sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner an diesen Transkriptionsfaktor bzw. dazu verwandte Proteine bindende Antikörper sowie gegen die Expression des Transkriptionsfaktors gerichtete Antisense-RNAs bzw. Ribozyme. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und Diagnoseverfahren, bei denen die vorstehenden Verbindungen zur Anwendung kommen.

Die terminale Chromosomenregion 15.3 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 11 (11p15.3) gilt als genreich und ist gekennzeich net durch eine Vielzahl erblicher Erkrankungen, die hier mit Hilfe genetischer Methoden lokalisiert wurden. Das Spektrum der Erkrankungen beinhaltet Entwicklungsstörungen und Miß bildungen, Dysplasien (Beckwith-Wiedemann-Syndrom, Free man-Sheldon-Syndrom, Atrophia areata), kardiovaskuläre Erkran kungen (Romano-Ward-Syndrom, Jervell-Lange-Nielsen-Syndrom), Stoffwechselstörungen und neurodegenerative Erkrankungen (Dia betes, Hyperinsulinämie, Nesidioblastose, Verstopfung, Nie mann-Pick-Krankheit, Jansky-Bielschowsky-Krankheit), Taubheit und Seh-Defekte (Usher-Syndrom), Hämoglobinopathien etc. Be sonders auffällig ist auch die Assoziation dieser Genomregion mit Tumorerkrankungen. Die Liste umfaßt z. B. Leukämien, Nephroblastome, Rhabdomyosarcome, rhabdoide Tumore, adrenocor ticale Carcinome, Hepatoblastome, Neuroblastome, Blasenkrebs, testikuläre Keimzelltumore, Ovarial-Carcinome, Brustkrebs, Lungen- und Magenkrebs. Allerdings konnten bisher nur wenige Kandidatengene aus 11p15.3 identifiziert und analysiert wer den, so daß ein starker Bedarf an solchen Markergenen besteht, die u. U. mit bestimmten, z. B. den vorstehend diskutierten Erkrankungen, assoziiert und von therapeutischem bzw. diagnostischem Wert sind.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Pro blem zugrunde, Marker bereitzustellen, die mit dem Vorhanden sein oder der möglichen Entwicklung von mit der chromosomalen Region 11p15.3 in Zusammenhang stehenden Erkrankungen korre liert sind und die für eine Diagnose, Prognose und/oder Thera pie dieser Erkrankungen von Nutzen sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus führungsformen erreicht.

Es konnten Nucleinsäuremoleküle (ASCL3 und Ascl3) identifi ziert werden, die für einen bisher nicht bekannten bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codieren. Das Gen ASCL3 wurde im mensch lichen Genom im Bereich 11p15.3 und das Gen Ascl3 im Genom der Maus auf Chromosom 7 identifiziert. Es kann davon ausgegangen werden, daß Störungen bei der Expression dieser Gene bzw. Veränderungen, die zu einem bHLH-Transkriptionsfaktor mit gestörter oder fehlender Funktion führen, in der Störung der Expression der von diesem Transkriptionsfaktor kontrollierten Gene resultieren, was zu eine der vorstehenden Erkrankungen führen kann, beispielsweise zur Entwicklung einer der vor stehenden Tumore, da Transkriptionsfaktoren aufgrund ihrer Regulations-Funktion als Kandidaten für die Auslösung von Tumorerkrankungen gelten. Die identifizierten Gene ASCL3 bzw. Ascl3 weisen eine "helix-loop-helix"-Region und eine DNA-Bin dedomäne auf, die Homologien zu dem "achaete-scute"-Genkomplex von Drosophila melanogaster (vgl. Jimenez und Modolell, Cur rent Biology 3 (1993), 626-632) zeigen. Der "achaete scute(as-c)"-Genkomplex von Drosophila melanogaster enthält vier miteinander verwandte Gene, die für die Ausbildung neura len Gewebes verantwortlich sind und durch ihre zellspezifische Expression die Topologie des Nervensystems der Fliege definie ren. Mutationen der as-c-Gene führen u. a. zu Fehlentwicklungen der kutikulären Sinnesorgane. Auch codieren die as-c-Gene für Transkriptionsfaktoren mit einer basischen helix-loop-helix- (bHLH)-Domäne. "Achaete-scute-like"(ASCL)-Gene konnten auch in Mensch und Maus nachgewiesen werden, nämlich das ASCL1-Gen auf Chromosom 12q22-23 und das ASCL2-Gen auf Chromosom 11p15.5. Beide Gene codieren für einen Transkriptionsfaktor mit einem bHLH-Motiv. Der Transkriptionsfaktor ASCL1 wird als ein Kon trollfaktor bei der Entwicklung neuronaler Vorläuferzellen in bestimmten neuralen Zellinien angesehen. Ferner ist der Transkriptionsfaktor ASCL1 in neuroendokrinen Tumoren, medul lären Thyroid-Tumoren und kleinzelligem Lungenkrebs stark exprimiert. Des weiteren wird der Transkriptionsfaktor ASCL2 als essentiell für die Entwicklung der Plazenta angesehen.

Aufgrund der chromosomalen Lokalisation des Gens, das für den erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 codiert, und der Verwandtschaft zu as-c- bzw. ASCL-Genen, die mit bestimm ten Krankheiten assoziiert sind, kann davon ausgegangen wer den, daß der erfindungsgemäße bHLH-Transkriptionsfaktor bei der Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen nützlich ist, bei denen eine pathologische Erhöhung oder Erniedrigung der Expression der von diesem Transkriptionsfaktor kontrol lierten Gene vorliegt.

Somit kann für eine therapeutische Intervention bei Erkrankun gen, die mit einer zu niedrigen Aktivität des erfindungsgemä ßen bHLH-Transkriptionsfaktors oder einer zu geringen Expres sion der von diesem kontrollierten Gene assoziiert sind, die Verabreichung dieses Faktors oder des für diesen codierenden Gens nützlich sein. Andererseits kann auch die Möglichkeit der Inaktivierung dieses Transkriptionsfaktors bei Erkrankungen, die mit einer zu hohen Aktivität des bHLH-Transkriptionsfak tors oder einer zu hohen Expression der von diesem kontrol lierten Gene einhergehen, therapeutisch sinnvoll sein. Eine solche Inaktivierung kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, beispielsweise auf genetischer Ebene ("Knock out", Hemmung der Translation durch Antisense-RNAs oder Ribozyme) oder Protein ebene (über den Transkriptionsfaktor hemmende Liganden, bei spielsweise Antikörper oder Antagonisten, Kinase/Phosphatase- Inihibitoren, Hemmung der Bindung des Transkriptionsfaktors an Pol I etc.). Voraussetzung für die vorstehend diskutierten therapeutischen Möglichkeiten ist allerdings, daß der erfin dungsgemäße Transkriptionsfaktor in ausreichenden Mengen und in möglichst reiner Form zur Verfügung steht bzw. das für diesen codierende Gen, was einerseits dessen rekombinante Herstellung ermöglicht, andererseits auch eine auf Gentherapie basierende Behandlung. Die vorliegende Erfindung stellt diese Verbindungen zur Verfügung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Se quenz, die für einen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 mit der in Fig. 1 (Mensch) oder Fig. 2 (Maus) gezeigten Aminosäure sequenz codiert, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die DNA-Sequenz die in Fig. 1 oder Fig. 2 gezeigte Nuclein säuresequenz enthält. Eine die DNA-Sequenz von Fig. 1 umfas sende DNA wurde als LLNLP704J141117Q3 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 21. Dez. 1999 unter DSM 13213 hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines von den vorstehenden erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptionsfaktors codiert, die sich aber von der DNA- Sequenz von Fig. 1 oder Fig. 2 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, die mit den vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisiert oder die ein Frag ment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der vorstehenden DNA-Sequenzen ist.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridi siert" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedin gungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 6 × SSC, 1% SDS und 1 × Denhardts-Lösung verwendet werden und bei denen die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 45°C liegen. Nach der Hybridi sierung wird vorzugsweise mit 2 × SSC, 1% SDS oder mit 0,2 × SSC (stringente Bedingungen) bei Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, vorzugsweise bei 50°C gewaschen (zur Definition von SSC und Denhardts-Lösung vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, oder Current Protocols in Molecu lar Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Va riante" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich ge genüber den in Fig. 1 oder Fig. 2 angegebenen Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder ande re im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen codierte Protein noch die biologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 aufweist und in Säugern bio logisch aktiv ist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäure sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die biologischen Eigenschaften des erfin dungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors verfügt.

Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vor stehend beschriebenen DNA-Sequenzen kann die Synthese des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors bzw. der verwand ten Proteine verringert oder eliminiert werden, was beispiels weise bei einem Teil der in der Einleitung beschriebenen Er krankungen wünschenswert ist. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu den vorstehenden DNA-Sequenzen komplementär ist und die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptions faktors verringern oder hemmen kann und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zu den vorstehenden DNA-Se quenzen komplementär ist und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Transkriptionsfaktors ebenfalls verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen, ge eignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA-Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang. Sie können andere RNAs inter molekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemä ßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Die Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (vgl. beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. die für die vorste hend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DNAs können auch in einen Vektor, vorzugsweise einen Expres sionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül in dem Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, welche die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp- oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryo ten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40- oder RVS-40-Promotor bzw. CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind außerdem beschrieben in Goeddel: Gene Expres sion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Weitere Beispiele für geeignete Pro motoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Pro motor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 sowie von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg stammende Vektoren. Zu den erfindungs gemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abge leitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, bei spielsweise pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die erfindungs gemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthal ten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispiels weise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfah ren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispiels weise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Die erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden, so daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispiels weise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend be schriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirts zellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirts zellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter Ver wendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind dem Fach mann bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen von den erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 bzw. Proteine mit dessen biologischer Aktivität sowie Verfahren zu deren rekombinanten Herstellung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Das erfindungs gemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend be schriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expres sion des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugs weise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann sind Bedin gungen bekannt, um transformierte bzw. transfizierte Wirts zellen zu kultivieren. Geeignete Reinigungsverfahren (bei spielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromato graphie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Er findung betrifft Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine (bHLH- Transkriptionsfaktor ASCL3 oder verwandte Proteine). Diese Antikörper können beispielsweise in diagnostischen Assays verwendet werden oder für therapeutische Zwecke, wobei es nach Anlagerung an das Zielmolekül, d. h. den bHLH-Transkriptions faktor, zu dessen Hemmung kommt. Die Antikörper können mono clonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen.

Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Anti körpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Anti körper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein syntheti sches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Ge winnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genann te monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stam mender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chi märer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, mensch lichen Antikörpern ähnelnde oder humanisierte Antikörper be sitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht vermindert. Die Her stellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde aus führlich beschrieben (vgl. beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Ak zeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinie renden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht mensch lichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Be reich (e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentli chen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabrei chung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das mensch liche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell frem den chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, klei nere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise auch zur Immunpräzipitation des erfindungsgemäßen bHLH-Transkrip tionsfaktors ASCL3, zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken oder für diagnostische Zwecke (siehe nachstehend) verwendet werden. Geeignete cDNA-Expressions banken basieren z. B. auf den Expressionsvektoren lambda.gt11, lambda.gt18-23, lambdaZAP und lambda.ORF8. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend be schriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.

Die vorliegende Erfindung erlaubt ferner die Durchführung therapeutischer Maßnahmen bei den vorstehend beschriebenen Erkrankungen, d. h., die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Anti sense-RNAs, Ribozyme und Antikörper können auch zur Herstel lung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors. (oder des damit verwandten Proteins) oder zum Austausch einer mutierten Form des Gens gegen eine funktionelle Form verwendet werden. Ein solches Arzneimittel kann daher zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die entwe der mit einer erhöhten oder erniedrigten Aktivität des erfin dungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 assoziiert sind. Bei Verabreichung des Transkriptionsfaktors selbst kann es günstig sein, diesen an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder Rinderseru malbumin (BSA), zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, eine Antisense-RNA oder ein Ribozym in Säuger, insbesondere den Menschen, eingebracht und exprimiert werden, vorzugsweise als Insertion in einem der nachstehend beschrie benen Vektoren. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, beispielsweise einem monoclonalen Antikörper, kann die Aktivität des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors bzw. der verwandten Proteine ebenfalls kontrolliert und reguliert wer den.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimit tel, das die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, Antisense-RNAs, Ribozyme, Expressionsvektoren, den erfindungs gemäßen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein Protein mit dessen biologischer Aktivität oder Antikörper enthält. Das Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharma zeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formu lierung eines derartigen Arzneimittels sind dem Fachmann be kannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispiels weise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subku tane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, in travenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt be stimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Pro motors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Se quenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Ade novirus, Vaccinia-Virus oder Adeno-assoziiertes Virus. Be sonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für die Gentherapie geeignete Vektoren sind außerdem in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 und WO 92/06180 offenbart. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (vgl. Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Die Gentherapie kann sowohl für die Erhöhung der Aktivität des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 (beispielsweise mit einem Expressionsvektor, der das ASCL3-Gen oder Ascl3-Gen enthält) als auch für eine Verringerung der Aktivität (mit einem Vek tor, der ein Gen für ein Ribozym, eine Antisense-RNA oder eine inaktive Form des bHLH-Transkriptionsfaktors ("knock-out") enthält) Anwendung finden.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, Störungen der Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 auf genetischer Ebene zu untersuchen. Mit einer erfin dungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, festge stellt werden, ob sie ein verändertes ASCL3-Gen enthalten, das zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist, oder ob beispielsweise der Trans kriptionsfaktor zu gering oder zu stark exprimiert wird. Dazu kann der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkrip tion, PCR, RT-PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper oder Frag mente davon eignen sich für die Diagnostik, d. h. beispiels weise zum Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Konzen tration des Transkriptionsfaktors, einer verkürzten oder ver längerten Form dieses Proteins etc., in einer Probe. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüs sigphase vorliegen oder an einen festen Träger gebunden wer den. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für Immunoassays sind ELISA und RIA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnose verfahren zum Nachweis einer eventuell gestörten Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3, bei dem man eine Probe mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem erfindungsgemäßen Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration, Länge und/oder Aminosäure-Sequenz des bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 oder die Konzentration, Länge und/oder Nucleinsäuresequenz der für diesen codierenden DNA bzw. mRNA im Vergleich zu einer Kon trollprobe unterscheiden. Die für dieses Diagnoseverfahren verwendbaren Sonden umfassen auf den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen basierende Primer, beispielsweise für eine PCR. Vorzugsweise sind die Sonden Oligonucleotide, die einen Nu cleinsäure-Bereich umfassen, der unter stringenten Bedingungen mit mindestens 10 aufeinanderfolgende Nucleotiden der Sequenz von Fig. 1 oder Fig. 2 oder natürlich vorkommenden Varianten bzw. Mutanten davon hybridisiert. Die Sonde kann auch eine Markierung tragen, z. B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung einen diagno stischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und/oder einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon enthält. Die DNA-Sequenz bzw. der Antikörper oder das Fragment davon können dabei in immobilisierter Form vorliegen. Ferner kann der diagnostische Kit übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Marker, Puffer, Kontrollen, etc., enthalten.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Nucleinsäure-Sequenz des für den humanen bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codierenden Gens und davon abgeleitete Aminosäuresequenz
Die Exon-Sequenzen sind einfach unterstrichen, Translations start- und stopkodon sind doppelt unterstrichen. Die Aminosäu resequenz ist unterhalb der Basensequenz gezeigt.

Fig. 2: Nucleinsäure-Sequenz der für den murinen bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codierenden cDNA und davon abgeleitete Aminosäuresequenz

Fig. 3: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der humanen und murinen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 68,4%. Die vor hergesagten "helix-loop-helix"-Domänen sind unterstrichen, die basische DNA-Bindedomäne ist doppelt unterstrichen.

Fig. 4: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenz des humanen bHLH- Transkriptionsfaktors ASCL3 mit einem Protein unbekannter Funktion aus C.elegans.
Die beiden Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 33%. Die größte Übereinstimmung ergibt sich dabei im Bereich der "helix-loop-helix"-Domäne (unterstrichen) und der basischen DNA-Bindedomäne (doppelt unterstrichen).

Fig. 5: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden humanen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3 und ASCL1 (Ver gleichsprotein)
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 25%. Diese be schränkt sich fast ausschließlich auf die "helix-loop-helix"- Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindedomäne (dop pelt unterstrichen).

Fig. 6: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden humanen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3 und ASCL2 (Ver gleichsprotein)
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 35,1%. Auch hier beschränkt sich diese im wesentlichen auf die "helix-loop- helix"-Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindedomäne (doppelt unterstrichen).

Fig. 7: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenz des humanen bHLH- Transkriptionsfaktors ASCL3 mit dem T3-Protein des D.melano gaster "Achaete scute"-Komplexes
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 24,5%. Diese beschränkt sich auch hier im wesentlichen auf die "helix-loop helix"-Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindungs domäne (doppelt unterstrichen).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Bestimmung der murinen Ascl3-cDNA-Sequenz

Das murine Gen AscL3 erstreckt sich über einen Bereich von 4,2 kb auf Chromosom 7 der Maus. Zu seiner Bestimmung wurde von einem cDNA-Clon (IMAGp998L19858; BAC-Clon 42H1, Genome Systems Inc.) ausgegangen. Durch Sequenzierung dieses Clons konnten 677 bp der cDNA-Sequenz ermittelt werden. Weitere 29 bp aus dem 5'-Bereich konnten durch Sequenzierung von RT-PCR-Produkt en bestimmt werden. Der 5'-nicht-translatierte Bereich hat eine Länge von mindestens 60 bp, der 3'-nicht translatierte Bereich erstreckt sich über 124 bp. Die mRNA besitzt einen offenen Leserahmen von 522 bp, der für ein Protein von 174 Aminosäuren kodiert. An Position 192 der mRNA war bei RT-PCR Experimenten ein Polymorphismus zu beobachten, hier wurde sowohl die Base A (wie in der genomischen Sequenz) als auch die Base G bestimmt. Dieser Polymorphismus führt nicht zum Austausch einer Aminosäure. Der cDNA-Clon IMAGp998L19858 stammt aus 13,5 und 14,5 Tage alten Mäuseembryonen. Durch RT-PCR konnte das Transkript zusätzlich in 17,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden, nicht jedoch in 11,5 Tage alten Embryonen. Diese Daten deuten daraufhin, daß das Gen in spä tembryonalen Stadien exprimiert wird.

Beispiel 2 Bestimmung der humanen ASCL3-Sequenz

Das orthologe humane Gen ASCl3 erstreckt sich über einen ge nomischen Bereich von 5,4 kb und ist auf dem chromosomalen Bereich 11p15.3 lokalisiert. Die Genstruktur wurde durch den Vergleich mit dem murinen ASCL3 Gen ermittelt, da keinerlei EST-Daten oder cDNA-Clone beim Menschen vorliegen; zur Auf findung diese Gens wurde der PAC-Clon LLNLP704J141117Q3 (Res sourcenzentrum RZPD, Berlin) verwendet. Das Gen ASCL3 codiert für eine aus 2 Exons bestehende mRNA von etwa 650 bp Länge (Fig. 1). Der 5'-nicht-translatierte Bereich hat eine Länge von mindestens 30 bp, der 3'-nicht-translatierte Bereich um faßt 47 bp. Aus dem offenen Leserahmen der mRNA läßt sich ein Protein von 181 Aminosäuren ableiten.

Beispiel 3 Vergleich der Aminosäure-Sequenzen des Gens ASCL3 (Mensch) mit dem Gen Ascl3 (Maus) und weiteren verwandten Genen

Ein Vergleich der Proteine aus Mensch und Maus ergab eine Übereinstimmung von 68,4% (Fig. 3). Das Programm PSORT2 sagte mit einer Wahrscheinlichkeit von 94% eine Lokalisation beider Proteine im Zellkern voraus. Die Analyse mit verschiedenen Programmen identifizierte beide Proteine als Mitglieder der Familie der basischen "helix-loop-helix"-Proteine (bHLH). Die "helix-loop-helix"-Domäne erstreckt sich bei beiden Proteinen auf die Aminosäurepositionen 103-145, die basische Bindungs domäne wird von 10 davorliegenden Aminosäuren gebildet (Fig. 3). Eine Datenbanksuche mit den Proteinen ergaben Ähnlich keiten zu zahlreichen anderen "helix-loop-helix"-Proteinen. Die größten Übereinstimmungen zeigen dabei ein "helix-loop-he lix"-Protein aus C. elegans mit unbekannter Funktion (33%, Acc. Nr. 2498011; Figur. 4), sowie Mitglieder der "achaete scute complex (Drosophila) homologue-like" Gene der Verte braten. Die humanen Gene ASCL1 und ASCL2 zeigen eine Überein stimmung von 25,1 bzw. 35,1% zum ASCL3 Gen auf Aminosäure- Ebene (Fig. 5 und 6). Die größten Ähnlichkeiten von ASCL3 zu einem Gen des D. melanogaster "Achaete scute"-Komplexes ergeben sich zu dem T3 Gen mit 24,6% übereinstimmenden Amino säuren (Fig. 7).

Tabelle 1

Daten der Gene ASCL3 (H. sapiens) und Asc13 (M. musculus)

ks: Transkriptionsstartpunkt (experimentell oder durch Homolo gievergleich bestimmt); Poly A: Anzahl der Polyadenylierungs stellen; alternat. Spleiß.: Alternative Spleißformen vorhan den; % As: Übereinstimmung zwischen beiden Proteinen in %; % Cds: Übereinstimmung zwischen den translatierten DNA-Sequenzen der mRNA in %; HLH: "helix-loop-helix"-Domäne.

Beispiel 4 Herstellung des murinen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3

Die DNA von Fig. 2 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressions vektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expres sionsplasmid pQE-8/ASCL3 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 von Fig. 2 (C-Terminuspartner). pQE-8/ASCL3 wird zur Transforma tion von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacte riol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qia gen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 5 Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach An färbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 21 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepuffer ter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Fär bung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusions protein werden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kanin chen

Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (kom plettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phospha tase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Anti körper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwickler lösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 W Nitro blau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1. Immunisierung (kom plettes Freund's Adju vans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund's Adju vans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1. Immunisierung (kom plettes Freunds Adju vans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund s Adju vans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, codierend für einen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 mit der in Fig. 1 (Mensch) oder Fig. 2 (Maus) gezeig ten Aminosäuresequenz.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, umfassend die in Fig. 1 oder Fig. 2 gezeigte Nucleinsäuresequenz.

3. DNA-Sequenz, codierend für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines von den DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2 codierten Transkriptionsfaktors, wobei die DNA-Sequenz

a) sich von der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 in der Codon sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unter scheidet;
b) mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3(a) hybridi siert; oder
c) ein Fragment, eine allelische Variante oder eine ande re Variante der DNA-Sequenz nach Anspruch 2, 3 (a) oder 3 (b) ist.

4. Ribozym, dadurch gekennzeichnet, daß es zu einer DNA-Se quenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA-Sequenz codierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

5. Antisense-RNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA spezi fisch binden kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA- Sequenz codierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

6. Expressionsvektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine für das Ribozym nach Anspruch 4 oder die Antisense-RNA nach Anspruch 5 codierende DNA-Se quenz.

7. Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 6.

8. bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder Protein mit dessen biologischer Aktivität, der (das) von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 oder eines Proteins mit dessen biologischer Aktivität nach Anspruch 8, umfassend die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen und die Gewinnung des Proteins aus der Zelle oder dem Zuchtmedium.

10. Antikörper, der an den bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein Protein mit dessen biologischer Aktivität nach An spruch 8 bindet, oder ein Fragment davon.

11. Arzneimittel, das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprü che 1 bis 3, das Ribozym nach Anspruch 4, die Antisense-RNA nach Anspruch 5, den Expressionsvektor nach Anspruch 6, den bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein Protein mit dessen biologischer Aktivität nach Anspruch 8, oder den Antikörper nach Anspruch 10 oder das Fragment davon enthält.

12. Diagnoseverfahren zum Nachweis einer eventuell gestörten Expression des bHLH-Transkriptionsfaktors, bei dem man eine Probe mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder dem Antikörper nach Anspruch 10 oder dem Fragment davon in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration, Länge und/oder Sequenz des bHLH- Transkriptionsfaktors ASCL3 oder der für diesen codierenden DNA oder mRNA im Vergleich zu einer Kontrollprobe unterschei den.

13. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12, der die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder den Antikörper nach Anspruch 10 oder das Frag ment davon enthält.