DD296965A5 - Hefeverarbeitungssystem - Google Patents
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Abstract
Ein Polypeptid fuer die Produktion in Hefe besteht aus einer Verschmelzung von Signalpeptid, Fuehrungspeptid und heterologem Protein oder Polypeptid. Das Polypeptid wird in der Aminosaeurenfolge im Anschlusz an eine Hefeverarbeitungsstelle modifiziert, die sich zwischen dem C-Terminalende des Fuehrungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, um so eine Darbietung der Verarbeitungsstelle zu schaffen, die sie zum proteolytischen Schneiden zugaenglich macht. Das geschieht durch Hinzufuegen von einer oder mehreren Aminosaeuren (von denen wenigstens eine negativ geladen ist) entweder am C-Terminalende des Fuehrungspeptids oder am N-Terminalende des Proteins oder an beiden. Das heterologe Protein kann beispielsweise Aprotinin oder ein Insulinvorlaeufer oder deren Analog sein.{Polypeptid; Produktion in Hefe; modifizierte Hefeverarbeitungsstelle; proteolytisches Schneiden; negativ geladene Aminosaeure}
Description
Hierzu 18 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die in Hefe expressiert und verarbeitet werden, ein DNA-Gebilde, welches eine DNA-Folge mit einer Codierung dieser Polypeptide enthält. Vektoren, welche diese DNA-Fragmente tragen, und Hefezellen, welche mit den Vektoren transformiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in Hefe.
Ausgangssituation der Erfindung
Hefeorganismen produzieren eine Reihe von Proteinen, welche intrazellular produziert werden, aber eine Funktion außerhalb der Zelle haben. Diese extrazellularen Proteine werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Diese sekretierten Proteine werden zunächst innerhalb der Zelle in einem Vorläufer oder einer Protein-Vorform expressiert, die eine Vorsequenz enthalten, welche die wirksame Steuerung des expressierten Produktes durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) gewährleistet. Die Vorsequenz, die normalerweise als Signalpeptid bezeichnet wird, wird im allgemeinen während der Translozierung von dem gewünschten Produkt abgeschnitten. Sobald das Protein in die sekretorische Bahn gelangt ist, wird es zum Golgi-Apparattransportiert. Vom Golgi-Apparat aus kann das Protein verschiedenen Routen folgen, die zu Abteilen führen, wie der Zellvakuole oder der Zellmembran, oder es kann aus der Zelle herausgeführt werden, um in das äußere Medium sekretiert zu werden (Pfeffer, S. R. und Rothman, J. E„ Ann. Rev. Biochem. 56 [1987], 829-852). Verschiedene Verfahren für die Expression und Sekretion von Proteinen, die heterolog zu Hefe sind, in Hefe wurden vorgeschlagen. Die veröffentlichte europäische PA Nr. 0088632 A beschreibt einen Prozeß, bei dem Proteine, die heterolog zu Hefe sind, expressiert, verarbeitet und sekretiert werden durch Transformation eines Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel, welche eine DNA aufgenommen hat, das das gewünschte Protein codiert, und ein Signalpeptid, durch Herstellung einer Kultur des transformierten Organismus, Züchten der Kultur und Gewinnung des Proteins aus dem Kulturmedium. Das Signalpeptid kann das eigene Signalpeptid der gewünschten Proteine, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid aus natürlichem und heterologen Signalpeptid sein.
Ein Problem, das bei der Verwendung von Signal peptiden auftreten kann, die heterolog zu Hefe sind, könnte darin bestehen, daß das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translozierung und/oder Schneidung hinter dem Signalpeptid gewährleistet. S. cerevisiae MFQ1 (α-Faktor) wird als Präroform von 165 Aminosäuren synthetisiert, die ein 19 Aminosäuren langes Signal- oder Vorpeptid aufweist, gefolgt von einem 64 Aminosäuren langen „Führungs-" oder Vorpeptid, das drei N-gelinkte Glykosylationsstellen einschließt, gefolgt von (LysArg[Asp/Glu, Ala]2-3a-Faktor)4 (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 [1982], 933-943). Der Signalführungsteil von PräproMFI wurde verbreitet eingesetzt, um die Synthese und Sekretion von heterologen Proteinen in S. cerevisiae zu erreichen.
Der Einsatz von Signal-/Führungspeptiden, die homolog zu Hefe sind, ist aus der US-PS 4546 082, den veröffentlichten europäischen PA Nr. 0116201 A, 0123294A, 0123544A, 0163529A und 0123289A und den dänischen PS 2484/84 und 3614/83 bekannt.
In EP 0123289 A wird die Verwendung des S. cerevisiae-a-Faktor-Vorläufers beschrieben, während DK-PS 2484/84 die Verwendung des Invertase-Signalpeptids von Saccharomyces cerevisiae und DK-PS 3614/83 die Verwendung des PHO 5-Signalpeptids von Saccharomyces cerevisiae für die Sekretion von Fremdproteinen beschreiben. US-PS 4 546082, EP 0016201A, 0123294 A, 0123544 A und 0163529 A beschreiben Verfahren, bei denen der aFaktor-Signalführer von Saccharomyces serevisiae(MFa1 oder MFa2) genutzt wird im Sekretionprozeß der expressierten heterologen Proteine in Hefe. Durch Verschmelzen der DNA-Folge, welche die S.cerevisiae-MFa1 )-Signal-/Führungsfolge am 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein codiert, wurde die Sekretion und Verarbeitung des gewünschten Proteins demonstriert.
EP 206783 legt ein System für die Sekretion von Polypeptiden von S.cerevisiae offen, bei welchem die a-Faktorführungsfolge verkürzt wurde, um die vier a-Faktorpeptide auszuschalten, die an der natürlichen Führungsfolge vorhanden sind, um so das Führungspeptid selbst zu belassen, das über die a-Faktorverarbeitungsstelle LysArgGluAlaGluAla an ein heterologes Polypeptid verschmolzen wird. Es wird angegeben, daß diese Konstruktion zu einem effizienten Verfahren für kleinere Peptide führt, weniger als 50 Aminosäuren. Für die Sekretion und Verarbeitung von größeren Polypeptiden wurde die natürliche a-Faktorführungsfolge verkürzt, um ein oder zwei a-Faktorpolylpeptide zwischen dem Führungspeptid und dem Polypeptid zu belassen.
Eine Reihe von sekretierten Proteinen wird so geführt, daß sie einem proteolytischen Verarbeitungssystem ausgesetzt sind, welches das Peptid schneiden kann, welches an das Karboxyende von zwei aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren gebunden ist. Diese enzymatische Aktivität wird bei S.cerevisiae durch das Gen KEX2 codiert (Julius, D.A. u.a.. Cell 37 [1984b], 1075). Die Verarbeitung des Produktes durch das Genprodukt KEX2 ist für die Sekretion des aktiven S. cerevisiae-Paaru ngsfaktors α 1 (MFa 1 oder α-Faktor) erforderlich, ist aber nicht an der Sekretion des aktiven S. cerevisiae-Paarungsfaktors a beteiligt.
Die Sekretion und korrekte Verarbeitung eines Polypeptide, das sekretiert werden soll, erreicht man in einigen Fällen, wenn ein Hefeorganismus gezüchtet wird, der mit einem Vektor transformiert wird, der so aufgebaut wird, wie das in der oben genannten Folge von Referenzen ausgeführt wird. In vielen Fällen ist jedoch der Sekretionspegel sehr gering oder es erfolgt keine Sekretion oder die proteolytische Verarbeitung kann unkorrekt oder unvollständig sein. Die Autoren der vorliegenden Erfindung nehmen an, daß die bis zu einem gewissen Maße auf eine unzureichende Exponierung der zwischen dem C-Terminalendedes Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins vorhandenen Verarbeitungsstelle zurückzuführen ist, so daß diese für das proteolytische Schneiden unzugänglich oder zumindest weniger zugänglich ist.
Summarische Beschreibung der Erfindung
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß es durch bestimmte Modifikationen in der Nähe der Verarbeitungsstelle am C-Terminalende des Führungspeptids und/oder am N-Terminalende eines mit dem Führungspeptid verschmolzenen heterologen Polypeptides möglich ist, einen höheren Ertrag des korrekt verarbeiteten Proteins zu erhalten, als mit unmodifizierten Führungspeptid-Heterologpolypeptid-Konstruktionen erreicht werden kann.
Demzufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Polypeptid, das aus einer Verschmelzung eines Signalpeptids, eines Führungspeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids besteht, wobei dieses Polypeptid in der Aminosäurefolge nahe der Hefeverarbeitungsstelle modifiziert ist, die sich zwischen dem C-Terminalende des Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, so daß die Verarbeitungsstelle präsentiert und für die proteolytische Schneidung zugänglich gemacht wird, wobei das Polypeptid folgende Struktur hat:
Signalpeptid-Führungspeptid-X1-X2-X3-X4-heterologes Protein, worin X1 ein gebundenes Peptid ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, X2 und X3 gleich oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lys und Arg gebildet wird, wobei X2 und X3 zusammen eine Hefeverarbeitungsstelle bilden, und X4 ein gebundenes Peptid ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, unter der Voraussetzung, daß X1 und/oder X4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine der Aminosäuren, die durch X'und/oder X4 dargestellt wird, eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Im vorliegenden Zusammenhang versteht man unter dem Begriff „Signalpeptid" eine Präsequenz oder Vorfolge, die vorwiegend hydrophob im Charakter und als eine N-Terminalsequenz an der Vorläuferform eines extrazellularen Proteins vorhanden ist, das in Hefe expressiert wird. Die Funktion des Signalpeptids ist es, das Eintreten des zu sekretierenden heterologen Proteins in das endoplasmatische Retikulum zu ermöglichen. Das Signalpeptid wird normalerweise im Verlauf dieses Prozesses abgeschnitten. Das Signalpeptid kann heterolog oder homolog zu dem Hefeorganismus sein, welches das Protein erzeugt, aber, wie oben ausgeführt wird, eine effizientere Schneidung des Signalpeptids erreicht man, wenn es zum fraglichen Hefeorganismus homolog ist.
Unter dem Begriff „Führungspeptid" versteht man ein vorwiegend hydrophiles Peptid, dessen Funktion es ist, die Steuerung des zu sekretierenden heterologen Proteins aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Bläschen zur Sekretion in das Medium zu ermöglichen (d.h., Hinausführung des expressierten Proteins oder Polypeptids durch die Zellwand oder wenigstens durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Zelle). Mit dem Ausdruck „heterologes Protein oder Polypeptid" bezeichnet man ein Protein oder Polypeptid, das in der Natur durch den Hefewirtsorganismus nicht produziert wird. Die Begriffe „Protein" und Polypeptid" werden im wesentlichen untereinander austauschbar in der nachfolgenden Beschreibung verwendet.
Die Modifikation des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle (der Stelle, an welcher das Führungspeptid durch proteolytische Spaltung, die durch proteolytische Hefeenzyme vermittelt wird, aus dem heterologen Protein entfernt wird), welche durch X1 und/oder X4 dargestellt wird, kann die Form einer Erweiterung, Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren am C-Terminalende des Führungspeptids und/oder am N-Terminalende des heterologen Proteins haben. Entsprechend der Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß eine effizientere und korrektere Verarbeitung des heterologen Proteins erreicht werden kann, wenn wenigstens eine der Aminosäuren, mit denen die Sequenz des Polypeptids erweitert wurde oder durch die eine oder mehrere der natürlichen Aminosäuren in der Folge substituiert wurden, eine negativ geladene Aminosäure, wie die oben angegebenen, ist. Eine ähnliche Wirkung kann man beobachten, wenn eine negativ geladene Aminosäure in der Nähe der Verarbeitungsstelle durch Deletion geschaffen wird, d. h., durch Deletieren einer oder mehrerer Aminosäuren vom C-Terminalende des Führungspeptids oder vom N-Terminalende der Proteinfolge, bis eine negativ geladene Aminosäure neben der Verarbeitungsstelle vorhanden ist.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß diese Wirkung der erhöhten Hydrophilizität zuzuschreiben ist, die durch die negativ geladenen Aminosäuren neben der Verarbeitungsstelle auferlegt wird, die zu einer verstärkten Exponierung der tertiären Struktur des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle ist der wäßrigen intrazellularen Umgebung führt und diese damit zugänglicher für das proteolytische Schneiden durch das Verarbeitungsenzym macht. Die
vorteilhafte Wirkung von negativ geladenen Aminosäuren gegenüber neutralen oder positiv geladenen Aminosäuren kann den negativ geladenen Nebenketten dieser Aminosäuren zugeschrieben werden, die zur Hydrophilizität der tertiären Struktur an der Verarbeitungsstelle beitragen, ohne zu einer potentiellen Unterbindung des Verarbeitungsenzyms zu führen.
Möglich ist es auch, daß negativ geladene Aminosäuren zur Schaffung und Erhaltung einer tertiären Struktur an der Verarbeitungsstelle beitragen (z. B. Windungen, Haarnadel- und Schleifenstrukturen), wobei andere Formen wie die Wechselwirkung mit anderen Aminosäureresten im Polypeptid Anwendung finden. Außerdem könnte auch eine direkte Wechselwirkung zwischen negativ geladenen Aminosäuren und dem Verarbeitsenzym erfolgen. Es wird daher angenommen, daß negativ geladene Aminosäuren, die sich angrenzend zu den beiden basischen Aminosäuren der Verarbeitungsstelle befinden, das Verarbeitungsenzym steuern, um ein korrektes und effizientes Schneiden durch Ladungswechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder zwischen Protein und Lösungsmittel auszuführen.
Nach einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein DNA-Gebilde, das eine DNA-Folge enthält, welche das oben definierte Polypeptid codiert.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor, der in der Lage ist, Hefe zu replizieren, und der ein DNA-Gebilde trägt, welches das oben definierte Polypeptid codiert, wie auch auf einen Hefestamm, der das heterologe Protein oder Polypeptid expressieren kann und mit diesem Vektor transformiert wird.
Nach noch einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptides in Hefe, welches darin besteht, den transformierten Hefestamm in einem geeigneten Medium zu kultivieren, um die Expression und Sekretion des heterologen Proteins oder Polypeptide zu erreichen, worauf das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
In Übereinstimmung mit der oben gegebenen Erklärung ist X1, wenn es eine einzelne Aminosäure darstellt, gleich GIu oder Asp.
X1 und/oder X4 stellen vorteilhaft 1 bis 6 Aminosäuren dar.
Wenn X1 eine Folge von zwei Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur BA haben, wobei A gleich GIu oder Asp ist und B gleich GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist, beispielsweise LeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von drei Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur CBA haben, wobei A und B wie oben definiert sind und C gleich GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist, beispielsweise AspLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von mehr als zwei Aminosäuren darstellt, kann eine der zusätzlichen Aminosäuren vorteilhaft Pro oder GIy sein, da es bekannt ist, daß diese Aminosäuren Haarnadel- oder Schleifenstrukturen einführen und/oder Teil dieser Elemente sind, die wahrscheinlich die Zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für das proteolytische Enzym erleichtern.
Wenn X1 eine Folge von vier Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur DCBA haben, wobei A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu oder LeuAspLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von fünf Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur EDCBA haben, wobei A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise LeuGluArgLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von sechs Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur FEDCBA haben, wobei A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise ValLeuGluArgLeuGlu.
Es ist selbstverständlich, daß andere Kombinationen von Aminosäuren möglich sind in der Bedeutung von X1, ohne daß das eine Abweichung vom Rahmen der Erfindung darstellt, vorausgesetzt, daß wenigstens eine der Aminosäuren in der Folge eine negativ geladene Aminosäure ist, wie oben erklärt wurde.
Geeignete Bedeutungen für X4 können die für X1 gegebenen sein, obwohl die Reihenfolge der Aminosäuren im typischen Fall umgekehrt ist (d.h., ABC, statt CBA usw.).
In Ausführungsbeispielen des Polypeptids nach der Erfindung, bei denen das heterologe Protein eingeleitet wird durch eine oder mehrere positiv geladene oder hydrophobe Aminosäuren, stellt X4 vorteilhaft eine oder mehrere Aminosäuren, statt einer Peptidbindung, dar, da angenommen wird, daß die eine größere Zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für proteolytische Enzyme darstellt.
In Fällen, in denen X4 eine N-Terminalerweiterung mit 1 bis 6 Aminosäuren darstellt, kann es angemessen sein, eine zusätzliche Verarbeitungsstelle zwischen der Aminosäure oder den Aminosäuren vorzusehen, die durch X4 dargestellt werden, und dem N-Terminalende des heterologen Proteins. Das ist besonders wichtig, wenn das Protein für Zwecke genutzt werden soll, die das Vorhandensein eines Proteins ohne N-Terminalerweiterung verlangen. Die zusätzlichen N-Terminalaminosäuren können in vitro durch proteolytisches Schneiden mit einem geeigneten proteolytischen Enzym, beispielsweise einer trypsinartigen Protease, oder durch Behandlung mit einer Chemikalie, wie Zyanogenbromid, entfernt werden. Möglich ist es auch, das Schneiden an der zusätzlichen Verarbeitungsstelle durch den Hefewirtsorganismus vornehmen zu lassen, wobei eine Verarbeitungsstelle ausgewählt wird, die für ein anderes proteolytisches Hefeenzym spezifisch ist.
Für einige Zwecke aber kann es vorteilhaft sein, die N-Terminalerweiterung so aufzubauen, daß sie einem bestimmten Zweck angepaßt ist. So kann die Erweiterung als Marker für den Nachweis des Proteins, als Säure zum Reinigen des Proteins oder als Mittel zur Steuerung der Wirkung eines Pharmazeutikums in vivo, z. B. zur Verlängerung der Halbwertszeit eines Medikamentes oder zur Steuerung zu einer bestimmten Stelle im Körper, dienen.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Polypeptids nach der vorliegenden Erfindung stellen X1 und/oder X4 eine Aminosäurefolge mit 1 bis Aminosäuren dar. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Aminosäure, die sich unmittelbar an X3 anschließt, vorzugsweise GIu oder Asp oder beide sind GIu oder Asp, da das eine vorteilhafte Darstellung der Verarbeitungsstelle auf Grund des hydrophilen Charakters dieser Aminosäuren bildet, wie oben ausführlicher erklärt wurde. Die Aminosäurenfolge, die durch X' oder X4 dargestellt wird, kann zweckmäßigerweise mehr als ein GJu oder Asp aufweisen.
Bei einem anderen interessanten Ausführungsbeispiel des Polypeptids nach der vorliegenden Erfindung stellen X1 und X4 beide eine oder mehrere Aminosäuren dar, mit anderen Worten, das Polypeptid ist sowohl am C-Terminalende des Führungspeptids als auch am N-Terminalende des heterologen Proteins modifiziert. Bei diesem Ausführungsbeispiel können X1 und X4 symmetrisch identisch sein, d. h., die durch X1 und X4 dargestellte(n) Aminosäure(n) sind die gleichen und gehen von X2 bzw. X3
Die Signalpeptidsequenz des Polypeptids nach der Erfindung kann jedes Signalpeptid sein, das eine wirksame Lenkung des expressierten Polypeptids in die sekretorische Bahn der Zelle gewährleistet Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder funktioneile Teile davon sein, oder es kann ein synthetisches Peptid sein Es wurde festgestellt, daß geeignete Signalpeptide des a-Faktorsignalpeptid, das Signalpeptid der Speichelamylase der Maus, ein modifiziertes Karboxypeptidasesignalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid sein Das Speichelamylasesignalpeptid der Maus wird von O Hagenbuchle u a , Nature 289,1981, S 643-646, beschrieben Die Karboxypeptidasesignalsequenz wird durch L A VaIIs u a, Cell 48 1987, S 887-897, beschrieben Das BAR 1-Signalpeptid wird in WO 87/02670 offengelegt Die Fuhrungspeptidsequenz des Polypeptids nach der Erfindung kann jedes Fuhrungspeptid sein das funktionell bei der Steuerung des expressierten Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum und weiter längs der sekretorischen Bahn wirkt Mögliche Fuhrungssequenzen, die fur diesen Zweck geeignet sind, sind natürliche Fuhrungspeptide die von Hefe oder anderen Organismen abgeleitet wurden, beispielsweise der a-Faktorfuhrer oder dessen funktionelles Analog Das Fuhrungspeptid kann auch ein synthetisches Fuhrungspeptid sein, ζ B einer der synthetischen Fuhrer, die in der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr WO 89/02463, offengelegt werden, mit den folgenden Aminosaurefolgen A Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu AIa-GIy-GIu GIu-IIe-AIa-GIu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
B Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala C Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala D Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp Glu-Ser-Ser-Val GIu-lle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-lle-lle-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-
AIa und E Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala oder ein Derivat davon
Das heterologe Protein, das nach der Methode der Erfindung produziert wird, kann jedes Protein sein, das vorteilhaft in Hefe produziert wird Beispiele fur solche Proteine sind Aprotinin oder andere Proteaseunterdrucker, Insulin (einschließlich der Insulinvorlaufer), menschliches oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Glukagon, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, der plattchenabgeleitete Wachstumsfaktor, Enzyme usw oder deren funktionelles Analog Im vorliegenden Zusammenhang versteht man unter dem Begriff „funktionelles Analog" ein Polypeptid mit einer ähnlichen Funktion wie das natürliche Protein (was sich auf die Natur, den Charakter beziehen soll, nicht auf den Pegel der biologischen Aktivität des naturlichen Proteins) Das Polypeptid kann dem naturlichen Protein strukturell ähnlich sein und kann vom natürlichen Protein durch den Zusatz von einer oder mehreren Aminosäuren zu einem der beiden oder zu beiden, dem C- und dem N-Terminalende des natürlichen Proteins, Substitution eines oder mehrerer Aminosäuren an einer oder an einer Reihe von verschiedenen Stellen in der natürlichen Aminosaurefolge, Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem der beiden oder an beiden Enden des naturlichen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosaurefolge oder durch Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der natürlichen Aminosaurefolge abgeleitet werden Solche Modifikationen sind fur mehrere der oben genannten Proteine bekannt Nach der Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß Modifikationen am C-Terminalende des Fuhrungspeptids oder am N-Terminalende des heterologen Proteins, wie sie oben beschrieben wurden, die Produktion von korrekt verarbeitetem Aprotinin (oder dessen funktionellen Analogs, wie es oben definiert wurde) in hohen Ertragen ermöglichen Aprotinin ist ein proteaseunterdruckendes Protein, dessen Eigenschaften es fur eine Reihe von medizinischen Zwec<en geeignet machen (ζ Β bei der Behandlung von Pankreatis, dem septischen Schocksyndrom, hyperfibrinolytische Hamorrhag und dem Myokardinfarkt) Die Verabreichung von Aprotinin in hohen Dosen verringert den Blutverlust in Verbindung mit Herzoperationen oder anderen großen chirurgischen Eingriffen erheblich Aprotinin ist auch als Zusatz zu Kulturmedien geeignet, aa es die Proteasen der Wirtszelle unterbindet, die andernfalls zum unerwünschten proteolytischen Schneiden der expressierten Proteine fuhren konnten Bei der Verwendung der bekannten natürlichen Fuhrungsfolgen, beispielsweise dem a-FaKtorfuhrer, traten Schwierigkeiten damit auf, hohe Ertrage an korrekt verarbeitetem Aprotinin in Hefe zu erhalten Natürliches, ursprüngliches Aprotinin wird am N-Terminal durch eine basische Aminosäure (Arg) eingeleitet, und aus diesem Grunde kann die vorausgehende Vera rbeitungsstelle fur das proteolytische Schneiden (wie das oben erklart wurde) weniger geeignet sein, wenn eines der bekannten Fuhrungspeptide (z B der a-Faktorfuhrer) eingesetzt wird, ohne nach der vorliegenden Erfindung modifiziert zu sein, was zu geringen Ertragen an korrekt verarbeitetem Aprotinin fuhrt, wenn überhaupt Ertrage erzielt werden Nach der vorliegenden Erfindung wurden besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der Produktion von Aprotinin erzielt, wenn X1 G luArgLeuGlu darstellt oder wenn X4GIuLeU oder GluLeuAspLeu darstellt (siehe die folgenden Beispiele), obwohl erwartet wird, daß auch mit anderen Bedeutungen von X1 und X4 vorteilhafte Ertrage an Aprotinin erzielt werden vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure und am besten die der Verarbeitungsstelle am nächsten hegende eine negativ geladene Aminosäure ist, wie das oben erklart wurde
Nach der Erfindung wurde außerdem festgestellt, daß Modifikationen am C-Terminalende des Fuhrungspeptids oder am N-Terminalendedes heterologen Proteins, wie sie oben beschrieben wurden, auch die Produktion ces korrekt verarbeiteten Insulinvorlaufers (oder dessen funktionellen Analogs, wie das oben definiert wurde) in hohen Ertragen ermöglichen Bei diesem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung kann X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-Glu darstellen, wobei X4 dann üblicherweise eine Peptidbindung ist Als Alternative dazu kann X4 GIu sein, in diesem Fall stellt X1 üblicherweise eine Peptidbindung dar Vorteilhafte Ergebnisse wurden insbesondere nach der Erfindung hinsichtlich der Expression des Insulin-Analogvorlaufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-29) erzielt, wenn X1 LysGluLeuGlu darstellt oder wenn X4 eine Substitution von Phe als der ersten Aminosäure des Insulinvorlaufers durch GIu darstellt (siehe die folgenden Beispiele) Angemessene Ergebnisse beim Insulm-Analogvorlaufer B(1-29)-SerAspAspAlaLys-A(1-29) wurden auch erzielt, wenn X1 Lys-Glu-Leu-Glu darstellt Außerdem wird erwartet, daßmanhohe Ertrage des Insulinvorlaufers erzielt, wenn X1 und X4 eine andere Bedeutung haben, vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure, und vorzugsweise die der Verarbeitungsstelle am nächsten gelegene eine negativ geladene Aminosäure ist, wie das oben erklart wurde
Das DNA-Gebilde nach der Erfindung, welches das Polypeptid nach der Erfindung codiert, kann synthetisch nach bekannten Standardmethoden hergestellt werden, ζ B durch die Phosphoamiditmethode, die von S L BeaucageundM H Caruthers,
Tetrahedron Letters 22,1981, S. 1859-1869, beschrieben wird, oder durch die von Matthes u.a., EMBO Journal 3,1984, S.801-805, beschriebene Methode. Nach der Phosphoamiditmethode werden Oligonukleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesegerät, gereinigt, dupliziert und ligiert, um das synthetische DNA-Gebilde zu bilden. Das DNA-Gebilde nach der Erfindung kann auch genomischen odercDNA-Ursprungs sein, kann beispielsweise gewonnen werden durch Herstellung einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenieren nach DNA-Folgen, welche das gesamte oder einen Teil des Polypeptids nach der Erfindung codieren durch Hybridisierung unter Anwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden nach Standardmethoden (siehe T.Maniatis u.a.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor, 1982). In diesem Fall kann eine genomische oder cDNA-Folge, welche ein Signal- und Führungspeptid codiert, an eine genomische oder cDNA-Folge gebunden werden, die das'heterologe Protein codiert, worauf die DNA-Folge an einer Stelle modifiziert werden kann, die der Aminosäurefolge X1-X2-X3-X4 des Polypeptids entspricht, z. B. durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die die gewünschte Aminosäure codieren, zur homologen Rekombination nach allgemein bekannten Verfahren.
Schließlich kann das DNA-Gebilde gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein und durch Hybridisierung von Fragmenten synthetischen, genomischen odercDNA-Ursprungs (was jeweils zutrifft) hergestellt werden, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des DNA-Gesamtgebildes entsprechen und wobei Standardverfahren angewendet werden. Es ist beispielsweise vorstellbar, daß die DNA-Folge, welche das heterologe Protein codiert, genomischen Ursprungs ist, während die Folge, welche das Führungspeptid codiert, synthetisch hergestellt sein kann.
Bevorzugte DNA-Gebilde, welche Aprotinin codieren, werden in den beigefügten Abbildungen 4,7,9,11 und 12 gezeigt, ebenso geeignete Modifikationen, welche Aprotinin oder dessen funktionelle Analoge codieren. Beispiele für geeignete Modifikationen der DNA-Folge sind Nukleotidsubstitutionen, die nicht zum Entstehen einer anderen Aminosäurefolge des Proteins führen, die aber der Kodonnutzung des Hefeorganismus entsprechen können, in welches das DNA-Gebilde eingefügt wird, oder Nukleotidsubstitutionen, die zum Entstehen einer unterschiedlichen Aminosäurefolge und damit, möglicherweise, zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen, ohne jedoch die Antiprotease-Eigenschaften des natürlichen Aprotinins zu beeinträchtigen. Andere Beispiele für mögliche Modifikationen sind die Einführung von einem oder mehreren Nukleotiden in die Folge, die Addition von einem oder mehreren Nukleotiden an einem Ende der Folge und die Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden an einem der Enden oder innerhalb der Folge. Beispiele für spezielle Aprotininanaloge sind die, welche in der europäischen Patentanmeldung, Publikation Nr.339942, beschrieben werden.
Bevorzugte DNA-Gebilde mit der Codierung für Insulinvorläufer werden in den beigefügten Abbildungen 16 und 17 gezeigt oder deren Modifikationen gemäß vorstehender Definition.
Der rekombinante Expressionsvektor, der eine DNA-Folge mit der Codierung des Polypeptids nach der Erfindung trägt, kann jeder Vektor sein, der zur Replikation in Hefeorganismen in der Lage ist. In dem Vektor sollte die DNA-Folge mit der Codierung für das Polypeptid nach der Erfindung operabel mit einer geeigneten Promotersequenz verbunden sein. Der Promoter kann jede DNA-Folge sein, die Transkriptionsaktivität in Hefe aufweist, und sie kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine homolog oder heterolog zu Hefe codieren. Der Promotor wird vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das Protein homolog zu Hefe codiert. Beispiele für geeignete Promoter sind die Promoter Saccharomyces cerevisiae Ma 1, TPI, ADH oder PGK. Die DNA-Folge, welche das Polypeptid nach der Erfindung codiert, sollte auch operabel mit einem geeigneten Terminator verbunden sein, z.B. dem TPI-Terminator (sieheT.Alber und G.Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1,1982, S.419-434). Der rekombinante Expressionsvektor nach der Erfindung weist außerdem eine DNA-Folge auf, die es dem Vektor ermöglicht, sich in Hefe zu replizieren. Beispiele für solche Folgen sind die Hefeplasmid-2 μ-Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Markerenthalten, z.B. dasTPI-Gen von Schizosaccharomyces pombe, wie das von P. R. Rüssel, Gene 40,1985, S. 125-130, beschrieben wird.
Die Verfahren, die zum Ligieren der DNA-Folgen eingesetzt werden, welche das Polypeptid nach der Erfindung codieren, also des Promoters bzw. des Terminators, sowie zu deren Einfügen in geeignete Hefevektoren, welche die für die Hefereplizierung notwendige Information enthalten, sind Fachleuten allgemein bekannt (siehe beispielsweise Maniatis u. a., ebenda). Es versteht sich von selbst, daß der Vektor hergestellt werden kann entweder durch zuerst die Schaffung eines DNA-Gebildes mit der gesamten DNA-Folge, die das Polypeptid nach der Erfindung codiert, und anschließend das Einfügen dieses Fragments in einen geeigneten Expressionsvektor oder durch sequentielles Einfügen von DNA-Fragmenten, die genetische Informationen für die einzelnen Elemente enthalten (beispielsweise das Signal, den Führer oder das heterologe Protein), gefolgt vom Ligieren. Der im Verfahren der Erfindung eingesetzte Hefeorganismus kann jeder geeignete Hefeorganismus sein, der bei der Züchtung große Mengen an heterologem Protein oder Peptid der fraglichen Spezies produziert. Beispiele für geeignete Hefeorganismen können Stämme der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces uvarum sein. Die Transformation der Hefezellen kann beispielsweise durch Protoplastbildung (siehe untenstehendes Beispiel 1), gefolgt von der Transformation auf eine bekannte Weise, ausgeführt werden. Das Medium, das zum Züchten der Zellen verwendet wird, kann jedes herkömmliche Medium sein, das für die wachsenden Hefeorganismen geeignet ist. Das sekretierte Protein, ein heterologes Protein, von dem im Medium ein signifikanter Teil in korrekt verarbeiteter Form vorhanden ist, kann aus dem Medium nach herkömmlichen Verfahren entfernt werden, einschließlich der Abtrennung der Hefezellen vom Medium durch Zentrifugieren oder Filtern, Ausfällen der proteinhaltigen Komponenten der obenaufschwimmenden Schicht oder des Filtrats durch ein Salz, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von der Reinigung durch eine Reihe chromatografischer Verfahren, z. B. der lonenaustauschchromatografie, der Affinitätschromatografie oder ähnlichen. Nach einem zusätzlichen Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein neuartiges Aprotininanalog mit der allgemeinen Formel X4-Aprotinin(1-58), worin X4 eine N-Terminalerweiterung um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird. X4 kann eine Folge von 1 bis 6 Aminosäuren, insbesondere 1 bis 4 Aminosäuren, darstellen und kann jede der oben gegebenen Bedeutungen haben. Besonders bevorzugte Bedeutungen für X4 sind Glu-Leu und Glu-Leu-Asp-Leu.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter offengelegt, in denen
Abb. 1: die DNA- und die Aminosäurefolge von Aprotinin (1 bis 58) zeigt; die gestaffelten Linien in der DNA-Folge
zeigen Stellen, an denen Duplexe aus synthetischen Oligonukleotiden ligiert wurden; Abb. 2: die Konstruktion von Plasmid pKFN-802 und pKFN-803 zeigt;
Abb.3: die Konstruktion von Plasmid pKFN-849 und pKFN-855 zeigt;
Abb. 4: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 406 bp von pKFN-849 und pKFN-855 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytische Schneiden erfolgt; Abb. 5Au. 5 B: die Unterbindung von Trypsin bzw. Plasmin durch Aprotinin zeigen; e bezeichnet pankreatisches
Rinderaprotinin, X bezeichnet GluLeu-Aprotinin und Δ bezeichnet GluLeuAspLeu-Aprotinin; Abb. 6: die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858 zeigt;
Abb. 7: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-852 und pKFN-858 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytischeSchneiden erfolgt; Abb. 8: die Konstruktion von Plasmid pKFN-995 und pKFN-998 zeigt;
Abb. 9: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-995 und pKFN-998 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytischeSchneiden erfolgt; Abb. 10: die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003zeigt;
Abb. 11: die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-1000 und pKFN-1003 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion die proteolytische Schneidung erfolgt; Abb. 12: die DNA-Folge eines synthetischen Aprotinin(3-58)-Gens zeigt; die gestaffelten Linien innerhalb der Folge
bezeichnen die Stellen, an denen fünf Duplexe, die aus 10 synthetisierten Oligonukleotiden gebildet werden, ligiert werden;
Abb. 13: die Konstruktion von Plasmid pKFN-305 und pKFN-374/375 zeigt;
Abb. 14: die Konstruktion von Plasmid pMT-636 zeigt;
Abb. 15: die Konstruktion von Plasmid pLaC-240zeigt;
Abb. 16: die DNA-Folge des modifizierten Führungs-Insulinvorläufergens von pLaC-240 zeigt;
Abb. 17: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragments zu 508 bp von pKFN-458 zeigt, das den MF 1-Signal-Führer(1-58)
und Insulinanalogvorläufer B(1-29,1GIu + 27 Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) zeigt.
Herstellung von Glu-Leu-Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-837
a) Konstruktion von Plasmid pKFN-802
Ein synthetisches Gen mit der Codierung für Aprotinin(1-58) wurde durch Ligierung aus 10 Oligonukleotiden hergestellt.
Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät unter Verwendung von Phorphoramiditchemikalie auf einer regulierten Porenglasauflage (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, [1981], 1859 bis 1869).
Es wurden folgende 10 Oligonukleotide synthetisiert:
NOR-760: CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC NOR-754: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCCTTCTTTTGGC NOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
NOR-355: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
NOR-356: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCA NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC NOR-358: GCAGCGCTAAGAGAAACAAGTTCAAGT
NOR-359: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
NOR-360: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT NOR-631: CTAGATTAAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC
Aus den oben genannten 10 Oligonukleotiden wurden, wie in der Abb. 1 gezeigt wird, 5 Duplexe, Abis E, gebildet.
Aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden wurden jeweils 20 pMol der Duplexe A bis E durch zehnminütiges Erhitzen bei 900C, gefolgt vom Abkühlen auf Zimmertemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten, gebildet.
Die fünf Duplexe wurden gemischt und mitT4-DNA-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als Band zu 191 bpnach der Elektrophorese des Ligationsgemischs auf einem 2%igen Agarosegel isoliert. Das gewonnene synthetische Gen wird in der Abb.1 gezeigt.
Das synthetische Gen wurde an ein EcoRI-Ncol-Fragment zu 209 bp von pLaC212spx3 und an das EcoRI-Xbal-Fragment zu 2,7 kb von Plasmid pUC 19 ligiert (Yanisch-Perron, C, Vieira, J., und Messing, J., Gene 33 [1985], 103-119). Plasmid pLaC212spx3 wird in Beispiel 3 der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr. WO 89/02463, beschrieben.
Das EcoRI-Ncol-Fragment zu 209bp von pLaC212spx3 codiert ein synthetisches Hefeführungspeptid.
Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren eines kompetenten E. coli-Stammes (r~, m+) mit Selektion auf Ampicillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A., und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 [1980] 499-560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für Aprotinin(1-58) enthielten.
Ein Plasmid pKFN-802 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN-802 wird in Abb. 2 veranschaulicht.
b) Konstruktion der Plasmide pKFN-849, pKFN-855 und des Hefestammes KFN-837 Das Ncol-Stul-Fragment zu 3,0kb von pKFN-802 wurde an das synthetische Fragment NOR-790/791 mit T4-DNA-Ligase ligiert:
MAKRELR CATGGCTAAGAGAGAATTGAGA C GATTCTCTCTTAACTCT
Das Ligationsgemisch wurde mit dem Restriktionsenzym Stul verdaut, um jeden möglichen Hintergrund von pKFN-802 zu verringern, und das resultierende Gemisch wurde zur Transformation eines kompetenten E. coli-Stammes (r~, m+) mit Selektion für Ampicillinresistenz verwendet. Durch DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S. und Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 [1977], 5463-5467) wurde gezeigt, das Plasmid pKFN-849von einer der resultierenden Kolonien die DNA-Folge von Glu-Leu-Aprotinin{1-58), korrekt mit dem synthetischen Hefeführungsgen verschmolzen, enthält. Die Konstruktion von Plasmid pKFN-849 wird in der Abb. 3 veranschaulicht.
pKFN-849 wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das 406-bp-Fragment wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragment von pMT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was das Plasmid pKFN-855 ergab, siehe Abb.3. Plasmid pMT636wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK88/00138 beschrieben.
pMT636 ist ein E. coli-S. cerevisiae-Schaukelvektor, der das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT) (Russell, P. R., Gene 40 [1985], 125-130), den S.cerevisiae-Triosephosphatisomerasepromotor und -terminator, TPIp und TPTT (Alber, T., und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 [1982], 419-434) enthält. Plasmid pKFN-855 enthält folgende Sequenz:
TPIP-LaC212spx3-Signal-Führung-Glu-Leu-Aprotinin(1-58)-TPIT, wobei der Signalführer LaC212spx3 der synthetische Hefeführer ist, der in der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr. WO 89/02463, beschrieben wurde. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmenteszu406bp von pKFN-849 und pKFN-855 wird in der Abb. 4 gezeigt.
Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7 B XE11-36 a/a, Δίρί Δίρί pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton,2% Galaktose, 1 % Laktat) bis auf einen Außendurchmesser von 0,6 bei 600 nm gezogen. Durch Zentrifugieren wurden 100 ml der Kultur geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und wieder in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2M Sorbitol, 25 mM Na2EDTA, pH-Wert 8,0 und 6,7mg/ml Dithiotreitol enthielt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 3O0C inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wieder in 10ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbitol, 10mM Na2EDTA, 0,1 M Natriumzitrat, pH-Wert 5,8, und 2 mg Novozym® 234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 3O0C inkubiert, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, in 10 ml 1,2 M Sorbitol und 10 ml CAS (1,2 M Sorbitol, 1OmM CaCI210mMTris-HCL(Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH-Wert 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS wieder suspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 μg des Plasmids pKFN-855 gemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wurde 1 mi von (20% Polyethylenglykol 4000, 2OmM CaCI2,1OmM CaCI2,1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5) zugesetzt und das Gemisch weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbitol, 33% YPD, 6,7 mM CaCI2,14 цд/тІ1.еигіп) suspendiert und zwei Stunden lang bei 3O0C inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,5 ml von 1,2 M Sorbitol suspendiert. Anschließend wurden bei 520C 6ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman u.a., Methods in Yeast Genetics (Methoden in der Hefegenetik), Cold Spring Harbor Laboratory [1981], das 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar enthielt) zugesetzt und die Suspension oben auf Platten gegossen, welche das gleiche agarverfestigte,sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 3O0C wurden transformante Kolonien herausgegriffen, reisoliert und zum Ansetzen von Flüssigkulturen verwendet. Ein solcher Transformant, KFN-837, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Der Hefestamm KFN-837 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pepton [von den Difco-Laboratories] und 6% Glukose) gezogen. Eine Kultur dieses Stammes zu 200 ml wurde bei 300C mit 250 U/min 3 Tage lang auf einen Außendurchmesser von 20 bei 600nm geschüttelt (trockene Hefebiomasse 18,8g/l). Nach dem Zentrifugieren wurde die obenaufschwimmende Schicht durch FPLC-Ionenaustauschchromatografie analysiert. Die obenaufschwimmende Hefeschicht wurde durch eine Millex-GV-Filtereinheit von 0,22 pm gefiltert, und 1 ml wurde auf eine MonoS-Kationenaustauschkolonne (0,5 cm χ 5cm), die mit 2OmM Bizin, pH-Wert 8,7, äquilibriert worden war, gegeben. Nach dem Waschen mit Äquilibrationspuffer wurde die Kolonne mit einem linearen NaCI-Gradienten (0-1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Die Trypsinunterbindungsaktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrofotometrische Analyse (Kassel, B., Methods Enzymol. 19 [1970], 844-852) und weiter bestimmt durch Integration der Absorption bei 280 nm aus.
E2M (Aprotinin) = 8,3
Der Ertrag lag bei 120mg/l an Glu-Leu-Aprotinin(1-58).
Zur Analyse der Aminosäuren und zur N-Terminalsequenzierung wurde die Konzentration und weitere Reinigung des eluierten Gradienten (Glu-Leu-Aprotinin[1-58]) durch Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) auf einer Gegenphasenkolonne (VydacC64,4,6 mm x 250 mm) durchgeführt. DieEluierung erfolgte mit einem CH3CN-Gradienten in 0,1 %TFA. Die aufgefangenen Fraktionen wurden durch Vakuumzentrifugieren auf etwa 100μΙ konzentriert, und zur N-Terminalsequenzierung und Aminosäureanalyse wurden Proben entnommen.
Durch N-Terminalsequenzierung wurde folgende Sequenz ermittelt:
Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-X-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala
was bestätigt, daß das N-Terminalende korrekt ist. Zysteinhalbreste werden nach dieser Methode nicht bestimmt, was mit den Leerzyklen (X) übereinstimmt, die für die Reste Ä7 und 16 ermittelt wurden.
Die Aminosäurenanalyse wird in der Tabelle 1 gezeigt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß das Produkt die erwartete Aminosäurenzusammensetzung hat, d.h. mehr GIu und Leu. Der leicht verringerte Gehaltan He kann höchstwahrscheinlich der unvollständigen Hydrolyse von lle(18)-lle(19) zugeschrieben werden (was in Fachkreisen allgemein bekannt ist). Auch liegt der Arg-Anteil etwas höher als erwartet.
Das kann jedoch auch bei natürlichem Aprotinin festgestellt werden (Tabelle 1, dritte Spalte).
Bei einem Vergleich nach der oben genannten Methode von Kassel wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Glu-Leu-Aprotinin(1-58) innerhalb des experimentellen Fehlers mit der spezifischen Aktivität von natürlichem Aprotinin identisch ist. Die Trypsin- und Plasmin-Unterbindung durch Glu-Leu-Aprotinin(1-58) in Begriffen der Titrationskurven, die auf die unten beschriebene Weise ermittelt wurden, war von der von pankreaktischem Rinderaprotinin (Aprotinin Novo) nicht zu unterscheiden. Nachdem das Enzym 30 Minuten lang mit Aprotinin oder dessen Analogen inkubiert worden war, wurden 0,6mM S2251 (KabiVitrum) zugesetzt, und die Aktivität wurde als Rate der Nitroanilinproduktion gemessen. Die Aktivität als Funktion der Aprotininkonzentration wird in den Abbildungen 5Aund 5 B grafisch dargestellt. Es wurde eine vollständige Unterbindung beider Enzyme mit allen drei Inhibitoren beobachtet.
Produktion von Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-840 Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde ein synthetisches Gen mit der Codierung für Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin (1-58) konstruiert. Anstelle von NOR-790/791 wurde das synthetische Fragment NOR-793/794 verwendet:
MAKREL DLR CATG GCTAAG AG AGAATTG GACTTGAGA CGATTCTCTCTTAACCTGAACTCT
Das pUC19-abgeleitete Plasmid pKFN-852 wurde auf ähnliche Weise wie pKFN-849 konstruiert.
Unter Anwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 erhielt man ein Plasmid pKFN-858, das folgende Konstruktion enthielt:
TPIp-LaC212spx3-Signal-Führer-GluLeuAspLeu-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858 wird in der Abb.6 veranschaulicht. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmenteszu 412 bp von pKFN-852 und pKFN-858wird in der Abb. 7 gegeben.
Plasmid pKFN-858 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-840 ergab.
Eine Kultur von KFN-840 zu 200 ml in YPD-Medium wurde bei 30°C mit 250 U/min drei Tage lang auf einen Außendurchmesser von 18 bei 600 mm geschüttelt (trockene Biomasse 16,7 mg/l). Die FPLC-Ionenchromatografie, die wie oben an der obenaufschwimmenden Schicht ausgeführt wurde, brachte einen Ertrag von 90mg/l Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin (1-58).
Die Aminosäureanalyse ergibt sich aus der Tabelle 1 und bestätigt die erwartete Aminosäurenzusammensetzung.
Die Titrationskurven der Trypsin- und Plasmin-Unterbindung von Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) waren nicht von denen von pankreatischem Rinder-Aprotinin (Aprotinin Novo) zu unterscheiden, siehe Abbildungen 5 A und 5 B.
Produktion von Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-1006
Plasmid pKFN-995 wurde aus pKFN-802 durch Ugat'ion des Ncol-Stul-Fragmentes zu 3,0 kb an das synthetische Fragment NOR-848/849 konstruiert:
MAAKE KE KRR CATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGG CGATTCCTTAACCTCTTCTCTTCC
Das Ligationsgemisch wurde mit dem Restriktionsenzym Ball verdaut, um einen möglichen Hintergrund von pKFN-802zu reduzieren.
Das Hefeexpressionsplasmid pKFN-998 wurde im wesentlichen so konstruiert, wie das im Beispiel 1 beschrieben und in der Abb. 8 gezeigt wurde:
TPTp-LaC212spx3-Signal-Führer(1-47)-Lys-Glu-Leu-Glu(Lys-Arg)-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Die DNA-Folge des EcoRi-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-995 und pKFN-998 wird in der Abb. 9 gegeben.
Plasmid pKFN-998 wurde in den Hefestamm MT663 transformiert, wie das im Beispiel 1 beschrieben wurde, was den Hefestamm KFN-1 006 ergab. Die Züchtung des transformierten Stammes KFN-1106 in YPD-Medium und die Analyse nach Aprotinin(1-58) in der obenaufschwimmenden Schicht wurde wie oben ausgeführt.
Der Ertrag lag bei 30 mg/l Aprotinin(1-58).
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung.
Produktion von Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-1 008
Das pUC-abgeleitete Plasmid pKFN-1 000 wurde wie im Beispiel 1 durch Ligationdes Ncol-Stul-Fragmentes zu 3,0 kb an das synthetische Fragment NOR-850/851 konstruiert:
МАЕ RLE KRR CATG GCTGAGAGATTG GAGAAGAGAAGG CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Unter Anwendung des Verfahrens aus den Beispielen 1 und 3 wurde ein Hefeexpressionsplasmid pKFN-1003 gewonnen, das folgende Konstruktion TPIp-LaC212spx3-Signal-Führer(1-47)-GluArgLeuGlu(Lys-Arg)-Aprotinin-(1-58)-TPIT enthielt.
Die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003 wird in der Abb. 10 veranschaulicht. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-1000 und pKFN-1003 wird in der Abb. 11 gegeben.
Plasmid pKFN-1003 wurde im Hefestamm MT663 transformiert, wie das oben beschrieben wurde, und ergab den Hefestamm KFN-1 008.
Die Züchtung des transformierten Stamms KFN-1 008 in YPD-Medium und die Analyse nach Aprotinin(1-58) in der obenaufschwimmenden Schicht wurde wie oben ausgeführt. Der Ertrag lag bei 120mg/l Aprotinin(1-58).
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung. Außerdem wurde durch Gasphasensequenzierung des reduzierten, pyridylethylierten Polypeptides die Bestätigung der vollständigen Primärstruktur ermittelt.
Außerdem war die spezifische unterbindende Aktivität des rekombinanten Aprotinins(1-58) gegenüber Trypsin nicht von der von pankreatischem Rinderaprotininzu unterscheiden.
Plasmid pKFN-802 (siehe Beispiel 1) wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das 400-bp-Fragment wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragmentvon pMT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was Plasmid pKFN-803 ergab, siehe Abb.2. pKFN-803 enthält die folgende Konstruktion:
TPIP-LaC212spx3-Signal-Führer-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Plasmid pKFN-803 wurde wie oben beschrieben im Hefestamm MT663 transformiert. Die Züchtung des transformierten Hefestamms KFN-783 in YPD-Medium und die FPLC-Ionenchromatografie der obenaufschwimmenden Schicht wurden so ausgeführt, wie das oben beschrieben wurde. Aprotinin(1—58) wurde quantitativ bestimmt durch Vergleich mit der Chromatografie von einer standardisierten Lösung authentischen Aprotinins, das aus der Rindspankreas gereinigt worden war. Der Ertrag an Aprotinin(1-58) lag bei weniger als 1 mg/l.
Tabelle 1 Amninosäurezusammensetzung
| Aminosäure | Aprotimn | Aprotimn | KFM-837 | KFN-840 |
| theoretisch | ermittelt | ermittelt | ermittelt | |
| Asp | 5 | 5,00 | 4,95 | 5,93 (+1) |
| Thr | 3 | 2,86 | 2,84 | 2,85 |
| Ser | 1 | 0,94 | 0,92 | 0,93 |
| GIu | 3 | 3,04 | 3,97 ( + 1) | 3,99 ( + 1) |
| Pro | 4 | 4,18 | 3,90 | 3,86 |
| GIy | 6 | 5,95 | 5,91 | 5,94 |
| AIa | 6 | 5,85 | 5,92 | 5,94 |
| Cys | 6 | 5,20 | 5,21 | 5,22 |
| VaI | 1 | 0,99 | 1,00 | 1,01 |
| Met | 1 | 0,83 | 0,65 | 0,67 |
| He | 2 | 1,39 | 1,58 | 1,58 |
| Leu | 2 | 1,97 | 3,00 ( + 1) | 4,00 (+2) |
| Tyr | 4 | 3,84 | 3,74 | 3,71 |
| Phe | 4 | 3,98 | 3,94 | 3,92 |
| Lys | 4 | 3,92 | 3,99 | 3,99 |
| Arg | 6 | 6,39 | 6,33 | 6,34 |
| Total | 58 | 56,33 | 57,87 | 59,88 |
Ein synthetisches Gen für Aprotinin (3-58) wurde durch Ligation aus einer Reihe von Nukleotiden konstruiert. Die folgenden lOOIigonukleotide wurden so synthetisiert, wie das im Beipsiel 1 beschrieben wurde:
I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
37-mer II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT
38-mer III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
35-mer IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
34-mer V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
39-mer Vl: CTCTGGAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
40-mer VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
27-mer VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
26-mer IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
39-mer X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC 38-mer
Aus den oben genannten 10 Oligonukleotiden wurden 5 Duplexe, A bis E, gebildet, wie das in der Abb. 12 gezeigt wird. Von jedem der Duplexe A bis E wurden 2OpMoI aus den entsprechenden Paaren der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide I bis X durch fünfminütiges Erhitzen auf 900C, gefolgt vom Abkühlen auf Zimmertemperatur über eine Zeitspanne von 75 Minuten, gebildet. Die fünf Duplexe wurden gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde nach Elektrophorese des Ligationsgemischs auf einem 2%igen Agarosegel als Band zu 176bp isoliert. Das gewonnene synthetische Gen wird in der Abb. 12 gezeigt.
Ein synthetisches Gen zu 176bp wurde an ein 330-bp-EcoRI-Hgal-Fragment von Plasmid pKFN-9 mit der Codierung für den Anpassungsfaktor α 1 der Signalführungsfolge (1—85) von S. cerevisiae (Markussen, J. u.a. Protein-Engineering 1 [1987], 215-223) und an das 2,7-kb-EcoRI-Xbal-Fragment von pUC 19 (Yanish-Perron, C, Vieira, J. und Messing, J., Gene 33 [1985],
1 03-119) ligiert. Die Konstruktion von pKFN-9, das die Hgal-Stelle unmittelbar hinter der MF1-Führungsfolge enthält, wird in EP 214826 beschrieben.
Das Ligationsgemisch wurde zurTransformation des kompetenten E. coli-Stammes(r~,m+) mit Selektion auf Ampicillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 [1980], 499-560) zeigte, daß die Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für Aprotinin(3 bis 58) enthielten. Ein Plasmid, pKNF305, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN 305 wird in der Abb. 13 gezeigt.
ρKFN 305 wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das Fragment zu 0,5 kb wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragment von ρ MT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was Plasmid pKFN 374 ergab, siehe Abb. 13. Plasmid pMT636 wurde aus pMT608 nach Deletierung des LEU-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Abb. 14- pMT6Q8 wird in EP 195691 beschrieben. pMT479 wird in EP 163529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT), den S. cerevisiae-Triosephosphatisomerasepromotor und -terminator, TPIp und ΤΡΙγ (Alber, T. und Kwasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 [1982], 419-434). Plasmid pKFN 374 enthält folgende Sequenz:
TPIP-MFa1-Signal-Führer(1-85)-Aprotinin(3-58)-TPIT,
wobei MFa 1 der Anpassungsfaktor Alpha 1 von S. cerevisiae mit der Codierungssequenz ist (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 [1982], 933-943), wobei man unter Signalführer (1-85) versteht, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFai-Signalführungsfolge enthält, und Aprotinin(3-85) ist die synthetische Sequenz, die ein Aprotininderivat codiert, dem die beiden ersten Aminosäurereste fehlen
Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, utpiutpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaI (1 % Bacto-Hefeextrakt,
2 % Bacto-Pepton, 2% Galaktose, 1 % Laktat) auf einen Außendurchmesser bei 600 nm von 0,6 gezogen.
Durch Zentrifugieren wurden 100 ml der resultierenden Kultur geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, wieder zentrifugiert und in 10 ml einer Lösung wieder zu Suspension gebracht, die 1,2 M Sorbitol, 25 rtiM Na2 EDTA, pH-Wert 8,0, und 6,7 mg/ml Dithiotreitol enthält. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 30°C inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wieder in 10ml einer Lösung suspendiert, die 1,2M Sorbitol, 1OmM Na2EDTA, 0,1 M Natriumzitrat, pH-Wert 5,8, und 2mg Novozym®234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 300C inkubiert, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, in 10 ml von 1,2 M Sorbitol und 10 ml CAS (1,2 M Sorbitol, 1OmMCaCI2,1OmMTMs-HCI (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH-Wert 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS wieder suspendiert. ZurTransformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 цд Plasmid pKFN374 gemischt und 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wurde 1 ml von (20% Polyethylenglykol4000,1OmM CaCI2,1OmM Tris-HCL, pH-Wert 7,5) zugesetzt und das Gemisch weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbitol, 33% YPD, 6,7 mM CaCI2,14цд je Milliliter Leuzin) erneut suspendiert und bei 300C für die Dauer von 2 Stunden inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,5 ml 1,2 M Sorbitol suspendiert. Anschließend wurden bei 520C 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman u. a., Methods in Yeast Genetics [Methoden in der Hefegenetik], Cold Spring Harbor Laboratory, [1981 ], das 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar enthielt) zugesetzt und die Suspension oben auf Platten gegossen, die das gleiche agar-verfestigte, sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 300C wurden transformante Kolonien herausgegriffen, reisoliert und zum Ansetzen von Flüssigkulturen verwendet. Einer der Transformanten, KFN322, wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Hefestamm KFN322 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pepton [von den Difco Laboratories] und 2% Glukose) gezogen. Eine Kultur des Stammes zu 10 ml wurde bei 3O0C auf einen Außendurchmesser bei 600 nm von 32 geschüttelt. Nachdem Zentrifugieren wurde die obenaufschwimmende Schicht durch FPLC-lonenaustauschchromatografie analysiert. Die obenaufschwimmende Hefeschicht wurde durch eine MillexR-GV-Filtereinheit von 0,22μητι gefiltert, und 1 ml wurde auf einer MonoS-Kationenaustauschkolonne (0,5 χ 5cm) eingesetzt, die mit 2OmM Bizin, pH-Wert 8,7 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrationspuffer wurde die Kolonne mit einem linearen NaCI-Gradienten (0 bis 1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Die Trypsinunterbindungsaktivität in den eluierten Fraktionen wurde durch spektrofotometrische Analyse quantitativ bestimmt sowie durch Absorptionsintegration bei 280 nm aus
1% E (Aprotinin) = 8,3.
Der Ertrag lag bei etwa 3mg/l Aprotinin(3-58).
Produktion des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) aus dem Hefestamm LaC 1667 Die Fragmente Sphl-Ncol zu 589bp und Hpal-Xbal zu 172 bp wurden aus pLAC212spx3 (in WO 89/02463 beschrieben) isoliert. Diese Fragmente wurden mit dem synthetischen Adapter
MAKELEKRFV NOR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATTCGTT NOR-964 CGATTCCTTAACCTTTTCTCTAAGCAA
verbunden und dem 10 kb-Xbal-Sphl-Fragment von pMT743 (das in WO 89/02463 beschrieben wird), was das Plasmid pLaC 240 (siehe Abb. 15) ergibt. Die DNA-Folge des modifizierten Führungs-Insulinvorläufer-Gens von pLaC 240 wird in der Abb. 16 gezeigt. Die Transformation des Hefestammes MT663 mit dem Plasmid pLaC240 ergab einen den Insulinvorläufer sekretierenden Stamm, LaC 1 667 (MT663/pLaC240), dessen Produktivität im Verhältnis zum Stamm LaC 1 414 (MT663/pLaC212spx3), welcher das Gen für den unmodifizierten Vorläufer von Insulin enthält, der in WO 89/02463 beschrieben wird, 165% beträgt.
Durch Ligation von 10 Oligonukleotiden wurde ein synthetisches Gen mit der Codierung für den Insulinanalogvorläufer B(1-29,1 Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) konstruiert. B(1-29,1 Glu+27Glu) bezeichnet das Polypeptid, welches die ersten 29 Aminosäurereste der B-Kette von menschlichem Insulin enthält, wobei die Glu-Reste an die Stelle von B1Phe- und B27Thr-Resten getreten sind. A(1—21) ist die Α-Kette von menschlichem Insulin. Ein Tripeptid, AlaAlaLys, verbindet den B29Lys-Rest, mit dem A1Gly-Rest.
Es wurden folgende 10 Oligonukleotide synthetisiert:
NOR-542: AAAGAGAAGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCAC NOR-543: AACCAAGTGGGAACCGCACAGTGTTGGTTAACTTC NOR-69: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT NOR-73: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC NOR-315: TCTACGAACCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGCT NOR-316: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACGTTC NOR-70: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT NOR-71: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC NOR-78: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT NOR-72: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG
Aus den obengenannten 10 Oligonukleotiden wurden 56 Duplexe gebildet, und die Duplexe wurden auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 ligiert.
Das synthetische 178-bp-Gen wurde an das 330-bp-EcoRI-Hgal-Fragment von pKFN-9 mit der Codierung für die S. cerevisiae-Anpassungsfaktor-Alpha-1-Signalführungs(1-85)-Folge(Markussen, J. u.a., Protein Engineering 1 [1987], 215-223) und an das 2,7-kb-EcoRI-Xbal-Fragmentvon Plasmid pUC19 (Yanish-Perron, C, Vieira, J. und Messing, J. Gene33 [1985], 103-119) ligiert.
Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation eines kompetenten E.coli-Stammes (r~, rrT) mit Selektion für Ampizillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., MethodsEntzymol. 65 [1980], 499-560) zeigte, daß die Plasmide von den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für den Insulinanalogvorläufer enthielten.
Ein Plasmid, pKFN-456, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
Nach dem Verfahren aus Beispiel 1 wurde ein Hefeexpressionsplasmid pKFN-458 gewonnen, welches folgende Expressionskassette enthielt:
TPIp-MF 1-Signal-Führer(1-85)-B(1-29,1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21)-TPIT.
Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 508 bp von pKFN-456 und pKFN-458 wird in der Abb. 17 gegeben.
Plasmid pKFN-458 wurde in den Hefestamm MG-663 transformiert, wie das oben beschrieben wurde, was den Hefestamm KFN-470 ergab.
Die Züchtung des transformierten Hefestamms KFN-470 in YPD-Medium wurde in der oben beschriebenen Weise ausgeführt.
Der Ertrag an Insulinanalogvorläufer in der obenaufschwimmenden Schicht wurde durch HPLC in der beschriebenen Weise ausgeführt (L. Snel u. a., Chromatographia 24 [1987], 329 bis 332).
In der Tabelle 2 werden die Expressionspegel der Insulinanalogvorläufer B(1-29,1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) und B(1-29,27Glu)-AlaAla-Lys-A(1-21) und des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAla-Lys-A(1-21) verglichen. Alle drei Vorläufer wurden in den gleichen Wirtsstamm, MT-663, expressiert, der mit dem S. pombe-TPI-Gen transformiert worden war, das Plasmide mit der Expressionskassette enthielt.
TPIp-MFa 1-Signal-Führer(1-85)-Vorläufer-TPIT.
Vorläufer Expressionspegel*
B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) 100%
B(1-29)(27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 148%
B(1-29),1Glu + 27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 479%
* Die Expressionspegel werden als Prozentsatz des Expressionspegels des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21 (angegeben, der willkürlich auf 100% festgelegt wird.
Claims (44)
1. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus einer Verschmelzung eines Signalpeptids, eines Führungspeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids, wobei dieses Polypeptid in seiner Aminosäurefolge im Anschluß an eine Hefeverarbeitungsstelle modifiziert ist, die sich zwischen dem C-Terminalende des Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, um so die Darbietung einer Verarbeitungsstelle zu schaffen, durch welche diese für das proteolytische Schneiden zugänglich wird, wobei das Polypeptid folgende Struktur hat Signalpeptid-Führungspeptid-X1-X2-X3-X4-heterologes Protein, worin X1 eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, X2 und X3 gleich oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die aus der aus Lys und Arg bestehenden Gruppe ausgewählt wird, X2 und X3 zusammen eine Hefeverarbeitungsstelle bilden, und X4 eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, unter der Voraussetzung, daß X1 und/oderX4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine derdurch X1 und/oder X4 dargestellten Aminosäuren eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 GIu oder Asp darstellt.
3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur BA darstellt, worin A GIu oder Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist.
4. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur CBA darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
5. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur DCBA darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
6. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von fünf Aminosäuren mit der Struktur EDCBA darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
7. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur FEDCBA darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
8. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 ein GIu oder Asp ist.
9. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin A GIu und Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leutist.
10. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
11. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
12. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von fünf Aminosäuren mit der Struktur ABCDE darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
13. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
14. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure, die unmittelbar an X2 angrenzt, GIu oder Asp ist, die Aminosäure, die unmittelbar an X3 angrenzt, GIu oder Asp ist, oder beide GIu oder Asp sind, wenn X1 und/oder X4 >1 Aminosäure darstellen.
15. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß entweder X1 oderX4 oder beide mehr als ein GIu oder Asp aufweisen, wenn X1 und/oder X4 mehr als eine Aminosäure darstellen.
16. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 und X4 beide >1 Aminosäure darstellen.
17. Polypeptid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X2 und X4symmetrisch identisch sind.
18. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen X4 und dem N-Terminalende des heterologen Proteins eine zusätzliche Verarbeitungsstelle geschaffen wird, wenn X4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellt.
19. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid dasa-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid von Speichelamylase der Maus, das Karboxypeptidasesignalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid ist.
20. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Führungspeptid ein natürliches Führungspeptid, wie das a-Faktorführungspeptid ist.
21. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Führungspeptid ein synthetisches Führungspeptid ist wie
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Aan-Thr-Thr-Leu-Ala
B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pre-Glu-Glu-Ser-Lei-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
C. Als-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala und
E. Gin-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Net-Ala.
22. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Aprotinin oder anderen Proteaseunterbindern, Insulin und Insulinvorläufern, menschlichem oder Rinderwachstumhormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, Glukagon, Faktor VII, Faktor VIII, FaktorXIII, blättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor, Enzymen und einem funktioneilen Analog jedes dieser Proteine.
23. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid Aprotinin oder dessen funktionelles Analog ist.
24. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-GIu ist.
25. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X4 Glu-Leu oder Glu-Leu-Asp-Leu ist.
26. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid Insulin oder ein Insulinvorläufer oder deren funktionelles Analog ist.
27. Polypeptid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-GIu ist.
28. Polypeptid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß X4 GIu ist.
29. Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulinanalogvorläufer B(1-29)-A!aAlaLys-A(1-29) ist und X Lys-Glu-Leu-Glu ist.
30. Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulinanalogvorläufer B(1-29)-SerAspAspAlaLys-A(1-29) ist und X1 Lys-Glu-Leu-Glu ist.
31. DNA-Gebilde, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Folge mit der Codierung für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 30 aufweist.
32. DNA-Gebilde nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Folge aufweist, die in der Abb. 4, 7, 9 oder 11 gezeigt wird, oder deren geeignete Modifikation.
33. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er sich in Hefe replizieren kann und ein DNA-Gebilde nach Anspruch 31 oder 32 trägt.
34. Hefe-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß er ein heterologes Protein oder Polypeptid expressieren kann und mit einem Vektor nach Anspruch 33 transformiert wird.
35. Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids in Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus der Züchtung eines Hefestamms nach Anspruch 34 in einem geeigneten Medium um die Expression und Sekretion/Verarbeitung des heterologen Proteins oder Polypeptids zu erreichen, worauf das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
36. Aprotininanalog mit der allgemeinen Formel X4-Aprotinin(1-58), dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine N-Terminalerweiterung um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewähltwird.
37. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 GIu oder Asp ist.
38. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin AGIu oder Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist.
39. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, Giy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
40. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
41. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von fünf Aminosäuren darstellt mit der Struktur ABCDE, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
42. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
43. Polypeptid nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4mehr als ein GIu oder Asp aufweist, wenn X4 mehr als eine Aminosäure aufweist.
44. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 Glu-Leu oder Glu-Leu-Asp-Leu ist.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20100303 |