DD236536A5 - Verfahren zur herstellung eines synthetischen peptides - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Peptides mit Einfluss auf die Sekretion der Hypophyse fuer die Anwendung zur Diagnostik oder zur Beschleunigung des Wachstums in der Tierproduktion. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Peptide mit hoeherer Aktivitaet, die gegenueber dem enzymatischen Abbau im Koerper widerstandsfaehig sind. Erfindungsgemaess werden neue Peptide mit der folgenden Sequenz hergestellt: R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-Gln-R17-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-R23-R24-R25-Ile-R27-R28-R29-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44worin R1 Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His oder D-His darstellt mit entweder einer CaMe- oder Na-Me-Substitution oder in unsubstituierter Form; R2 ist Ala, D-Ala oder D-NMA; R3 ist Asp oder D-Asp; R8 ist Ser, Asn, D-Ser oder D-Asn; R10 ist Tyr oder D-Tyr; R12 ist Arg oder Lys; R13 ist Ile oder Val; R14 ist Leu oder D-Leu; R15 ist Gly oder D-Ala; R17 ist Leu oder D-Leu; R18 ist Tyr oder Ser; R23 ist Leu oder D-Leu; R24 ist His oder Gln; R25 ist Glu, Asp, D-Glu oder D-Asp; R27 ist Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva oder Val; R28 ist Asn oder Ser; R29 ist Arg oder D-Arg; R34 ist Arg oder Ser; R38 ist Gln oder Arg; R39 ist Arg oder Gly; R40 ist Ser oder Ala; R42 ist Phe, Ala oder Val; R43 ist Asn oder Arg; R44 ist mit der Massgabe, dass irgendeiner oder alle der Reste zwischen R28 und einschliesslich R44 gestrichen werden koennen und der weiteren Massgabe, dass R2 D-NMA und/oder R14 D-Leu und/oder R29 D-Arg ist.

Description

AP G 12 P/276 457-3 65 333/18

Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Peptides

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptides mit Einfluß auf die Punktion der Hypophyse beim Menschen oder bei anderen Lebewesen. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Peptid hergestellt, daß die Freisetzung von Wachstumshormonen durch die Hypophyse beschleunigt .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Physiologen haben seit längerer Zeit erkannt, daß der Hypothalamus die sekretorischen Punktionen der Adenohypophyse mit den vom Hypothalamus produzierten speziellen Substanzen steuert, die die Sekretion jedes Hypophysenhormons stimuliert oder inhibiert. Ein hypothalamischer Inhibierungsfaktor wurde 1972 in Form von Somatostatin charakterisiert, das die Sekretion von Wachstumshormon (GH) inhibiert. Im Jahre 1982 wurden humanpankreatische (Tumor) freisetzende Paktoren (hpGRP) aus Extraktionen menschlicher pankreatischer Tumore isoliert, gereinigt, bestimmt, synthetisiert und getestet, wobei gefunden wurde, daß sie die Preisetzung von GH durch die Hypophyse beschleunigen. Beide hypophysiotrope Faktoren wurden durch Totalsynthese reproduziert, und es wurden Analoge der natürlichen Strukturen synthetisiert. Man vermutet, daß der humanhypothalamische GH-freisetζende Paktor präzise die gleiche Struktur hat; somit wird der Begriff hGRP hier anschließend verwendet. Außerdem wurde ein entsprechender schweinehypothalamischer GH-freisetzender Paktor (pGRP), ein entsprechender

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rattenhypothalarriischer GH-freisetzender Faktor (rGRP) und ein entsprechender rinderhypothalamisciier GH-freisetzender Paktor bGRF charakterisiert und synthetisiert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen synthetischen Peptiden mit Einfluß auf die Funktion der Hypophyse, die gegenüber bekannten Peptiden eine wesentlich höhere Aktivität aufweisen und die gegenüber dem enzymatischen Abbau im Körper widerstandsfähig sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Es wurden nun synthetische Polypeptide synthetisiert und getestet, die GH aus kultivierten Hypophysenzellen freisetzen und die zumindest teilweise den enzymatischen Abbau im Körper hemmen und eine sehr wesentlich gesteigerte Potenz zeigen. Diese Peptide weisen Hei*CH₃-D-AIa (D-HMA) in 2-Stellung und/oder D-Leu in 14-Stellung und/oder D-Arg in 29-Stellung auf und vorzugsweise auch HIe in 27-Stellung. D-Leu kann in 17- und/oder 23-Stellung vorhanden sein, und entweder D-GIu oder D-Asp kann in der 25-Stellung vorhanden sein. Die Peptide können auch einen der folgenden Reste in der 1-Stellung haben: Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pGL-Phe, Leu, His und D-His, wobei diese Reste gegebenenfalls eine Methylsubstitution entweder am alpha-Kohlenstoff oder in der alpha-Aminogruppe aufweisen können. Sie können gegebenenfalls D-Asp in 3-Stel-

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lung und/oder entweder D-Arg oder D-Ser in 8-Stellung und/ oder D-Tyr in 10-Stellung und/oder D-AIa in 15-Stellung aufweisen. Auch können sie D-Met oder Uv a anstelle von entweder UIe oder Met in 27-Stellung aufweisen.

Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen in Zusammenhang mit der Erfindung gehören derartige Analoge mit zwischen etwa 27 und 44 Resten in der Länge, oder eines ihrer nichttoxischen Salze, dispergiert in einer' pharmazeutisch oder Veterinär annehmbaren Flüssigkeit oder einem festen Träger. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können in der klinischen Humanoder Veterinärmedizin zur Verabreichung für therapeutische Zv/ecke auch zu diagnostischen Zwecken eingesetzt werden. Darüber hinaus können sie dazu verwendet werden, das Wachstum von Warmblütern einschließlich Vögeln (Geflügel) sowie in der Aquikultur bei Kaltblütern-,' z.B. Fischen, Aalen usw. zu beschleunigen.

Die zur Definition der Peptide verwendeten Itfomenklatur entspricht der von Schroder u. Lubke in "Die Peptide" (The Peptides), Academic Press, 1965t worin in Übereinstimmung mit der üblichen Darstellung die Aminogruppe am U-Ende (IT-Terminal) links und die Carboxygruppe am C-Ende (C-Terminal) rechts erscheint. Unter natürlichen Aminosäuren sind übliche, natürlich auftretende, in Proteinen zu findende' Aminosäuren zu verstehen, wie GIy, Ala, VaI, Leu, He, Ser, Thr,· Lys, Arg, Asp, Asn, GIu, Gin, Gys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Mit UIe ist üorleucin und mit iiva ist Uorvalin gemeint. Wo die Aminosäurereste isomere Formen aufweisen, ist es die L-Form, die dargestellt ist, falls nichts anderes ausdrücklich hervorgehoben wird. D-IiMA bedeutet das D-Isomere von Alanin, worin die alpha-Aminogruppe durch Methyl substituiert ist.

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Die Erfindung "betrifft synthetische Peptide mit der folgenden Sequenz (I):

R₁-R₂-ß₃-Ala-Ile-Phe-Thr-R_Q-Ser-R₁ Q-

, -R₁ C-GIn-R₁ ,,-R_{1 Q}-AIa-Arg-LyS-LeU-R₂₃-

ASn-GIn-GlU-R₃₈-R₃₉-R₄₀-ATg-R₄₂-R₄₃-R₄₄ worin R₁ Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His oder D-His bedeutet mit entweder einer oder F^Me-Substitution oder unsubstituiert ist, R₂ ist . Ala, D-AIa oder D-IiMA; R₃ ist Asp oder D-Asp; R_Q ist Ser, Asn, D-Ser oder D-Asn; R₁₀ ist Tyr oder D-Tyr; R₁₂ ist Arg oder Lys; R₁₃ ist He oder VaI; R₁₄ ist Leu oder/D-Leu; R₁,- ist GIy oder D-AIa; R₁^ ist Leu oder D-Leu; R₁Q ist Tyr oder Ser; R₂-, ist Leu oder D-Leu; R₉, ist His oder Gin; R₀₁- ist GIu, Asp, D-GIu oder D-Asp;· R₂Y ist Met, D-Met, Ala, IiIe, He, Leu, 'jtfva' oder VaI; R₂Q ist Asn oder Ser; R₂Q ist Arg oder D-Arg; L, ist Arg oder Ser; R₀O ist GIn oder Arg; R₀q ist Arg oder GIy; R₄₀ ist Ser oder Ala; R^₂ ist Phe, Ala oder VaI; R₄., ist Asn oder Arg; R₄₄ ist eine natürliche Aminosäure ;

mit der Maßgabe, daß beliebige oder alle Reste zwischen R₂Q und einschließlich R.* gestrichen werden können und der weiteren Maßgabe, daß R₂ D-EMA und/oder R₁, D-Leu und/oder R₂Q D-Arg ist. "Y" wird hier für die Darstellung des Carboxyteiles d·ϊ3 Aminosäurerestes am C-Terminal verwendet und einer der folgenden Radikale sein: -COOR, -GRO, -COlTHIiHR, -CON(R) (R¹) oder -CH₂OR, wobei R und R' Niederalkyl, Pluorniederalkyl oder Wasserstoff sein können und die bevorzugten Niederalkylgruppen Methyl, Ethyl'und Propyl sind.

Wenn sich ein Rest in der 44-Stellung befindet, wird üblicher-

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weise eine Aminosäure außer Cys gewählt, falls der Wunsch "besteht, ein Dimeres zu bilden oder das synthetische Peptid an ein anderes Peptid zu koppeln, Wenn Met in 1-Stellung auftritt, ist es vorzuziehen, einen anderen Rest in 27-Stellung zu haben.

Wie oben aufgeführt, haben Fragmente, die sich von ^-Terminal her über den Re3t-27 erstrecken, biologische Wirksamkeit bei der Freisetzung von GH durch die Hypophyse und derartige biologisch aktive Fragmente werden als in den Schutzumfang der Erfindung fallend betrachtet. Wenn sich das Peptidfragment nur bis zum Rest 27 oder 28 erstreckt, sollte Y-COIiHp oder ein substituiertes Amid sein. Wenn sich das Fragment bis auf einen der Reste 29 bis 39 erstreckt, ist vorzugsweise ein Amid oder ein substituiertes Amid, kann aber auch -COOH sein. Wenn .das Fragment 40 oder mehr Reste hat, gibt es keine deutliche Präferenz für den Teil am G-Terminal.

Die Peptide wurden mittels geeigneter Verfahren synthetisiert, beispielsweise durch alleinige Festphasentechnik, teilweise Festphasentechnik, Fragementkondensation oder klassische Lösungskupplungen. Es kann auch die kürzlich entwickelte rekombinante DiJA-Technik eingesetzt werden, um einen Teil eines Analogen, der nur natürliche Aminosäurereste enthält, herzustellen, der dann mit einem kurzen ίΤ-Ierrainal-Peptid verbunden wird. Beispielsweise sind die Techniken der vollständigen Festphasensynthese in dem Lehrbuch "Solid-Phase Peptide Synthesis" (Festphasenpeptidsynthese) von Stewart und Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969 beschrieben und erläutert durch die Offenbarung in der US-PS 4 105 603 (VaIe etal.), die am 8. August 1978 veröffentlicht wurde. Die klassische Lösungssynthese ist detailliert in der Monografie "Methoden der Organischen Chemie" von Houben-Weyl, Synthese von Peptiden, E. Wunsch (Herausgeber), Georg Thieme, Verlag Stuttgart, BRD, beschrieben

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(Die IPragmentkondensationsmethode der Synthese ist in der US-PS 3 972 859 (vom 3. 8. 1976) erläutert. Andere gängige Synthesen sind in den US-PS 3 842 067 (vom 15. 10. 1974) und 3 862 925 (vom 28. 1.-1975) erläutert.

Allen diesen Synthesen gemeinsam ist der Schutz der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäureteile mit geeigneten Schutzgruppen, die das Auftreten einer chemischen Reaktion an dieser Stelle verhüten, bis die Gruppe letztentlich entfernt wird, Üblicherweise ist ihnen weiterhin gemeinsam, der Schutz einer alpha-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während dieses mit der Carboxygruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe, um nun die Reaktion an dieser Stelle stattfinden zu lassen. Demgemäß ist es gewöhnlich so, daß als eine Stufe der Synthese eine Zwischenverbindung hergestellt wird., zu der Qeder der Aminosäurereste gehört, angeordnet in der gewünschten Sequenz, in der Peptidkette mit Seitenkettenschutzgruppen, die mit den entsprechenden Resten verbunden sind.

Als innerhalb des Schutζumfanges der vorliegenden Erfindung befindlich werden auch Zwischenprodukte der Formel (II) angesehen:

X¹-R₁(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(Z⁴)~R₈(X⁴ oder X⁵ )-Ser (X⁴)-R₁₀ (X²)-Arg (X⁶)-R₁₂ (X⁶ oder X⁷)-R., 3-R₁₄-R₁₅-Gln (X⁵) -R₁₇-R₁₈ (X²) -AIa-Arg (X⁶) -Lys (X⁷) -LeU-R₂₃-R₂₄(X oder X⁵)-R₂₅-(X³)-He-R₂₇-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-R₂₉(X⁶)-Gln(X⁵)-Gln(X⁵)-Gly-Glu(X³)-R₃₄(x4 oder X⁶)-As_n(X^)-GIn (X⁵)-Glu(X³)-R₃₈(X⁵ oder X⁶J-R₃₉(X⁶)-R₄₀(X⁴)-Arg(X⁶)-R₄₂-R₄₃(X⁵ oder X⁶)-R₄₄(X⁸)-X⁹,

worin X entweder Wasserstoff oder eine λ-Aminoschutzgruppe

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sind solche, die aus dem Stand der Technik für die stufenweise Synthese von Polypeptiden bekannt sind. Unter die zu verwendenden Klassen von ^,-Aminoschutzgruppen, die als X eingesetzt v/erden können, fallen (1) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp wie Fluorenylmethyloxycarbony1 (JMOG), Benzylozycarbonyl (Z) und substituiertes Z, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Iiitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (2) aliphatisch^ Urethan-Schutzgruppen wie t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, und (3) Cycloalkyl-Urethantyp-Schutzgruppen wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl. Die bevorzugte o^-Aminoschutzgruppe ist BOC, gerade dann, wenn ein H^-Me-substituierter Rest sich in 1-Stellung befindet.

X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe' für den ImidazoIstickstoff von His, wie z.B. Tos.

X kann eine geeignete Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr sein, wie Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorbenzyl (DCB). Die be-

vorzugte Schutzgruppe ist 2,β Dichlorbenzyl. X kann Wasserstoff sein, das bedeutet, daß es in dieser Stellung keine Seitenkettenschutzgruppe am Aminosäurerest gibt.

J/ ist i/asserstoff oder eine geeignete esterbildende Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asp oder GIu, wie Benzyl (OBzI), 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl und Ethyl.

X kann eine geeignete Schutzgruppe für die Kydrosygruppe von Thr oder Ser sein, wie Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorbenzyl und CBZ. Die bevorzugte Schutzgruppe ist BzI. X kann V/asser st off sein, was be-

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deutet, daß keine Schutzgruppe an der Hydroxygruppe vorhanden ist.

5 X ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Asn oder GIn, Es ist vorzugsweise Xanthyl (Xan).

X ist eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidingruppe von Arg, wie Nitro, Tos, CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOG, oder ist Wasserstoff.

X ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys, Beispiele für geeignete Seitenkettenamino-Schutzgruppen sind 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-Cl-Z), Tos, t-Amyloxycarbonyl und BOG,-

8 '

X ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenkettenschutzgruppe wie sie generell weiter oben genannt wurde. Met kann gegebenenfalls durch Sauerstoff geschützt werden, wird aber vorzugsweise ungeschützt gelassen.

Die Auswahl einer Seitenkettenamino-Schutzgruppe ist nicht kritisch mit der Ausnahme, daß im allgemeinen eine auszuwählen ist, die während der Abspaltung der Schutzgruppen für die o^ -Aminogruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Allerdings ist für einige Aminosäuren, z.B. His, ein Schutz nicht allgemein erforderlich, nachdem die Kupplung vollzogen ist, und die Schutzgruppen können dieselben sein.

X ist eine geeignete Schutzgruppe für die Carboxygruppe am

3 G-Ende, wie die esterbildende Gruppe X , oder sie ist eine Haftbindung, wie sie bei der Pestphasensynthese zur Bindung an einen festen Harzträger benutzt wird, oder sie ist das -X , wobei in diesem Falle der Rest am G-Ende einen Carboxyteil

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hat, der Y ist, wie es weiter vorher definiert worden ist. Wenn ein solcher fester Harzträger verwendet wird, ist er im weitesten Sinne als Schutzgruppe anzusehen und kann irgendeiner von denen aus dem Stand der Technik sein, wie: -O-CEL-Harzträger, -HH-Benzylhydrylamin-(BHA)-Harzträger oder -HH-Paramethylbenzylhydrylamin-(MBHA)-Harzträger. Wenn das uns.ubstituierte Amid gewünscht ist, ist das BHA- oder MBHA-Harz bevorzugt, da die Abspaltung direkt zum Amid führt. Pur den Pail, daß das H-Methylamid gewünscht wird, kann es aus dem H-Methyl-BHA-Harz erzeugt werden. Sollten andere substituierte Amide gewünscht sein, oder sollten andere Gruppen als die freie Säure am C-Bnde gewünscht sein, kann es vorzuziehen sein, das Peptid unter Verwendung klassischer Methoden gemäß Houben-V/eyl zu synthetisieren.

In der Formel für das Zwischenprodukt ist zumindest eine der

9 X-üruppen eine Schutzgruppe, oder X erfaßt einen Harzträger.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Peptids durch

a) Bilden eines Peptids mit wenigstens einer Schutzgruppe und der Formel (II), worin X, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ und X jeweils entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe dar-s·

stellt und Jr ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Haft-

bindung an dem Harzträger oder des -X , in welchem Falle der Rest am G-Ende einen Carboxyteil ist, der Y entspricht;

b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen oder der Haftbindung von dem Peptid der Formel (II) und

c) gewünschtenfalls Umwandeln des erhaltenen Peptids in dessen nichttosisches Salz.

Bei der Auswahl einer besonderen Seitenkettenschutzgruppe', die

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bei der Synthese der Peptide eingesetzt wird, bestehen folgende allgemeine Regeln: (a) die Schutzgruppe behält'vorzugsweise ihre Schutzeigenschaften und wird nicht unter Kupplung sbedingungen abgespalten, (b) die Schutzgruppe sollte dem Reagenz gegenüber stabil sein und ist, mit Ausnahme von Xyn, vorzugsweise unter den Reaktionsbedingungen stabil, die für die Entfernung derxr-Aminoschützgruppe bei jeder Synthesestufe ausgewählt wird, und (c) die Seitenkettenschutzgruppe muß nach Ende der Synthes entfernbar sein, bei der man die gewünschte Aminosäuresequenz erhält, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht in unerwünschter Weise be einträcht igen.

Wenn die Peptide nicht nach der rekominanten DNS-Technologie hergestellt werden, werden sie vorzugsweise mittels Pestphasensynthese hergestellt, die dies allgemein von Herrifield J.Am.Chem.Socw 85. (19β3)ρ 2149 beschrieben wurde, obgleich auch nach anderen aus dem Stand der Technik bekannten und oben genannten Verfahren gearbeitet werden kann. Bei der Pestpha- . sensynthese !wird vom C-Ende des Peptids begonnen, indem eine geschützte «--Aminosäure an ein geeignetes Harz gekuppelt wird. Ein solches Startmaterial kann durch Anfügen einer d,-Aminogeschützten Aminosäure über eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydrosymethylharz oder durch eine Amidbindung an ein BHA-Harζ oder MBHA-Harz hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes.ist von Bodansky et al., Chem.Ind. (London) 38 (1966) 1597-98 beschrieben wor-' den. Chlormethyliertes Harze sind'kommerziell von Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien und von Lab. Systems, Inc. erhältlich. Die Herstellung eines solchen Harzes ist von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Syntheses" (Preeman& Co., San !Francisco, 1969) Kap. 1, S. 1-6 beschrieben worden. BHA- und MBHA-Harzträger sind kommerziell erhältlich und werden um allgemeinen eingesetzt, wenn die zu synthetisierenden gewünsch-

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ten Polypeptide ein unsubstituiertes Amid am C-Ende haben.

Die Aminosäure mit C-Ende, z.B. Asn, geschützt durch BOG und durch Xan, kann zuerst an das chlorinethylierte Harz gekuppelt werden, und zwar nach der Verfahrensweise, die in Chemistry Letters (1973), 165-168 von K. Horiki et al. beschrieben wurde, unter Verwendung von KP in DMP bei etwa 60° C über 24 Stunden und unter Rühren, wenn das Peptid mit 43 Resten zu synthetisieren, ist . jtfach dem Kuppeln der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die au-Aminoschutzgruppe entfernt unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TPA) in Methylenchlorid oder in TPA allein* Das Abspalten der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur von zwischen etwa 0 C und Zimmertemperatur durchgeführt. Andere Standardpräparate zum Abspalten, wie HcI in Dioxan sowie Bedingungen zur Entfernung der spezifischen Λ--Aminoschutzgruppen können gemäß der Beschreibung in Schroder u. Iaibke "The Peptides"; 1, S. 72-75 (Academic Press 1965) eingesetzt v/erden.

Uach Entfernung der <*—Amino schutzgruppe werden die verbliebenen ^-Amino-. und Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in gewünschtem Maße gekuppelt, wobei man ein bereits oben definiertes Zwischenprodukt erhält, oder als Alternative zur Zugabe jeder Aminosäure separat in der Synthese, die mögliche Kupplung einiger von ihnen aneinander bereits vor der Zugabe zum Pestphasen-Reaktionsgefäß. Die Auswahl eines entsprechenden Kupplungsreagenz erfolgt gemäß dem Stand der Technik. Insbesondere als Kupplungsreagenz geeignet ist N,l^:i'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).

Die bei der Pestphasens3m.th.ese der Peptide eingesetzten aktivierenden Reagentien sind in der Peptidchemie bekannt. Beispiele geeigneter aktivierender Reagentien sind Carbodiimide wie ίΤ,Ιί¹-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-H^f-(3-dimethylaminopropyl)

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carbodiimid. Andere aktivierende Reagentien und deren Verwendung bei der Peptidkupplung sind von Schroder und Lubke s.ο« im Kap. III und von Kappor in J. Pharm. Sei. 59 (1970) S. 1-27 beschrieben worden.

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in das Festphasen-Reaktionsgefäß in etwa dem vierfachen Überschuß oder mehr eingebracht, und die Kupplung kann in einem Medium von Dimethylformamid (DMP):CH₂Cl₂ (1:1) oder in MP oder CHpCIp allein durchgeführt werden. In Fällen, wo die Kupplung unvollständig ist, wird die Kupplungsprozedur wiederholt bevor die. Entfernung der »,.-Amino schutzgruppe vor dem Kuppeln der nächsten Aminosäure erfolgt. Der Erfolg der Kupplungsreaktion in jedem Synthesestadium, wenn sie manuell durchgeführt wird, wird vorzugsweise über die liinhydrinreaktion verfolgt, wie von E. Kaiser et al. in Anal. Biochem. 34 (1970) 595 beschrieben. Die Kupplungsreäktionen können automatisch durchgeführt werden wie z.B. auf einem Beckmann 990-Automatiksynthesizer unter Verwendung eines Programms wie von Rivier et al. in Biopolymers, 1979, 17, S.*1927-193S berichtet.

liachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollständig ist, kann das Zwischenprodukt-Peptid vom Harzträger entfernt werden durch Behandlung mit einem Reagenz wie Flußsäure, das nicht nur das "Peptid vom Träger abspaltet, sondern ebenso die verbliebenen Seitenkettenschutzgruppen X, X , X , Ί7, X , X , X und X und

Q -1

die Haftbindung 'L und ebenso die ο-Amino schutzgruppe X , wenn eine vorhanden ist, um das Peptid als freie Säure zu erhalten. Wenn in der Sequenz Met vorhanden ist, wird die BOC-Schutzgruppe vorzugsweise zuerst entfernt unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandithiol vor dem Abtrennen des Peptids vom Harz mit HF, um die potentielle S-Alleylierung zu eliminieren. Wenn zum Abtrennen Flußsäure eingesetzt wird, werden Anisol und

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Methylethylsulfid als Spülmittel in den Reaktionsbehälter eingebracht.

Ausfuhrun^abeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Das folgende Beispiel stellt ein bevorzugtes Verfahren zur Synthetisierung von Peptiden mittels Festphasentechnik dar. Es ist natürlich selbstverständlich, daß die Synthese eines entsprechend kürzeren Peptidfragments in der gleichen Weise bewirkt wird durch einfaches Eliminieren der notwendigen Anzahl von Aminosäuren an jedem Ende der Kette; allerdings wird gegenwärtig vermutet, daß biologisch aktive Fragmente die angezeigte Sequenz am il-Ende 'enthalten sollten.

Beispiel I

Die Synthese des Peptids (imieTyr¹ , D-illiA², . D-Leu²³)-rGR3¹ (1-43)-OH mit der Formel

Ii MeTyr-D-lCiA-Asp-Aöa-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ili-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-üln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem chlormethylierten Harz mit einem Substitutionsbereich von etwa 0,1 bis 0,5 mmol/ g Hajrz. Die Kupplung von BOC-Asn(Xan) an das Harz erfolgte gemäß der allgemeinen Verfahrensweise in Chemical Letters, siehe

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oben, unter Verwendung von KP in DiIP bei etwa 60° C über Stunden unter Rühren, wobei man eine Substitution von etwa 0,35 mmol Asn pro Gramm Harz erhielt.

lach dem Entblockieren und der neutralisation wurde die Peptidkette schrittweise am Harz aufgebaut in allgemeiner Übereinstimmung nach der Verfahrensweise von Rivier, J.; J. Amer. Cehm. Soc. 96, 2986-2992 (1974). Alle dabei verwendeten Lösungsmittel waren sorgfältig durch Spülen mit einem Inertgas wie z.B. Helium oder Stickstoff entgast worden, um zu sichern, daß kein Sauerstoff vorhanden war, wodurch der Schwefel des Met-Restes in unerwünschter Weise oxidiert v/erden könnte.

Das Entblockieren erfolgt vorteilhaft in Übereinstimmung mit der folgenden Tabelle A .

Tabelle A Reagenz Mischzeit (Hinuten)

1. 60 % TFA/2 % Ethandithiol 10

2. 60 % ΤΡΛ/2 % Ethandithiol 15

3. IPA/1 % Ethandithiol 0,5

4. Et₃Ii (10 %) in CH₂Cl₂ ' 0,5

5. MeOH 0,5

6. Et₃U-(IO %) in CH₂Cl₂ 0,5

7. MeOH (zweimal) . 0,5

8. CH₂Cl₂ (zweimal) 0,5

Die Kupplungen wurden vorzugsweise gemäß der folgenden Tabelle B durchgeführt:

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Tabelle B Reagenz Mischzeit (Minuten)

9. DGCI -

10. Boc-Aminosäure 50 - 90

11. Me OH (zv/eimal) 0,5

12. CH₂Cl₂ (zweimal) 0,5

13. Ac₂O (3M) in GH₂CL₂) 15,0

14. GH₂CL₂ 0,5

15. MeOH 0,5

16. GH₂Cl₂ (zweimal) 0,5

Es wurden ein- bis zwei mmol BOC-geschützter Aminosäure in Methylenchlorid pro g Harz eingesetzt plus ein Äquivalent 1,0 molarem DCCI in Methylenchlorid für zwei Stunden. Wenn BOC-Arg (TOS) gekuppelt wird, wird ein Gemisch von 50 % DMP und Methylenchlorid verwendet. Bzl-Ether wurde Hydroxy-Seitenketten- " schutzgruppe für Ser und Thr eingesetzt. Die Amidogruppe von Asn oder GIn wurde durch Xan geschützt wenn die DCC-Kupplung verwendet wird, wie es bevorzugt wird. Es kann auch p-lTitrophenylester (ONp) verwendet werden, um das Carboxyende von Asn oder GIn und beispielsweise BOC-Asn (ΟϊΤρ) kann über ITacht unter Einsatz von einem Äquivalent HOBt in einem 50 %igen Gemisch von DMF und M^thylenchlorid gekuppelt werden. Als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette wurde 2-Chlor-benzyloxycarbonyl (2C1-Z) verwendet. Tos wurde eingesetzt, um die Guanidingruppen von Arg und den Imidazolstickstoff von His zu schützen, und die GIu- oder Asp-Seitenketten-Carboxygruppe wurde mit OBzI geschützt. Die phenolische Hydroxygruppe von Tyr wurde mit 2,6-Dichlorbenzyl (DCB) geschützt. Am Ende der Synthese erhielt man die folgende Zusammensetzung:

BOC-IT ^x MeTyr (X²) -D-HHA-Asp (X³) -Ala-Ile-Phe-Thr (X⁴)-Ser (X⁴) Ser (X⁴) -Tyr (X²) -Arg (X⁶) -Arg (X⁶) -He-Le U-GIy-GIn(X⁵) -

Leu-Tyr(X²)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-D-Leu-Iiis(X)-Glu (X³)-Ile-Met-Asn(X⁵)-Arg(X⁶)-Gln(x5)-Gln(x5)-Gly-Glu(x3)-

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g()-Asn(X⁵)-GIn(X⁵)-GIu(X³)-GIn(Z⁵)-Arg(X⁶)-Ser(X⁴)-Arg(X⁶)-Phe-Asn(X⁵)-X⁹ worin X² DCB ist, X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos, X⁷ ist 2C1-Z und X⁹ ist -Q-GHp-Harziäger.

Xan kann teilweise oder vollständig durch TPA-Behandlung entfernt werden, um die '^-Aminoschutzgruppe zu entblockieren.

Um das geschützte Peptidharz zu spalten und zu entschützen, wurde es mit 1,5 ml Anisol, 0,5 ml Methylmethylsulfid und ml Flußsäure (HP) pro Gramm Peptidharz bei -20° G für eine halbe Stunde und bei 0° G für eine halbe Stunde behandelt".. Nach der Entfernung von HP unter Hochvakuum wurde der Harz -abwechselnd mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen und das Peptid dann mit 2 N wäßriger Essigsäure extrahiert und aus dem Harz durch Filtrieren abgetrennt. Das gespaltene und entschützte Peptid wurde darm in 0 bis 5 %iger Essigsäure gelöst und gereinigt beispielsweise mittels Sephadex G-50 Peingelfiltration.

Das Peptid wurde dann weiter durch präparative oder halbpräparative HPLC gereinigt, wie bei Rivier et al., Peptide: Sturktur und biologische Punktion (Peptides: Structure and Biological Function) (1979) S. 125-128 und MarKi et al. J.Arn. Ghem.Soc. 103, 3178 (1981) beschrieben. Patronen'von V/at er s Associates prep LC-500 wurden mit 15-20 u Cj₈ Silicia von Vydac (300 A) gepackt. Ein Gradient von CHoClT in TEiVP wurde durch einen Hiederdruck-Eldexgradientenerzeuger erzeugt wie bei Rivier J.; J. Liqu. Chromatography^, 343-367 (1978) beschrieben. Die chroatografischen Fraktionen wurden sorgfältig über HPLC beobachtet und nur die Fraktionen, die wesentliche Reinheit zeigten, wurden vereinigt. Die Entsalzung der gereinigten Fraktionen, die unabhängig auf Reinheit geprüft wurden, erreichte man unter Verwendung eines Gradienten von CELCH in 0,1 % TPA. Der Mittelschnitt wurde dann lyophilisiert, um das gewünschte Pep-

- 17 - 65 333/18

tid zu erhalten, wobei dessen Reinheit größer als 98 % sein kann.

Die Synthese wurde wiederholt unter Verwendung eines MBHA-Harzes, um das gleiche Peptid mit einem amidierten C-Terminus zu erhalten, unter Einsatz des ursprünglichen Verfahrens, wie es von VaIe et al in der US-PS 4 292 313 beschrieben wurde, um Asn an das MBHA-Harz zu binden.

Beispiel II

Die Synthese eines amidierten Peptids mit 40 Resten /G MeHis , D-NMA², D-Leu²³/ - hGRF (1-4O)-IH₂ mit der Formel:

H-C MeHis-D-MilA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Als-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-•Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-liH₂ ·

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel III

Die Synthese von /D-MiA², Ule²T7-rGRP (1-43)-OH mit der Formel

H-His-D- DiJMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg- Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-MTe-Asn-Arg- Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beck-

- 18 - 65 333/18

mann 990-Peptid-Synthetisators auf einem chlormethylierten Harz, wie es allgemein im Beispiel 1 beschrieben v/urde. Das Peptid v/urde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel IV

Die Synthese des hGRF-Analogfragments /D-IMA , ille y-hGRP (1-32)-ITHp mit der Formel

H-Tyr-D-IIvLi-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Syr-ilrg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-HIe-Ser-ATg-GIn-GIn-GIy-IiH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach ZLC und HPLC gefunden. Die Synthese wurde zweimal wiederholt, und man erhielt /D-BMA², D-Met²⁷/-hGPJ? (1-32)-M und /"D-IiIMA², D-Leu²³, iIle²⁷/-hGRF( 1-32)-ITH₂.

Beispiel V

Die Synthese des hGRF-Analog-Fragments /D-HMA , NIe²V-hGRF (1-29)-IH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Tfctr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-VaI-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Hle-Ser-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verv/endung eines Beckmann. 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Bei-

- 19- 65 333/18

spiel II beschrieben.

Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden. Die Synthese wurde wiederholt und man erhielt /D-², Efle²⁷7-hGRF( 1-27) -

Beispiel VI

Die Synthese von /D-IMA², ITle²⁷/-rGRF (1-29)-Mi₂ mit der Formel

li-His-D-miA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-ilrg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-lile-Asn-ilrg-iJHp

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBILI-Harζ wie im Beispiel II beschrieben.

Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC

ρ p "5

gefunden. Die Synthese wurde wiederholt, um'/D-IHdA , D-Leu , ²T (1-29)-Mi₂ zu erhalten.

Beispiel VII

Die Synthese von /D-MIA², D-GIu²⁵, Hle²⁷7-hGRF( 1-29)-ITH₂ ^mit der Formel

H-Tyr-D-MdA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Als-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Glu-Ile-BTe-Ser-Arg

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein

- 20 - 65 333/18

nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel Till

Die Synthese von /I)-HMA², D-GIu²⁵, Hva²T/-rGRP( 1-29)-HH₂ mit der Formel

H-His-D-HMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-iDyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-ilva-Asn-Arg

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben.

Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und PHLG gefunden.

Beispiel IX

Die Synthese von /D-Phe¹,' D-HMA², D-Leu²³7-pGRF(1 -44)-I¹IH₂ ^mit der Formel

H-D-Phe-D-lilaA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-GIy-GIu-ATg-ASn-GIn-GIu-GIn-GIy-AIa-ATg-VaI-ATg-LeU-NH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentliehen rein nach TLG mad HPLG gefunden.

- 21 - 65 333/18

Beispiel X

Die Synthese von (pCL-Phe¹, D-MA², D-Leu¹⁷'²³, Asp²⁵, Ile²⁷)-rGBF C1-43)-OH mit der Formel

H-pCl-Phe-D-lffiA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-D-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Asp-Ile-Ile-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf. einem chlormethyliertem Harz in der Weise, wie es allgemein im Beispiel I beschrieben wird. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLG gefunden.

Beispiel TX

Die Synthese von (D-HLiA², D-Asp³'²⁵)-hGRP( 1-32)-HH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-I'iMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ilrg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-GIy-Mi₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wds im Beispiel II beschrieben.

Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

- 22 - ' 65 333/18

Beispiel SII

Die Synthese von (D-Tyr¹, D-HMA², D-Asp³, D-Asn⁸, D-Tyr¹⁰, D-AIa¹⁵, D-Leu^17>23, D-Asp²⁵, D-Met²⁷)-hGRF(1-29)-HH₂ mit der Formel

H-D-Tyr-D-ittül-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Äla-Gln-D-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-He-»D-Met-Ser-Arg-IH₂

v/urde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem UßiiA-iiaxz wie im Beispiel II beschrieben.

Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel XIII

Die Synthese von (D-His¹, D-MJA², D-Ser⁸, D-Leu²³, IUe²⁷)-rGRP(1-43)-OH mit der Formel

H-D-His-D-ffiwA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Ser-6er-Tyr-Arg-i\rg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990_Peptid-Synthetisators auf einem chlormethylierten Harz in der V/eise, wie es allgemein im Beispiel 1 beschrieben wurde. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

- 23 - 65 333/18

Beispiel ZIV

Die Synthese eines rGRP-Analog-Pragmentes und zwar von

¹, D-WaUi², D-GIu²⁵)-rGEF( 1-29)-M₂ mit der Formel

N^-MeTyr-D-MilA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Met-Asn

wurde schritt?/eise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel IJ beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beiapiel XV

Die Synthese von (C*lvieLeu¹, D-IMA², D'Leu²³, D-GIu²⁵, AIa²⁷)-rGRP-(VaI⁴⁴)-IiH₂ mit der Pormel

H-C⁰⁰Me Leu-D-MIA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-i'irg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-ilrg-Lys-Leu-D-Leu-His-D-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-lIHo

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel· II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel ZVI

Die Synthese von (D-IiMiI², Nle²⁷)-pGRF(1-29)-NH₂ mit der Pormel

- 24 - 65 333/18

H-Tyr-D-lttlA.-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Hle-Ser-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 "beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach ¹HLG und IJPLC gefunden.

Beispiel XVII

Die Synthese von (D-Tyr¹, D-IMA², D-Leu²³ )-bGR]?( 1-44)-NH₂ mit der !Formel

H-D-Tyr-D-iilvIA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-iirg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln~Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg- LeU-IiH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde alsim wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel XVIII

Die Synthese von (D-MHA.², Nie²⁷) .bGRP( 1-29.)'-IiH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-inM-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ilrg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-AIa-Arg-Lys-Leu-Leu-U-ln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-

i¹ . *·

- 25 - 65 333/18

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz v/ie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentliehen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel XIZ

Die Synthese von (CniePhe¹, D-IMA², VaI²⁷VrGRP-(LeU⁴"⁴)-ITH₂ mit der Formel

H-G^-MePhe-D-ffiia-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Val-Asn-Arg-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Leu-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptids-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel XX

Die Synthese von (D-Met¹, D-IIMA², Tyr¹⁸)-bGRP( 1-44)-IJH₂ mit der Formel

H-D-Met-D-iijMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-, Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-'Asp-Ili-Met-Asn-Arg-GIn-GIn-GIy-GIu-ATg-ASn-GIn-GIu-GIn-GIy-AIa-ATg-VaI-ATg-LeU-Mi₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beck-

- 26 - 65 333/18

mann.990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 "beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel Ul

Die Synthese von (I^Mellis¹, D-MA², Nle²⁷)-pGPJF (1-29) mit der Formel

H-F^ileHis-D-lMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ilrg-Lys-Val Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-wle-Ser

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisat'ors auf einem MBHA-Harz, wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 "beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel XXII

Die Synthese des hGRF-Änalogfragments (D-MIA², Leu²⁷, Asn²⁸)-hGR]?( 1-32)-HH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-lJIaA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-GIn-GIn-GIy-NH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einen MBHA-Hara wie im Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im wesentlichen

- 27 - 65 333/18

rein nach. TLG und HPLC gefunden. Die Synthese wurde zweimal wiederholt und man erhielt (D-MvIA², Hva²⁷)-hGRF(1-32)-NH₂.

Beispiel XXIII

Die Synthese von (D-MIA², Lys¹², IUe²⁷)-rGRF(1-29)-NH₂, ^mit der Formel

H-His-D-MMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Ihr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHÄ-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach. TLC und HPLC gefunden. Die Synthese wurde zweimal wiederholt, und man erhielt (D-KMA², VaI¹³), Ser¹⁸)-rGRF(1-29)

Beispiel SXIV

Die Synthese des hGRF-Analogfragments (D-IMA², Arg¹², lie²⁷)· hGRF(1-29)-MH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-BlilA-Asp-Ala-Ile-Phe-Shr-Asn-Ser-Tyr-iirg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990_Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid ?/urde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

- 28 - 65 333/18

Beispiel XXV

Die Synthese von (D-Phe¹, D-KLlA², D-AIa¹⁵, D-Met²⁷)-hGRF (1-29) mit der Formel .

H-D-Phe-D-MäA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Ara

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im. Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel

Die Synthese von (D-MdA², His²⁴, D-Asp²⁵)-hGRFO-32)-IH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-liMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-C-ln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Asp-Ile-Met-Ser-Arg- GIn-GIn-GIy-XlH₂.

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben., Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel SXVII

Die Synthese von (rtleHis¹, D-KMA², D-Asp²⁵)-rGRF(1-29)-HH₂ mit der Formel

3 1 · .

- 29 - 65 333/18

F¹MeHiS-D-IiIiIA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Ieu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Asp-Ile-Met-Asn- ATg-IH₂

y/urde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem IvLBHA-H ar ζ wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel

Die Synthese von (D-His¹, D-ΙΠίΑ², D-Asn⁸, iJle²⁷, Ser³⁴,Ala⁴⁰) rGRP(1-43)-OH mit der Formel

H-D-His-D-IMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-KTe-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ala-Arg-Phe-Asn-OH

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem chlorinethylierten Harz in der Weise, wie es allgemein im Beispiel I beschrieben wurde; das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel Uli.

Die Synthese von (D-AIa², D-Asp³, D-Arg²⁹)-hGKP(1-32)-iiH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-AlarD-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ilrg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-'Asp-Ile-Met-Ser-D-Arg-Gin-GIn-GIy-IIH₂

- 30 - 65 333/18

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel XXX

Die Synthese von (D-Tyr¹, D-ltfHA², D-Asp³'²⁵, D-Asn⁸, D-Tyr¹⁰, D-AIa¹⁵, D-Leu¹⁴'¹⁷»²³, D-Met²⁷, D-Arg²⁹)—hGRP(1-29)-HH₂ mit der Formel

H-D-Tyr-D-IMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-VaI-'D-LeU-D-Ala-Gln-D-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-D-Met-Ser-D-Arg-M₂

wurde schrittweise durchgeführt" unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel XXXI

Die Synthese von (D-His¹, D-SMA², D-Ser⁸, D-Leu¹⁴, NIe²⁶)-rGEP(1-43J-HHCH₂CH-mit der Formel

H-D-His-D-IWA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Iile-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-IHGH₂GH₃

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem chlormetiiylierten Harz in der Weise, wie es allgemein im Beispiel I beschrieben wurde.

- 31- 65 333/18

Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach ¹SLG und HPLG gefunden.

Beispiel ΧΧΣΙΙ

Die Synthese des rGRP Analogfragments (IPHeTyr , D-Leu , D-GIu²⁵)-rGKP( 1-27)-IiH₂ mit der Formel

K^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Tlir-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Met-iTHp

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthestisators auf eineia MBHA-Harz v/ie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLG gefunden.

Beispiel

ττγτττ

1 ' P 1 A PQ

Die Synthese von (D-Tyr , D-2BIA , D-Leu ^, D-Arg^)-pGRF(1-44) mit der Pormel

H-D-Tyr-D-ffiiLl-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-IIe-Met-Ser-D-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-i'Lrg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-iVrg Le u-l

vairde schrittv/eise durchgerführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz v/ie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefun den.

- 32 - 65 333/18

Beispiel XaZIV

Die Synthese von (C^'IeLeu¹ , D-MA², D-Leu¹⁴, D-GIu²⁵, He²⁷) rGKF( 1-27)-2JH₂ mit der Formel

H-C^-MeLeu-D-miA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Ile-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-H ar ζ v/ie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel XXXV

Die'Synthese von (D-Tyr¹, D-ΜίΑ², D-Leu¹⁴, D-Arg²⁹, AIa⁴²)-bGHPC1-44)-HH₂ mit der Formel

H-D-Tyi'-D-^^^-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asn-Ile-Met-Asn-D-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-AIa-Arg-AIa-Arg-Leu-MHo

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et air im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLO und HPLG gefunden·

Beispiel

Die Synthese von (D-HI-Li², IiIe²⁷, D-Arg²⁹)-pGEP(1 -29)-HHp mit

- 33 - 65 333/18

der Formel

H-Tyr-D-MHA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-ille-Ser-D-Arg-ϊίΗρ

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie allgemein von VaIe et al. im US-Patent 4 292 313 beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLG gefunden. Das Acetatsalz wurde anschließend durch Lösen des Peptids in Wasser, und Zusatz von 1 II Essigsäure hergestellt. Die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert, um das Essigsäuresalz zu erhalten.

Beispiel !HZVII

Die Synthese des hGHF-Analogen (D-ΙΏνΙΑ², iJle²⁷, D-Arg²⁵)-hGPJ¹ (1-29)-HH₂ mit der Formel

H-Tyr-D-iffilA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-ITle-Ser-D-

würde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptids-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Analoge wurde als im v/esentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden. Die Synthese wurde wiederholt, um (D-NMA², D-Leu¹⁴, Nie²⁷, D-Arg²⁹)-hGRF(1-32)-iiH₂ herzustellen.

1 I₁-

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Beispiel XOTIII

Die Synthese von (D-Leu^U, Nie²⁷ )-rGRI?( 1-29)-HH₂ mit der For mel

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-. Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-ille-Asn-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden. Die Synthese wurde wiederholt, um zu (D-HMA², D-Leu¹⁴, Nie²⁷)-rGEP(I -29)-33H₂ zu gelangen.

Beispiel

Die Synthese des hGRP-Analogen (D-JBIA², Nie²⁷, Asn²⁸)-hGRP (1-29)-HH₂ mit. der Pormel

H-Tyr-D-im-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-!\fH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-oynthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden»

Beispiel XL

Die Synthese von (D-AIa², D-GIu²⁵, Nie²⁷, D-Arg²⁹^GRP(1-29)-mit der Pormel

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H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Glu-Ile-iUe-Ser-D

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Bach Entfernung aus dem Harz und Entschützen wird das Peptid mit 11T Essigsäure behandelt, um zum Acetatsalz vor der Lyophilisierung herzustellen. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel ZLI

Die Synthese von (Nie²⁷, D-Arg²⁹)-rGRF(1-29)-EH₂ mit der Formel

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Ehe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-jtfle-Asn-D-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLC gefunden.

Beispiel XLII

Die Synthese von (pCl-Phe¹, D-MvIA², D-Leu¹⁴, HIe²⁷, D-Arg²⁹)-rGSJ?(1-43)-OH mit der Formel

H-pCl-Phe-D-MMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-ilrg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Nle-Asn-D-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH

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wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einein chlormethylierten Harz in der V/eise, v/ie es allgemein im Beispiel I beschrieben wurde. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLG und HPLO gefunden.

Beispiel XLIII

Die Synthese des hGEF-Analogfragmentes (D-HMA , D-Tyr¹⁰, Hie²⁷)· hGRF(1-29)-IH₂ mit der Formel H-Tyr-D-IMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-iJle-Ser-Arg-IJH₂

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid -wurde als im v/es ent liehen rein nach TLG und HPLG gefunden. Die Synthese wurde wiederholt, um zu (D-HMA², D-Leu¹⁷, Eile²⁷)-hGRF (1-27)-MH₂ zu gelangen.

Beispiel XLIV

Die Synthese des hGKF-Analogfragmentes (-D-MzIA², Hle²⁷)-hGRF (1-29)-IiHEt mit der Formel

H-Tyr-D-l^:JIvIA-Asp-Ala-Ile-Phe-Tlar-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-lTle-Ser-Aeg-FHGH₂GH₃

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem chlormethylierten Harz in der Weise, wie es allgemein im Beispiel I beschrieben wurde. Das Peptid wurde aus dem Harz durch Ammonolyse mittels

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Ethylenaminbehandlung abgespalten.· Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden·

Beispiel XLV

Die Synthese von (D-Leu¹⁴), lTle²⁷)-rGfiF(1-29)-M₂ mit der Formel

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-ille-Mg

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden.

Beispiel XLVI

Me Synthese des hGRF-Analogfragmentes (D-Tyr¹, D-IMA , , D-Arg²⁹)-hGRP( 1-29)-IiH₂ mit der Formel

H-D-Tyr-Dr-iffiiA-Asp-Ala-Ile-Ehe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-üys-Val-Leu Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-iTle-Ser-D-Arg

wurde schrittweise durchgeführt untrr Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLC und HPLC gefunden. Die Synthese wurde zxveimal wiederholt, um zu (Met¹, D-IlHA², iae²⁷)-hGRF(1-27)-MI₉ zu gelangen.

Beispiel XLVII

Die Synthese des hGRF-Analogfragmentes (D-I^MeTyr,D-HMA2

• ·. - 33 - 65 333/18

%. !Tie²⁷J-IiGRIi¹ (1-29)-M₂ mit der Formel

H-D-U MeTyr-D-MA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Iiys-VaI-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys,-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Hle- Ser-Arg-MHg

wurde schrittweise durchgefiüart unter Verwendung eines Beckmann 990-Peptid-Synthetlsators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde als im wesentlichen rein nach TLO und HPLG gefunden.

Beispiel ZLVIII

Die Synthese des hGRF-Analogfragmentes (His¹, D-MIA², HIe²⁷)-hGKF(1-29)-HH₂ mit der· Formel

H-His-D-IMA-Asp-Ala-Ile-Phe-TIir-Asn-Ser-Tjrr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Hle-Ser-Arg-

wurde schrittweise durchgeführt unter Verwendung eines Beck-, mann 990_Peptid-Synthetisators auf einem MBHA-Harz wie im Beispiel II beschrieben. Das Peptid wurde nach TLG und HPLG als im wesentlichen rein angesehen.

1 27

Die Synthese wurde zweimal wiederholt, um zu (His , UIe , D-

Arg²⁹).-hGRF( 1-27)-HH₂ zu gelangen. . . ·

Die in den Beispielen hergestellten Peptide verglich man mit synthetischen hpGfUKi-4O)-OH in vitro-Assays, wobei gefunden wurde, daß sie eine allgemein größere Potenz für die GH-Sekretion und ähnliche Eigenaktivitäten zeigten. Alle diese Peptide sind als biologisch aktiv anzusehen und potentiell nützlich für

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die Stimulierung der Freisetzung von GH durch die Hypophyse,

Um die Effektivität verschiedener synthetischer Peptide zur Beschleunigung der Freisetzung von Wachstumshormonen zu bestimmen, wurden in vitro-Assays durchgeführt unter Verwendung von synthetischem hpGRF(1-4O)-OH als Standard in nebeneinanderliegendem Vergleich mit äquimolaren Konzentrationen der verschiedenen anderen synthetisierten Analoge und Fragmente. Es wurden Kulturen verwendet, die Zellen von rattenhypophysen enthielten, die man 3 bis 5 Tage vorher entfernt hatte. Kulturen, die alsoptimal für die Sekretion von Wachstumshormonen zu betrachten sind, werden für die Vergleichsversuche eingesetzt, wie es allgemein von-VaIe et al. in Endorinology, 91 (1972) 562-572 und noch eingehender von VaIe et al. in Endocrinology 112, 1553-55 (1983) beschrieben worden ist. Die Inkubation mit der zu testenden Substanz erfolgt über 3 bis 4 Stunden und Aliquote des Kultur/aüdiums werden entfernt und behandelt, um deren Gehalte an iminunore aktiver GH (ir GH) durch eine gut charakterisierende Radioimmunoassay au messen. Die Ergebnisse sieses Vergleichstests für äquimolare Konzentrationen sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Peptid Vergleich (%)

hGRF(1-40)-0H

(Standard für diesen Test) 100 i

(D-HMA², HIe²⁷)-hGRF( 1-29)-HH₂ 1330 J

(D-IMA², HIe²⁷)-hGRF(1-27)-HH₂ 150 5

(B-MUi², Hle²⁷)-hGRF(1-29)-HHEt 1130 5

(D-HMA², HIe²⁷, Asn²⁸)-hGRF( 1-29)-HK₂ 520 ^c,

(D-Leu¹⁴, lie²⁷)-rGRF( 1-29)-HH₀ . 120 ^c,

(HIe²⁷, D-Arg²⁹)-rGRF(1-29)-HH₂ 386

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(D-ITMA², MIe*⁷ )-rGRI¹C1-29 J-BH₂ 900 %

(D-MiIA², D-Tyr¹⁰, IiIe²⁷)-hGRP(1 -29J-HH₂ 270 % (D-MiIA², ETIe²⁷, D-Arg²⁹)-hGRP(1 -29)-NH₂ 580 % (D-Tyr¹, D-Μ,ϊΑ², ITle²⁷, D-Arg²⁹)-hGRP(1-29)-HH₂ 60% (D-IT¹^MeTyT¹, D-ITMjV², ITIe²⁷)-hGRP(1-29)-JTH₂ 30% (His¹, D-IJMA², ITle²⁷)-hGRP(1-29)-ITH₂ · 260%

In vitro Tests dieser synthetischen Peptide zeigen, daß jedes dieser die volle biologische Eigenaktivität von hpGRP(1-40)-OH aufweist. Die minimale effektive Konzentration für /D-NMA , lTle²⁷7-hpGRP( 1-29)-Mi₂ ist etwas 1 picomolar.

Zusätzlich zu den in vitro-Tests für die Sekretion von Wachs- ' tumshormonen wurden über in vivo-Experimente die synthetischen Peptide intravenös in Urethan-anästetisierte männliche Ratten injiziert und bestimmt, daß sie die spontane GH-Sekretion ohne Beeinflussung der Wirkung auf die exogene GRP unterdrücken. Es wurden Blutproben genommen unmittelbar vorher und 10, 20 und 90 Minuten nach den Injektionen. GH-Spiegel im Blut, gemessen durch Radioimmunoassay, zeigten, daß synthetisches /D-MvIA², Ule²⁷/-hGRP( 1-29)-ITH₂ annähernd sechsmal wirksamer als hGRP(1-40)-OH ist, im Hinblick auf Blutspiegel von Hypophysen-GH bei Messung sowohl bei 10 als auch bei 30 Minuten nach i.v.-Injektion. Andere bekannte in vivo-Tests von GRP, die für die Bestimmung der Sekretion von GH als wirkungsvoll bekannt sind, sind für die Bestätigung dieser Ergebnisse eingesetzt worden. Dosierungen zwischen etwa 50 ITanogramm und etwa 5 Mikrogramm dieser Peptide pro kg Körpermasse sind zum Hervorrufen der GH-Sekretion als wirkungsvoll anzusehen. Einige Peptide, die in vetro biologische Wirksamkeit etwa gleich oder leicht geringer als der Standard, zeigten eine wesentlich grössere in vivo Wirksamkeit.

Derartige synthetische hpGRP-Analoge und möglicherv/eise rGRP- und pGRP-Analoge sollten für die Anwendung beim Menschen als

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nützlich angesehen v/erden, rtenn. der Arzt die GH-Produktion fördern will. Die Stimulierung der GH-Sekretion durch derartige Analoge ist bei Patienten mit vollständigem oder relativem GH-Mangel hervorgerufen durch Unterproduktion endogener GRF, von Interesse. Weiterhin ist es wahrscheinlich, daß steigende GH-Sekretion und damit einhergehende Steigerung des Wachstums bei Mengen oder Tieren mit normalen GH-Spiegeln erreicht werden kann. Darüber hinaus sollte die Verabreichung den Körperfettgehalt und andere GH-abhängige metabolische, immunologische und Entwicklungsprozesse verändern. Beispielsweise können diese Analoge als Mittel zur Stimulierung anabolischer Prozesse bei Menschen unter Zuständen, wie sie in der Folge von Verbrennungen auftreten, nützlich sein. Ein-weiteres Beispiel wäre, wenn diese Analogen·Warmblutigen Tieren der Tierproduktion verabreicht werden würden, z.B. Hühnchen, Truthühnchen, Schweinen, Ziegen, Rindern und Schafen, oder auch in der Aquikultur zur Aufzucht von Fischen oder anderen kaltblütigen Wasserlebewesen, wie Meeresschildkröten oder Aalen und amphibischen Lebewesen, um das Wachstum zu beschleunigen und das Verhältnis von Protein zu Fett zu steigern, erzielt durch Fütterung effektiver Peptidmengen.

Für die Verabreichung an Menschen sollten diese synthetischen Peptide eine Reinheit von wenigstens etwa 93 % haben, vorzugsweise von wenigstens 98 %, Für die Zwecke dieser Erfindung bezieht sich "Reinheit" auf das gewünschte Peptid, das die angegebene Hasse % aller vorhandener Peptide und Peptidfragmente ausmacht. Für die Verabreichung derartiger synthetischer Peptide an Tiere und auch an industriell produzierte Tiere, urn das Wachstum zu beschleunigen und den Fettgehalt zu verringern, kann eine niedrige Reinheit von etwa 5 % oder auch 0,01 % akzeptiert werden.

Diese synthetischen Peptide oder deren nichttosischen Salze, kombiniert mit einem pharmazeutisch oder Veterinär annehmba-

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ren Träger in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, kann an Lebewesen einschließlich Menschen entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, perkutan, z.B. intranasal oder eben oral verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch einen Arzt erfolgen, um die Freisetzung von GH zu stimulieren, wenn der zu behandelnde Patient eine solche therapeutische Behandlung benötigt. Die erforderliche Dosis hängt von den Behandlungsbedingungen ab, von der Behandlungsgenauigkeit und- von der Dauer der gewünschten Behandlung ab.

Derartige Peptide werden oft in Form nichttoxischer Salze verabreicht, beispielsweise als Säureadditionssalz oder Metallkomplexe, z.B. mit Zink, Eisen oder ähnlichen Metallen (die als Salze für die Zwecke diesel" Anmeldung angesehen werden). Beispiele für solche Säureaddition3salze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und'ähnliche. Wenn der aktive Bestandteil oral in Tablettenform zu verabreichen ist, kann die Tablette ein Bindemittel wie Tragacanth, Maisstärke, oder Gelatine enthalten; ein Verteilungsmittel· wie Alginsäure; und ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat. Wenn eine Verabreichung in flüssiger Form gewünscht wird, können Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffe verwendet v/erden, und intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Salzlösung, Phosphatpufferlösungen oder ähnlichen bewirkt werden.

Die Peptide sollten an menschliche Patienten unter ärztlicher Aufsicht verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten üblicherweise das Peptid zusammen mit einem konventionellen, festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Träger. Üblicherweise liegt die parenterale Dosis .des Peptids zwischen etwa 0,01 bis etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm Körpermasse des Patienten. Obgleich die Erfindung in Hinblick auf ihre bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, die die beste den Erfindern gegenwärtig bekannte Art darstellt,

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sollte klar sein, daß zahlreiche Änderungen und Modifikationen für den Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet durchführbar sind, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen, die in den nachstehenden Ansprüchen dargelegt ist. Beispielsweise können Modifikationen in der Peptidkette, insbesondere Weglassungen erfolgen, beginnend am Carboxyende des Peptids bis etwa zur Position 27» gemäß bis heute bekannter experimenteller Praxis, um Peptide oder Peptidfragmente zu erhalten, die alle oder die wesentlichsten Teile der biologischen Potenz des Peptids aufweisen. Auch solche Peptide werden als im Schutzumfang der Erfindung liegend betrachtet. Darüber hinaus können an einem oder beiden liettenenden Additionen durchgeführt werden und/oder allgemein äquivalente Reste für natürlich auftretende Reste substituiert werden, wie das in der Peptidchemie allgemein bekannt ist, um zu anderen Analogen zu gelangen, die wenigstens einen wesentlichen Teil der Potenz der beanspruchten Polypeptide haben, ohne daß babei der Schutzumfang der Erfindung verlassen wird.

Darüber hinaus können Abweichungen hinsichtlich der bevorzugten -ÜHp-Gruppe am C-Ende erfolgen in Übereinstimmung mit dem gegenwärtigen Stand der Technik, so kann z.B. der Carboxyteil des Aminosäurerestes am C-Ende das Radikal -GOOR, -CRO, -COHHMHR₁ -COiJ(R)(R¹) oder -GH₂OR sein, worin R und R¹ Itfiederalkyl, Pluorniederalkyl oder Wasserstoff darstellen, ohne daß dadurch für Veränderungen in Form äquivalenter synthetischer Peptide von der Erfindung abgewichen wird. ·

Claims (9)

1. \ - 44 - 65 333/18

   Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Peptides mit der Sequenz

   -R₂-R--Ala-Ile-Phe-Thr-RQ-Ser-Rj Q-ATg-R₁ g-R-j ,-R₁.-R_{1 5}*- nR₁ ^-R₁ Q-AIa-Arg-LysLeuRE^RIleRRR

   worin

   R₁ Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His oder Di-His darstellt,mit entweder einer C%e-oder ii^-Lle-Substitution oder in unsubstituierter Form; Rp ist Ala, D-AIa oder D-KMA; Ro ist Asp oder D-Asp; R_Q ist Ser, Asn, D-Ser oder D-Asn; R₁₀ ist Tyr oder D-Tyr; R₁₂ ist Arg oder Lys; R₁₃ ist He oder VaI; R₁₄ ist Leu oder D-Leu; R₁₁- ist GIy oder D-AIa; R₁ ~ ist Leu oder D-Leu; R₁₈ ist Tyr oder Ser; R₂₃ ist Leu oder D-Leu; R₂. ist His oder'GIn; R₂,- ist GIu, Asp, D-GIu oder D-'Asp; R₂~ ist Met, D-Met, AIa, lile, He, Leu, ITva oder VaI; R₂₈ ist Asn öder Ser; R₂Q ist Arg oder D-Arg; R₃₄ ist Arg oder Ser; R-^₈ ist GIn oder Arg; R-g ist Arg oder GIy; R₄₀ ist Ser oder Ala; R₄₂ ist Phe, Ala oder VaI; R₄o ist Asn oder Arg; R₄₄ ist mit der Maßgabe, daß irgendeiner oder alle der Reste.zwischen R₂₈ und einschließlich R,« gestrichen werden können und der weiteren Mäßgabe, daß R₂ D-ϊίΜΑ und/oder R₁₄ D-Leu und/oder R₂g D-Arg ist; oder eines seiner nichttoxischen Salze, gekennzeichnet dadurch, daß

   a) ein Peptid mit zumindest einer Schutzgruppe und der Formel (II) '

   X¹^₁(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)-R₈(X⁴ oder X⁵)-Ser-(X⁴)-R₁Q(X²)-Arg(X⁶)-R₁₂(X⁶ oder X⁷)-R₁₃-R₁₄-R₁₅-Gln(X⁵)-R₁₇-R₁₈(X²)-Ala-ia"g(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-

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   oder X⁵)-R^{I? )-Ile-R₂~-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-

   ^ oder X⁶)-

   ((X^)-GIu(X-³)-R^o (X⁵ oder X°)-R-_q (X⁰)-R. _n-(X⁴)-Arg(X^b)-R,₂-R^₃(X⁵ oder X⁰J-(⁰)³

   ₂^_{3 4}

   worin X, X¹, X , X^, X⁴, X⁵, X⁶, X' und X jeweils Wasserstoff oder eine Schutzgruppe sind;

   X ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Haftbindung

   9
   an den Harzträger oder ist des -X _t wobei in letzterem Falle der Rest am C-Ende einen Carbozyteil hat, der Y ist;

   b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen oder der Haftbindung vom Peptid der Formel (II); und

   c) gewünschtenfalls Umwandeln des erhaltenen Peptids der Sequenz (I) in eines seiner nichttoxischen Salze.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ₂ ist»
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß R₂^ D-Arg ist.
4. 4. Verfahren nach einem der Punkte 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß R*4 D-Leu ist,
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß R₂₅ D-GIu ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5> gekennzeichnet dadurch, daß Rpj IiIe ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß R₁Y D-Leu ist.

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8. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß R₂C D-Asp ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß Rh^ D-Leu ist, Rp^ ist D-Leu, Rp,- ist Asp, Rp7 ist HIe und die Reste 30 bis 44 sind nicht vorhanden,