CZ387298A3 - Způsob výroby aminoalkoholů a jejich derivátů - Google Patents
Způsob výroby aminoalkoholů a jejich derivátů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ387298A3 CZ387298A3 CZ983872A CZ387298A CZ387298A3 CZ 387298 A3 CZ387298 A3 CZ 387298A3 CZ 983872 A CZ983872 A CZ 983872A CZ 387298 A CZ387298 A CZ 387298A CZ 387298 A3 CZ387298 A3 CZ 387298A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cyclopentene
- microorganisms
- dsm
- amino
- enzyme
- Prior art date
Links
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 31
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 125000002433 cyclopentenyl group Chemical class C1(=CCCC1)* 0.000 claims abstract description 10
- UXKZFJDNFBNQHE-NTSWFWBYSA-N [(1r,4s)-4-aminocyclopent-2-en-1-yl]methanol Chemical compound N[C@H]1C[C@@H](CO)C=C1 UXKZFJDNFBNQHE-NTSWFWBYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 claims description 19
- -1 C 1 _ 4 -alkoxy Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 16
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 14
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 10
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 10
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 10
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 10
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims description 9
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 8
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 7
- JVSLVBYLHIRGJQ-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)NC1CC(CO)C=C1 JVSLVBYLHIRGJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- 241000193400 Bacillus simplex Species 0.000 claims description 6
- 241001657434 Gordonia sp. Species 0.000 claims description 6
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 241001673062 Achromobacter xylosoxidans Species 0.000 claims description 5
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- DDUFYKNOXPZZIW-UHFFFAOYSA-N 3-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-one Chemical compound C1C2C(=O)NC1C=C2 DDUFYKNOXPZZIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 claims description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 3
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000001244 carboxylic acid anhydrides Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 claims 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 125000000229 (C1-C4)alkoxy group Chemical group 0.000 abstract 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- IHLRGGLJGGTPCY-HWKANZROSA-N (e)-hept-5-en-3-one Chemical compound CCC(=O)C\C=C\C IHLRGGLJGGTPCY-HWKANZROSA-N 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 150000001941 cyclopentenes Chemical class 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 11
- UXKZFJDNFBNQHE-RITPCOANSA-N [(1s,4r)-4-aminocyclopent-2-en-1-yl]methanol Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](CO)C=C1 UXKZFJDNFBNQHE-RITPCOANSA-N 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 10
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 10
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PVRSHAUROLANIJ-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]butanamide Chemical compound CCCC(=O)NC1CC(CO)C=C1 PVRSHAUROLANIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 6
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 6
- BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N tuberculostearic acid Chemical compound CCCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 4
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 241000203751 Gordonia <actinomycete> Species 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 4
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- RMZJPEGRFQHGBT-UHFFFAOYSA-N tert-butyl carbonofluoridate Chemical compound CC(C)(C)OC(F)=O RMZJPEGRFQHGBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N tetrachlorvinphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(=C/Cl)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 3
- 241000735552 Erythroxylum Species 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 235000008957 cocaer Nutrition 0.000 description 3
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 3
- MFOXRZGFZGAVAO-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]-2-phenylacetamide Chemical compound C1=CC(CO)CC1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 MFOXRZGFZGAVAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- DGMOBVGABMBZSB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)C(Cl)=O DGMOBVGABMBZSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMZCDNSFRSVYKQ-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetyl chloride Chemical compound ClC(=O)CC1=CC=CC=C1 VMZCDNSFRSVYKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- VGCXGMAHQTYDJK-UHFFFAOYSA-N Chloroacetyl chloride Chemical compound ClCC(Cl)=O VGCXGMAHQTYDJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000243198 Peritrichia Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVECBJCOGJRVPX-UHFFFAOYSA-N butyryl chloride Chemical compound CCCC(Cl)=O DVECBJCOGJRVPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 2
- VESDMJYTNQGIHQ-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]-2-methylpropanamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1CC(CO)C=C1 VESDMJYTNQGIHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATIOJBQXVDKWON-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]propanamide Chemical compound CCC(=O)NC1CC(CO)C=C1 ATIOJBQXVDKWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- RZWZRACFZGVKFM-UHFFFAOYSA-N propanoyl chloride Chemical compound CCC(Cl)=O RZWZRACFZGVKFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N pyocyanin Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CC=CC2=O YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSSYCIGJYCVRRK-RQJHMYQMSA-N (-)-carbovir Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1C[C@H](CO)C=C1 XSSYCIGJYCVRRK-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 1
- VTCHZFWYUPZZKL-CRCLSJGQSA-N (1r,4s)-4-azaniumylcyclopent-2-ene-1-carboxylate Chemical compound N[C@H]1C[C@@H](C(O)=O)C=C1 VTCHZFWYUPZZKL-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- DDUFYKNOXPZZIW-UHNVWZDZSA-N (1s,4r)-3-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-one Chemical compound C1[C@@H]2C(=O)N[C@H]1C=C2 DDUFYKNOXPZZIW-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(3s,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N 0.000 description 1
- WTXGYGWMPUGBAL-SQOUGZDYSA-N (3r,4s,5r,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxepan-2-one Chemical compound O[C@@H]1COC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WTXGYGWMPUGBAL-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- UXKZFJDNFBNQHE-UHFFFAOYSA-N (4-aminocyclopent-2-en-1-yl)methanol Chemical compound NC1CC(CO)C=C1 UXKZFJDNFBNQHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-M (R)-mandelate Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 1
- VGUWZCUCNQXGBU-UHFFFAOYSA-N 3-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]-5-nitro-1h-indole Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CNC2=CC=C([N+]([O-])=O)C=C12 VGUWZCUCNQXGBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-dimethylaminopyridine Substances CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPFWYFYRULFDQP-UHFFFAOYSA-N 5-azabicyclo[2.2.1]hept-2-ene Chemical class C1C2CNC1C=C2 KPFWYFYRULFDQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101100186132 Arabidopsis thaliana NAC054 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000186001 Arthrobacter pascens Species 0.000 description 1
- 241000185993 Arthrobacter ramosus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- NMZPZMDSAIODAP-UHFFFAOYSA-N C(C(C)O)O.C(C1=CC=CC=C1)(=O)C(=O)O Chemical compound C(C(C)O)O.C(C1=CC=CC=C1)(=O)C(=O)O NMZPZMDSAIODAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-LWMBPPNESA-L D-tartrate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](O)[C@H](O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-LWMBPPNESA-L 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127463 Enzyme Inducers Drugs 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 1
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- LNVILFYCPVOHPV-IHPCNDPISA-N His-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNVILFYCPVOHPV-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191948 Kocuria rosea Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 1
- 241000185994 Pseudarthrobacter oxydans Species 0.000 description 1
- 241000168225 Pseudomonas alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000589755 Pseudomonas mendocina Species 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 241000185992 Rhizobium viscosum Species 0.000 description 1
- 241000187694 Rhodococcus fascians Species 0.000 description 1
- 241001524101 Rhodococcus opacus Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187389 Streptomyces lavendulae Species 0.000 description 1
- 241000187411 Streptomyces phaeochromogenes Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DFJSXBUVSKWALM-UHFFFAOYSA-N [4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.NC1CC(CO)C=C1 DFJSXBUVSKWALM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N acetic acid phenyl ester Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L adipate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC([O-])=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical compound [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000037237 body shape Effects 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N butanoyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OC(=O)CCC YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YBOWSASUXDVAKE-QRPNPIFTSA-N c1cc2ccccc2[nH]1.N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O Chemical compound c1cc2ccccc2[nH]1.N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O YBOWSASUXDVAKE-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- LMYOLOWXQDLHKQ-UHFFFAOYSA-N cyclopent-2-en-1-ylmethanol Chemical compound OCC1CCC=C1 LMYOLOWXQDLHKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HGBCAGWLIQGSMW-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O HGBCAGWLIQGSMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- PQPVPZTVJLXQAS-UHFFFAOYSA-N hydroxy-methyl-phenylsilicon Chemical class C[Si](O)C1=CC=CC=C1 PQPVPZTVJLXQAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- UDOQSZFLISRVBI-UHFFFAOYSA-N n-[4-(hydroxymethyl)cyclopenten-1-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CCC(CO)C1 UDOQSZFLISRVBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- CCRRYEULCXQEFI-UHFFFAOYSA-N nitrous acid propanoic acid Chemical compound N(=O)O.C(CC)(=O)O CCRRYEULCXQEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078226 phenylalanine oxidase Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000001967 plate count agar Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N propionic anhydride Chemical compound CCC(=O)OC(=O)CC WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- NQIZWJGHIYDHRL-SFYZADRCSA-N tert-butyl (1s,4r)-2-oxo-3-azabicyclo[2.2.1]hept-5-ene-3-carboxylate Chemical compound C1[C@@]2([H])C=C[C@]1([H])N(C(=O)OC(C)(C)C)C2=O NQIZWJGHIYDHRL-SFYZADRCSA-N 0.000 description 1
- MVIWPMBRXBNBDX-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-[4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC1CC(CO)C=C1 MVIWPMBRXBNBDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- DDUFYKNOXPZZIW-CRCLSJGQSA-N vince lactam Chemical compound C1[C@H]2C(=O)N[C@@H]1C=C2 DDUFYKNOXPZZIW-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/52—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring condensed with a ring other than six-membered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(57) Anotace:
Nové mikroorganismy, které jsou schopné zužitkovat deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII, ve kterém R1 znamená Ci-4alkyl,
Ci-4alkoxy, aryl nebo aryloxy, jako jediný zdroj dusíku, jako jedniný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Nové enzymy, které hydrolyzují deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII. Nový způsob výroby /1R.4S/- nebo /1S, 4R/-l-amino-4-/hydroxymethyl/-2-cyklopentenu vzorců I a II a/nebo derivátů /1S, 4R/- nebo /IR, 4S/amlnoalkoholů obecných vzorců III a IV, kde R1 má uvedený význam.
·· ··
Mikroorgansimy a způsob výroby aminoalkoholů a jejich derivátů
Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu výroby (1R,4S)- nebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorců I, II
HO'
II a/nebo derivátů (1S,4R)- nebo (IR,4S)-aminoalkoholů obecných vzorců III, IV hoz \ 7 γ ni noz jf
IV jakož i nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat derivát cyklopentenu obecného vzorce VII ΗΟχγγΗΎκ vii jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.
Vynález se dále týká enzymových extraktů a enzymů s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou, které se získají z těchto mikroorganismů.
Dosavadní stav techniky (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten obecného vzorce I je důležitý meziprodukt pro výrobu karbocyklických nukleosidů ·« ·· • · · • ··♦ • · « • · « • · · · · · • · • ·
- 2 jako např. CarbovirR (Campbell a spol., J.Org.Chem.,1995,60,4602 -4616) .
Způsoby výroby (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu jsou popsány autory Campbell a spol. (shora) a Park K.H. & Rapoport H. (J.Org.Chem.,1994, 59,394-399).
Při těchto způsobech slouží jako edukt bud' D-glukon-6-lakton nebo D-serin, přičemž je nutných ca 15 stupňů synthesy pro vytvoření (IR,4S)-N-terc.butoxykarbonyl-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, kterému se pak odstraní chránící skupina za vzniku (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu.
Oba tyto způsoby jsou nákladné, zdlouhavé a velkoprodukčně neuskutečnitelné.
Spis WO 93/17020 popisuje způsob výroby (lR,4S)-l-amino-4(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu, přičemž se redukuje (lR,4S)-4amino-2-cyklopenten-l-karboxylová kyselina hydridem hlinitolithným na požadovaný produkt.
Nevýhodou tohoto postupu je jednak to, že se také redukuje dvojná vazba cyklopentenového kruhu, špatná dostupnost hydridu hlinitolithného a jednak to, že je to příliš drahé.
Taylor, S.J. a spol. (Tetrahetron: Asymmetry sv. 4, č. 6, 1993, 1117-1128) popisují způsob výroby (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl ) -2-cyklopentenu , přičemž se vychází z (+)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-onu jako eduktu. Edukt se při tom převádí pomocí mikroorganismů druhu Pseudomonas solanacearum nebo Pseudomonas fluorescens na (IR,4S)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on, který se pak přeměňuje pomocí di-terc-butyldikarbonátu na (IR,4S)-N-terc.-butoxykarbonyl-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on, který se pak redukuje borhydridem sodným a kyselinou trifluoroctovou na požadovaný produkt.
Tento postup je příliš nákladný.
• · ·· • · · ·· · · 4 • · 4 • · ί ·
Dále Martinez a spol. popisují (J.Org.Chem. 1996,61,7963-7966) desetistupňovou synthesu (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu, přičemž se vychází z diethylesteru kyseliny dialkylmalonové. Nevýhodou tohoto postupu je rovněž zdlouhavost a neuskutečnitelnost při velkovýrobě.
Úkolem předloženého vynálezu bylo poskytnout jednoduchý způsob výroby (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu.
Podstata vynálezu
Tato úloha se řeší pomocí mikroorganismů podle vynálezu podle nároku 1, jakož i pomocí enzymových extraktů z nich získaných, enzymů podle vynálezu podle nároku 4 a způsobem podle vynálezu podle nároku 7.
Mikroorganismy podle vynálezu se mohou izolovat z půdních vzorků, kalu nebo odpaních vod za pomoci běžných mikrobiologických technik.
Podle vynálezu se izolace mikroorganismů uskuteční tak, že se pěstují obvyklým způsobem v živném mediu, které obsahuje jeden nebo více derivátů cyklopentenu obecného vzorce VII „NH XR
HO
VII kde R1 znamená C-]_4-alkyl, C1_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy,
- jako jediný zdroj uhlíku a dusíku
- jako jediný dusíku s vhodným zdrojem uhlíku nebo
- jako jediný zdroj uhlíku s vhodným zdrojem dusíku.
Jako C1_4-alkyl se může například použít methyl, ethyl, propyl, isopropyl nebo butyl.
Jako C1_4-alkoxy lze například použít methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, nebo terč. butoxy.
• · · · · • · ·· · 3 3 · · · • ··· · · 33
Jako aryl se může například použít fenyl nebo benzyl. Výhodně se používá benzyl.
Jako aryloxy se může například použít benzyloxy nebo fenoxy. Podle toho jsou jako deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII vhodné například: N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten nebo N-fenylacetyl-1-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Účelně se z kultury získané pěstováním vyselektují ty, které zužitkují (IR,4S)-isomer derivátu cyklopentenu vzorce VII jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.
Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy využít například amonium, nitráty, aminokyseliny nebo močoviny jako růstový substrát.
Jako vhodný zdroj uhlíku mohou mikroorganismy využít například cukry, cukerné alkoholy, C2-C4-karboxylové kyseliny nebo aminokyseliny jako růstový substrát. Jako cukr lze použít hexosy jako je glukosa nebo pentosy. Jako cukerný alkohol se může použít například glycerin. Jako C2-C4~karboxylové kyseliny se mohou například použít kyselina octová nebo kyselina propionová. Jako aminokyseliny se mohou například použít leucin, alanin, asparagin.
Jako selekční a růstové medium se mohou použít v oboru obvyklá media, jako například medium popsané v tabulce 1 nebo plné medium (medium obsahující extrakt kvasnic), výhodně se používá medium popsané v tabulce 1.
Během pěstování a selekce se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako indukrtory enzymů se mohou použít deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII.
Obvykle se pěstování a selekce uskutečňuje při teplotě 20 až 40 °C, výhodně od 30 až 38 °C a při pH mezi 5,5 a 8,0, výhodně mezi 6,8 a 7,8.
φ φ
Výhodné mikroorganismy jsou rodu Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella, zejména druhu Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutan ty. Mikroorganismy DSM 10686 a 10687 byly uloženy 20.05.1996, mikroorgansimy DSM 10328 a DSM 10329 byly uloženy 06.11.1995, mikroorganismy DSM 11291 08.10.1996 a mikroorganismy DSM 11172 20.09.1996 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH (DSMZ), Mascheroderweg lb, D38124 Braunschweig, podle
Budapešťské úmluvy.
Pod výrazem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, například UV-ozářením.
Taxonomický popis Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172) buněčná forma šířka pm délka pm tyčinky
0,5-0,6
1,0-2,5 pohyblivost + mrskání peritrich
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH + aminopeptidáza (Cerny) + spory oxidáza + kataláza +
ADH (alkoholdehydrogenáza) N02 z NO3 • · denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny kyselina z (OF-test):
glukosy fruktosy arabinosy adipátu + kaprátu + citrátu + malátu + mannitolu
Taxonomický popis Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 106 86)
1. Morfologie a barva kolonii: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáři rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou lesklé částečně rozteklé, béžový s růžovým tónem, RAL 1001;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová
3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Rhodococcus; určení délky řetězce kyseliny mykolové (c32-c44) a srovnání údajů s údaji zanesenými do databanky DSM-kyselin mykolových ukázalo na velmi vysokou podobnost se vzorky kmenů Rhodococcus erythropolis (podobnost 0,588).
4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna vysoká shodnost (100%) se sekvencemi spezifických oblastí Rhodococcus erythropolis.
• ·
Výsledek identifikace je jednoznačný, nebot tři na sobě nezávislé metody (kyseliny mykolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) přiřadily kmen druhu Rhodococcus erythropolis.
Taxonomický popis Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)
1. Morfologie a barva kolonii: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáři rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou světle oranžové, (RAL 2008);
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová;
3. Vzorek menachinonu: MK-9(H2) 100%;
4. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Gordona; určení délky řetězce kyseliny mykolové (c5O-c6o) se uskutečnilo pomocí vysokoteplotní plynové chromatografie. Tento vzorek odpovídá vzorku, jaký se nalézá u zástupců rodu Gordona.
5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
6. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna relativně nízká shodnost (98,8%) se sekvencemi spezifických oblastí Gordona rubropertincta.
Na základě předložených výsledků (menachinony, kyseliny mykolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) lze izolát sice jednoznačně přiřadit rodu Gordona. Přiřazení ke známému druhu Gordona není možné na základě těchto výsledků. Je tedy třeba předpokládat, že se u kmenu DSM 10687 jedná o nový dosud nepopsaný druh rodu Gordona.
to
- 8 denitrificans
Taxonomický popis Alcaligenes xylosoxydans ssp. HSZ 17 (DSM 10329)
Vlastnosti kmene buněčná forma šířka μιη délka μπι pohyblivost mrskání
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny) spory oxidáza tyčinky 0,5-0,6 1,5-3,0 +
peritrich kataláza + růst anaerobně
ADH (alkoholdehydrogenáza) +
N02 z no3 + denitrifikace + ureáza hydrolýza želatiny
Tween 80 « · « · · 9 · «
- 9 kyselina z (OF-test): glukosy aerobně xylosy 80 zužitkování substrátu glukosy fruktosy arabinosy citrátu malátu mannitolu
Taxonomický popis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) charakteristika: Gram-positivni nepravidelné tyčinky s výrazným růstovým cyklem tyčinky-koky; striktně aerobní; žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukosy pohyblivost spory katalasa + /neso-diaminopimelinová kysselina v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: A3a, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala podobnost sekvence 16S rDNA: sekvencování oblasti s největší variabilitou prokázalo jako nejvyšší hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A.ramosus a A.oxydans • fe fe* • fefefe » • · · · fefe fefe · fefefe · fe · 9 » · fe
Taxonomický popis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30 buněčná forma šířka μπι délka μιη
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza spory oxidáza kataláza pohyblivost růst anaerobně nitrit z nitrátu denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny kyselina z:
L-arabinosy galaktosy melezitosy fúkosy arabitolu mannitolu erythritolu pleomorfní tyčinky 0,6-1,0 1,5-3,0 +
+ alkalizace lakmusového mléka: +
I flfl • · • · flfl
- 11 • flflflfl « • flfl · · ketolaktosa
Parciální sekvencování 16SrDNA prokázalo srovnatelně velké ca 96 % podobnosti k zástupcům rodů Agrobacterium a Rhizobium Jednoznačné přiřazení k jednomu typu popsanému v rámci těchto rodů není možné.
Taxonomický popis Bacillus simplex K2 buněčná forma šířka μιη délka μιη tyčinky
0,8-1,0
3,0-5,0 spory elipsoidní kulaté sporangium kataláza anaerobní růst
VP reakce maximální teplota positivní růst při °C negativní růst při °C
k. W.
růst v mediu pH 5,7 NaCl 2 % %
% %
mediu s lysozymem » ·* • ·
4 44 • ·
- 12 4 44 44
4 4 4 9
4 9 44 • · 9444 4
4 4 9
44 44 kyselina z (ASS)
D-glukosy + L-arabinosy + D-xylosy
D-mannitu + D-fruktosy + plyn z fruktosy lecithináza hydrolýza škrobu + želatiny + kaseinu
Tween 80 + eskulinu zužitkování citrátu + propionátu nitrit z nitrátu + indol fenylalanindesamináza arginindihydroláza
Analýza buněčných mastných kyselin potvrdila přiřazení k rodu Bacillus.
Parciální sekvencování 16SrDNA prokázala 100 %
Bacillus simplex.
podobnost k
- 13 toto ·· · ··· t · · • · toto · • · · to · • · · to ···· ·· ··· to
Taxonomický popis Pseudomonas putida K32 buněčná forma šířka μπι délka μπι pohyblivost mrskání
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza spory oxidáza tyčinky
0,8-0,9
1,5-4,0 +
polarní>l kataláza + růst anaerobně pigmenty fluoreskující + pyocyanin
ADH + nitrit z nitrátu denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny zužitkování substrátu ·· ·· to· to to «to ·· to to · • to · • to ·· »
• · φ Μ·
- 14 • i · *
ΦΦΦ ·
ΦΦ ΦΦ • · · · • φ ·♦ ··» · φ • * φ «φ ΦΦ adipát citrát + malát +
D-mandelát + fenylacetát +
D-tartrát
D-glukosa + trehalosa mannitol benzoylformiát propylenglykol + butylamin + benzylamin + tryptamin acetamid + hippurát +
Profil buněčných mastných kyselin je typický pro Pseudomonas putida.
Parciální sekvencování 16SrDNA prokázala ca 98 % podobnost k Pseudomonas mendocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnost k Pseudomonas putida byla 97,4 %.
Taxonomický popis Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou matné, světle červenooranžové RAL 2008;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová;
3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Rhodococcus;
Určení délky řetězce kyseliny mykolové (C32~C44) a srovnání údajů se záznami DSMZ-databanky mykolových kyselin prokázalo jen velmi malou podobnost ke vzorkům kmenů Rhodococcus ruber ·· ♦♦ 4 4 44 44
4 4 44 44 4 4 4 4
444 4 4 4444
44 4 4 4 4444 ·
4 4 4 4 4 4 4
4444 44 444 444 44 44 (podobnost, 0,019). Tento korelační faktor je příliš malý na to, aby mohl být použit pro identifikaci druhu.
5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
Tento vzorek mastných kyselin je diagnostický pro všechny zástupce rodu Rhodococcus a jejich blízké příbuzné jako Mycobakterium, Nocardia a Gordona. Byl učiněn pokus o diferenciaci druhu při zohlednění kvalitativních a kvantitativních rozdílů ve vzorku mastných kyselin. Pomocí numerických metod se vzorek mastných kyselin z Rhodococcus sp. FB 387 srovnal se záznamy databanky. Také pomocí této metody se nemohl Rhodococcus sp. FB 387 z důvodu malé podobnosti (0,063) přiřadit k žádnému popsanému druhu Rhodococcus.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu bylo přiřazeno 96-818 s 97,9 % korelací Rhodococcus opacus. Tato shodnost sekvence je hodně pod 99,5 %, jak se požaduje pro jednoznačné přiřazení k druhu v tomto taxonu.
Na základě předložených výsledků je možné vycházet z toho, že se u kmene Rhodococcus sp. FB 387 jedná o nový dosud nepopsaný druh Rhodococcus.
Enzymy podle vynálezu, N-acetylaminoalkoholhydrolasy, které jsou schopné hydrolyzovat deriváty cyklopentenu shora uvedeného vzorce VII, lze například získat v oboru běžným způsobem otevřením buněk mikroorganismů podle vynálezu. K tomu se může například použít metodu s ultrazvukem nebo Frenschovu tlakovou metodu. Například se tyto enzymy získají z mikroorganismů Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686). Enzymy, které se získají z mikroorganismů podle vynálezu, zejména Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686), mají výhodně následující vlastnosti:
a) pH optimum při pH 7,0 ± 1,0;
b) teplotní optimum mezi 25 a 30 °C při hodnotě pH 7,0; a ·· BB • Β Β * BBB
Β Β 4 • · 4 •ΒΒΒ ··
- 16 BB • ΒΒΒ Β Β
ΒΒ «
c) hodnota ΚΜ pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten 22,5 mM ±7,5 mM (30 °C, 100 mM fosfátový pufr, pH 7,0).
Sekvenční analýza enzymu získatelného jako z Rhodococcus erythro poliš CB 101 (DSM 10686) poskytla dále:
d) N-koncovou sekvenci aminokyselin Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn;
a určení molekulové hmotnosti poskytlo:
e) molekulovou hmotnost 50 kD, určeno pomocí SDS-PAGE.
Enzymy, které se získají z mikroorganismů podle vynálezu, například z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), hydrolysují například zejména N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2 -cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-propionyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, a N-isobutyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Způsob výroby podle vynálezu (1R,4S)- nebo (IS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorců I, II
HO ,nh2
,ΛΝΗ2
II a/nebo derivátů (1S,4R)- nebo vzorců III, IV (IR,4S)-aminoalkoholů obecných
III
HO
IV
ΦΦ φφ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φφ φ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φφ kde R1 má uvedený význam, v prvním stupni acyluje vzorce V se může například provádět tak, že se (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on na derivát (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce VI
O
VI kde R1 má uvedený význam.
Edukt (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on se může vyrobit podle EP-B 0 508 352.
Acylace se může provádět halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce VIII
II
R1 - C - X
VIII, kde X znamená atom halogenu a kde R1 má uvedený význam, nebo anhydridem karboxylové kyseliny obecného vzorce IX
O O
II II
C C IX, / \ / \
R1 O R1 kde R1 má uvedený význam.
• ··
- 18 ·· »· ··· ·· • # • * ··
Jako atom halogenu se může použít F, Cl, Br nebo I. Výhodně se používá Cl nebo F.
Příklady halogenidů karboxylových kyselin jsou: acetylchlorid, chloracetylchlorid, chlorid kyseliny máselné, chlorid kyseliny isomáselné, chlorid kyseliny fenyloctové, benzylester kyseliny chlormravenčí (Cbz-Cl), chlorid kyseliny propionové, benzoylchlorid, alkylester kyseliny chlormravenčí nebo terč.-butyloxykarbonylfluorid. Příklady pro anhydridy karboxylových kyselin jsou: terč.-butoxykarbonylanhydrid, anhydrid kyseliny máselné, anhydrid kyseliny octové nebo anhydrid kyseliny propionové.
Acylace se může provádět bez rozpouštědla nebo s aprotickým rozpouštědlem.
Účelně se acylace provádí v aprotickém rozpouštědle. Jako aprotické rozpouštědlo jsou například vhodné pyridin, acetonitril, dimethylformamid, tetrahydrofuran, toluen, methylenchlorid, N-methylpyrrolidon, popřípadě jejich směsi. Výhodně se jako rozpouštědlo používá pyridin nebo acetonitril, zejména směs pyridinu a acetonitrilu.
od -80 do 50 °C, výhodně derivát (±)-2-azabicyklona derivát cyklopentenu
Učelně se acylace provádí při teplotě od 0 do 25 °C.
Ve druhém stupni se může redukovat -[2.2.1]hept-5-en-3-onu vzorce VI obecného vzorce VII
HO
VII kde R1 má uvedený význam.
Redukce se účelně provádí borhydridem a lkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo aluminiumhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo vitridem (natrium-bis-(2-methoxyethflfl flfl • flfl flfl·· • · • · flfl·· fl· fl · • fl · • · ·· • · oxy)aluminiumhydrid). Jako aluminiumhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumaluminiumhydrid. Jako borhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumborhydrid. Jako borhydrid kovu alkalické zeminy lze použít kalciumborhydrid.
Účelně se redukce provádí v protickém rozpouštědle. Jako protické rozpouštědlo se mohou použít nízké alifatické alkoholy jako je methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol. sek. butanol, terč. butanol, nebo voda, popřípadě jejich směsi.
Redukce se účelně provádí při teplotě od -40 do 40 °C, výhodně od 0 do 20 °C.
Přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII na (1R,4S)nebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců I, II
HO ,nh2
,ΛΝΗ2
II se provádí podle vynálezu bud' pomocí mikroorganismů nebo enzymových extraktů z nich, pomocí acylas penicilinu G nebo pomocí enzymů s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou.
Při této biotransformaci vznikná vedle (1R,4S)- nebo (1S,4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorce I nebo II, který se popřípadě izoluje, derivát (1R,4S)- nebo (IS,4R)-aminoalkoholu obecných vzorců III, IV
III HO
IV kde R1 má uvedený význam. Posledně jmenované sloučeniny se mohou rovněž izolovat.
44
4 4 4
4 44 • 4444 4
4 4 • ·
- 20 44 «4 · 4 · • 444 • 4 · 4 • 4 · •444 ·4 4
Principiálně jsou vhodné všechny mikroorganismy, které zužitkují derivát cyklopentenu obecného vzorce VII jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Účelně se biotransformace provádí s mikroorganismy, které zužitkují (IR,4S)-isomer derivátu cyklopentenu jako jediný zdroj uhlíku, jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo jako jediný zdroj dusíku.
Výhodně se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů rodu Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Gordona, zejména druhu Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. (DSM 10687), jakož i s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty. Tyto právě popsané mikroorganismy jsou uloženy podle Budapešťské úmluvy.
Pro postup jsou obvzláště vhodné druhy mikroorganismů Alcaligenes/ /Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) a Gordona sp. CB 100 (DSM 10687).
Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování těchto mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.
Enzymy podle vynálezu vhodné pro způsob, N-acetylaminoalkoholhydrolasy, se mohou získat podle předtím popsaných postupů a mají vlastnosti, které již byly popsány.
Vhodné acylázy penicilinu G se získají z mnoha mikroorganismů, například z bakterií nebo aktinomycetenů, zvláště z následujících mikroorganismů: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus ·· toto « toto < ··· • · • · · toto·· ··
- 21 • to to· ·· ·· ·· ·· · · · to • to «to·· • ·· ··· · e • · ··· ··· ··· ·· to· megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 a Micrococcus roseus ATCC 416. Zejména se používají obchodně dostupné acylázy penicillinu G jako acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z E.coli (Boehring Mannheim) nebo z Bacillus megaterium.
Ve výhodném provedení se používají imobilizované acylázy penicilinu G.
Biotransformace se může provádět v mediích známých v oboru, jako například v nízkomolárních fosfátových, citrátových nebo Hepes-pufrech, ve vodě, v úplných mediích jako například Nutrient Yeast Broth (NYB) nebo v mediích popsaných v tabulce 1. Výhodně se biotransformace provádí v mediu uvedeném v tabulce 1 nebo nízkomolárním fosfátovém pufru.
Účelně se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálního přidávání derivátu cyklopentenu (vzorec VII) tak, že koncentrace nepřesáhne 10 % hmotn., výhodně 2 % hmotn.
Hodnota pH během biotransformace může být v rozmezí od 5 do 9, výhodně od 6 do 8. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 25 do 30 °C.
Jestliže se při biotransformaci tvoří (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxy-methyl)-2-cyklopenten, pak se tento může kyselou hydrolýzou, např. kyselinou chlorovodíkovou převést na (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
Příklady provrdení vynálezu
Příklad 1
Výroba (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
100 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo
• · · · ··· · · pod dusíkem v acetonitrilu (800 ml) a pyridinu (161,26 ml). Při 12 °C se přikapalo 104,5 g acetylchloridu po dobu 2 hodin. Směs se ještě míchala 4,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 800 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 3krát extrahovala 400 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCI (400 ml), vodou (400 ml), nasyceným NaCl (400 ml), sušily síranem hóřečnatým a zcela odpařily. Ke zbytku se přidal methylenchlorid a to se filtrovala přes křemičitanový gel. Filtrát se zahustil a produkt se čistil destilací. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 71 %.
1H-NMR (CDC13):δ[ppm] 400 MHz
2,25 (AB syst.,2H);
2,8(s,3H); 3,42(m,lH); 5,30(m,lH); 6,89(m,lH); 6,92(m,lH).
Příklad 2
Výroba (+)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
100,3 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (720 ml) a pyridinu (142 ml). Při 12 °C se přikapalo 141,8 g chloridu kyseliny máselné po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 720 ml vody. Acetonitril se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (300 ml). Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCI (350 ml), nasyceným NaCl (400 ml) a vodou (500 ml), sušily se síranem hóřečnatým a úplně odpařily. Produkt se čistil destilací. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 85 %.
• ··
- 23 • · XH-NMR (CDC13):δ[ppm] 400 MHz
0,98(t,J=8,5 Hz,3H);
1,58-1,65(2H);
2,23(AB syst., 2H) ;
2,82-2,90(2H); 3,42(m,lH); 5,30(m,lH);
6,62 (m,1H);
6,92(m,1H).
Příklad 3
Výroba (±)-2-fenylacetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
33,4 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (240 ml) a pyridinu (48,3 ml). Při 12 °C se přikapalo 68,6 g chloridu kyseliny fenyloctové po dobu 30 minut. Směs se ještě míchala 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 240 ml vody. Acetonitril se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (150 ml). Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCI (150 ml), nasyceným NaCl (150 ml) a vodou (150 ml), sušily se síranem hořeČnatým a úplně odpařily. Surový produkt se filtroval přes křemičitanový gel (hexan:ethylacetát=l:1). Získalo se 68,34 g surového produktu jako žlutý olej.
Příklad 4
Výroba (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (325 ml) a pyridinu (41 ml). Při 12 °C se přikapalo 43,9 g chloridu kyseliny propionové po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 145 ml vody a acetonitril se odpařil za
vakua. Vodná fáze se 3krát extrahovala 115 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCI (140 ml), nasycenými roztoky NaHCO^ (40 ml) a NaCl (40 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se čistil destilací. Získalo se 55,8 g titulní sloučeniny, která stáním ztuhla. Výtěžek byl 81,6 %.
Kpo,28 Pa 75-80 °C
t.t..: 54-56 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 0,95 (t,3H);
400 MHz 2,10(quad.,1H);
2,28(quad.,1H); 2,64(m,2H); 3,42(s,lH); 5,16(m,lH); 6,78(m,lH);
6,96(m,1H).
Příklad 5
Výroba (±)-2-isobutyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
45,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (310 ml) a pyridinu (39 ml). Při 10 °C se přikapalo 54,1 g chloridu kyseliny isomaselné po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 140 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 4krát extrahovala 120 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly 1H HCI (50 ml), nasycenými roztoky NaHCOg (50 ml) a NaCl (50 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil v n-hexanu (240 ml) s aktivním uhlím za zpětného toku. Po filtraci aktivního uhlí se filtrát ochladil při 0 °C a titulní sloučenina filtrovala. Získalo se
54,5 g produktu. Výtěžek byl 76 %.
• · • 9
- 25 » · · β > · · · • · · · 4 • · « • « · ·
t.t..: 41-42 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 0,92 (d,3H);
400 MHz l,06(d,3H);
2,10(m,lH); 2,28(m,lH); 3,40(m,2H); 5,16(S,1H); 6,78(m,lH);
7,92(m,lH).
Příklad 6
Výroba (±)-2-chloracetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
10,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem a při 10 °C ve směsi dichlormethanu (10 ml), pyridinu ( 8 , 4 ml) a 0,22 g Ν,N-4-dimethylaminopyridinu. Přikapalo se
13,5 g chloracetylchloridu po dobu 1 hodiny. Teplota stoupla až na 44 °C. Směs se dále míchala 2 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 100 ml vody. Po oddělení fází se vodná fáze extrahovala 100 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil ve 100 ml diisopropyletheru za zpětného toku v přítomnosti 1 g aktivního uhlí po dobu 10 minut. Po horké filtraci se filtrát ochladil na teplotu místnosti, pevná látka se filtrovala a sušila. Získalo se 10, 35 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 60 %.
t.t..: 86-88 °C 1H-NMR (CDC13):δ[ppm] 2,28 (d,lH);
400 MHz 2,40(d,lH);
3,48(s,lH);
4,56(d,2H);
5,30(s,lH);
6,70(d,lH);
6,94(m,lH).
Příklad 7
Výroba (±)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
79,56 g (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (450 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 45 minut přidávalo 19,8 g natriumborhydridu.
Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upravilo pH na 1,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promylo se methylenchloridem a odpařilo. Surový produkt se ještě čistil filtrací křemičitanovým gelem s rozpouštědlem ethylacetát/methanol 5:1. Filtrát se zahustil. Získalo se 51,83 g produktu jako bílá pevná látka. Výtěžek byl 64 % vztaženo na vnesený 2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
t.t.: 91-93 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 1,18 (m,lH);
400 MHz l,78(s,3H);
2,29(m,lH);
2,66(m,lH);
3,35(s,2H);
4,58(s,lH);
4,72(m,lH);
5,61(d,lH);
5,85(d,lH);
7,83(d,lH).
• 0 *·
- 27 Příklad 8
Výroba (±)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
73,87 g (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (400 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 45 minut přidávalo 15,68 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upravilo pH na 1,5 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promyl se methylenchloridem, odpařil a sušil za vysokého vakua. Získalo se 60,55 g produktu. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
t.t.: 71-72 °C 1H-NMR (CDC13):5[ppm] 0,98(t,J=8,5Hz, 3H);
400 MHz 1,40-1,50(1H);
1,58-1,68(2H);
2,10-2,18(2H);
2,42-2,55(1H);
2,85(m,lH);
3,62(AB syst.,2H);
4,98(m,lH);
5,78-5,82(2H);
6,38(m,lH).
Příklad 9
Výroba (±)-N-fenylacetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g surového (+)-2-fenylacetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (450 ml) a ochladilo na - 10 °C. Po částech se po dobu 1 hodiny přidávalo 13,2 • ·
- 28 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3,5 hodin při teplotě místnosti a pak se upravilo pH na 3,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Směs se úplně odpařila. Zbytek se sušil a čistil filtrací s křemičitanovým gelem (hexan:ethylacetát=l : 9) Po překrystalování z ethylacetátu se získalo 54,6 g bílé pevné látky. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-fenylacettyl-2 -azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
1H-NMR (CDC13):S[ppm] 1,28-1,35(1H);
400 MHz l,40(m,lH);
2,38-2,45(1H);
2,79(m,lH);
3,50(AB syst.,2H);
3,52(s,3H);
4,98(m,lH);
5,75(m,2H);
5,98(m,lH);
7,20-7,38(5H).
Příklad 10
Výroba (±)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g surového hydrochloridu (±)-l-amino-4-hydroxymethyl-2 -cyklopentenu se rozpustilo pod dusíkem při teplotě místnosti ve směsi 150 ml vody a 150 ml dioxanu. Roztok se upravil IN NaOH na hodnotu pH 14, pak se přidal roztok terč.butyloxykarbonylfluoridu (BOC-F, 20 % přebytek) v diethyletheru a při teplotě místnosti ještě 3 hodiny dále míchal (BOC-F připravený podle Synthesis 1975,599). Hodnota pH se upravila koncentrovanou HCl na 2. Po destilaci organických rozpouštědel se ke zbytku přidalo 50 ml vody a směs se 3krát extrahovala 100 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se úplně odpařily. Zbytek se kristalizoval ve směsi 110 ml diisopropyletheru a 80 ml n-hexanu. Získalo se 11,95 g titulní sloučeniny. Výtěžek představoval 56 %.
t.t.: 68-70 °C • ·
| 1H-NMR | (DMSO-d6):ó[ppm] | 1,18 (m,lH); |
| 400 MHz | l,38(s,9H); 2,26(m,lH); 2,65(m,lH); 3,33(t,2H); 4,4 5(m,1H); 4,55(t,lH); 5,62(m,lH); 5,79(m,lH); 6,73(d,lH). | |
| Příklad | 11 |
Výroba (±)-N-propionyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
16,6 g (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (140 ml) a 2-butanolu (66 ml) a ochladilo na -5°C. Po částech se po dobu 2 hodin přidávaly 3 g natriumborhydridu. Směs se ještě míchala 2,5 hodiny při teplotě 10 °C a pak se upravilo pH na 2,2 pomocí směsi koncentrované kyseliny chlorovodíkové a vody (1/1). Roztok se odpařil na 40 g a pH se upravilo na hodnotu 6,2 s 2N NaOH. Směs se extrahovala 5krát 50 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se úplně odpařily a zbytek se překrystalizoval z toluenu (150 ml). Získalo se 11,1 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 65 %.
t.t.: 67-68 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 0,96(t,3H);
400MHz 1,16(quint.,1H);
2,04(quad.,2H);
2,26(m,lH); .
2,66(m,lH);
3,34(m,2H);
4,58(t,lH);
4,72(m,1H);
5,61(m,lH);
• ·
5,84(m,lH);
7,72(d,lH).
·· · · • ·
Příklad 12
Výroba (±)-N-isobutyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g (±)-2-isobutyryl-3-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (32 ml) a 2-butanolu (84 ml) a ochladilo na 0 °C. Po částech se po dobu 3,5 hodiny přidávalo 1,37 g natriumborhydridu. Směs se dále míchala 3 hodiny při teplotě 20 °C, pak se upravilo pH na 2,5 pomocí směsi koncentrované kyseliny chlorovodíkové a vody (1/1) a pak se neutralizovalo 2N NaOH. Směs se odpařila na 40 g. Zbytek se extrahoval 3krát 80 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se úplně odpařily. Získaná pevná látka krystalizovala v 25ml toluenu. Získalo se 6,8 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 73,6 %.
t.t.: 80-81 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 0,98(d,6H);
400 MHz l,16(quint.,1H);
2,30(m,2H);
2,68(m,lH);
3,32(t,2H);
4,58(t,lH);
4,70(m,lH);
5,61(m,lH);
5,82(m,lH);
7,68(d,lH).
Příklad 13
Výroba (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí acyláz penicilinu G
Pro biotransformaci se použila acyláza
EC 3.5.1.11 • 0
- 31 • 0 00 0 0 0 *
0 ·♦
0000 ·
0 0 penicilinu G z E.coli (Boehring Mannheim) 165 U (jednotek)/g nebo acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z Bacillus megaterium. K tomu se inkubovalo 50 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 5-9; 4 ml) s 1 % hmotn. neracemického N-fenylacetyl-l-amino-4-hydroxy methyl-2-cyklopentenu a 400 mg odpovídající acylázy penicilinu G při 37 °C.
Po určitých časových intervalech se odebíraly vzorky a analyzovaly pomocí tenkovrstevné chromatografie (křemičitanový gel 60, butanol:voda:ledová kys. octová=3:1:1; detekce ninhydrinem), plynové chromatografie (kapilární sloupec, HP-5,5 % fenylmethylsiloxanu) nebo pomocí HPLC. Enzym odštěpil s vysokou aktivitou fenacetylovou skupinu a uvolnil až 40 % odpovídajícího aminoalkoholu. Volný aminoalkohol se získal s ee-hodnotou 80 %.
Příklad 14
Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí mikroorganismů
14.1 Kal (20 %) z čističky ARA ve Visp se inkuboval v A+N mediu (viz tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % hmotn. N-acetyl-, N-propionyl-, N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, při 37 °C za třepání. Tvorba (1R,4S)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se sledovala pomocí tenkovrstevné chromatografie.
% těchto obohacených vzorků se l-3x přeočkovalo a jednotlivě naneslo na pevná media (Plate Count Agar v mediu z tabulky 1; 20 g/l). Tímto způsobem se izolovaly mikroorganismy Alcaligenes/Bor detella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).
14.2 Takto izolované mikroorganismy se pěstovaly v mediu (tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % Ν-acetyl-, N-propionyl-,
N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Rostly 24 až 36 hodin až k optické hustotě (OD) od 2 do 3. Takto získané buňky se sebraly v pozdně exponenciální růsto• · ·· φ φ φ • ΦΦΦ φ φ « • φ φ
ΦΦ·· ΦΦ • · ·· ΦΦ φ · φ · • ΦΦΦ φ ΦΦ φ φ · φ φ φ vé fázi a promyly v 10 mM fosfátovém pufru.
Následující biotransformace se provedla v 50 mM fosfátovém pufru (pH 4,5-9), který obsahoval 1 % hmotn. Ν-acetyl-, N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Tenkovrstevnou chromatografii se zjistilo, že 50 % substrátu bylo hydrolyzována na (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten. HPLC analýzy udaly ee-hodnoty mezi 80 a 93 %.
Jestliže se jako substrát použil N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, byla biotransformace 0,14 (g/l/h/OD) pro kmen DSM 10686, když se pěstovalo na A+N mediu a 0,03 (g/l/h/OD), když se pěstovalo na NYB (Nutrient Yaest Broth) mediu, které obsahovalo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Jestliže se provedla stejná přeměna s kmenem DSM 10687 při koncentraci substrátu (N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten) 200 mM, byla biotransformace 0,161 (g/l/h/OD).
Tabulka 1 medium A+N
MgCl2
CaCl2
FeCl3
Na2SO4 kh2po4
Na2HPO4
NaCl
0,4 g/1 0,014 g/1 0,8 mg/l 0,1 g/i 1 g/1
2,5 g/1 3 g/1 roztok vitamínů 1 ml/1 roztok stupových prvků 1 ml/1 pH 7,5
14.3. Rhodococcus erythropolis DSM 10686 se pěstoval v 6 1 fermentoru v minimálním mediu (srovnej tabulku 2) s octanem amonným (3 g/1) jako zdroj uhlíku, popřípadě dusíku při 30 °C do buněčné hustoty OD 650>25. Během buněčného růstu se kontinuálně přidávala 50 % kyselina octová jako dodatečný zdroj uhlíku. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo 60 g (+/-)-N-acetyl-14 4·
4444 44
4
- 33 44 44
4 4 1
4 44 amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a dále inkubovalo několik hodin. Nakonec se ještě jednou přidalo 40 g (±)-N-acetyl-l-amino -4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a pak dalších deset hodin inkubovalo. Průběh biotransformace se sledoval on-line pomocí HPLC. Při dosažení 40 % analytického výtěžku, vztaženo na vnesený racemický substrát, a ee-hodnoty 85 % se fermentace ukončila přidáním kyseliny.
Tabulka 2 složení media
| Komponenty | Koncentrace |
| extrakt kvasnic | 0,5 g/1 |
| pepton M66 | 0,5 g/1 |
| kh2po4 | 4,0 g/1 |
| Na2HPO4.2H2O | 0,5 g/1 |
| k2so4 | 2,0 g/1 |
| NH4~acetát | 3,0 g/1 |
| CaCl2 | 0,2 g/1 |
| MgCl2.6 H2O | 1,0 g/1 |
| roztok stopových prvků (viz dole) | 1,5 ml/1 |
| PPG (polypropylenglykol) | o,i g/1 |
Roztok stopových prvků
| KOH | 15,1 g/1 |
| EDTA.Na2 . 2H2O | 100,0 g/1 |
| ZnSO4 . 7H2O | 9,0 g/1 |
| MnCl2 . 4H2O | 4,0 g/1 |
| h3bo3 | 2,7 g/1 |
| CoCl2 . 6H2O | 1,8 g/1 |
| CUC12 . 2H2O | 1,5 g/1 |
| NÍC12 . 6H2O | 0,18 g/1 |
| Na2Mo04 . 2H2O | 0,27 g/1 |
·« ·· · · • ··♦ • · • · ···· ·· • ·
- 34 ·· ♦ · • · · » • 9 ··
9 9 9
9 9
14.4 Podobně jako v příkladu 14.3 se pěstovaly mikroorganismy Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 a Pseudomonas putida K32 na octanu sodném v mediu (tabulka 1) se sloučeninami a bez sloučenin Ν-acetyl-, Ν-propionyl-, N-isobutyryl nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, v dalším zkráceně označené jako aminoalkoholy.
Následující výsledky se dosáhly s exponenciálními buňkami, které se pěstovaly bez aminoalkoholů (analyzováno HPLC):
| Kmen | Poměr [mMol/OD.h] | Hodnota | ee/přeměna |
| HSZ 5 (DSM 10328) | 0,05 | 88,7/16 | |
| HSZ 17 (DSM 10329) | 0,005 | 95/23 | |
| K32 | 0,05 | 54/1 | |
| CB101 (DSM 10686) | 0,1 | 84/39 | |
| Kmeny K2 a | K17 se pěstovaly, | sebraly a | podrobily |
| 60-hodinové biotransformaci. | |||
| Kmen | Poměr [mMol/OD.h] | Hodnota | ee/přeměna |
[%] se [%]
| K2 | 92/10 | |
| HSZ 30 | - | 93/3,5 |
Ze všech násad se sebraly exponenciální a stacionární buňky a použily se pro biotransformaci jako buňky v klidu. Na základě
DC-analýzy se nepozoroval žádný rozdíl v počátečním poměru u buněk indukovaných nebo neidukovaných aminoalkoholem.
• ··· • 9 « • 9 4 «·99 99
- 35 99 ► · 9 « » · ·· ·· · · « • · a
99
Příklad 15
Čištění N-acetylaminoalkoholhydrolázy z Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)
Enzym byl čištěn jak je dále uvedeno až byl pozorován už jen jeden proteinový pruh v SDS-PAGE (Pharmacia Phast Gel, 10-15 % gradient) při molekulové hmotnosti 50 kD.
Buňky Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) se promyly v 50 mM Tris-pufru (pH 6,2) a koncentrovaly na optickou hustotu 190 při OD650nm· Po Přidání fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) na konečnou koncentraci 1 mM
Frenchovu lisu (tlakové zařízení)
Po odstředění se získalo 200 •1 a DNAzy se buňky podrobily aby se získal surový extrakt, ml bezbuněčného extraktu s se naneslo na iontoměničový 26/10 Q-Sepharose (Pharmacia), Tris-pufrem (pH 8,0), který koncentrací proteinů 4,8 mg ml’
960 mg bezbuněčného extraktu chromatografický sloupec HiLoad který byl ekvilibrován 50 mM obsahoval 1 mM dithiothreitolu (DTT).
Po promytí sloupce stejným pufrem byly proteiny eluovány lineárním gradientem (1500 ml; gradient: 50 mM Tris-pufr (pH 8,0), obsahující 1 mM DTT- 50mM Tris-pufr (pH 7,0), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCI). Enzym se eluoval ze sloupce mezi 370 a 430 mM NaCI a při pH 7,6. Aktivní frakce se sbíraly a zahustily na 9 ml. Obsah proteinů byl 41 mg.
Pro další čištění se roztok proteinů nanesl na gelověfiltrační chromatografický sloupec HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem, který obsahoval 50 mM NaCI a 1 mM DTT. Aktivní frakce se spojily a měly společný obsah proteinů 10,9 mg.
Tento proteinový roztok se nanesl na sloupec Mono Q HR5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem (pH 8,5) obsahujícím 1 mM DDT. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem (40 ml) 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT - 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCI. Enzym se eluoval mezi 390 mM NaCI a 440 mM NaCI. Aktivní frakce ·· ·· • · · • · · · • · « • · 4
ΦΦΦΦ ··
- 36 ΦΦΦ Φ Φ Φ
ΦΦ 4 obsahovaly 1,4 mg proteinu.
V posledním čistícím kroku se použil stejný sloupec ekvilibrovaný stejným pufrem. Jako eluční gradient sloužil stejný pufr s 0-500 mM NaCl a pH 7,0-8,5. Tímto způsobem se dalo izolovat 430 pg čistého enzymu.
N-koncová sekvence enzymu se určila přímo z Protein-Blot. Získala se sekvence 20 následujících aminokyseli:Thr-Glu-GlnAsn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-SerAsn.
Tato sekvence není homologní ke známým proteinům.
Příklad 16
Charakterizace enzymu
Charakterizace enzymu se prováděla jak s čištěným enzymem, tak také s bezbuněčným extraktem, který byl odsolen pomocí sloupce Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).
Koncentrace proteinů v bezbuněčném extraktu byla 7,3 mg ml-1 a . o . — Ί koncentrace proteinu v čištěném enzymu byla 135 pg ml . PMSF se k bezbuněčnému extraktu nepřidával.
16.1 Určení Km
Určení Km se provedlo v bezbuněčném extraktu. Hodnota Km reakce byla při pH 7,0 a při teplotě 30 °C 22,5 mM pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethylcyklopenten.
16.2 pH optimum pH optimum pro hydrolýzu N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopentenu (25 mM) se určovalo s čištěným enzymem a v bezbuněčném extraktu v rozsahu pH od 6,2 - 9,0 v následujících roztocích pufru.
Tris-pufr 100 mM pH 9,0;8,5;8,0;7,5;7,0 citrát-fosfátový pufr 100 mM pH 7,0;6,55;6,2
- 37 • · ·· • · · • ··· • · · • · · ···· ··
Aktivita se měřila 24 hodin.
pH optimum reakce bylo mezi pH 7,0 a 7,5 pro produkci 1R,4S a 1S,4R enantiomeru.
U bezbuněčného extraktu bylo pH optimum aktivity při pH 7,0. Selektivita byla však lepší mezi pH 6,0 a pH 7,0
Obr. 1 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na hodnotě pH.
16.3 Teplotní optimum pro reakci uvedenou v příkladu 16.2 leželo mezi 25 a 30 °C.
Obr. 2 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na teplotě.
• to i · i · ·· · • · • · • « • · ··
PROTOKOL SEKVENCE (1) OBECNÉ ÚDAJE (i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: LONZA AG (B) ULICE: Muenchensteinerstrasse 38 (C) MÍSTO: Basel (E) ZEMĚ : Švýcarsko (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO: 4002 (ii) OZNAĚNÍ VYNÁLEZU: Způsob výroby aminoalkoholu (iii) POČET SEKVENCÍ: 1 (iv) POČÍTAČOVĚ ČITELNÉ ZNĚNÍ:
(A) NOSIČ DAT: Floppy disk (B) POČÍTAČ: PC IBM kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (EPA (2) ÚDAJE K SEQ ID NO: 1:
(i) VÝZNAKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (C) TVAR PROVÁŽCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (iii)HYPOTETICKY: NE (iv) ANTISENSE: NE (v) DRUH FRAGMENTU: N-konec (vi) PŮVOD:
(B) KMEN: Rhodococcus erythropolis (C) INDIVIDUUM/ISOLÁT: Rhodococcus erythropolis CB101 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 1:
Thr Glu Gin Asn Leu His Trp Leu Ser Ala Thr Glu Met Ala Ala Ser 15 10 15
Val Ala Ser Asn
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mikroorganismy, vyznačující se tím, že že jsou schopné zužitkovat deriváty cyklopentenu, zvolené ze sloučenin obecného vzorce VIIHONHR1VII kde kde R1 znamená C1_4-alkyl, C1_4~alkoxy, aryl nebo aryloxy, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, jakož i jejich enzymové extrakty.
- 2. Mikroorganismy a extrakty podle nároku 1, kde mikroorganismy jsou vybrané z rodů Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella.
- 3. Mikroorganismy a extrakty podle nároku 1 nebo 2, kde mikroorganismy jsou vybrané z druhů Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 4. Enzym s aktivitou N-acetylaminoalkoholhydrolasy, který se získá z mikroorganismů podle jednoho z nároků 1 až 3a je schopný hydrolyzovat deriváty cyklopentenu vybrané ze sloučenin obecného vzorce VII • 0 • •0 00 00 «000 0 000 0 0 0 0 0000 00 0 0 0 0000 0 kde kde R1 znamená C1_4-alkyl, C4_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy, jakož i jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 5. Enzym podle nároku 4, vyznačující se tím, že máa) pH optimum při pH 7,0 ± 1,0;b) teplotní optimum mezi 25 a 30 °C při hodnotě pH 7,0; ac) hodnotu KM pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten 22,5 mM ±7,5 mM (30 °C, 100 mM fosfátový pufr,), jakož i jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 6. Enzym podle jednoho z nároků 4 nebo 5, vyznačující se dále tím, že mád) N-koncovou sekvenci aminokyselin Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn; ae) molekulovou hmotnost 50 kD, určeno pomocí SDS-PAGE.jakož i jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 7. Způsob výroby (1R,4S)- a/nebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl ) -2-cyklopentenu vzorců I a IIHONHII » toto « · • · ·· ·* • ·* · • · »* • · · to · · • · to toto toto a/nebo derivátů (1S,4R)- a/nebo (IR,4S)-aminoalkoholů obecných vzorců III a IVHO /'7R1IIIHO nh^r1 iv okde R1 znamená C1_4-alkyl, C1_4~alkoxy, aryl nebo aryloxy, který zahrnuje přeměnu derivátu cyklopentenu obecného vzorce VIIHO N,Y oVII kde R1 má uvedený význam, pomocí mikroorganismu a/nebo enzymového preparátu podle nároku 1, enzymu podle nároku 4 a/nebo acylázy penicilinu G na sloučeniny vzorce I a/nebo II, jakož i popřípadě izolaci těchto sloučenin a/nebo při této přeměně vzniklých derivátů aminoalkoholů vzorců III a/nebo IV.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující že derivát cyklopentenu obecného vzorce VII se tímHO NY oVII kde R1 má uvedený význam, se vyrobí tak, že se v prvním stupni acyluje (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on vzorce VV • 4- 43 na derivát (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce VI4 44 44OVI
kde R1 má uvedený význam, a tato sloučenina se ve druhém stupni redukuje na derivát cyklopentenu obecného vzorce VII. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tí: že se acylace v prvním stupni provádí s halogenidem karboxylové * kyseliny obecného vzorce VIII 0 II R1- C - X VIII kde R1 má uvedený význam a X znamená atom anhydridem karboxylvé kyseliny obecného vzorce halogenu, nebo s IX 0 0 íl II v C C / \ / \ R1 0 R1 IX, 1 kde R1 má uvedený význam. 10. Způsob podle jednoho z nároků 8 nebo 9, jící se tím, že se acylace v prvním aprotickém rozpouštědle. vyznačustupni provádí v • · • · fl » flfl • · • ··· • · · • · fl - 11. Způsob podle jednoho z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že se redukce ve druhém stupni provádí borhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy, aluminiumhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy a/nebo vitridem.
- 12. Způsob podle jednoho z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že se redukce ve druhém stupni provádí v protickém rozpouštědle.
- 13. Způsob podle jednoho z nároků 7 až 12, vyznačující se tím, že se přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII uskutečňuje pomocí mikroorganismů rodu Rhodo coccus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella.
- 14. Způsob podle jednoho z nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že se přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII uskutečňuje pomocí acylasy penicilinu G z mikroorganismů druhu Bacillus megaterium nebo Escherichia coli.
- 15. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 7 až 14, vyzná čující se tím, že se přeměna ve třetím stupni provádí při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH od 5 do 9.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH135996 | 1996-05-30 | ||
| CH28297 | 1997-02-10 | ||
| CH90897 | 1997-04-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ387298A3 true CZ387298A3 (cs) | 1999-04-14 |
| CZ296447B6 CZ296447B6 (cs) | 2006-03-15 |
Family
ID=27171964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0387298A CZ296447B6 (cs) | 1996-05-30 | 1997-05-30 | Mikroorganismy, enzym nebo enzymový extrakt a zpusob výroby derivátu cyklopentenu |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6368850B1 (cs) |
| EP (1) | EP0904348B1 (cs) |
| JP (1) | JP4335314B2 (cs) |
| KR (1) | KR100577891B1 (cs) |
| CN (1) | CN1224697C (cs) |
| AT (1) | ATE283348T1 (cs) |
| AU (1) | AU3170597A (cs) |
| CA (1) | CA2253977C (cs) |
| CZ (1) | CZ296447B6 (cs) |
| DE (1) | DE59712095D1 (cs) |
| DK (1) | DK0904348T3 (cs) |
| ES (1) | ES2229362T3 (cs) |
| HU (1) | HU226141B1 (cs) |
| IL (1) | IL127235A (cs) |
| PT (1) | PT904348E (cs) |
| WO (1) | WO1997045529A1 (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK285229B6 (sk) * | 1997-05-13 | 2006-09-07 | Lonza Ag | Spôsob výroby derivátov (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4- (hydroxymetyl)-2-cyklopenténu a enantioméru (1R,4S)-N-butyryl-1- amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu |
| SK284594B6 (sk) * | 1997-11-27 | 2005-07-01 | Lonza Ag | Spôsob výroby derivátov aminoalkoholov a ich soli |
| DE59905679D1 (de) | 1998-10-30 | 2003-06-26 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von 4-[(2',5'-diamino-6'-halogenpyrimidin-4'-yl)amino]-cyclopent-2-enylmethanolen |
| ATE240945T1 (de) * | 1998-10-30 | 2003-06-15 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von 4-((2',5'-diamino- 6'-halogenpyrimidin-4'-yl)amino)-cyclopent-2- enylmethanolen |
| WO2000039324A2 (de) | 1998-12-23 | 2000-07-06 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 1- amino-4- (hydroxymethyl)- cyclopent-2- en-derivaten |
| DE50002340D1 (de) | 1999-01-06 | 2003-07-03 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von robenidin bzw. dessen derivate |
| PL359411A1 (en) * | 2000-07-13 | 2004-08-23 | Sankyo Company, Limited | Amino alcohol derivatives |
| JP4841984B2 (ja) * | 2006-03-22 | 2011-12-21 | 広栄化学工業株式会社 | 光学活性含窒素環状化合物の製造方法 |
| US8236853B1 (en) | 2007-12-03 | 2012-08-07 | University Of South Florida | Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives |
| CN102557990B (zh) * | 2011-04-25 | 2014-06-25 | 开原亨泰制药股份有限公司 | (1s，4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法 |
| TWI738341B (zh) * | 2020-05-14 | 2021-09-01 | 施雨霈 | 酒類弱鹼化設備及其弱鹼化方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8916479D0 (en) | 1989-07-19 | 1989-09-06 | Glaxo Group Ltd | Chemical process |
| GB8916478D0 (en) | 1989-07-19 | 1989-09-06 | Glaxo Group Ltd | Chemical process |
| US5057630A (en) | 1990-04-06 | 1991-10-15 | Glaxo Inc. | Synthesis of cyclopentene derivatives |
| GB9204015D0 (en) * | 1992-02-25 | 1992-04-08 | Wellcome Found | Therapeutic nucleosides |
-
1997
- 1997-05-30 CA CA002253977A patent/CA2253977C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 DK DK97927092T patent/DK0904348T3/da active
- 1997-05-30 IL IL12723597A patent/IL127235A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 AU AU31705/97A patent/AU3170597A/en not_active Abandoned
- 1997-05-30 ES ES97927092T patent/ES2229362T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 JP JP54163097A patent/JP4335314B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 HU HU9902963A patent/HU226141B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 CN CNB971951829A patent/CN1224697C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 DE DE59712095T patent/DE59712095D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 PT PT97927092T patent/PT904348E/pt unknown
- 1997-05-30 WO PCT/EP1997/002838 patent/WO1997045529A1/de active IP Right Grant
- 1997-05-30 CZ CZ0387298A patent/CZ296447B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 AT AT97927092T patent/ATE283348T1/de active
- 1997-05-30 US US09/194,626 patent/US6368850B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 KR KR1020057007360A patent/KR100577891B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 EP EP97927092A patent/EP0904348B1/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-14 US US09/992,982 patent/US6787347B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-07-21 US US10/896,223 patent/US7405065B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20050047558A (ko) | 2005-05-20 |
| DK0904348T3 (da) | 2005-02-14 |
| US20030008360A1 (en) | 2003-01-09 |
| US20040265985A1 (en) | 2004-12-30 |
| KR100577891B1 (ko) | 2006-05-10 |
| HUP9902963A2 (hu) | 1999-12-28 |
| JP4335314B2 (ja) | 2009-09-30 |
| US6368850B1 (en) | 2002-04-09 |
| CN1224697C (zh) | 2005-10-26 |
| IL127235A0 (en) | 1999-09-22 |
| DE59712095D1 (de) | 2004-12-30 |
| PT904348E (pt) | 2005-04-29 |
| IL127235A (en) | 2003-04-10 |
| EP0904348B1 (de) | 2004-11-24 |
| CZ296447B6 (cs) | 2006-03-15 |
| CA2253977C (en) | 2009-08-04 |
| ATE283348T1 (de) | 2004-12-15 |
| WO1997045529A1 (de) | 1997-12-04 |
| HUP9902963A3 (en) | 2001-10-29 |
| US6787347B2 (en) | 2004-09-07 |
| HU226141B1 (en) | 2008-05-28 |
| EP0904348A1 (de) | 1999-03-31 |
| CN1220695A (zh) | 1999-06-23 |
| AU3170597A (en) | 1998-01-05 |
| ES2229362T3 (es) | 2005-04-16 |
| JP2000512488A (ja) | 2000-09-26 |
| US7405065B2 (en) | 2008-07-29 |
| CA2253977A1 (en) | 1997-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2010116397A (ja) | （１ｓ，４ｒ）−または（１ｒ，４ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールの製造方法 | |
| US6787347B2 (en) | Process for the preparation of amino alcohols and derivatives thereof and microorganisms useful in process | |
| KR100562734B1 (ko) | 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법 | |
| US6391597B1 (en) | Method for producing optically active 1-(4-t-butylphenyl)-5-oxo-3-pyrrolidine carboxylic acid and/or an enantiomeric ester thereof | |
| US20020037559A1 (en) | Process for producing n-protected d-proline derivatives | |
| JP4652577B2 (ja) | 光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体の製造方法 | |
| JP2001506500A (ja) | Ｄ−プロリン誘導体を調製する方法 | |
| JP2002233392A (ja) | 光学活性４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120530 |