[go: up one dir, main page]

CN1220695A - 氨基醇及其衍生物的制备方法 - Google Patents

氨基醇及其衍生物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1220695A
CN1220695A CN97195182A CN97195182A CN1220695A CN 1220695 A CN1220695 A CN 1220695A CN 97195182 A CN97195182 A CN 97195182A CN 97195182 A CN97195182 A CN 97195182A CN 1220695 A CN1220695 A CN 1220695A
Authority
CN
China
Prior art keywords
general formula
microorganism
enzyme
acid
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN97195182A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1224697C (zh
Inventor
C·贝尔内格-埃格利
O·M·伯奇
P·博萨尔
W·布林顿
F·布鲁克斯
K·比尔戈夫
L·迪克
K－S·埃特
I·格吉斯伯格
M·索泰
E·M·于尔邦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza AG filed Critical Lonza AG
Publication of CN1220695A publication Critical patent/CN1220695A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1224697C publication Critical patent/CN1224697C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/52—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring condensed with a ring other than six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的微生物,它能够利用通式(Ⅶ)的环戊烯衍生物作为唯一的氮源、或唯一的碳源、或唯一的氮源和碳源,通式中的R1表示C1－C4烷基、C1－C4烷氧基、芳基或芳氧基。本发明还涉及一些新的酶,它们能水解通式(Ⅶ)的环戊烯衍生物。本发明还涉及以下物质的新制备方法:通式Ⅰ和Ⅱ的(1R,4S)－或(1S,4R)－1－氨基－4－(羟甲基)－2－环戊烯和/或通式Ⅲ或Ⅳ的(1S,4R)－或(1R,4S)－氨基醇衍生物,通式中的R1表示C1－C4烷基。

Description

氨基醇及其衍生物的制备方法
本发明涉及以下通式的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯，
Figure A9719518200051
和/或以下通式的(1S,4R)-或(1R,4S)-氨基醇衍生物：
Figure A9719518200052
的新制备方法。
并涉及能够利用以下通式的环戊烯衍生物作为唯一氮源，或唯一碳源，或即作为唯一氮源又作为唯一碳源的微生物：
Figure A9719518200053
本发明还涉及从上述微生物获得的具有N-乙酰基氨基醇水解活性的酶提取物和酶。
结构式Ⅰ的(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯是用于制备环碳核苷(例如Carbovir)的一种重要中间体。(Campbell等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1995,60,4602-4616)。
Campbell等(见上文)和Park K.H.与Rapoport H.(有机化学杂志(J.Org.Chem.)1994,59,394-399)对(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的制备方法进行了说明。
上述方法所用的前体是D-葡糖酸-δ-内酯或D-丝氨酸，而且需要约15步合成步骤来形成(1R,4S)-N-叔丁氧基-羰基-4-(羟甲基)-2-环戊烯，后者然后经去保护形成(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯。上述两种方法成本高、复杂、而且不能进行产业化生产。
WO93/17020说明了一种(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的制备方法，其中用氢化锂铝还原(1R,4S)-4-(氨基)-2-环戊烯-1-羧酸得到所需的产物。
上述方法的缺点在于，一方面，环戊烯环的双键也被还原了，氢化锂铝难以处理，另一方面，成本过高。
Taylor,S.J.等(Tetrahedron:Asymmetry V01.4,No.6,1993,1117-1128)说明了一种由前体(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮制备(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的方法。其中，利用青枯假单孢菌或荧光假单孢菌将此前体转化成(1R,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，继而用二-叔丁基二碳酸酯转化成(1R,4S)-N-叔丁氧基羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，再用硼氢化钠和三氟乙酸还原成所需的产物。该方法的成本太高。
此外，Martinez等(J.Ogr.Chem.1996,61,7963-7966)说明了一种由二乙基二烷基丙二酸酯合成(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的十步法。该方法也存在复杂和不能产业化的缺点。
本发明的目的之一是提供一种简单的制备(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的方法。该目的是利用本发明权利要求1所述的微生物、及其酶提取物，本发明权利要求4所述的酶和本发明权利要求7所述的方法实现的。
本发明的微生物可以借助常规微生物技术从土壤标本、淤泥或废水中分离得到。
该微生物的分离根据本发明如下进行，即按照常规方法将其培养在含有以下通式的一种或多种环戊烯衍生物的营养培养基中：
Figure A9719518200061
其中的R1表示C1-C4烷基，C1-C4烷氧基、芳基或芳氧基，此类化合物被作为：
·唯一的碳源和氮源
·唯一的氮源，辅以合适的碳源，或者
·唯一的碳源，辅以合适的氮源。
例如，作为C1-C4烷基，可用甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。作为C1-C4烷氧基，可用甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基或叔丁氧基。作为芳基，可用苯基或苄基。优选的是苄基。作为芳氧基，可用苄氧基或苯氧基。所以，以下例子适合作为通式Ⅶ的环戊烯衍生物：1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯，1-丁酰-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯或1-苯乙酰-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
通过培养微生物，从所得培养物中选择出利用通式Ⅶ环戊烯衍生物(1R,4S)异构体作为唯一氮源、作为唯一碳源或作为唯一氮源和碳源的微生物。
该微生物可以利用合适的氮源例如铵、硝酸盐、氨基酸或脲作为生长基质。微生物可以利用合适的碳源例如糖、糖醇、C2-C4羧酸或氨基酸作为生长基质。葡萄糖之类己糖或戊糖可用作糖。例如乙二醇可用作糖醇。乙酸或丙酸可用作C2-C4羧酸。亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺可用作氨基酸。
培养基的选择是该领域熟练技术人员的常规技能，例如表1所示的培养基或完全培养基(含有酵母提取物的培养基)，优选的是用表1所示的培养基。
在培养和选择过程中，宜对微生物的活性酶进行诱导。通式Ⅶ的环戊烯衍生物可用作酶诱导物。
培养和选择一般在20℃至40℃进行，以30℃至38℃为佳，在pH5.5至8.0进行，以6.8至7.8为佳。
优选的微生物是红球菌属、戈登氏菌属(Gordona)、节细菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属或产碱杆菌属/博德特氏菌属，具体的菌种是erythropolis红球菌CB101(DSM10686)、产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)、HSZ5种节细菌(DSM10328)、FB387种红球菌(DSM11291)、xylosoxydans产碱杆菌反硝化HSZ17种(DSM 10329)、土壤杆菌/根瘤菌HSZ30、单纯芽孢杆菌K2、恶臭假单孢菌K32或CB100种戈登氏菌(DSM10687)，以及它们的功能相当的变异株或突变株。以上菌种根据布达佩斯条约在德意志微生物保存中心进行了保存，DSM10686和DSM10687保存于1996年5月20,DSM10328和DSM10329保存于1995年11月6日，DSM11921保存于1996年10月8日，DSM11172保存于1996年9月20。
“功能相当的变异株或突变株”指与原始微生物具有基本相同的特性和功能的微生物。这种变异株和突变株可以随机地通过例如UV辐射产生。
产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)的分类学描述
      细胞形态       杆状
      宽度(微米)    0.5-0.6
      长度(微米)    1.0-2.5
      运动性           +
      鞭毛构成      周鞭毛
      革兰氏反应       -
      3％KOH水解       +
      氨基肽酶(Cerny)  +
      芽孢                          -
      氧化酶                        +
      过氧化氢酶                    +
      ADH(醇脱氢酶)                 -
      从NO3到NO2                  -
      反硝化                        -
      脲酶                          -
      明胶水解                      -
      用以下物质形成酸(被测的)：
      葡萄糖                        -
      果糖                          -
      阿拉伯糖                      -
      己二酸盐(酯)                  +
      癸酸盐(酯)                    +
      柠檬酸盐(酯)                  +
      苹果酸盐(酯)                  +
      甘露醇                        -
erythropolis红球菌CB101(DSM10686)的分类学描述
1．菌落的形态与颜色：短分支状菌丝，衰老时分裂成短杆和小球，菌落有光泽且部分融合，米色略带粉红，RAL1001；
2．肽聚糖的诊断(diagnosed)氨基酸：内消旋二氨基庚二酸(mesodiaminopimelicacid)；
3．分支菌酸：红球菌分支菌酸；对分支菌酸长度(C32-C44)的测定以及将其资料与DSM分支菌酸资料库中的目录相比较，发现其结构与erythropolis红球菌极其相似(相似率为0.588)。
4．脂肪酸结构：非分支链、饱和及不饱和脂肪酸加上结核硬脂酸。
5．根据对该菌种16S rDNA的部分测序，发现与erythropolis红球菌特有区域的序列具有高度一致性(100％)。
以上鉴定结果是明确的，因为三种相互独立的方法(分支菌酸、脂肪酸、16SrDNA测序)均将该菌种归于erythropolis红球菌菌种。
CB100种戈登氏菌(DSM10687)的分类学描述
1．菌落的形态与颜色：短分支状菌丝，衰老时分裂成短杆和小球，菌落有光泽且部分融合，菌落呈浅黄色，(RAL2008)；
2．肽聚糖的诊断(diagnosed)氨基酸：内消旋二氨基庚二酸；
3．甲基萘醌类结构：MK-9(H2)100％
4．分支菌酸：戈登氏菌分支菌酸；利用高温气相色谱测定分支菌酸链长度(C50-C60)。该结构与戈登氏菌代表性菌种中的结构相对应。
5．脂肪酸结构：非分支链、饱和及不饱和脂肪酸加上结核硬脂酸。
6．根据对该菌种16S rDNA的部分测序，发现与rubropertincta戈登氏菌特有区域的序列只有较低的一致性(98.8％)。
根据所得结果(甲基萘醌类、分支菌酸、脂肪酸、16S rDNA)，虽然该分离株可以明确归于戈登氏菌属，但是根据已有的结果无法归人戈登氏菌属下的已知菌种。所以，假设DSM10687菌株为一新的、从未描述过的戈登氏属菌种。
xylosoxydans产碱杆菌反硝化HSZ17种(DSM10329)的分类学描述
      该菌株特征：
      细胞形态        杆状
      宽度(微米)    0.5-0.6
      长度(微米)    1.5-3.0
      运动性           +
      鞭毛构成      周鞭毛
      革兰氏反应       -
      3％KOH水解       +
      氨基肽酶(Cerny)  +
      芽孢             -
      氧化酶           +
      过氧化氢酶       +
      无氧生长         -
      ADH(醇脱氢酶)    +
      从NO3到NO2     +
      反硝化           +
      脲酶             -
      以下物质的水解：
    明胶                        -
    吐温80                      -
    用以下物质形成酸(被测的)：
    葡萄糖，无氧                -
    木糖80                      -
    基质的利用
    葡萄糖                      -
    果糖                        -
    阿拉伯糖                    -
    柠檬酸盐(酯)                +
    苹果酸盐(酯)                +
    甘露醇                      -HSZ5种节细菌(DSM10328)的分类学描述
    特征：                      革兰氏阳性；不规则杆状，具有
                                明显杆状-球状生长周期；严格厌
                                氧；不由葡萄糖产酸或产气。
    运动性                      -
    芽孢                        -
    过氧化氢酶                  +
    细胞壁内的内消旋二氨基庚酸：无
    肽聚糖类型：                A3α,L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
    16S rDNA序列相似性：        根据对可变性最高区域的测序，
                                与pascens节细菌、ramosus节细
                                菌和oxydans节细菌的一致性最
                                高值为98.2％土壤杆菌/根瘤菌HSZ30的分类学描述
    细胞形态                    多形杆状
    宽度(微米)                  0.6-1.0
    长度(微米)                  1.5-3.0
    革兰氏反应                  -
    3％KOH水解                +
    氨基肽酶(Cerny)           +
    芽孢                      -
    氧化酶                    +
    过氧化氢酶                +
    运动性                    +
    无氧生长                  -
    将硝酸根转化成亚硝酸根    -
    反硝化                    -
    脲酶                      +
    明胶水解                  -
    用以下物质形成酸(被测的)：
    L-阿拉伯糖                +
    半乳糖                    -
    松三糖                    -
    岩藻糖                    +
    阿糖醇                    -
    甘露醇                    -
    赤藓醇                    -
    石蕊乳液的碱化            +
    酮乳糖(ketolactose)       -
其16S rDNA的部分测序发现，与土壤杆菌和根瘤菌属下代表性菌种具有较大的相似性，约96％。但是不可能将其明确归入这两属菌种。
单纯芽孢杆菌K2的分类学描述
    细胞形态                  杆状
    宽度(微米)                0.8-1.0
    长度(微米)                3.0-5.0
    芽孢                         -
    椭圆形                       -
    圆形                         -
    芽孢囊                       -过氧化氢酶                            +无氧生长                              -VP反应                                n.g.最高温度生长为阳性的温度℃                    40生长为阴性的温度℃                    50在pH7.5的培养基中的生长               -2％NaCl                               +5％                                   -7％                                   -10％                                  -溶菌酶培养基                          +用以下物质形成酸(ASS)：D-葡萄糖                              +L-阿拉伯糖                            +D-木糖                                -D-甘露醇                              +D-果糖                                +利用果糖产气                          -卵磷脂酶                              -对以下物质的水解：淀粉                                  +明胶                                  +酪蛋白                                -吐温80                                +七叶苷                                -对以下物质的利用：柠檬酸                                +丙酸                                  -将硝酸根转化成亚硝酸根                +吲哚                                  -苯丙氨酸脱氨酶                        -
    精氨酸脱氢酶                         -对产生的细胞脂肪酸的分析明确将其归入芽孢杆菌属。16S rDNA的部分测序揭示与单纯芽孢杆菌相似性100％。恶臭假单孢菌K32的分类学描述
    细胞形态                               杆状
    宽度(微米)                            0.8-0.9
    长度(微米)                            1.5-4.0
    运动性                                   +
    鞭毛构成                              极性(polar)＞1
    革兰氏反应                               -
    3％KOH水解                               +
    氨基肽酶                                 +
    芽孢                                     -
    氧化酶                                   +
    过氧化氢酶                               +
    无氧生长                                 -
    色素
    荧光颜料                                 +
    绿脓菌素                                 -
    ADH                                      +
    从硝酸根转化成亚硝酸根                   -
    反硝化                                   -
    脲酶                                     -
    明胶的水解                               -
    基质的利用：
    己二酸盐(酯)                             -
    柠檬酸                                   +
    苹果酸                                   +
    D-苯乙醇酸盐(酯)                         +
    苯乙酸酯                                 +
    D-酒石酸盐(酯)                           -
      D-葡萄糖            +
      海藻糖              -
      甘露醇              -
      苯甲酰甲酸盐(酯)    -
      丙二醇              +
      丁胺                +
      苄胺                +
      色胺                -
      乙酰胺              +
      马尿酸              +
细胞脂肪酸特性属于典型的恶臭假单孢菌。
16S rDNA部分测序揭示与门多萨假单孢菌和产碱假单孢菌相似性约98％，与恶臭假单孢菌的相似性为97.4％。
FB387种红球菌(DSM 11291)的分类学描述
1．菌落形态与颜色：短分支菌丝，衰老时分裂成杆体和球体，菌落不光滑，浅红色-橙色RAL2008；
2．肽聚糖的诊断(diagnosed)氨基酸：内消旋二氨基庚二酸；
3．分支菌酸：红球菌分支菌酸；对分支菌酸长度(C32-C44)的测定及将所得数据与DSMZ分支菌酸数据库中的目录相比较发现，与ruber红球菌菌种的结构只有很小的相似性(相似性0.019)。这样低的相关系数不能用以进行菌种的鉴定．
4．脂肪酸结构：非分支链、饱和及不饱和脂肪酸加上结核硬脂酸。这样的脂肪酸结构可用于所有的红球菌属及与之密切相关菌属的(例如分支杆菌属、诺卡菌属和戈登氏菌属)代表性菌种的确认。我们试图测定脂肪酸结构的定性和定量差异，以期进行菌种水平的区分。使用了多种方法将FB387种红球菌的脂肪酸特征与数据库中的目录比较。用这种方法不可能确定FB387种红球菌的种属，因为它与任何已知红球菌属下的菌种相似性都很小(0.063)。
5．根据对该菌种16S rDNA的部分测序，96-818以97.9％的相关性被确认为红球菌。这一序列的一致性远低于分类学上明确菌种分类所要求的99.5％。
根据所得结果，可以假设FB87种红球菌株为一新的、从未被描述过的红球菌菌种。
本发明的酶，即能够水解上述通式Ⅶ环戊烯衍生物的N-乙酰氨基-醇水解酶，可以通过以技术人员所知常规方法裂解本发明微生物细胞获得。例如，可用超声波法或弗氏(French)压碎法。这类酶可以从例如erythropolis红球菌CB101(DSM10686)获得。可以从本发明微生物，尤其是erythropolis红球菌CB101(DSM10686)获得的酶宜具有以下特性：
a)最适pH为pH7.0+1.0；
b)最适温度在pH7.0时是25℃到30℃之间；
c)对底物1-乙酰氨基-羟甲基-2-环戊烯的KM为22.5+7.5mM(30℃,100mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)。
对得自erythropolis红球菌CB101(DSM10686)的酶的序列分析进一步揭示：
d)N末端的氨基酸序列为Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn；
分子量测定发现：
e)经SDS-PAGE测定，分子量为50kD。
可由本发明微生物例如erythropolis红球菌CB101(DSM10686)获得的这类酶，具体水解(例如)1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、1-丙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯和1-异丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
本发明制备通式Ⅰ或Ⅱ的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟基甲基)-2-环戊烯和/或通式Ⅲ或Ⅳ的(1S,4R)-或(1R,4S)-氨基醇衍生物(其中R1为上述含意)
Figure A9719518200152
的方法，可以如下进行(例如)，第一步，酰化通式Ⅴ的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮
Figure A9719518200153
产生通式Ⅵ的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮衍生物
Figure A9719518200161
其中R1的含意如前。前体(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备在EP-B 0 508 352中已公开。酰化可用通式Ⅷ的羰基卤化物来进行其中的X表示卤原子，R1的含意如前，或者用通式Ⅸ的羧酸酐进行
Figure A9719518200163
其中R1的含意如前。
F、Cl、Br或Ⅰ可用作卤原子X。优选的是用Cl和F。
羰基卤化物例子有：乙酰氯、氯乙酰氯、丁酰氯、异丁酰氯、苯乙酰氯、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)、丙酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸烯丙酯或氟甲酸叔丁酯。羧酸酐的例子有：二叔丁基二碳酸酯、丁酸酐、乙酸酐或丙酸酐。
酰化反应可以不用溶剂或用非质子传递性(质子惰性)溶剂进行。
酰化反应以在非质子传递性溶剂中进行为佳。合适的非质子传递性溶剂例如吡啶、乙腈、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮，或它们的混合物。优选的溶剂是吡啶或乙腈，尤其是吡啶和乙腈的混合物。
酰化反应以在-80℃至50℃进行为佳，0℃至25℃更好。
该方法的第二步，通式Ⅵ的(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮衍生物被还原产生通式Ⅶ的环戊烯衍生物
Figure A9719518200164
其中R1的含意如前。
还原反应宜用碱金属硼氢化物或碱土金属硼氢化物，碱金属铝氢化物或碱土金属铝氢化物，或Vitride(氢化钠二(2-甲氧基乙氧基)铝)进行。氢化钠铝或氢化钾铝可用作碱金属铝氢化物。硼氢化钠或硼氢化钾可用作碱金属硼氢化物。硼氢化钙可用作碱土金属硼氢化物。
还原反应宜在质子传递性溶剂中进行。可用的质子传递性溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇之类的较低(分子量)脂肪醇，或水，或它们的混合物。
还原反应宜在-40℃至40℃温度之间进行，0℃至20℃更好。
通式Ⅶ的环戊烯衍生物向通式Ⅰ或Ⅱ的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯的转化，根据本发明用微生物或微生物的酶提取物，用青霉素G酰基转移酶，或用具有N-乙酰氨基-醇水解酶活性的的酶进行。
Figure A9719518200171
这种生物转化不仅生成通式Ⅰ或Ⅱ的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟基甲基)-2-环戊烯并在反应适当阶段分离得到，而且生成通式Ⅲ或Ⅳ的(1S,4R)-或(1R,4S)-氨基醇衍生物
Figure A9719518200172
其中R1的含意如前。后者也可以同样在反应适当阶段分离得到。
所有利用通式Ⅶ的环戊烯衍生物作为唯一氮源、唯一碳源或唯一碳源和氮源的微生物都适用。生物转化宜利用以环戊烯衍生物的(1R,4S)异构体作为唯一碳源、唯一碳源和氮源或唯一氮源的微生物进行。
生物转化宜利用以下菌属的微生物进行：产碱杆菌/博德特氏菌属、红球菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌属/根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属或戈登氏菌属，具体的菌种是产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)、erythropolis红球菌CB 101(DSM10686)、HSZ5种节细菌(DSM10328)、FB387种红球菌(DSM11291)、xylosoxydans产碱杆菌反硝化HSZ17亚种(DSM10329)、土壤杆菌/根瘤菌HSZ30、单纯芽孢杆菌K2、恶臭假单孢菌K32或戈登氏菌(DSM 9687)，以及它们的功能相当的变异株或突变株。以上菌种如上所述已根据布达佩斯条约进行了保存。
特别适合于本发明方法的微生物菌种是产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)、erythropolis红球菌CB101(DSM10686)、CB100种戈登氏菌(DSM10687)。
在按照常规方法初步培养这些微生物之后，生物转化可用静息细胞(不再需要碳源和能源的非生长细胞)或生长细胞进行。生物转化最好用静息细胞进行。
根据本发明适合于本发明方法的酶，即N-乙酰氨基-醇水解酶可用上述方法获得，并具有上述特性。
可从多种微生物获取合适的青霉素G酰基转移酶，例如从杆菌或放线菌获取，具体地说是：大肠杆菌ATCC9637、巨大芽孢杆菌、淡紫链霉菌ATCC13664、诺卡菌sp.ATCC13635、rettgeri普罗威登斯菌ATCC9918、viscosus节杆菌ATCC15294、fascians红球菌ATCC12975、产褐色链霉菌ATCC21289、无色杆菌ATCC23584和玫瑰色微球菌ATCC416。可用购得的青霉素G酰基转移酶，具体如大肠杆菌(Boehringer Mannheim)或巨大芽孢杆菌的EC3.5.1.11。
在一优选实施方案中，使用固定化的青霉素G酰基转移酶。
生物转化可在该领域常用培养基中进行，例如，在低摩尔浓度的磷酸盐、柠檬酸盐或Hepes缓冲液中、在水中、在营养酵母肉汤(NYB)或表中所述完全培养基中进行。生物转化以在表1所示的培养基或低摩尔浓度磷酸盐缓冲液中进行为佳。
进行生物转化时，环戊烯衍生物(通式Ⅶ)可以一次性加入或连续加入，其浓度不超过10重量％，以2重量％为佳。
生物转化过程中的pH范围为5至9，以6至8为佳。生物转化宜在20℃至40℃温度进行，以25℃至30℃为佳。
如果在生物转化过程中生成了(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯，可以通过酸水解，例如用盐酸，将其转化为(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯。
实施例：
实施例1
(±)-2-乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在充氮下，将100g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(800ml)和吡啶(161.26ml)中。在12℃，用2小时的时间滴加104.5g乙酰氯。混合物然后室温搅拌4.5小时。加入800ml水，真空蒸发去除乙腈。水相用400ml乙酸乙酯萃取3次。合并后的有机相用1N的HCl(400ml)、水(400ml)、饱和NaCl(400ml)洗涤，用硫酸镁干燥，并彻底蒸发。残留物用二氯甲烷吸收并通过硅胶过滤。浓缩滤液并蒸馏纯化产物。得到107.76g产物，呈澄清的液体。得率为71％。沸点(0.07torr):51℃
1H-NMR(CDCl3)；δ[ppm]    2.25(AB syst.,2H)；
400MHz                      2.8(s,3H)；
                            3.42(m,1H)；
                            5.30(m,1H)；
                            6.89(m,1H)；
                            6.92(m,1H)。
实施例2
(±)-2-丁酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
充氮下，将100.3g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于乙腈(720ml)和吡啶(142ml)中。在12℃，用1小时的时间滴加141.8g丁酰氯。然后在室温搅拌反应3小时，加入720ml水，真空蒸发去除乙腈。水相用300ml乙酸乙酯萃取3次。合并后的有机相用1N的HCl(350ml)、饱和NaCl(400ml)和水(500ml)洗涤，用硫酸镁干燥，并彻底蒸发。蒸馏纯化产物。得到107.76g，呈澄清液体。得率为85％。
沸点(0.05torr):70℃
1H-NMR(CDCl3)；δ[ppm]    0.98(t,J=8.5Hz,3H)；
400MHz                      1.58-1.65(2H)；
                            2.23(AB syst.,2H)；
                            2.82-2.90(2H)；
                            3.42(m,1H)；
                            5.30(m,1H)；
                            6.62(m,1H)；
                            6.90(m,1H)。
实施例3
(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
充氮下，将33-4g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于乙腈(240ml)和吡啶(48.3ml)中。在12℃，用30分钟时间滴加68.6g苯基乙酰氯。混合物然后室温搅拌3.5小时，加入240ml水，真空蒸发去除乙腈。水相用150ml乙酸乙酯萃取3次。合并后的有机相用1N的HCl(150ml)、饱和NaCl(150ml)和水(150ml)洗涤，硫酸镁干燥，并彻底蒸发。粗产物经硅胶(己烷∶乙酸乙酯=1∶1)过滤。得到68.34g粗产物，呈黄色油状。
实施例4
(±)-2-丙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
充氮下，将47g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于乙腈(325ml)和吡啶(41ml)中。在12℃，用1小时时间滴加43.9g丙酰氯。反应物然后室温搅拌5小时，加入145ml水，真空蒸发去除乙腈。水相用115ml乙酸乙酯萃取3次。合并后的有机相用1N的HCl(140ml)、饱和NaHCO3(40ml)和NaCl(40ml)溶液洗涤，用硫酸钠干燥，并彻底蒸发。蒸馏纯化残留物。得到55.8g标题化合物，静置后固化。得率为81.6％。
2.8mbar时的沸点：75-80℃
熔点：54-56℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm]          0.95(t,3H)；
400MHz                              2.10(quart.,1H)；
                                    2.28(quart.,1H)；
                                    2.64(m,2H)；
                                    3.42(s,1H)；
                                    5.16(s,1H)；
                                    6.78(m,1H)；
                                    6.96(m,1H)。
实施例5
(±)-2-异丁酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
充氮下，将45.1g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(310ml)和吡啶(39ml)中。在10℃，用1小时时间滴加54.1g异丁酰氯。反应物然后室温搅拌5小时，加入140ml水，真空蒸发去除乙腈。水相用4×120ml乙酸乙酯萃取4次。合并后的有机相用1N的HCl(50ml)、饱和NaHCO3(50ml)和NaCl(50ml)溶液洗涤，硫酸钠干燥，并彻底蒸发。残留物在加有活性炭的正己烷(240ml)中回流煮沸。滤除活性炭后，滤液冷却至0℃并过滤得到标题化合物。得到54.5g产物。得率为76％。
熔点：41-42℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm]  0.92(d,3H)；
400MHz                      1.06(d,3H)；
                            2.10(m,1H)；
                            2.28(m,1H)；
                            3.40(m,2H)；
                            5.16(s,1H)；
                            6.78(m,1H)；
                            7.92(m,1H)。
实施例6
(±)-2-氯乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备10℃，充氮下，将10.1g(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于二氯甲烷(10ml)、吡啶(8.4ml)和0.22g4-N,N-二甲基氨基-吡啶的混合液中。用1小时时间滴加13.5g氯乙酰氯。温度升至44℃。昆合物然后室温再搅拌反应2小时，加入100ml水。相分离后，水相用100ml二氯甲烷萃取。合并后的有机相用硫酸钠干燥，并彻底蒸发。残留物在加有1g活性炭的100ml异丙醚中回流煮沸10分钟。乘热过滤后，滤液冷却至室温，过滤得到固体并干燥。得到10.35g标题化合物。得率为60％。
熔点：86-88℃
1H-NMR(CDCl3)；δ[ppm]  2.28(d,1H)；
400MHz                    2.40(d,1H)；
                          3.48(s,1H)；
                          4.56(d,2H)；
                          5.30(s,1H)；
                          6.70(d,1H)；
                          6.94(m,1H)。
实施例7
(±)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
充氮下将79.56g(±)-2-乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶于乙醇(450ml)中，并冷却至-10℃。用45分钟，分批加入19.8g硼氢化钠。
0℃搅拌反应3小时，然后用浓硫酸调节pH至1.8。在混合物中加入乙酸乙酯(200ml)，过滤去除固体。然后彻底蒸发。残留物用水吸收，用二氯甲烷洗涤并彻底蒸发。粗产物用乙酸乙酯/甲醇5∶1溶剂硅胶过滤纯化，滤液浓缩。得到51.83g白色固体产物。按照所用的2-乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计算，得率为64％。
熔点：91-93℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm] 1.18(m,1H)；
400MHz                    1.78(s,3H)；
                          2.29(m,1H)；
                          2.66(m,1H)；
                          3.35(s,1H)；
                          4.58(s,1H)；
                          4.72(m,1H)；
                          5.61(d,1H)；
                          5.85(d,1H)；
                          7.83(d,1H)。
实施例8
(±)-1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
充氮下，将73.87g(±)-2-丁酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(400ml)中，并冷却至-10℃。用45分钟，分批加入15.86g硼氢化钠。0℃搅拌反应3小时，然后用浓硫酸调节pH至1.5，加入乙酸乙酯(200ml)，过滤去除固体。然后彻底蒸发。残留物用水吸收，用二氯甲烷洗涤，蒸发并高真空干燥。得到60.55g产物。按照所用的(±)2-丁酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计算，得率为80％。
熔点：71-72℃
1H-NMR(CDCl3)；δ[ppm]  0.98(t,J=8.5Hz,3H)；
400MHz                    1.40-1.50(1H)；
                          1.58-1.68(2H)；
                          2.10-2.18(2H)；
                          2.42-2.55(1H)；
                          2.85(m,1H)；
                          3.62(AB syst.,2H)；
                          4.98(m,1H)；
                          5.78-5.82(2H)；
                          6.38(m,1H)。
实施例9
(±)-1-苯乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
充氮下，将67g粗制(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450ml)中，并冷却至-10℃。用1小时，分批加入13.2g硼氢化钠。室温搅拌反应3.5小时，然后用浓硫酸调节pH至3.8。彻底蒸发混合物。干燥残留物，硅胶过滤(己烷/乙酸乙酯=1∶9)纯化。从乙酸乙酯中重结晶后，得到54.6g白色固体。按照所用的(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计算，得率为80％。
1H-NMR(CDCl3)；δ[ppm]  1.28-1.35(1H)；
400MHz                    1.40(m,1H)；
                          2.38-2.45(1H)；
                          2.79(m,1H)；
                          3.50(AB syst.,2H)；
                          3.52(s,3H)；
                          4.98(m,1H)；
                          5.75(m,2H)；
                          5.98(m,1H)；
                          7.20-7.38(5H)。
实施例10
(±)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
室温，充氮下，将15g粗制盐酸(±)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯溶解在150ml水和150ml二噁烷的混合液中。用1N的NaOH将溶液的pH调至14，然后加入叔丁氧基羰基氟(BOC-F，过量20％)的二乙醚溶液，混合物室温继续搅拌3小时(按照Synthesis 1975,599中公开的方法制备BOC-F)。用浓盐酸将pH调至2。蒸馏去除有机溶剂后，在残留物中加入50ml水，混合物用3×100ml乙酸乙酯萃取。合并的有机相彻底蒸发。残留物在110ml二丙醚和80ml正己烷的混合液中结晶。得到11.95g标题化合物。得率为56％。
熔点：68-70℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm]1.18(m,1H)；
400MHz                    1.38(s,9H)；
                          2.26(m,1H)；
                          2.65(m,1H)；
                          3.33(t.,2H)；
                          4.45(m,1H)；
                          4.55(t,1H)；
                          5.62(m,1H)；
                          5.79(m,1H)；
                          6.73(d,1H)。
实施例11
(±)-1-丙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
充氮下，将16.6g(±)-2-丙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(140ml)和2-丁醇(66ml)中，并冷却至-5℃。用2小时，分批加入3g硼氢化钠。混合物10℃搅拌2.5小时，并用浓盐酸和水的(1/1)混合液调节pH至2.2。将溶液蒸发至40g，并用2N的NaOH将pH调至6.2。混合物用5×50ml二氯甲烷萃取。彻底蒸发合并的有机相。在甲苯(150ml)中结晶残留物。得到11.1g标题化合物。得率为65％。
熔点：67-68℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm]0.96(t,3H)；
400MHz                    1.16(quint.,1H)；
                          2.04(quart.,2H)；
                          2.26(m,1H)；
                          2.66(m,1H)；
                          3.34(m,2H)；
                          4.58(t,1H)；
                          4.72(m,1H)；
                          5.61(m,1H)；
                          5.84(m,1H)；
                          7.72(d,1H)。
实施例12
(±)-1-异丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
充氮下，将9g(±)-2-异丁酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(32ml)和2-丁醇(84ml)中，并冷却至0℃。用3.5小时，分批加入1.37g硼氢化钠。混合物20℃搅拌3小时，并用浓盐酸和水的(1/1)混合液调节pH至2.5，再用2N的NaOH中和。将溶液蒸发至40g。残留物用3×80ml二氯甲烷萃取.彻底蒸发合并的有机相。在25ml甲苯中结晶得到的固体。得到6.8g标题化合物。得率为73.6％。
熔点80-81℃
1H-NMR(DMSO-d6)；δ[ppm]0.98(d,6H)；
400MHz                    1.16(quint.,1H)；
                          2.30(m,2H)；
                          2.68(m,1H)；
                          3.32(t,2H)；
                          4.58(t,1H)；
                          4.70(m,1H)；
                          5.61(m,1H)；
                          5.82(m,1H)；
                          7.68(d,1H)。
实施例13
用青霉素G酰基转移酶制备(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯
将大肠杆菌青霉素G酰基转移酶EC3.5.1.11(Boehringer Mannheim)165单位/克(U/g)或巨大芽孢杆菌的青霉素G酰基转移酶EC3.5.1.11用于此生物转化。
为此，将50mM磷酸钠缓冲液(pH5-9；4ml)，与1％(重量)非外消旋1-苯乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯和400mg合适的青霉素G转移酶于37℃一起孵育。
然后按照一定的时间间隔取样，用薄层色谱(硅胶60，丁醇∶水∶冰醋酸=3∶1∶1；用水合茚三酮来检测)、气相色谱(毛细管柱，HP-5,5％苯基甲基硅氧烷)或HPLC进行分析。酶以很高的活性去除了苯乙酰基团，因此释放出多达40％相应的氨基醇。得到的游离氨基醇的ee为80％。
实施例14
用微生物制备(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯14.1将Visp的ARA废水处理厂的淤泥(20％)在含有0.5％(重量)1-乙酰基、1-丙
酰基、1-异丁酰基或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的A+N培养基(参见表
1)中37℃振荡培养，形成(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯后进行薄层色
谱。
用上述培养富集物的1％进行1-3位转移，在固体培养基(表1培养基中加入29g/l平板计数琼脂)上进行分离。以此方法分离出微生物产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)、erythropolis红球菌CB101(DSM10686)、CB100种戈登氏菌(DSM10687)和FB387种红球菌(DSM11291)。14.2将由此分离得到的微生物培养在含有0.5％1-乙酰基、1-丙酰基、1-异丁酰
基或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的培养基(参见表1)中。在24至36小时
内，它们生长至光密度(0D)2至3。在生长后期的对数期收获所得的细胞并
以10mM磷酸盐缓冲液洗涤。
在含有1％(重量)1-乙酰基、1-异丁酰基或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的
50mM磷酸盐缓冲液中进行随后的生物转化。用薄层色谱发现，50％的底
物被水解成(1R,4S)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯。HPLC分析发现ee值在80
％至93％之间。
用1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯作为底物时，菌株DSM10686培养在A+N
培养基上的生物转化速度为0.14(g/L/h/OD)，培养在含1-丁酰氨基-氨基-4-
羟甲基-2-环戊烯的NYB(营养酵母肉汤)上的生物转化速度为
0.03(g/l/h/OD)。
如果用菌株DSM10687,200mM的底物(1-丁酰氨基-氨基-4-羟甲基-2-环戊
烯)浓度进行同样转化，生物转化的速度是0.161(g/l/h/OD)。
表1 A+N培养基
MgCl2             0.4g/l
CaCl2             0.014g/l
FeCl3             0.8mg/l
Na2SO4           0.1g/l
KH2PO4           1g/l
Na2HPO4          2.5g/l
NaCl               3g/l
  维生素液                 1ml/l
  微量元素溶液             1ml/l
  pH7.514.3在一台6L发酵罐中37℃将erythropolis红球菌DSMl0686培养在以乙酸铵
(3g/l)为碳源和氮源的基本培养基(参见表2)中，直至细胞密度的
OD650＞25。在细胞生长期间，连续加入50％的乙酸作为补充碳源。为了诱
导酶活性，然后加入60g(+/-)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯，继续培养数小
时。最后，再加入40g(+/-)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯，再继续培养10
小时。用HPLC在线监测生物转化的进展。当达到40％的分析得率(根据所
用的外消旋底物)和85％的ee时，加酸终止发酵。
表2
培养基组成
  组份                  浓度
  酵母提取物            0.5g/l
  蛋白胨M66             0.5g/l
  KH2PO4              4.0g/l
  Na2HPO4·2H2O      0.5g/l
  K2SO4               2.0g/l
  乙酸铵                3.0g/l
  CaCl2                0.2g/l
  MgCl2·6H2O         1.0g/l
  微量元素溶液(见下表)  1.5g/l
  PPG(聚丙二醇)         0.1g/l
  微量元素溶液
  KOH                   15.1g/l
  EDTA·Na·2H2O       100.0g/l
  ZnSO4·7H2O         9.0g/l
  MnCl2·4H2O         4.0g/l
  H3BO3               2.7g/l
  CoCl2·6H2O         1.8g/l
  CuCl2·2H2O         1.5g/l
  NiCl2·6H2O          0.18g/l
  NaMoO4·2H2O           0.27g/l14.4仿效实施例14.3，将微生物HSZ5种节细菌(DSM 10328)、FB387种红球菌
(DSM11291)、xylosoxydans产碱杆菌反硝化HSZ17亚种(DSM 10329)、土
壤杆菌/根瘤菌HSZ30、单纯芽孢杆菌K2和恶臭假单孢菌K32培养在乙酸
钠加以及不加1-乙酰基、1-丙酰基、1-异丁酰基或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-
环戊烯(后文简称为氨基醇)的培养基(表1)中。
用不加氨基醇培养的对数期细胞，获得如下结果(HPLC分析)：
菌株                    速度(mmol/OD.h)    ee/转化率(％)
HSZ5(DSM 10328)         0.05                88.7/16
HSZ17(DSM 10329)        0.005               95/23
K32                     0.05                54/1
CB101(DSM 10686)        0.1                 84/39
培养菌株K2和K17，收获并用于60小时的生物转化。
菌株    速度(mmol/OD.h)    ee/转化率(％)
K2      -                  92/10
HSZ30   -                  93/3.5
收获各批培养物的对数期和稳定期细胞作为静息细胞用于生物转化。根据
OTLC分析，氨基醇诱导细胞或不诱导细胞的初速度未见差异。
实施例15
从erythropolis红球菌CB101(DSM10686)中纯化N-乙酰氨基-醇水解酶
纯化此酶，直至在SDS-PAGE(Pharmacia Phast凝胶，10-15％梯度)中只有一条50kD分子量的蛋白质条带为止。
erythropolis红球菌CB101(DSM10686)细胞以50mM的tris缓冲液(pH6.2)洗涤，并浓缩至光密度OD650nm为190。在加入苯基甲烷磺酰氟(PMSF)至最终浓度1mM和DNAse后，为了获得粗提取物，用弗氏压碎法处理细胞。离心后得到200ml无细胞提取液，其蛋白质浓度为4.8mg/ml。
将960mg无细胞提取液上样在HiLoad 26/10 Q-Sepharose离子交换色谱柱(Pharmacia)上，色谱柱预先用含1mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM的Tris缓冲液(pH8.0)平衡。
用该缓冲液洗柱后，用线性梯度缓冲液洗脱蛋白质(1500ml；梯度：含1mMDTT的50mM tris缓冲液pH8.0至含1mM DTT和1M NaCl的50mM tris缓冲液pH7.0)。该酶在pH7.6,370mM至430mMNaCl之间从柱上洗脱。收集活性流份，并浓缩至9ml。蛋白质含量为41mg。
为了进一步纯化，将此蛋白溶液上样在HiLoad 26/10 Superdex75凝胶过滤色谱柱(Pharmacia)上，此柱预先用50mM NaCl和1mM DTT的50mM tris缓冲液平衡。收集活性流份，总蛋白质含量为10.9mg。
将此蛋白质溶液上样在Mono Q HR5/5色谱柱(Pharmacia)上，色谱柱预先用含1mM DTT的50mMtris缓冲液(pH8.5)平衡。用线性梯度缓冲液(40ml)洗脱蛋白质，即用含1mM DTT的50mM tris缓冲液(pH8.5)至含1mM DTT和1M NaCl的50mM tris缓冲液(pH8.5)洗脱。该酶在390mM NaCl至440mM NaCl之间洗脱。活性组份中含有1.4mg蛋白质。
在最后的纯化步骤中，使用以相同缓冲液平衡的相同的色谱柱。使用的洗脱梯度是含0至500mM NaCl,pH7.08.5的相同缓冲液。用此法可分离到430微克纯酶。
用蛋白质印迹法直接测定了酶的N端序列，得到以下20个氨基酸的序列：Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Aal-Ser-Asn。
此序列与已知蛋白质不同源。
实施例16
酶的特性
用纯化的酶和经Sephadex G25色谱柱(PD-10,Pharmacia)脱盐的无细胞提取物进行酶的鉴定。
无细胞提取物中的蛋白质浓度为7.3mg/ml。纯酶的蛋白浓度为135μg/ml。在无细胞提取物中不添加PMSF。16.1Km的测定
在无细胞提取物中测定Km.pH7.0，30℃时，此酶对底物1-乙酰氨基-4-羟
甲基-2-环戊烯反应的Km为22.5mM。16.2最适pH
在以下缓冲液中，用纯化的酶和无细胞提取物，在pH6.2至9.0范围内测定
此酶水解1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯(25mM)的最适pH。
tris缓冲液100mM pH9.0；8.5；8.0；7.5；7.0
柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液100mM pH7.0；6.55；6.2
测定了24小时的酶活性。
生成1R,4S和1S,4R对映结构体反应的最适pH应7.0至7.5之间。
酶在无细胞提取物中活性的最适pH为7.0。但是，pH6.0至pH7.0之间的选
择性较好。
图1显示erythropolis红球菌CB101(DSM10686)的N-乙酰氨基-醇水解酶(无
细胞提取物)的活性与pH的关系。16.3实施例16.2表明，反应的最适温度在25至30℃。
图2显示，erythropolis红球菌CB101(DSM10686)的N-乙酰氨基-醇水解酶
(无细胞提取物)的活性与温度的关系
                         序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名：LONZA AG(B)街道：Muenchensteinerstrasse 38(C)城市：Basel(E)国家：瑞士(F)邮政编码：4002(ⅱ)发明名称：氨基醇的制备方法(ⅲ)序列数量：1(ⅳ)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：20个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：未知(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义链：无(ⅴ)片段类型：N末端(ⅵ)来源：(B)菌株：erythropolis红球菌(C)个体/分离体：erythropolis红球菌CB101(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Thr Glu Gln Asn Leu His Trp Leu Ser Ala Thr Glu Met Ala1               5                   10Ala Ser Val Ala Ser Asn
15              20
      微生物国际保藏存活证明(译文)
          微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
保藏日     1996-10-08
保藏号     DSM11291
微生物分类命名     FB387
国际保藏单位名称     德意志微生物保藏中心
代理机构盖章
      微生物国际保藏存活证明(译文)
    微生物国际保藏存活证明(译文)
Figure A9719518200361
        微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
    保藏日     1996-05-20
保藏号     DSM10686
微生物分类命名     BEC005
国际保藏单位名称     德意志微生物保藏中心
代理机构盖章
           微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
    保藏日     1995-11-06
保藏号     DSM10329
微生物分类命名     HSZ17
国际保藏单位名称     德意志微生物保藏中心
代理机构盖章
        微生物国际保藏存活证明(译文)
Figure A9719518200391
       微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
保藏日     1995-11-06
保藏号     DSM10328
微生物分类命名     HSZ5
国际保藏单位名称     德意志微生物保藏中心
代理机构盖章
         微生物国际保藏存活证明(译文)
Figure A9719518200411
            微生物国际保藏存活证明(译文)
Figure A9719518200421
             微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
保藏日     1996-09-20
    保藏号     DSM11172
微生物分类命名     FB188
国际保藏单位名称     德意志微生物保藏中心
代理机构盖章
             微生物国际保藏证明(译文)
    保藏人     隆萨股份公司
    地址     不伦瑞克
保藏日     1996-05-20
保藏号     DSM10687
微生物分类命名     BEC006
国际保藏单位名称 德意志微生物保藏中心
代理机构盖章

Claims (15)

1．微生物以及从中提取的酶，其特征在于该微生物能够利用选自以下通式化合物的环戊烯衍生物作为唯一的碳源、或唯一的氮源、或唯一的碳源和氮源，
Figure A9719518200021
其中R1表示C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、芳基或芳氧基。
2．根据权利要求1所述的微生物和提取物，其中的微生物选自、红球菌属、戈登氏菌属、节细菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属或产碱杆菌属/博德特氏菌属。
3．根据权利要求1所述的微生物和提取物，其中的微生物选自以下菌株：具体的种是产碱杆菌/博德特氏菌FB188(DSM11172)、erythropolis红球菌CB101(DSM10686)、HSZ5种节细菌(DSM10328)、FB387种红球菌(DSM11291)、xylosoxydans产碱杆菌反硝化HSZ17亚种(DSM10329)、土壤杆菌/根瘤菌HSZ30、单纯芽孢杆菌K2、恶臭假单孢菌K32或CB100种戈登氏菌(DSM10687)，以及与它们功能相当的变异株和突变株。
4．具有N-乙酰氨基-醇水解酶活性的酶以及与它们功能相当的变异体和突变体，来自权利要求1至3中任一项所述的微生物，它们能够水解选自以下通式化合物的环戊烯衍生物
Figure A9719518200022
其中，R1表示C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，芳基或芳氧基。
5．根据权利要求4所述的酶以及与它们功能相当的变异体和突变体，其特征在于，
a)最适pH为7.0±1.0；
b)pH7.0时的最适温度为25至30℃之间；
c)对底物1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的KM是22.5+7.5mM(30℃,100mM磷酸盐缓冲液)。
6．根据权利要求4或5所述的酶及与它们功能相当的变异体和突变体，其特征还在于：
d)N末端的氨基酸序列为Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn；
e)经SDS-PAGE测定的分子量为50kD。
7．制备以下物质的方法：通式Ⅰ和Ⅱ的(1R,4S)-和/或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟-甲基)-2-环戊烯
Figure A9719518200031
和/或通式Ⅲ和Ⅳ的(1S,4R)-和/或(1R,4S)-氨基醇衍生物：
Figure A9719518200032
其中R1表示C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，芳基或芳氧基，该方法包括：借助权利要求1所述的微生物、酶、或借助权利要求4所述的酶、和/或青霉素G酰基转移酶将通式Ⅶ的环戊烯衍生物，
Figure A9719518200033
其中R1如前所述转化成通式Ⅰ和/或Ⅱ的化合物，并适当分离该转化产生的上述化合物、和/或产生的通式Ⅲ和/或Ⅵ的氨基醇衍生物。
8．根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通式Ⅶ的环戊烯衍生物，其中的R1如前所述的制备方法如下：
第一步，酰化通式Ⅴ(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，得到通式Ⅵ(±)-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的衍生物
Figure A9719518200041
其中R1如前所述，第二步，将此化合物还原成通式Ⅶ的环戊烯衍生物。
9．根据权利要求8所述的方法，其特征在于第一步的酰化是用通式Ⅶ的羰基卤化物进行的
Figure A9719518200042
其中的X表示卤原子，R1如前所述，或者用通式Ⅸ的羧酸酐进行其中R1如前所述。
10．根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于第一步的酰化是在非质子传递性溶剂中进行的。
11．根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其特征在于，第二步中的还原是利用碱金属或碱土金属的硼氢化物、碱金属或碱土金属铝氢化物和/或Vitride进行的。
12．根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其特征在于，第二步中的还原是在质子传递性溶剂中进行的。
13．根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其特征在于，通式Ⅶ的环戊烯衍生物的反应是用红球菌属、戈登氏菌属、节细菌数、产碱杆菌属、土壤杆菌/瘤杆菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属或产碱杆菌/博德特氏菌属的微生物进行的。
14．根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其特征在于，通式Ⅶ的环戊烯衍生物的反应是用巨大芽孢杆菌或大肠杆菌的青霉素G酰基转移酶进行的。
15．根据权利要求7至14中任一项所述的方法，其特征在于，第三步中的反应是在温度20至40℃，在pH5至9中进行的。
CNB971951829A 1996-05-30 1997-05-30 氨基醇及其衍生物的制备方法 Expired - Fee Related CN1224697C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH135996 1996-05-30
CH1359/96 1996-05-30
CH282/97 1997-02-10
CH28297 1997-02-10
CH90897 1997-04-18
CH908/97 1997-04-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1220695A true CN1220695A (zh) 1999-06-23
CN1224697C CN1224697C (zh) 2005-10-26

Family

ID=27171964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971951829A Expired - Fee Related CN1224697C (zh) 1996-05-30 1997-05-30 氨基醇及其衍生物的制备方法

Country Status (16)

Country Link
US (3) US6368850B1 (zh)
EP (1) EP0904348B1 (zh)
JP (1) JP4335314B2 (zh)
KR (1) KR100577891B1 (zh)
CN (1) CN1224697C (zh)
AT (1) ATE283348T1 (zh)
AU (1) AU3170597A (zh)
CA (1) CA2253977C (zh)
CZ (1) CZ296447B6 (zh)
DE (1) DE59712095D1 (zh)
DK (1) DK0904348T3 (zh)
ES (1) ES2229362T3 (zh)
HU (1) HU226141B1 (zh)
IL (1) IL127235A (zh)
PT (1) PT904348E (zh)
WO (1) WO1997045529A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1115343C (zh) * 1997-05-13 2003-07-23 隆萨股份公司 (1s,4r)－或(1r,4s)－4－(2－氨基－6－氯－9h－嘌呤－9－基)－2－环戊烯－1－甲醇或其盐的制备方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK284594B6 (sk) * 1997-11-27 2005-07-01 Lonza Ag Spôsob výroby derivátov aminoalkoholov a ich soli
DE59905679D1 (de) 1998-10-30 2003-06-26 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von 4-[(2',5'-diamino-6'-halogenpyrimidin-4'-yl)amino]-cyclopent-2-enylmethanolen
ATE240945T1 (de) * 1998-10-30 2003-06-15 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von 4-((2',5'-diamino- 6'-halogenpyrimidin-4'-yl)amino)-cyclopent-2- enylmethanolen
WO2000039324A2 (de) 1998-12-23 2000-07-06 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 1- amino-4- (hydroxymethyl)- cyclopent-2- en-derivaten
DE50002340D1 (de) 1999-01-06 2003-07-03 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von robenidin bzw. dessen derivate
PL359411A1 (en) * 2000-07-13 2004-08-23 Sankyo Company, Limited Amino alcohol derivatives
JP4841984B2 (ja) * 2006-03-22 2011-12-21 広栄化学工業株式会社 光学活性含窒素環状化合物の製造方法
US8236853B1 (en) 2007-12-03 2012-08-07 University Of South Florida Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives
CN102557990B (zh) * 2011-04-25 2014-06-25 开原亨泰制药股份有限公司 (1s，4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法
TWI738341B (zh) * 2020-05-14 2021-09-01 施雨霈 酒類弱鹼化設備及其弱鹼化方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8916479D0 (en) 1989-07-19 1989-09-06 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB8916478D0 (en) 1989-07-19 1989-09-06 Glaxo Group Ltd Chemical process
US5057630A (en) 1990-04-06 1991-10-15 Glaxo Inc. Synthesis of cyclopentene derivatives
GB9204015D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Wellcome Found Therapeutic nucleosides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1115343C (zh) * 1997-05-13 2003-07-23 隆萨股份公司 (1s,4r)－或(1r,4s)－4－(2－氨基－6－氯－9h－嘌呤－9－基)－2－环戊烯－1－甲醇或其盐的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050047558A (ko) 2005-05-20
DK0904348T3 (da) 2005-02-14
US20030008360A1 (en) 2003-01-09
US20040265985A1 (en) 2004-12-30
KR100577891B1 (ko) 2006-05-10
HUP9902963A2 (hu) 1999-12-28
JP4335314B2 (ja) 2009-09-30
US6368850B1 (en) 2002-04-09
CN1224697C (zh) 2005-10-26
IL127235A0 (en) 1999-09-22
DE59712095D1 (de) 2004-12-30
PT904348E (pt) 2005-04-29
IL127235A (en) 2003-04-10
EP0904348B1 (de) 2004-11-24
CZ296447B6 (cs) 2006-03-15
CA2253977C (en) 2009-08-04
ATE283348T1 (de) 2004-12-15
WO1997045529A1 (de) 1997-12-04
HUP9902963A3 (en) 2001-10-29
US6787347B2 (en) 2004-09-07
HU226141B1 (en) 2008-05-28
EP0904348A1 (de) 1999-03-31
AU3170597A (en) 1998-01-05
ES2229362T3 (es) 2005-04-16
CZ387298A3 (cs) 1999-04-14
JP2000512488A (ja) 2000-09-26
US7405065B2 (en) 2008-07-29
CA2253977A1 (en) 1997-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1032436A (zh) 生物学生产酰胺的方法
CN1057568C (zh) Ｄ－α氨基酸的制备方法
CN1492042A (zh) 新型腈水合酶
CN1100144A (zh) 可用作制备紫杉烷的中间体用化合物的对映体混合物离析用酶促方法
CN1515669A (zh) 由氧化葡糖杆菌t-100得到的l-山梨酮脱氢酶
CN1172003C (zh) N-乙酰神经氨酸的制造方法
CN1366550A (zh) (r)－2－辛醇脱氢酶,产生此酶的方法,编码此酶的dna,以及使用此酶生产醇类的方法
CN1224697C (zh) 氨基醇及其衍生物的制备方法
CN1993464A (zh) 新羰基还原酶、其基因及它们的使用方法
CN1115343C (zh) (1s,4r)－或(1r,4s)－4－(2－氨基－6－氯－9h－嘌呤－9－基)－2－环戊烯－1－甲醇或其盐的制备方法
CN1171992C (zh) L-脯氨酸4位羟基化酶的制备方法
CN85101191A (zh) L-肉毒碱的微生物学制备方法
CN1379779A (zh) 制备苯并噁嗪衍生物及其中间体的方法
CN1633502A (zh) 制备(3r,5s)－(e)－7－[2－环丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基]－3,5－二羟基庚－6－烯酸酯的方法
CN1708583A (zh) 用于制备d－氨基酸的突变株
CN1639328A (zh) 新型脱氢酶和编码该脱氢酶的基因
CN1916164A (zh) 生产D－N－氨基甲酰基－α－氨基酸的方法
CN1150325C (zh) 编码氨肽酶的dna分子和生产该氨肽酶的方法
CN1497046A (zh) α-酮酸还原酶及其制备方法，以及使用此酶制备光学活性的α-羟基酸的方法
CN1108372C (zh) 酰胺的制备工艺
CN1213400A (zh) N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法
CN1761742A (zh) 内酯酶的制造方法及其应用
CN1827591A (zh) 外消旋或光学活性的4－(羟甲基)－2－环戊烯衍生物的制备方法
CN1184311C (zh) L－脯氨酸3位羟基化酶的制造方法
CN1302117C (zh) 生产l－抗坏血酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20051026

Termination date: 20120530