CZ296447B6

CZ296447B6 - Mikroorganismy, enzym nebo enzymový extrakt a zpusob výroby derivátu cyklopentenu

Info

Publication number: CZ296447B6
Application number: CZ0387298A
Authority: CZ
Inventors: Bernegger-Egli@Christine; Birch@Olwen; Bossard@Pierre; Brieden@Walter; Brux@Frank; Burgdorf@Knut; Duc@Laurent; Etter@Kay-Sarah; Guggisberg@Yves; Sauter@Martin; Maria Urban@Eva
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2006-03-15
Also published as: KR20050047558A; DK0904348T3; US20030008360A1; US20040265985A1; KR100577891B1; HUP9902963A2; JP4335314B2; US6368850B1; CN1224697C; IL127235A0; DE59712095D1; PT904348E; IL127235A; EP0904348B1; CA2253977C; ATE283348T1; WO1997045529A1; HUP9902963A3; US6787347B2; HU226141B1

Abstract

Resení se týká nových mikroorganismu, které jsou schopné zuzitkovat deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII, ve kterém R.sup.1.n. znamená C.sub.1-4.n.-alkyl, C.sub.1-4.n.-alkoxy, aryl nebo aryloxy,jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Rovnez se týká nových enzymu, které hydrolyzují deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII. Dále se vynález týká nového zpusobu výroby (1R,4S)- nebo (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorcu I aII a/nebo derivátu (1S, 4R)- nebo (1R, 4S)-aminoalkoholu obecných vzorcu III a IV, kde R.sup.1.n. má uvedený význam.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat derivát cyklopentenu. Vynález se dále týká enzymových extraktů a enzymů s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou, které se získají z těchto mikroorganismů. Dále se vynález týká nového způsobu výroby (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4—(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu a/nebo derivátů (1D,4R)nebo (lR,4S)-aminoalkoholů.

Dosavadní stav techniky (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten je důležitý mezi produkt pro výrobu karbocyklických nukleotidů jako např. Carbovir^ (Campbell a spol., J. Org. Chem., 1995, 60, 4602-4616).

Způsob výroby (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu jsou popsány autory Campbell a spol. (shora) a Park K.H. & Rapoport H. (J. Org. Chem., 1994, 59, 394-399).

Při těchto způsobech slouží jako edukt buď D-glukon-5-lakton nebo D-serin, přičemž je nutných ca 15 stupňů syntézy pro vytvoření (lR,4S)-N-terc.butoxykarbonyl-4-hydroxymethyl-2cyklopentenu, kterému se pak odstraní chránící skupina za vzniku (lR,4S)-l-amino-4(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu.

Oba tyto způsoby jsou nákladné, zdlouhavé a velkoprodukčně neuskutečnitelné.

Spis WO 93/17020 popisuje způsob výroby (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu, přičemž se redukuje (lR,4S)-4—amino-2-cyklopenten-l-karboxylová kyselina hydridem hlinitolithným na požadovaný produkt.

Nevýhodou tohoto postupu je jednak to, že se také redukuje dvojná vazba cyklopentenového kruhu, špatná dostupnost hydridu hlinitolithného a jednak to, že je to příliš drahé.

Taylor, S.J. a spol (Tetrahetron: Asymmetry sv. 4, č. 6, 1993, 1117-1128), popisují způsob výroby (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu, přičemž se vychází z (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-onu jako eduktu. Edukt se při tom převádí pomocí mikroorganismů druhu Pseudomonas solanacearum nebo Pseudomonas fluorescens na (lR,4S)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on, který se pak přeměňuje pomocí di-tórc-butyldikarbonátu na (1R,4S)-N/erc-butoxykarbonyl-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on, který se pak redukuje borhydridem sodným a kyselinou trifluoroctovou na požadovaný produkt.

Tento postup je příliš nákladný.

Dále Martinez a spol. popisují (J. Org. Chem. 1996, 61, 7963-7966) desetistupňovou syntézu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu, přičemž se vychází z diethylesteru kyseliny dialkylmalonové. Nevýhodou tohoto postupu je rovněž zdlouhavost a neuskutečnitelnost při velkovýrobě.

Úkolem předloženého vynálezu bylo poskytnout jednoduchý způsob výroby (lR,4S)-l-amino4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu.

-1 CZ 296447 B6

Podstata vynálezu

Tato úloha se řeší pomocí mikroorganismů podle vynálezu podle nároku 1, jakož i pomocí enzymových extraktů z nich získaných, enzymů podle vynálezu podle nároku 2, a způsobem podle vynálezu podle nároku 6.

Mikroorganismy podle vynálezu se mohou izolovat z půdních vzorků, kalu nebo odpadních vod za pomocí běžných mikrobiologických technik.

Mikroorganismy podle vynálezu, které jsou schopné zužitkovat deriváty cyklopentenu níže uvedeného vzorce VII jsou vybrané z druhů Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1117), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM) 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.

Podle vynálezu se izolace mikroorganismů uskuteční tak, že se pěstuje obvyklým způsobem v živném médiu, které obsahuje jeden nebo více derivátů cyklopentenu obecného vzorce VII

kde R¹ znamená Cj^-alkyl, Ci^-alkoxy, aryl nebo aryloxy,

- j ako j ediný zdroj uhlíku a dusíku

- j ako j ediný dusí ku s vhodným zdroj em uhlíku nebo

- jako jediný zdroj uhlíku s vhodným zdrojem dusíku.

Jako Ci^-alkyl se může například použít methyl, ethyl, propyl, izopropyl nebo butyl.

Jako C^-alkoxy lze například použít methoxy, ethoxy, propoxy, izopropoxy, butoxy, nebo terc-butoxy.

Jako aryl se může například použít fenyl nebo benzyl. Výhodně se používá benzyl.

Jako aryloxy se může například použít benzyloxy nebo fenoxy. Podle toho jsou jako deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII vhodné například: N-acetyl-l-amino-4—hydroxymethyl-2cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten nebo N-fenylacetyl-1amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.

Účelně se z kultury získané pěstováním vyselektují ty, které zužitkují (lR,4S)-izomer derivátu cyklopentenu vzorce VII jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.

Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy využít například amonium, nitráty, aminokyseliny nebo močoviny jako růstový substrát.

Jako vhodný zdroj uhlíku mohou mikroorganismy využít například cukry, cukerné alkoholy, C2-C4-karboxylové kyseliny nebo aminokyseliny jako růstový substrát. Jako cukr lze použít hexózy jako je glukóza nebo pentózy. Jako cukerný alkohol se může použít například glycerin. Jako C₂-C₄-karboxylové kyseliny se mohou například použít kyselina octová nebo kyselina propionová. Jako aminokyseliny se mohou například použít leucin, alanin, asparagin.

-2CZ 296447 B6

Jako selekční a růstové médium se mohou použít v oboru obvyklá média, jako například média popsané v tabulce 1 nebo plné médium (médium obsahující extrakt kvasnic), výhodně se používá médium popsané v tabulce 1.

Během pěstování a selekce se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako induktory enzymů se mohou použít deriváty cyklopentenu obecného vzorce VII.

Obvykle se pěstování a selekce uskutečňuje při teplotě 20 až 40 °C, výhodně od 30 až 38 °C a při pH mezi 5,5 a 8,0, výhodně mezi 6,8 a 7,8.

Výhodné mikroorganismy jsou rodu Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella, zejména druhu Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686(, Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Arthrobacter sp HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifícans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty. Mikroorganismy DSM 10686 a 10687 byly uloženy 20.05.1996, mikroorganismy DSM 10328 a DSM 10329 byly uloženy 06.11. 1995, mikroorganismy DSM 11291 08.10.1996 a mikroorganismy DSM 11172 20.09.1996 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH (DSMZ), Mascheroderweg lb, D38124 Braunschweig, podle Budapešťské úmluvy.

Pod výrazem „funkčně ekvivalentní varianty a mutanty“ se rozumějí mikroorganismy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, například UV-ozářením.

Taxonomický popis Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172)

buněčná forma	tyčinky
šířka pm	0,5-0,6
délka pm	1,0-2,5
pohyblivost	+
mrskání	peritrich
Gram-reakce	—
lyže 3%ním KOH	+
aminopeptidáza (cemy)	+
spory	-
oxidáza	+
kataláza	+
ADH (alkoholdehydrogenáza)	-
NO₂zNO₃	—
denitrifikace	-
ureáza	—
hydrolýza želatiny	-
kyselina z (OF-test):
glukózy	-
fruktózy	-
arabinózy	-
adipátu	+
kaprátu	+
citrátu	+
malátu	+
mannitolu

-3CZ 296447 B6

Taxonomický popis Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 106 86)

1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou lesklé částečně rozteklé, béžový s růžovým tónem, RAL 1001;

2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová

3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Rhodococcus; určení délky řetězce kyseliny mykolové (C32-C44) a srovnání údajů s údaji zanesenými do databanky DSM-kyselin mykolových ukázalo na velmi vysokou podobnost se vzorky kmenů Rhodococcus erythropolis (podobnost 0,588).

4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.

5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna vysoká shodnost (100%) se sekvencemi specifických oblastí Rhodococcus erythropolis.

Výsledek identifikace je jednoznačný, neboť tři na sobě nezávislé metody (kyseliny mykolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) přiřadily kmen druhu Rhodococcus erythropolis.

Taxonomický popis Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)

1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou světle oranžové, (RAL 2008);

2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová;

3. Vzorek menachinonu: MK-9(H₂) 100%;

4. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Gordona; určení délky řetězce kyseliny mykolové (C₅o-C₆o) se uskutečnilo pomocí vysokoteplotní plynové chromatografie. Tento vzorek odpovídá vzorku, který se nalézá u zástupců rodu Gordona.

5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.

6. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna relativně nízká shodnost (98,8%) se sekvencemi specifických oblastí Gordona rubropertincta.

Na základě předložených výsledků (manechinony, kyseliny mykolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) lze izolát sice jednoznačně přiřadit rodu Gordona. Přiřazení ke známému druhu Gordona není možné na základě těchto výsledků. Je tedy třeba předpokládat, že se u kmenu DSM 10687 jedná o nový dosud nepopsaný druh rodu Gordona.

Taxonomický popis Alcaligenes xylosoxydans ssp denitrificans HSZ 17 (DSM 10329)

-4CZ 296447 B6

Vlastnosti kmene
buněčná forma	tyčinky
šířka pm	0,5-0,6
délka pm	1,5-3,0
pohyblivost	+
mrskání	peritrich
Gram-reakce
lyže 3%ním KOH	+
aminopeptidáza (Cemy)	+
spory	-
oxidáza	+
kataláza	+
růst anaerobně	-
ADH (alkoholdehydrogenáza)	+
NO₂zNO₃	+
denitrifikace	+
ureáza	-
hydrolýza
želatiny	-
Tween 80	-
kyselina z (OF-test):
glukózy aerobně	-
xylózy 80	-
zužitkování substrátu
glukózy	-
fruktózy	-
arabinózy	-
citrátu	+
malátu	+
mannitolu

Taxonomický popis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328)

charakteristika:	Gram-pozitivní nepravidelné tyčinky s výrazným růstovým cyklem tyčinky-koky; striktně aerobní; žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukózy
pohyblivost spory kataláza	+

-5CZ 296447 B6 weóO-diaminopimelmová kyselina v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: A3a, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala podobnost sekvence 16S rDNA: sekvencování oblasti s největší variabilitou prokázalo jako nejvyšší hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A. ramosus a A. oxydans

Taxonomický popis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30

buněčná forma	pleomorfní tyčinky
šířka μπι	0,6-1,0
délka pm	1,5-3,0
Gram-rekce	—
lyže 3%ním KOH	+
aminopeptidáza	+
spory	-
oxidáza	+
kataláza	+
pohyblivost	+
růst anaerobně	-
nitrit z nitrátu	-
denitrifikace	-
ureáza	+
hydrolýza želatiny	-
kyselina z:
L-arabinózy	+
galaktózy	-
melezitózy	-
fukózy	+
arabitolu	—
mannitolu	—
erythritolu	-
alkalizace lakmusového mléka:	+
ketolaktóza	—

Parciální sekvencování 16SrDNA prokázalo srovnatelně velké ca 96 % podobnosti k zástupcům rodu Agrobacterium a Rhizobium. Jednoznačné přiřazení k jednomu typu popsanému v rámci těchto rodů není možné.

-6CZ 296447 B6

Taxonomický popis Bacillus simplex K2

buněčná forma šířka pm délka pm	tyčinky 0,8-1,0 3,0-5,0
spory elipsoidní kulaté sporangium	-
kataláza	+
anaerobní růst	-
VP reakce	k.W.
maximální teplota pozitivní růst při °C negativní růst při °C	40 45
růst v médiu pH 5,7 NaCl 2 % 5% 7% 10% médium s lysozymem	+ +

kyselina z (ASS)

D-glukózy L-arabinózy D-xylózy D-mannitu D-fruktózy	+ + + +
plyn z fřuktózy	-
lecithináza	-
hydrolýza škrobu želatina kaseinu Tween 80 eskulinu	+ + +
zužitkování citrátu propionátu	+
nitrit z nitrátu	+
indol	-
fenylalanindesamináza	-
arginindihydroláza	—

-ΊCZ 296447 B6

Analýza buněčných mastných kyselin potvrdila přiřazení krodu Bacillus.

Parciální sekvencování 16SrDNA prokázala 100 % podobnost k Bacillus simplex.

Toxonomický popis Pseudomonas putida K32

buněčná forma	tyčinky
šířka μιη	0,8-0,9
délka μιη	l,5H,0
pohyblivost	+
mrskání	polární^
Gram-reakce
lyze3%nímKOH	+
aminopeptidáza	+
spory	-
oxidáza	+
kataláza	+
růst anaerobně	-
pigmenty fluoreskující	+
pyocyanin	—
ADH	+
nitrát z nitrátu	-
denitrifikace	-
ureáza	-
hydrolýza želatiny	-
zužitkování substrátu
adipát	-
citrát	+
malát	+
D-mandelát	+
fenylacetát	+
D-tartrát	—
D-glukóza	+
trehalóza	—
mannitol	—
benzoylformiát	-
propylenglykol	+
butylamin	+
benzylamin	+
tryptamin	-

acetamid + hippurát +

Profil buněčných mastných kyselin je typický pro Pseudomonas putida.

Parciální sekvencování 16SrDNA prokázala ca 98 % podobnost k Pseudomonas mendocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnost k Pseudomonas putida byla 97,4 %.

Taxonomický popis Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)

1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou matné, světle červenooranžové RAL 2008;

2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelínová;

3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové z Rhodococcus;

Určení délky řetězce kyseliny mykolové (C₃₂-C44) a srovnání údajů se záznamy DSMZ-databanky mykolových kyselin prokázalo jen velmi malou podobnost ke vzorkům kmenů Rhodococcus ruber (podobnost, 0,019). Tento korelační faktor je příliš malý na to, aby mohl být použit pro identifikaci druhu.

Tento vzorek mastných kyselin je diagnostický pro všechny zástupce rodu Rhodococcus a jejich blízké příbuzné jako Mycobakterium, Nocardia a Gordona. Byl učiněn pokus o diferenciaci druhu při zohlednění kvalitativních a kvantitativních rozdílů ve vzorku mastnýchkyselin. Pomocí numerických metod se vzorek mastných kyselin z Rhodococcus sp. FB 387 srovnal se záznamy databanky. Také pomocí této metody se nemohl Rhodococcus sp. FB 387 z důvodu malé podobnosti (0,063) přiřadit k žádnému popsanému druhu Rhodococcus.

6. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byl přiřazeno 96-818 s 97,9% korelací Rhodococcus opacus. Tato shodnost sekvence je hodně pod 99,5 %, jak se požaduje pro jednoznačné přiřazení k druhu v tomto taxonu.

Na základě předložených výsledků je možné vycházet z toho, že se u kmene Rhodococcus sp. FB 387 jedná o nový dosud nepopsaný druh Rhodococcus.

Enzymy podle vynálezu, N-acetylaminoalkoholhydrolázy, které jsou schopné hydrolyzovat deriváty cyklopentenu shora uvedeného vzorce VII, lze například získat v oboru běžným způsobem „otevřením“ buněk mikroorganismů podle vynálezu. Ktomu se může například použít metodu s ultrazvukem nebo Frenschovu tlakovou metodu. Například se tyto enzymy získají z mikroorganismů Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686). Enzymy, které se získají z mikroorganismů podle vynálezu, zejména Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686), mají výhodně následující vlastnosti:

a) pH optimum při pH 7,0 ± 1,0;

b) teplotní optimum mezi 25 a 30 °C při hodnotě pH 7,0; a

c) hodnota K_M pro substrát N-acetyl-l-amino-4—hydroxymethyl-2-cyklopenten 22,5 mM ± 7,5 mM (30 °C, 100 mM fosfátový pufr, pH 7,0).

-9CZ 296447 Β6

Sekvenční analýza enzymu získatelného jako zRhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) poskytla dále:

d) N-koncovou sekvenci aminokyselin Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-ThrGlu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Aer-Asn;

a určení molekulové hmotnosti poskytlo:

e) molekulovou hmotnost 50 kD, určeno pomocí SDS-PAGE.

Enzymy, které se získají z mikroorganismů podle vynálezu, například z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), hydrolyzují například zejména N-acetyl-l-amino—4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-propionyl-1amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, a N-izobutyryl-l-amino-A-hydroxymethyl-2-cyklopenten.

Způsob výroby podle vynálezu (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorců I, II

HO

II a/nebo derivátů (lS,4R)-nebo (lR,4S)-aminoalkoholů obecných vzorců III, IV

HO

NH

IV kde R¹ má uvedený význam, se může například provádět tak, že se v prvním stupni acyluje (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on vzorce V na derivát (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce VI

VI kde R¹ má uvedený význam.

Edukt (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on se může vyrobit podle EP-B 0 508 352.

-10CZ 296447 B6

Acylace se může provádět halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce VIII

O

TI

R¹ - C - XVIII, kde X znamená atom halogenu a kde R¹ má uvedený význam, nebo anhydridem karboxylové kyseliny obecného vzorce IX ⁰°

ITH c cix, / \ / \

R¹ O R¹ kde R¹ má uvedený význam.

Jako atom halogenu se může použít F, Cl, Br nebo I. Výhodně se používá Cl nebo F.

Příklady halogenidů karboxylových kyselin jsou: acetylchlorid, chloracetylchlorid, chlorid kyseliny máselné, chlorid kyseliny izomáselné, chlorid kyseliny fenyloctové, benzylester kyseliny chlormravenčí (Cbz-Cl), chlorid kyseliny propionové, benzoylchlorid, alkylester kyseliny chlormravenčí nebo terc.butyloxykarbonylfluorid. Příklady pro anhydridy karboxylových kyselin jsou: terc.-butoxykarbonylethydrid, anhydrid kyseliny máselné, anhydrid kyseliny octové nebo anhydrid kyseliny propionové.

Acylace se může provádět bez rozpouštědla nebo s aprotickým rozpouštědlem.

Účelně se acylace provádí v aprotickém rozpouštědle. Jako aprotické rozpouštědlo jsou například vhodné pyridin, acetonitril, dimethylformamid, tetrahydrofůran, toluen, methylenchlorid, N-methylpyrrolidon, popřípadě jejích směsí. Výhodně se jako rozpouštědlo používá pyridin nebo acetonitril, zejména směs pyridinu a acetonitrilu.

Účelně se acylace provádí při teplotě od -80 do 50 °C, výhodně od 0 do 25 °C.

Ve druhém stupni se může redukovat derivát (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-onu vzorce VI se derivát cyklopentenu obecného vzorce VII

VII kde R¹ má uvedený význam.

Redukce se účelně provádí borhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo aluminiumhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo vitridem (natrium-bis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid). Jako aluminiumhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumaluminiumhydrid. Jako borhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumborhydrid. Jako borhydrid kovu alkalické zeminy lze použít kalciumborhydrid.

-11 CZ 296447 B6

ÚČelňe se redukce provádí v protickém rozpouštědle. Jako protické rozpouštědlo se mohou použít nízké alifatické alkoholy jako je methanol, ethanol, propanol, izopropanol, butanol, izobutanol, sek. butanol, terč, butanol, nebo voda, popřípadě jejich směsi.

Redukce se účelně provádí při teplotě od -40 do 40 °C, výhodně od 0 do 20 °C.

Přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII na (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-ammo-4(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců I, II

se provádí podle vynálezu buď pomocí mikroorganismů nebo enzymových extraktů z nich, pomocí acyláz penicilinu G nebo pomocí enzymů s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou. Při této biotransformaci vzniká vedle (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4—(hydroxymethyl)2-cyklopenten vzorce I nebo II, který se popřípadě izoluje, derivát (1R,4S)- nebo (1S,4R)aminoalkoholu obecných vzorců III, IV

kde R¹ má uvedený význam. Posledně jmenované sloučeniny se mohou rovněž izolovat.

Principiálně jsou vhodné všechny mikroorganismy, které zužitkují derivát cyklopentenu obecného vzorce VII jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Účelně se biotransformace provádí s mikroorganismy, které zužitkují (lR,4S)-izomer derivát cyklopentenu jako jediný zdroj uhlíku, jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo jako jediný zdroj dusíku.

Výhodně se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů rodu Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Gordona, zejména druhu Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifícans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. (DSM 10687), jakož i s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty. Tyto právě popsané mikroorganismy jsou uloženy podle Budapešťské úmluvy.

Pro postup jsou obzvláště vhodné druhy mikroorganismů Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) a Gordona sp. CG 100 (DSM 10687).

Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování těchto mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.

Enzymy podle vynálezu vhodné pro způsob, N-acetylaminoalkoholhydrolázy, se mohou získat podle předtím popsaných postupů a mají vlastnosti, které již byly popsány.

Vhodné acylázy penicilinu G se získají z mnoha mikroorganismů, například z bakterií nebo aktinomycetenů, zvláště z následujících mikroorganismů: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975,

-12CZ 296447 B6

Streptómyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 a Micrococcus roseus ATCC 416. Zejména se používají obchodně dostupné acylázy penicillinu G jako acyláza EC 3.5.1.1.11 penicilinu G zE. coli (Boehring Mannheim) nebo zBacillus megaterium. Ve výhodném provedení se používají mobilizované acylázy penicilinu G.

Biotransformace se může provádět v médiích známých v oboru, jako například v nízkomolámích fosfátových, citrátových nebo Hepes-pufrech, ve vodě, v úplných médiích jako například „Nutriet Yeast Broth“ (NYB) nebo v médiích popsaných v tabulce 1. Výhodně se biotransformace provádí v médiu uvedeném v tabulce 1 nebo nízkomolámím fosfátovém pufru.

Účelně se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálního přidávání derivátu cyklopentenu (vzorec VII), tak, že koncentrace nepřesáhne 10% hmotn., výhodně 2 % hmotn.

Hodnota pH během biotransformace může být v rozmezí od 5 do 9, výhodně od 6 do 8. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 25 do 30 °C.

Jestliže se při biotransformacipo tvoří (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxy-methyl)-2-cyklopenten, pak se tento může kyselou hydrolýzou, např. kyselinou chlorovodíkovou převést na (1R,4S)-1amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2. l]hept-5-en-3-onu

100 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (800 ml) a pyridinu (161,26 ml). Při 12 °C se přikapalo 104,5 g acetylchloridu po dobu 2 hodin. Směs se ještě míchala 4,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 800 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 3krát extrahoval 400 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly 1N HC1 (400 ml), vodou (400 ml), nasyceným NaCl (400 ml), sušily síranem hořečnatým a zcela odpařily. Ke zbytku se přidal methylenchlorid a to se filtrovala přes křemičitanový gel. Filtrát se zahustil a produkt se čistil destilací. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 71 %.

Kp9.33i p_a: 51 °C ‘H-NMR (CDC1₃): δ [ppm]

400 MHz

2,25 (AB syst., 2H);

2,8 (s, 3H);

3,42 (m, 1H);

5,30 (m, 1H);

6,89 (m, 1H);

6,92 (m, 1H).

Příklad 2

Výroba (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1 ]hept-5-en-3-onu

100,3 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (720 ml) a pyridinu (142 ml). Při 12 °C se přidalo 141,8 g chloridu kyseliny máselné po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 720 ml vody. Acetonitril se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (300 ml).

-13CZ 296447 B6

Spojené organické fáze se ještě promyly IN HC1 (350 ml), nasyceným NaCl (400 ml) a vodou (500 ml), sušily se síranem hořečnatým a úplně odpařily. Produkt se čistil destilací. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 85 %.

KPó,665 Pa· 70 °C *°H-NMR (CDClj): δ [ppm]

400 MHz

0,98 (t, J=8,5 HZ, 3H); 1,58-1,65 (2H);

2,23 (AB syst.; 2H); 2,82-2,90 (2H);

3,42 (m, 1H);

5,30 (m, 1H);

6,62 (m, 1H);

6,92 (m, 1H).

Příklad 3

Výroba (±)-2-fenylacetyl-2-azabicyklo[2.2. l]hept-5-en-3-onu

33,4 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (240 ml) a pyridinu (48,3 ml). Při 12 °C se přikapalo 68,6 g chloridu kyseliny fenyloctové po dobu 30 minut. Směs se ještě míchalo 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 240 ml vody. Acetonitril se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (150 ml). Spojené organické fáze se ještě promyly IN HC1 (150 ml), nasyceným NaCl (150 ml) a vodou (150 ml), sušily se síranem hořečnatým a úplně odpařily. Surový produkt se filtroval přes křemičitanový gel (hexan:ethylacetát=l:l). Získalo se 68,34 g surového produktu jako žlutý olej.

Příklad 4

Výroba (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1 ]hept-5-en-3-onu g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (325 ml) a pyridinu (41 ml). Při 12 °C se přikapalo 43,9 g chloridu kyseliny propionové po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 145 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 3krát extrahoval 115 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IN HC1 (140 ml), nasycenými roztoky NaHCO₃ (40 ml) a NaCl (40 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se čistil destilací. Získalo se 55,8 g titulní sloučeniny, která stáném ztuhla. Výtěžek byl 81,6 %.

K_p 0,28 Pa 75 až 80 °C

t.t..: 54 až 56 °C 'H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm]

400 MHz

0,95 (t, 3H);

2,10 (quad., 1H);

2,28 (quad., 1H);

2,64 (m, 2H);

3,42 (s, 1H);

5,16 (m, 1H);

6,78 (m, 1H);

6,96 (m, 1H);

- 14CZ 296447 B6

Příklad 5

Výroba (±)-2-izobutyryl-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu

45,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (310 ml) a pyridinu (39 ml). Při 10 °C se přikapalo 54,1 g chloridu kyseliny izomáselné po dobu 1 hodinu. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 140 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 4krát extrahoval 120ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyla 120 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly 1H HC1 (50 ml), nasycenými roztoky NaHCO₃ (50 ml) a NaCl (50 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil v n-hexanu (240 ml) s aktivním uhlím za zpětného toku. Po filtraci aktivního uhlí se filtrát ochladil při 0 °C a titulní sloučenina filtrovala. Získalo se 54,5 g produktu. Výtěžek byl 76 %.

t.t.: 41 až 42 °C

Ή-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm]

400 MHz

0,92 (d, 3H);

1,06 (d, 3H);

2,10 (m, 1H);

2,28 (m, 1H);

3,40 (m, 2H);

5,16 (s, 1H);

6,78 (m, 1H);

7,92 (m, 1H).

Příklad 6

Výroba (±)-2-chloracetyl-2-azabicyklo[2.2. l]hept-5-en-3-onu

10,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem a při 10 °C ve směsi dichlormethanu (10 ml), pyridinu (8,4 ml) a 0,22 g N,N-4—dimeethylaminopyridinu. Přikapalo se

13,5 g chloracetylchloridu po dobu 1 hodiny. Teplota stoupla až na 44 °C. Směs se dále míchala 2 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 100 ml vody. Po oddělení fází se vodná fáze extrahovala 100 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil ve 100 ml diizopropyletheru za zpětného toku v přítomnosti 1 g aktivního uhlí po dobu 10 minut. Po horké filtraci se filtrát ochladil na teplotu místnosti, pevná látka se filtrovala a sušila. Získalo se 10, 35 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 60 %.

t.t.: 86 až 88 °C 'H-NMR (CDC1₃): δ [ppm]

400 MHz

2,28 (d, 1H);

2,40 (d, 1H);

3,48 (s, 1H);

4,56 (d, 2H);

5,30 (s, 1H);

6,70 (d, 1H);

6,94 (m, 1H).

Příklad 7

Výroba (±)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl)-2-cyklopentenu

-15 CZ 296447 B6

79,56 g (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem vethanolu (450 ml) a ochladilo se na -10 °C. PO částech se po dobu 45 minut přidávalo 19,8 g natriumborhydridu.

Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upravilo pH na 1,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promylo se methylenchloridem a odpařilo. Surový produkt se ještě čistil filtrací křemičitanovým gelem s rozpouštědlem ethylacetát/methanol 5:1. Filtrát se zahustil. Získalo se 51,83 g produktu jako bílá pevná látka. Výtěžek byl 64 % vztaženo na vnesený 2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on.

t.t.: 91 až 93 °C ’Η-NMR (DMSO-ds): δ [ppm]

400 MHz

1,18 (m, 1H);

1,78 (s, 3H);

2,29 (m, 1H);

2,66 (m, 1H);

3,35 (s, 2H);

4,58 (s, 1H);

4,72 (m, 1H);

5,61 (d, 1H);

5,85 (d, 1H);

7,83 (d, 1H).

Příklad 8

Výroba (±)-N-butyryl-l-amino-4—(hydro xymethyl)-2-cyklopentenu

73,87 g (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem vethanolu (400 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 45 minut přidávalo 15,68 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upravilo pH na 1,5 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promyl se methylenchloridem, odpařil a sušil za vysokého vakua. Získalo se 60,55 g produktu. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2. l]hept-5-en-3-on.

t.t.: 71 až 72 °C ’Η-NMR (CDC1₃): δ [ppm]

400 MHz

0,98 (t, 1=8,5 Hz, 3H);

1,40-1,50 (1H);

1,58-1,68 (2H); 2,10-2,18 (2H); 2,42-2,55 (1H);

2,85 (m, 1H);

3,62 (AB syst., 2H);

4,98 (m, 1H);

5,78-5,82 (2H);

6,38 (m, 1H).

Příklad 9

Výroba (±)-N-fenylacetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu

-16CZ 296447 B6 g surového (±)-2-fenylacetal-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-enu-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (450 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 1 hodiny přidávalo 13,2 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3,5 hodiny při teplotě místnosti a pak se upravilo pH na 3,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Směs se úplně odpařilo. Zbytek se sušil a čistil filtrací s křemičitanovým gelem (hexan:ethylacetát=l : 9). Po překrystalování z ethylacetátu se získalo 54,6 g bílé pevné látky. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-fenylacetyl-2azabicyklo[2.2.1 ]hept-5-en-3-on.

‘H-NMR (CDC1₃): δ [ppm]

400 MHz

1,28-1,35 (1H);

1,40 (m,lH);

2,38-2,45 (1H);

2,79 (m, 1H);

3,50 (AB syst. 2H);

3,52 (s, 3H);

4.98 (m, 1H);

5,75 (m, 2H);

5.98 (m, 1H);

7,20-7,38 (5H)

Příklad 10

Výroba (±)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g surového hydrochloridu (±)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu se rozpustilo pod dusíkem při teplotě místnosti ve směsi 150 ml vody a 150 ml dioxanu. Roztok se upravil 1N NaOH na hodnotu pH 14, pak se přidal roztok terc.butyloxykarbonylfluoridu (BOC-F, 20 % přebytek) v diethyletheru a při teplotě místnosti ještě 3 hodiny dále míchal (BOC-F připravený podle Syntézis 1975,599). Hodnota pH se upravila koncentrovanou HC1 na 2. Po destilaci organických rozpouštědel se ke zbytku přidalo 50 ml vody a směs se 3krát extrahovala 100 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se úplně odpařily. Zbytek se krystalizoval ve směsi 110 ml diizopropyletheru a 80 ml n-hexanu. Získalo se 11,95 g titulní sloučeniny. Výtěžek představoval 56 %.

t.t.: 68 až 70 °C

Ή-NMR (DMSO-dg): δ [ppm]

400 MHz

1,18 (m, 1H);

1,38 (s, 9H);

2,26 (m, 1H);

2,65 (m, 1H);

3,33 (t, 2H);

4,45 (m, 1H);

4,55 (t, 1H);

5,62 (m, 1H);

5,79 (m, 1H);

6,73 (d, 1H).

Příklad 11

Výroba (±)-N-propionyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu

-17CZ 296447 B6

16,6 g (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (140 ml) a 2-butanolu (66 ml) a ochladilo na -5 °C. Po částech se po dobu 2 hodin přidávaly 3 g natriumborhydridu. Smě se ještě míchala 2,5 hodiny při teplotě 10 °C a pak se upravilo pH na

2,2 pomocí směsi koncentrované kyseliny chlorovodíkové a vody (1/1). Roztok se odpařil na 40 g a pH se upravilo na hodnotu 6,2 s 2N NOH. Směs se extrahovala 5krát 50 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se úplně odpařily a zbytek se překrystaloval z toluenu (150 ml). Získalo se 11,1 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 65 %.

t.t.t: 67 až 68 °C

’Η-NMR (DMSO-de): δ [ppm] 400 MHz

0,96 (t, 3H); 1,16 (quint., 1H); 2,04 (quad., 2H); 2,26 (m, 1H); 2,66 (m, 1H); 3,34 (m, 2H); 4,58 (t, 1H); 4.72 (m, 1H); 5,61 (m, 1H); 5,84 (m, 1H); 7.72 (d, 1H).

Příklad 12

Výroba (±)-n-izobutyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl-2-cyklopentenu

9g (±)-2-izobutyryl-3-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (32 ml) a 2-butanolu (84 ml) a ochladilo na 0 °C. Po částech se po dobu 3,5 hodiny přidávalo 1,37 g natriumborhydridu. Směs se dále míchala 3 hodiny při teplotě 20 °C, pak se upravilo pH na 2,5 pomocí směsi koncentrované kyseliny chlorovodíkové a vody (1/1) a pak se neutralizovala 2N NaOH. Směs se odpařilo na 40 g. Zbytek se extrahoval 3krát 80 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se úplně odpařily. Získaná pevná látka krystalizovala v 25ml toluenu. Získalo se 6,8 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 73,6 %.

t.t.: 80 až 81 °C ’Η-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm]

400 MHz

0,98 (d, 6H);

1,16 (quint., 1H);

2,30 (m, 2H);

2.68 (m, 1H);

3,32 (t, 2H);

4,58 (t, 1H);

4,70 (m, 1H);

5,61 (m, 1H);

5,82 (m, 1H);

7.68 (d, 1H).

Příklad 13

Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí acyláz penicilinu G

Pro biotransformaci se použila acyláza EC 3.5.1.11 penicillinu G z E. coli (Boehring Mannheim) 165 U (jednotek)/g nebo acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z Bacillus megaterium. Ktomu se

-18CZ 296447 B6 inkubovalo 50 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 5-9; 4 ml) s 1 % hmotn. neracemického N-fenylacetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a 400 mg odpovídající acylázy penicilinu G při 37 °C.

Po určitých časových intervalech se odebíraly vzorky a analyzovaly pomocí tenkovrstevné chromatografie (křemičitanový gel 60, butanol:voda:ledová kys. octová=3:l:l; detekce ninhydridem), plynové chromatografie (kapilární sloupec, HP-5, 5% fenylmethylsiloxanu) nebo pomocí HPLC. Enzym odštěpil s vysokou aktivitou fenacetylovou skupinu a uvolnil až 40 % odpovídajícího aminoalkoholu. Volný aminoalkohol se získal s ee-hodnotou 80 %.

Příkladu 14

Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí mikroorganismů

14.1 Kal (20 %) z čističky ARA ve Visp se inkuboval v A+N médiu (viz tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % hmotn. Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, při 37 °C za třepání. Tvorba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se sledovala pomocí tenkovrstevné chromatografie.

% těchto obohacených vzorků se l-3x přeočkovalo a jednotlivé naneslo na pevná média (Plate Count Sgar v médiu z tabulky 1; 20 g/1). Tímto způsobem se izolovaly mikroorganismy Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).

14.2 Takto izolované mikroorganismy se pěstovaly v médiu (tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopentenu. Rostly 24 až 36 hodin až k optické hustotě (OD) od 2 do 3. Takto získané buňky se sebraly v pozdně exponenciální růstové fázi a promyly v 10 mM fosfátovém pufru.

Následující biotransformace se provedla v 50 mM fosfátovém pufru (pH 4,5-9), který obsahoval 1 % hmotn. N-acetyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Tenkovrstevnou chromatografií a zjistilo, že 50 % substrátu bylo hydrolyzováno na (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten. HPLC analýzy udaly ee-hodnoty mezi 80 a 93 %.

Jestliže se jako substrát použil N-butyryl-l-amino-4—hydroxymethyl-2-cyklopenten, byla biotransformace 0,14 (g/l/h/OD) pro kmen DSM 10686, když se pěstovalo na A+N médiu a 0,03 (g/l/h/OD), když se pěstovalo na NYB („Nutrient Yaest Broth“) médiu, které obsahovalo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.

Jestliže se provedla stejná přeměna s kmenem DSM 10687 při koncentraci substrátu (N-butyryll-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten) 200 mM, byla biotransformace 0,161 (g/l/h/OD).

Tabulka 1 médium A + N

MgCl₂

CaCl₂

FeCl₃

Na₂SO₄

0,4 g/1

0,014 g/1

KH₂PO₄

Na₂HPO₄

NaCl roztok vitaminů roztok stupňových prvků pH 7,5

0,8 mg/1

0,1 g/1 g/1

2,5 g/1 g/1 lml/1 lml/1

CZ 296447 B6

14.3 Rhodococcus erythropolis DSM 10686 se pěstoval v 61 fermentoru v minimálním médiu (srovnej tabulku 2) s octanem amonným (3 g/1) jako zdroj uhlíku, popřípadě dusíku při 30 °C do buněčné hustoty OD 650>25. Během buněčného růstu se kontinuálně přidávala 50 % kyselina octová jako dodatečný zdroj uhlíku. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo 60 g (+/-)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a dále inkubovalo několik hodin. Nakonec se ještě jednou přidalo 40 g (±)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a pak dalších deset hodin inkubovalo. Průběh biotransformace se sledoval on-line pomocí HPLC. Při dosažení 40% analytického výtěžku, vztaženo na vnesený racemický substrát, a ee-hodnoty 85 % se fermentace ukončila přidáním kyseliny.

Tabulka 2 složení média

Komponenty	Koncentrace
extrakt kvasnic pepton M66 KH₂PO₄ Na₂HPO₄.2H₂O K₂SO₄ NH₄-acetát CaCl₂ MgCl₂.6 H₂O roztok stopových prvků (viz dole) PPG (polypropylenglykol)	0,5 g/1 0,5 g/1 4,0 g/1 0,5 g/1 2,0 g/1 3,0 g/1 0,2 g/1 1,0 g/1 1,5 ml/1 0,1 g/1

Roztok stopových prvků

KOH EDTA.Na₂.2H₂O ZnSO₄.7H₂O MnCl₂.4H₂O H₃BO₃ CoCl₂.6H₂O CuC1₂.2H₂O NiCl₂.6H₂O Na₂MoO₄.2H₂O

15,1 g/1 100,0 g/1 9,0 g/1 4,0 g/1 2.7 g/1 1.8 g/1 1,5 g/1 0,18 g/1 0,27 g/1

14.4 Podobně jako v příkladu 14.3 se pěstovaly mikroorganismy Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 a Pseudomonas putida K32 na octanu sodném v médiu (tabulka 1) se sloučeninami a bez sloučenin Ν-acetyl-, N-propionyl-, N-izobutyryl nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopenten, v dalším zkráceně označené jako aminoalkoholy.

Následující výsledky se dosáhly s exponenciálními buňkami, které se pěstovaly bez aminoalkoholů (analyzováno HPLC):

Kmen	Poměr [mMol/OD.h] Hodnota ee/přeměna [%]
HSZ 5 (DSM 10328) HSZ 17 (DSM 10329) K32 CB101 (DSM 10686)	0,05 88,7/16 0,005 95/23 0,05 54/1 0,1 84/39

Kmeny K2 a K17 se pěstovaly, sebraly a podrobily se 60-hodinové biotransformaci.

Kmen

Poměr [mMol/OD.h]

Hodnota ee/přeměna [%]

K2 HSZ30

92/10

93/3,5

Ze všech násad se sebraly exponenciální a stacionární buňky a použily se pro biotransformaci jako buňky v klidu. Na základě DC-analýzy se nepozoroval žádný rozdíl v počátečním poměru u buněk indukovaných nebo neindukovaných aminoalkoholem.

Příklad 15

Čistění N-acetylaminoalkoholhydrolázy z Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)

Enzym byl čištěn jak je dále uvedeno až byl pozorován už jen jeden proteinový pruh v SDSPAGE (Pharmacia Phast Gel, 10-15 % gradient) při molekulové hmotnosti 50 kD.

Buňky Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) se promyly v 50 mM Tris-pufru (pH 6,2) a koncentrovaly na optickou hustotu 190 při ODgsonm· Po přidání fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) na konečnou koncentraci 1 mM a DNAzy se buňky podrobily Frenchovu lisu (tlakové zařízení), aby se získal surový extrakt. Po odstředění se získalo 200 ml bezbuněčného extraktu s koncentrací proteinů 4,8 mg ml'¹.

960 mg bezbuněčného extraktu se naneslo na iontoměničový chromatografícký sloupec HiLoad 26/10 Q-Sepharose (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem (pH 8,0), který obsahoval 1 mM dithiothreitolu (DTT).

Po promytí sloupce stejným pufrem byly proteiny eluovány lineárním gradientem (1500 ml; gradient: 50 mM Tris-pufr (pH 8,0), obsahující 1 mM DTT- 50mM Tris-pufr (pH 7,0), obsahující 1 mM DTT 1 M NaCl). Enzym se eluoval ze sloupce mezi 370 a 430 mM NaCl a při pH 7,6. Aktivní frakce se sbíraly a zahustily na 9 ml. Obsah proteinů byl 41 mg.

Pro další čištění se roztok proteinů nanesl na gelověfiltrační chromatografícký sloupec HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem, který obsahoval 50 mM NaCl a 1 mM DTT. Aktivní frakce se spojily a měly společný obsah proteinů 10,9 mg.

Tento proteinový roztok se nanesl na sloupec Mono Q HR5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem (pH 8,5) obsahujícím 1 mM DTT. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem (40 ml) 50 mM Tris-pufr (pH 8,5)d, obsahující 1 mM DTT gradientem (40 ml) 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT - 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCl. Enzym se eluoval mezi 390 mM NaCl a 440 mM NaCl. Aktivní frakce obsahovaly 1,4 mg proteinu.

V posledním čisticím kroku se použil stejný sloupec ekvilibrovaný stejným pufrem. Jako eluční gradient sloužil stejný pufr s 0-500 mM NaCl a pH 7,0-8,5. Tímto způsobem se dalo izolovat 430 pg čistého enzymu.

N-koncová sekvence enzymu se určila přímo z „Protein-Blot“. Získala se sekvence 20 následujících aminokyselin: Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-MetAla-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn.

Tato sekvence není homologní ke známým proteinům.

-21 CZ 296447 B6

Příklad 16

Charakterizace enzymu

Charakterizace enzymu se prováděla jak s čištěným enzymem, tak také s bezbuněčným extraktem, který byl odsolen pomocí sloupce Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).

Koncentrace proteinů v bezbuněčném extraktu byla 7,3 mg ml¹ a koncentrace proteinů v čištěném enzymu byla 135 pg ml'¹. PMSF se k bezbuněčnému extraktu nepřidával.

16.1 určení K_m

Určení K_m se provedlo v bezbuněčném extraktu. Hodnota K_m reakce byla při pH 7,0 a při teplotě 30 °C 22,5 mM pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethylcyklopenten.

16.2 pH optimum pH optimum pro hydrolýzu N-acetyl-l-amino—4-hydroxymethy 1-2-cyklopen tenu (25 mM) se určovalo s čištěným enzymem a v bezbuněčném extraktu v rozsahu pH od 6,2 - 9,0 v následujících roztocích pufru.

Tris-pufr 100 mM pH 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 citrát-fosfátový pufr 100 mM pH 7,0; 6,55; 6,2

Aktivita se měřila 24 hodin.

pH optimum reakce bylo mezi pH 7,0 a 7,5 pro produkci 1R,4S a 1S,4R enantiomeru.

U bezbuněčného extraktu bylo pH optimum aktivity při pH 7,0. Selektivita byla však lepší mezi pH6,0apH7,0

Obr. 1 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na hodnotě pH.

16.3 Teplotní optimum pro reakci uvedenou v příkladu 16.2 leželo mezi 25 a 30 °C.

Obr. 2 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na teplotě.

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ ÚDAJE (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: LONZA AG (B) ULICE: Muenchensteinerstrasse 38 (C) MÍSTO: Basel (E) ZEMĚ: Švýcarsko (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO: 4002 (ii) OZNAČENÍ VYNÁLEZU: Způsob výroby aminoalkoholu

-22CZ 296447 B6 (iii) POČET SEKVENCÍ: 1 (iv) POČÍTAČOVĚ ČITELNÉ ZNĚNÍ:

(A) NOSIČ DAT: Floppy disk (B) POČÍTAČ: PC IBM kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, verze #1.30 (EPA) (2) ÚDAJE K SEQ ID NO: 1:

(i) VÝZNAM SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (C) TVAR PROVAZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKY: NE (iv) ANTISENSE:

(v) DRUH FRAGMENTU: N-konec (ví) PŮVOD:

(B) KMEN: Rhodococcus erythropolis (C) 1NDIVIDUUM/IZOLÁT: Rhodococcus erythropolis CB101 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: 1:

Thr Glu Gin Asn Leu His Trp Leu Ser Ala Thr Glu Met Ala Ala Ser

10 15

Val Ala Ser Asn

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mikroorganismy, které jsou schopné zužitkovat deriváty cyklopentenu, zvolené ze sloučenin obecného vzorce VII kde R^l znamená Ci_4-alkyl, C^-alkoxy, aryl nebo aryloxy, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, přičemž jsou mikroorganismy vybrané z druhů Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. Denitrifícans HSZ 17 (DSM 10329), nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
2. Enzym nebo enzymový extrakt s aktivitou N-acetylaminoalkoholhydrolázy, který se získá z mikroorganismů schopných zužitkovat alespoň jeden derivát cyklopentenu vybraného ze sloučeniny obecného vzorce ΥΠ kde R¹ znamená Ci-4-alkyl, Ci_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, přičemž je enzym nebo enzymový extrakt schopný hydrolyzovat sloučeninu vzorce VII a enzym má

a) N-koncovou sekvenci aminokyselin Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-ThrGlu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn; a

b) molekulovou hmotnost 50 kD, určeno pomocí SDS-PAGE.
3. Enzym podle nároku 2, přičemž má

c) pH optimum při pH 7,0 ± 1,0;

d) teplotní optimum mezi 25 a 30 °C při hodnotě pH 7,0; a

e) hodnotu K_M pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten 22,5 mM ± 7,5 mM; 30 °C, 100 mM fosfátový pufr.
4. Enzym nebo enzymový extrakt podle nároku 2 nebo 3, který se získá z mikroorganismů zvolených z rodu Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella.

-24CZ 296447 B6
5. Enzym nebo enzymový extrakt podle jednoho z nároků 2 až 4, kteiý se získá z mikroorganismů vybraných z druhů Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i jejich funkčně ekvivalentních variant a mutantů.
6. Způsob výroby (1R,4S)- a/nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorců I a II

HO nh₂ © /^h“..

110 ^z (Π) a/nebo derivátů (1S,4R)- a/nebo (lR,4S)-aminoalkoholů obecných vzorců III a IV

HO^Z

Nil R¹Ύ

O kde R¹ znamená C^-alkyl, Ci_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy, vyznačující se přeměňuje derivát cyklopentenu obecného vzorce VII tím, že se ho/”

VII) kde R¹ má výše uvedený význam, pomocí mikroorganismu podle nároku 1 a/nebo enzymu nebo enzymového extraktu podle nároku 2, a/nebo acylázy penicilinu G na sloučeniny vzorce I a/nebo Π, jakož i se popřípadě izolují tyto sloučeniny a/nebo při této přeměně vzniklé deriváty aminoalkoholů vzorců III a/nebo IV.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že derivát cyklopentenu obecného vzorce VH kde R¹ má uvedený význam, se vyrobí tak, že se v prvním stupni acyluje (±)-2-azabicyklo- (V)

-25CZ 296447 B6 na derivát (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce VI

O (VI) kde R¹ má výše uvedený význam, a tato sloučenina se ve druhém stupni redukuje na derivát cyklopentenu obecného vzorce VII.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se acylace v prvním stupni provádí s homologenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce Vin

R¹ - C - X (VIII) kde R¹ má výše uvedený význam a X znamená atom halogenu, nebo s anhydridem karboxylové kyseliny obecného vzorce IX

IT ti (ix)

R¹ O R¹ kde R¹ má význam uvedený.
9. Způsob podle jednoho z nároku 7 nebo 8, v y z n a č u j í c í se tím, že se acylace v prvním stupni provádí v aprotickém rozpouštědle.
10. Způsob podle jednoho z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že se redukce ve druhém stupni provádí borhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy, aluminiumhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy a/nebo vitridem.
11. Způsob podle jednoho z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že se redukce ve druhém stupni provádí v protickém rozpouštědle.
12. Způsob podle jednoho z nároků 6ažll,vyznačující setím, že se přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII uskutečňuje pomocí mikroorganismů rodu Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella.
13. Způsob podle jednoho z nároků 6ažl 2, vyznačující se tím, že se přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce VII uskutečňuje pomocí acylázy penicilinu G z mikroorganismů druhu Bacillus megaterium nebo Escherichia coli.
14. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 6až 13, vyznačující se tím, že se přeměna ve třetím stupni provádí při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH od 5 do 9.