CZ297524B6

CZ297524B6 - Sůl bis-indolylmaleimidu, farmaceutický prostředek s jejím obsahem a způsob její přípravy

Info

Publication number: CZ297524B6
Application number: CZ0150298A
Authority: CZ
Inventors: Lowell Engel@Gary; Alphonse Farid@Nagy; Mary Faul@Margaret; Robert Jirousek@Michael; Ann Richardson@Lori; Larry Winneroski@Leonard
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1996-11-18
Publication date: 2007-01-03
Also published as: EP0776895A1; ATE172199T1; CA2237221A1; PE22798A1; DK0776895T3; TR199800759T2; WO1997018809A1; AR004336A1; MX9803792A; US6117861A; PL184715B1; AU1054897A; HU226821B1; US5710145A; JPH11500149A; CA2237221C; KR100304210B1; NO982182L; CY2103B1; NO982182D0

Abstract

Bis-indolylmaleimidová sůl vzorce Ia a její solváty, způsob její přípravy reakcí volného bis-indolylmaleinimidového makrocyklického derivátu s kyselinou methansulfonovou a farmaceuticképřípravky s obsahem této soli, které jsou vhodné pro inhibici proteinkinázy C u savců.

Description

Sůl bis-indolylmaleimidu, farmaceutický prostředek s jejím obsahem a způsob její přípravy (57) Anotace:

Bis-indolylmaleimidová sůl vzorce Ia a její solváty, způsob její přípravy reakcí volného bis-indolylmaleinimidového makrocyklického derivátu s kyselinou methansulfonovou a farmaceutické přípravky s obsahem této soli, které jsou vhodné pro inhibici proteinkinázy C u savců.

N(CH₃)₂ . CH3SO3H

Sůl bis-indolylmaleimidu, farmaceutický prostředek s jejím obsahem a způsob její přípravy

Oblast techniky

Tento vynález se týká nové soli dále vymezené sloučeniny a jejího solvátu. Vynález se dále týká způsobu její přípravy a farmaceutických přípravků s obsahem této soli, které jsou vhodné pro inhibici proteinkinázy C u savců, zvláště léčení mikrovaskulámích komplikací diabetů.

Dosavadní stav techniky

Proteinkináza C (PKC) zahrnuje skupinu blízce příbuzných enzymů, které působí jako serin/threonin-kinázy. Proteinkináza C má důležitou úlohu při signalizaci buňka-buňka, genové expresi a v řízení diferenciace buněk a buněčného růstu. V současné době je známo nejméně deset isozymů PKC, které se liší distribucí v tkáních, enzymatickou specifičností a regulační funkcí, viz Noshizuka Y., Annu. Rev. Biochem., 58, 31^14 (1989) a Nishizuka Y., Science, 258, 607614(1992).

Isozymy proteinkinázy C tvoří jednoduché polypeptidové řetězce obsahující ve své délce od 592 do 737 aminokyselin. Tyto isozymy obsahují regulační doménu a katalytickou doménu, které jsou spojeny spojovacím peptidem. Regulační a katalytické domény lze dále členit podle konstantních a variabilních oblastí. Katalytická doména proteinkinázy C je velmi podobná těmto doménám u jiných proteinkináz, zatímco regulační doména je pro PKC isozymy jedinečná. Tyto PKC isozymy vykazují 40 až 80% homoiogii v hodnotách aminokyselin v rámci skupiny. Nicméně homologie jednoho isozymu mezi různými druhy je obecné větší než 97 %.

Proteinkináza C je s membránou-spojený enzym, který je alostericky regulován mnoha faktory, které zahrnují membránové fosfolipidy, vápník a určité membránové lipidy jako jsou diacylglyceroly, které se uvolňují v odezvě na aktivitu fosfolipas, viz Bell R.M. a Bums D.J. J. Biol. Chem., 266, 4661—4664 (1991); Nishizuka Y., Science, 258, 607-614 (1992). Isozymy proteinkinázy C, alfa-, beta-Ι-, beta-2- a gama-isozym vyžadují pro plnou aktivaci membránový fosfolipid, vápník a diacylglycerolové/forbolové estery. Delta-, epsilon-, eta- a etheta-formy PKC jsou při své aktivaci nezávislé na vápníku. Zeta- a lambda-forma PKC jsou nezávislé jak na vápníku, tak na diacylglycerolu a předpokládá se, že pro jejich aktivaci je nutný pouze membránový fosfolipid.

V daném chorobném stavu může být zahrnut pouze jeden nebo dva isozymy proteinkinázy C. Například zvýšené hladiny krevní glukosy zjišťované u diabetiků vedou k isozym-specifickému zvýšení beta-2-isozymu ve vaskulámích tkáních, viz Inoguchi a sp., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 11059-11065 (1992). S diabetem spojené zvýšení beta-isozymu v lidských krevních destičkách je spojováno s jejich změněnou odezvou k agonistům, viz Bastyr III, E.J. a Lu J., Diabetes 42, (Suppl. 1) 97A (1993). Také se prokázalo, že lidský receptor vitaminu D je selektivně fosforylován beta-proteinkinázou C. Tato fosforylace je spojována se změněnými funkcemi tohoto receptoru, viz Hsieh a sp., Proč. Nati. Adad. Sci. USA, 88, 9315-9319 (1991); Hsieh a sp., J. Biol. Chem., 268, 15118-15126 (1993). Kromě toho bylo podle současných prací prokázáno, že beta-2-isozym odpovídá za proliferaci erythroleukemických buněk, zatímco alfa-isozym je zahrnut v megakaryocytní diferenciaci uvedených stejných buněk, viz Murray a sp., J, Biol. Chem., 268, 15847-15853 (1993).

Všudy přítomná poloha isozymů proteinkinázy C a jejich významná úloha ve íyziologii poskytuje důvody k přípravě vysoce selektivních inhibitorů PKC. Podaný důkaz představující spojení určitých isozymů s chorobnými stavy je přiměřený k předpokladu, že sloučeniny s inhibičními účinky selektivními k jednomu nebo dvěma isozymům proteinkinázy C vzhledem k ostatním

- 1 CZ 297524 B6 isozymům PKC a dalším proteinkinázam budou výhodnými terapeutickými prostředky. Takové sloučeniny vykazují větší účinnost a nižší toxicitu díky jejich specifičnosti.

Skupina N,N'-přemostěných bisindolylmaleinimidů byla zveřejněna v práci autorů Haeth a sp.,

EP 0 657 458 (U.S.S.N. 08/413,735) publikované 14. června 1995 jako EP 0 657 458. Výhodné sloučeniny v této skupině N,N'-přemostěných sloučenin zahrnují sloučeninu vzorce I:

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je sůl vzorce Ia

(Ia)

Výhodným provedením tohoto vynálezu je sůl vzorce Ia

. CH3SO3H (Ia) a její sol vaty.

- 2 CZ 297524 B6

Obzvláště výhodným provedením tohoto vynálezu je některá ze svrchu uvedených solí, která je v podstatě krystalická. Účelně jde o sůl, kterouje (S)—13-[(dimethylamino)methyl]-l 0,11,14,15— tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l ,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dion-methansulfonat-monohydrat.

Předmětem tohoto vynálezu je také některá methansulfonátová sůl bis-indolylmaleimidu uvedená svrchu pro použití jako léčivo, zvláště pro léčbu mikrovaskulámích komplikací diabetů.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje některou z výše uvedených solí společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými ředidly, přísadami nebo nosiči.

Předmětem tohoto vynálezu je též způsob přípravy některé ze svrchu uvedených solí, jehož podstata spočívá v tom, že reaguje sloučenina vzorce I

s kyselinou methansulfonovou v nereaktivním organickém rozpouštědle.

Při výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu je rozpouštědlem vodný aceton, účelně rozpouštědlem je aceton s vodou v objemovém poměru od 5:1 do 10:1, zvláště výhodně rozpouštědlem je aceton s vodou v objemovém poměru 9:1.

Dále se uvádějí podrobnější údaje související s předmětným vynálezem.

Vynález poskytuje novou účelnou solnou formu sloučeniny vzorce I. Nanejvýš nečekaně bylo zjištěno, že tato solná forma má zlepšenou rozpustnost a pro pacienta výrazně zlepšenou biologickou dostupnost. Dále, tuto solnou formu lze snadno připravit a přečistit v krystalické formě. Tato sůl podle vynálezu je tedy farmaceuticky vhodnější a představuje zlepšený terapeutický prostředek. Tato sůl podle vynálezu je vhodná k léčení stavů spojených s diabetes mellitus a jeho komplikacemi, ischemií, zánětem, chorobami centrálního nervového systému, kardiovaskulární choroby, dermatologického onemocnění a rakoviny.

Vynález poskytuje mesylatovou sůl sloučeniny vzorce I, kterouje sloučenina svrchu uvedeného vzorce Ia a její solvaty.

Předmětný vynález umožňuje způsob inhibice proteinkinázy C, který zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny vzorce Ia savci potřebujícímu tuto léčbu. Způsob je vhodný pro léčení stavů, u kterých bylo prokázáno, že proteinkináza C se zúčastňuje v patologických procesech, jako je ischemie, zánět, choroby centrálního nervového systému, kardiovaskulární choroba, dermatologické onemocnění a rakovina a zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny vzorce Ia savci potřebujícímu tuto léčbu.

- 3 CZ 297524 B6

Předmětný vynález skýtá farmaceutický přípravek, kterým je léčivo, a zvláště léčivo pro léčení mikrovaskulámích diabetických komplikací, zejména diabetické retinopatie, nefropatie a neuropatie. Předmět vynálezu proto umožňuje způsob léčení diabetes mellitus a jeho komplikací, který zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny vzorce Ia savci potřebujícímu tuto léčbu.

Konečným aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické přípravky obsahující sloučeninu vzorce Ia společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými přísadami, nosiči nebo ředidly.

Pro účely vynálezu jsou jak v popisu, tak v patentových nárocích uvedeny následující výrazy a zkratky, které jsou definovány následujícím způsobem:

Výraz „farmaceutický přípravek“, použitý v tomto textu, je ekvivalentní s výrazem „farmaceutický prostředek“.

Výraz „farmaceuticky účinné množství“, použitý v tomto textu, znamená množství sloučeniny, které je schopné inhibovat účinnost PKC u savců. Konkrétní dávka sloučeniny podávané podle vynálezu bude samozřejmě dána stanovenými skutečnostmi vztaženými k danému případu, zahrnujícími sloučeninu která bude podávána, způsob podání, zvláštní stav, který bude léčen a další podobné okolnosti. Uvedená sloučenina může být podávána různými způsoby, zahrnujícími orální rektální, transdermální, subkutánní, topické, intravenosní, intramuskulámí nebo intranasální podání. Výhodně je tato sloučenina podávána orálně. Pro všechny indikace obvyklá denní dávka obsahuje od asi 0,01 mg/kg do asi 20 mg/kg účinné sloučeniny podle vynálezu. Výhodně denní dávka je asi 0,01 až asi 10 mg/kg, ještě výhodněji pod 1 mg/kg a nejvýhodněji asi 0,05 až asi 0,5 mg/kg.

Výraz „léčení“, použitý v tomto textu, se vztahuje k péči a dohledu na pacienta s cílem zvládnutí choroby, stavu nebo poruchy a zahrnuje podání sloučeniny podle vynálezu k zabránění nástupu symptomů nebo komplikací, mírnění symptomů nebo komplikací nebo eliminaci choroby, stavu nebo poruchy.

Výraz „celkové příbuzné sloučeniny“, použitý v tomto textu, se týká relativních množství nečistot v konečném produktu. Nečistoty zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na ně, reakční meziprodukty nebo nežádoucí vedlejší reakční produkty, které přecházejí do konečného produktu. Celkové příbuzné sloučeniny se stanoví zkouškou na čistotu.

Jak je uvedeno výše, vynález poskytuje sloučeniny vzorce Ia, které selektivně inhibují proteinkinázu C:

(Ia) a jejich solvaty.

- 4 CZ 297524 B6

Sloučenina vzorce Ia může existovat ve formě solvatů, jako je solvat s vodou (hydrát), methanolem, ethanolem, dimethylformamidem, ethylacetatem a podobně. Také je možné připravit směsi takových hydrátů a solvátů. Zdrojem těchto hydrátů a/nebo solvatů mohou být rozpouštědla 5 použitá pro krystalizaci, která mohou být stejná jako rozpouštědlo použité pro přípravu nebo rozpouštědlo dodatečně přidané. Takovéto hydráty a solváty jsou v rozsahu přítomného vynálezu. Výhodně se sloučeniny vzorce Ia připraví jako monohydrat nebo trihydrat.

Je známo, že mohou existovat různé stereoisomemí formy sloučenin vzorce Ia. Výhodné slouče10 niny podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce Ib a Ic:

(Ic)

CH3SO3H

Nicméně součástí vynálezu jsou i racematy a jednotlivé enantiomery a jejich směsi.

Příprava volné baze sloučeniny vzorce I je popsána v práci Heath a sp., EP 0 657 458, publikované 14. července 1995 jako EP 0 657 458, která je včleněna do tohoto textu odkazem. Výhodně se tato sloučenina připraví podle dále uvedeného schématu:

ch₃

(lil

- 5 CZ 297524 B6

R, znamená OMesyl nebo Br,

Pi znamená chránící skupinu hydroxyskupiny, výhodně terc.butyldifenylsilyloxyskupinu (TBDPS), terc.butyldimethylsilyloxyskupinu (TBDMS), trifenylmethylskupinu (trityl), mono- nebo di-methoxytritylskupinu, nebo alky- nebo arylester,

L znamená dobře odštěpitelnou skupinu jako je chlor, brom, jod, mesyl, tosyl a podobně. Výhodně L znamená 0-mesyl nebo Br.

Reakce vedoucí k tvorbě sloučeniny obecného vzorce IV se provede kterýmkoli ze známých způsobů přípravy N-substituovaných iondolů. Reakce se obvykle provede s přibližně ekvimolárními množstvími sloučenin obecného vzorce II a III účastnících se reakce, ačkoliv i jiné poměry, zejména ty, kde alkylační složka je v přebytku, jsou v této reakci možné. Reakce se nejlépe provede v polárním aprotickém rozpouštědle za použití soli alkalického kovu nebo za jiných podmínek alkylace, které jsou v oboru známé. Reakční podmínky zahrnují: hexamethyldisilazid draselný v dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu nebo hydrid sodný v dimethylformamidu. Výhodně se reakce provede za pomalého protiproudého přídavku do uhličitanu česného v buď acetonitrilu, nebo v dimethylformamidu (DMF). Teplota při reakci je výhodně v rozmezí od asi teploty místnosti do asi teploty zpětného toku reakční směsi.

Sloučenina obecného vzorce IV se převede na sloučeninu vzorce V způsobu známými v oboru pro odstranění chránící skupiny z hydroxyskupiny. Sloučenina vzorce V se výhodně převede na sloučeninu obecného vzorce VI reakcí sloučeniny vzorce V s anhydridem kyseliny methansulfonové a pyridinem v THF nebo methylenchloridu v atmosféře dusíku, nebo reakcí tohoto alkoholu s bromem za přítomnosti trifenylfosfínu nebo trifenylfosfítu a pyridinu v methylenchloridu, THF nebo acetonitrilu nebo v jiném vhodném rozpouštědle. Sloučenina obecného vzorce IV se převede na dimethylaminovou formu, sloučeninu I, reakcí sloučeniny obecného vzorce VI s dimethyl

- 6 CZ 297524 B6 aminem v polárním rozpouštědle jako vDMF, THF/voda, dimethylacetamidu nebo za jiných podmínek známých v oboru.

Mesylatová sůl podle vynálezu se připraví reakcí sloučeniny obecného vzorce I s kyselinou methansulfonovou v nereaktivním organickém rozpouštědle, výhodně ve směsi organického rozpouštědla a vody a nej výhodněji ve vodném acetonu. Reakci je možné provést i v jiných rozpouštědlech jako je methanol, aceton, ethylacetat a jejich směsi. Poměr rozpouštědla k vodě není kritický a obecně je určen rozpustností reagujících sloučenin. Výhodné poměry rozpouštědla k vodě jsou obecně v rozmezích od 0,1 : 1 až 100 : 1 v objemech rozpouštědla k objemu vody. Výhodně je tento poměr 1 : 1 až 20 : 1 a nej výhodněji 5 : 1 až 10 : 1. Optimální poměr je závislý na zvoleném rozpouštědle, kterým je výhodně aceton v poměru 9 : 1 vzhledem k vodě. Reakce se obvykle provede s přibližně ekvimolámími množstvími obou reagujících složek ačkoliv proveditelné je i provedení s jinými poměry, zejména s těmi, kde kyselina methansulfonová je v přebytku. Rychlost přídavku kyseliny methansulfonové není pro reakci kritický parametr a přídavek může být proveden rychle (<5 minut) nebo pomalu během 6 nebo více hodin. Reakce se provede při teplotách v rozmezí od 0 °C do teploty zpětného toku. Reakční směs se míchá až do dokončení tvorby soli, jak se stanoví práškovou rentgenovou difrakční analýzou a může to trvat od 5 minut do 12 hodin. Soli podle vynálezu se výhodně a snadno převede na monohydrat sušením nebo vystavením prostředí o 20 až 60% relativní vlhkosti. Tato v podstatě krystalická sůl vykazuje definované hodnoty teploty tání, dvoj lomu a rentgenogramů. Obecně mají tyto krystaly méně než 10 % amorfní formy pevné složky, a výhodně méně než 5 % a nej výhodněji méně než 1 % amorfní pevné složky.

Tato mesylatová sůl se izoluje filtrací nebo jinými separačními způsoby známými v oboru, přímo z reakční směsi ve výtěžcích v rozmezí od 50 do 100 %. Je-li to žádoucí, lze k dalšímu přečištění soli použít rekiystalizaci nebo další způsoby k tomuto účelu používané v oboru.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady a přípravy jsou uvedeny pouze pro další objasnění vynálezu. Rozsah vynálezu není nijak omezen následujícími příklady. V následujících příkladech a přípravách jsou pro teplotu tání, spektrum nukleární magnetické rezonance, hmotnostní spektrum, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na silikagelu, paladium na dřevěné uhlí, N,N-dimethylformamid, tetrahydrofuran a ethylacetat používaný v příslušném pořadí následující zkratky: t.t., NMR, MS, HPLC, DMF, Pd/C, THF a EtOAc. Výrazy „NMR“ a „MS“ znamenají, že spektrum odpovídá požadované struktuře.

Příprava 1

3—(2-[(Methylsulfonyl)oxy]ethoxy]~4-(trifenylmcthoxy)—l-butanol-methansulfonat

V 500 ml CH2CI2 se v atmosféře N₂ rozpustí tritylchlorid (175,2 g, 0,616 mol). Přidá se triethylamin (71,9 g, 100 ml, 0,710 mol) a pak R,S-glycidol (50,0 g, 0,648 mol) a reakční směs se zahřívá za mírného refluxování (42 °C) 4 hodiny. Pak se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a extrahuje se dvakrát 250 ml vodného nasyceného roztoku chloridu amonného a potom 250 ml solného roztoku. Vodné vrstvy se reextrahují 100 ml CH₂C1₂, organická vrstva se vysuší (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá trityl—glycidol ve formě oleje, ze kterého se rekrystalizací z ethanolu získá 104,4 g (54 %) trity 1—glycidolu ve formě pevné látky.

1M roztok vinylmagnesiumbromidu v THF (50 ml, 50 mmol, 2,0 ekv.) se v atmosféře N₂ ochladí na -20 °C a přidá se kněmu katalytické množství jodidu mědi (0,24 g, 1,26 mmol, 0,05 ekv.). Vzniklá směs se míchá při -20 °C přidá trityl—glycidol (7,91 g, 25,0 mmol) v 40 ml suchého THF. Tato reakční směs se míchá 3 minuty při -20 °C, pak se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se ještě 15 minut. Reakce se pak rychle přeruší ochlazením reakční směsi na -30 °C a pomalým přídavkem 125 ml vodného nasyceného roztoku chloridu amonného. Získaná směs se

- 7 CZ 297524 B6 extrahuje 200 ml ethylacetatu. Organická vrstva se extrahuje vodným roztokem 0,93 g (2,50 mmol, 0,1 ekv.) dihyratu dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) ve 125 ml deionizované vody pro odstranění kovů. Vodné vrstvy se pak reextrahují 50 ml ethylacetatu, spojené organické vrstvy se promyjí 100 ml solného roztoku, vysuší se (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá olej, který se zfiltruje přes oxid křemičitý (76 g) s použitím 1,2 1 hexanů/ethylacetatu 3/1. Filtrát se odpaří ve vakuu a získá se 9,7 g l-O-(trifenylmethyl)-2hydroxypentanolu ve formě světle žlutě zbarveného oleje (100 %).

Při teplotě místnosti se přidá 60% suspenze hydridu sodného v minerálním olej (6,13 g, 0,153 mol, 1,5 ekv.) suspendovaná v 175 ml suchého THF. Vzniklá směs se míchá 1,5 hodiny při teplotě místnosti a pak se přidá injekční stříkačkou 17,7 ml (0,204 mmol, 2 ekv.) čerstvě předestilovaného allylbromidu. Reakční směs se zahřívá 1 hodinu při 45 °C. Průběh reakce lze sledovat TLC nebo HPLC. Pak se reakční směs ochladí na 0 °C a pomalu se přidá 400 ml vodného nasyceného roztoku chloridu amonného k odstranění přebytku báze. Získaná směs se extrahuje 800 ml ethylacetatu a organická vrstva se promyje 500 ml vody. Vodné vrstvy se reextrahují 100 ml ethylacetatu a spojené organické vrstvy se promyjí 200 ml solného roztoku, vysuší se (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 41,5 g (>100%) l,l',l-[[[2-(2-propenyloxy)-4-pentenyl]oxy]methylidin]tris[benzenu] ve formě žlutého oleje.

l,l',l-[[[2-(2-Propenyloxy)-4-pentenyl]oxy]methylidin]tris[benzen] (39,3 g, 0,102 mol) se rozpustí v roztoku 390 ml bezvodého methylalkoholu a 60 ml CH₂C1₂ a ochladí se na -50 až -40 °C za probublávání viskozní reakční směsi dusíkem. Pak se reakční směsí při -50 až -40 °C probublává 80 minut ozon, dokud se reakční směs nezbarví do světlemodra. Výsledná reakční směs se nechá ohřát v atmosféře dusíku na 0 °C a pomalu se k přerušení reakce přidá roztok borhydridu sodného (23,15 g, 0,612 mol, 6 ekv.) v 85 ml ethanolu/85 ml vody, přičemž se teplota udržuje pod 10 °C. Pak se reakční směs míchá 30 minut v ledové lázni, dále se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se přes noc. Teplota se pak zvýší zahřátím na 31 °C. Reakční směs se zředí 400 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a extrahuje se 800 ml ethylacetatu. Organická vrstva se promyje 400 ml vody a vodné vrstvy se reextrahují 150 ml ethylacetatu. Spojené organické vrstvy se promyjí 200 ml solného roztoku, vysuší se (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá kalný olej. Rekrystalizací tohoto oleje z hexanů/ethylacetatu 2/1 se ve třech podílech získá 28,9 g 3-(2-hydroxyethoxy)-4-(trifenylmethoxy)-l-butanolu (72 %).

Příprava 2 (S)—Trityl—glycidol

V 7 1 CH₂C1₂ se v atmosféře dusíku rozpustí tritylchlorid (2866 g, 10,3 mol). Přidá se triethylamin (1189 g, 1638 ml, 11,8 mol) a pak (R)-(+)-glycidol (795,0 g, 10,6 mol) za použití 1 1 CH₂C1₂ k promytí. Tento reakční roztok se zahřívá za mírného refluxování (42 °C) 3 až 4 hodiny. Pak se reakční směs ochladí na teplotu místnosti a přidají se 3 1 solného roztoku. Organická vrstva se vysuší (600 g Na₂SO₄) a odpařením ve vakuu se získá titulní sloučenina ve formě oleje, ze kterého se rekrystalizací zethanolu získá 2354 g (70%) titulní sloučeniny ve formě pevné látky.

Příprava 3 (S)-3-[2-[(Methylsulfonyl)oxy]ethoxy]-4-(trifenylmethoxy)-l-butanol-methansulfonat

1M roztok vinylmagnesiumbrimidu (5,761, 5,76 mol, 1,96 ekv.) v THF se v atmosféře dusíku ochladí na -20 °C a přidá katalytické množství jodidu mědi (28,2 g, 0,148 mol, 0,05 ekv). Získaná směs se míchá při -20 °C 5 minut a pak se po kapkách, během 1,5 hodiny při -20 °C přidá roztok (S)-trity-glycidolu (929,0 g, 2,94 mol) v 3,2 1 suchého THF. Reakční směs se pak míchá 1 hodinu při -20 °C. Pak se reakce ukončí ochlazením reakční směsi na-30 °C a pomalým přidáním 5 1 nasyceného roztoku chloridu amonného. Organická vrstva se pak dvakrát extrahuje 1 1 10% hmotn./obj. roztoku dihydratu dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) k odstranění přítomných kovů. Organická vrstva se promyje 2 1 solného roztoku, vysuší se

- 8 CZ 297524 B6 (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 1061 g (96%) (S)-l-O-trifenylmethyl-4-hydroxypentanolu ve formě oleje.

60% suspenze hydridu sodného v minerálním oleji (268,9 g, 6,72 mol, 1,5 ekv.) se suspenduje v atmosféře dusíku v 2,8 1 THF a při teplotě místnosti se přidá roztok (S)-l-O-trifenyl-methyl4-hydroxypentanolu (1543 g, 4,48 mol) v 5,6 1 suchého THF. Získaná reakční směs se míchá 1,5 hodiny při teplotě místnosti a pak se přidá během 20 minut 770 ml (8,89 mol, 2 ekv.) čerstvě předestilovaného allylbromidu. Reakční směs zahřívá 1 až 2 hodiny při 45 °C. Pak se reakční směs ochladí na 15 až 20 °C a pomalu se přidají 2 1 nasyceného vodného roztoku chloridu amonného k odstranění přebytku báze. Výsledná směs se zředí 1 1 ethylacetatu a 1 1 vody a oddělí se organická vrstva. Vodná vrstva se reextrahuje 500 1 ethylacetatu, spojené organické vrstvy se vysuší (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 1867 g (98%) (S)-l,l',l-[[[2-(2-propenyloxy)-4-pentenyl]oxy]methylidin]tris[benzenu] ve formě žlutého oleje.

(Sj-1,1',1 l'-[[[2-(2-Propenyloxy)-4-pentenyl]oxy]methylidin]tris[benzen] (1281 g, 3,33 mol) se rozpustí v roztoku 4 1 bezvodého methanolu a 3,6 1 CH2CI2 a ochladí se na -50 až -40 °C přičemž viskozní roztok se probublává dusíkem. K reakční směsi se přidá indikátor, sudan III, a reakční směs se probublává při -50 až -40 °C ozon po dobu 13 hodin, dokud se barva roztoku nezmění z tmavorůžové na světle zelenou/žlutou. Získaná reakční směs se nechá ohřát na 0 °C v atmosféře dusíku a pak se pomalu přidá během 40 minut roztok borhydridu sodného (754 g,

19,9 mol, 6 ekv.) v 2,5 1 ethanolu/2,5 1 vody, přičemž teplota reakční směsi se udržuje pod 30 °C. Pak se reakční směs míchá přes noc při teplotě místnosti. Průběh reakce se sleduje HPLC. Reakční směs se pak ochladí na 10 až 15 °C a pomalu se přidá ke 4 1 nasyceného vodného roztoku chloridu amonného při <20 °C. Takto zalitá reakční směs se pak zfiltruje a pevné látky se pak promyje 3 1 CH2CI2. Organická vrstva se oddělí a promyje se 3 1 nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a vodné vrstvy se reextrahují 1 1 ΟΗ₂Ο1₂. Spojené organické vrstvy se vysuší (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 1361 g (>100%) (S)-3-(2-hydroxyethoxy)-4(trifenylmethoxy)-l-butanolu ve formě oleje.

(S)-3-(2-Hydroxyethoxy)-4-(trifenylmethoxy)-l-butanol (500 g, 1,27 mol) se rozpustí v 4,8 1 CH₂C1₂, ochladí se v atmosféře N₂ na 0 °C a přidá se triethylamin (386,4 g, 532 ml 3,81 mol, 3,0 ekv.). Pak se po kapkách během 30 minut při <5 °C přidá methansulfonylchlorid (396,3 g, 268 ml, 3,46 mol, 2,7 ekv.). Výsledná reakční směs se míchá při 0 až 5 °C 1 až 2 hodiny a průběh reakce se sleduje HPEC. Pak se reakční směs zředí dalším CH₂C1, promyje se dvakrát 2 1 vody a 2 1 nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Vodné vrstvy se reextrahují 1 1 CH2CI2 a spojené organické vrstvy se vysuší (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá surová pevná látka, ze které se rekrystalizací z heptanu/ethylacetatu 1/1 získá 615 g (88%) (S)-3-[2-[(methylsulfonyl)oxy]ethoxy]-4-(trifenylmethoxy)-l-butanol-methasulfonatu ve třech postupných podílech ve formě pevné látky. NMR. MS.

Příprava 4

3—[2—J odethoxy]—4-(trifeny lmethoxy)-1 -j odbutan

Roztok 3-[2-[(methylsulfonyl)oxy]ethoxy]-4-(trifenylmethoxy)-l-butanol-methansulfonat (5,0 g, 9,10 mmol) v 500 ml acetonu v čistotě pro syntézu se zpracuje s hydrogenuhličitanem sodným (0,0770 g, 0,910 mmol, 0,1 ekv.) a jodidem sodným (34,2 g, 0,228 mol, 25 ekv.). Vzniklá směs se míchá v atmosféře dusíku při 50 °C asi 16 hodin. Průběh reakce lze sledovat HPEC. Pak se z reakční směsi ve vakuu odstraní aceton a získaná pevná látka se extrahuje do směsi 300 ml ethylacetatu/200 ml vody. Organická vrstva se promyje dalšími 200 ml vody a spojené vodné vrstvy se reextrahují dalšími 100 ml ethylacetatu. Spojené organické vrstvy se promyjí 200 ml 10% vodného roztoku siřičitanu sodného (toto promytí odstraní žluté zbarvení), 100 ml solného roztoku, vysuší se (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 5,45 g (98 %) 3-[2jodethoxy]-4-(triofenylmethoxy)-jodbutanu ve formě čirého oleje. MS. NMR.

- 9 CZ 297524 B6

Příprava 5 (S)-l 0,11,14,15-Tetrahydro-l 3-[methansulfonyloxy(methyl)]-4,9:16,21 -dimetheno-1 H,13Hdibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][3,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3-dion

3,4-(bis)-(lH-Indol-3-yl)-N-methylmaleinimid (10,04 g, 29,4 mmol) a (S)-3-(2-jodethoxy)4-(terc.butyldifenylsilyloxy)-l-jodbutan (17,9 g, 29,4 mmol) se spojí a rozpustí se v bezvodém DMF (80 ml). Tento roztok se přidá dávkovacím čerpadlem spojeným s injekční stříkačkou během 72 hodin do suspenze uhličitanu česného (38,3 g, 118 mmol) v bezvodém DMF (1,7 1) v atmosféře dusíku při 50 °C. DMF se odstraní ve vakuu. Zbytek se rozdělí mezi CHC1₃/1N HC1. Kyselá vrstva se reextrahuje chloroformem a ethylacetatem. Spojené organické vrstvy se promyjí 1N HC1 (1 x), vodou (2 x) se solným roztokem (2 x), vysuší se Na₂SO4 a zahuštěním se získá fuchsinová pevná látka. Surová reakční směs se použije bez dalšího čištění.

Surová reakční směs se suspenduje v ethanolu (700 ml) a zpracuje se s 5N KOH (800 ml). Reakční teplota se zvýší na 80 °C. Po 72 hodinách se odstraní ethanol ve vakuu; vodná suspenze se ochladí na 0 °C a okyselí se 5N HC1. Fialová sraženina se oddělí a promyje se přes vrstvu oxidu křemičitého s použitím ethylacetatu jako elučního prostředku. Eluent se zahustí a získá se 8,7 g částečně silylovaného maleinimidu ve formě fuchsinové pevné látky, která se použije v následující reakci bez dalšího čištění.

K roztoku výše uvedeného anhydridu (8,7 g, 19,7 mmol) v DMF (1 1) se přidá v atmosféře dusíku a při teplotě místnosti 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazan (41,6 ml, 197 mol) a methanol (4 ml, 98,5 mmol). Po 40 hodinách se reakční směs zahustí ve vakuu a přidá se roztok MeCN/lN HC1 2 : 1 (obj./obj.) (100 ml). Zbytek se promíchává 1 hodinu. Organické rozpouštědlo se odstraní a vodná suspenze se extrahuje ethylacetatem. Odstraněním rozpouštědel se získá 8,9 g malenimidu, který se použije bez dalšího čištění.

K suspenzi výše uvedeného malenimidu (8,9 g, 20 mmol) v CH₂C1₂ (800 ml) se v atmosféře dusíku a při teplotě místnosti přidá pyridin (4,85 ml, 60 mmol) a mírný přebytek anhydridu kyseliny methansulfonové (4,21 g, 24 mmol). Po 16 hodinách se reakční směs promyje 0,1 N HC1, solným roztokem a organická vrstva se zahustí. Zbytek se promyje přes vrstvu oxidu křemičitého za použití pomalé gradientově eluce 0 až 10% MeCN v CH₂C1₂. Zahuštěním frakce obsahující požadovaný mesylat se získá 2,8 g titulní sloučeniny ve formě fuchsinové pevné látky. Celkový výtěžek z dijodidu je 18 % MS.

Příprava 6 (S)_ 13-[(Dimethylamino)methyl]-l 0,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-l H-13Hdibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3-(2H)-dion

2,3-bis-(lH-Indol-3-yl)-N-methylmaleinamid (114,7 g, 0,336 mol) a (S)-3-[2-[(methylsulfonyl)oxy]ethoxy]^l-(trifenylmethoxy)-l-butanol-methansulfonat (220,0 g, 0,401 mol, 1,2 ekv.) se rozpustí v 4,3 1 DMF. Tento roztok činidel se pak pomalu přidá, během 70 hodin (rychlostí přibližně 1 ml/min) ke kaši uhličitanu česného (437,8 g, 1,34 mol, 4,0 ekv.) v 7 1 DMF při teplotě 50 °C. Po 70 až 72 hodinách se reakční směs ochladí a zfiltruje, a odstraněním DMF ve vakuu se získá zbytek, který se rozpustí v 4,6 1 CH₂C1₂. Organická vrstva se extrahuje 1,15 1 vodné 1N HC1 a pak 4,6 1 solného roztoku. Spojené vodné vrstvy se pak reextrahují 1,1 1 CH₂C1. Spojené organické vrstvy se vysuší (Na₂SO₄) a zfiltrují. Většina rozpouštědla se odstraní ve vakuu a výsledný roztok se zfiltruje přes 2 kg silikagelu s použitím 15,1 až 18,9 litrů (4 až 5 galonů) dalšího podílu CH₂C1₂ k odstranění základních složek. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získaná purpurově zbarvená pevná látka po trituraci v 7 objemech acetonitrilu (vztaženo na hmotnost surového (S)— 10,11,14,15-tetrahydro-2-methyl-l 3-[(trifenylmethoxy)methyl]^l,9:16,21-dimetheno-l H, 13H-dibenzo[E,K]-pyrrolo[3,4-H] [1,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l ,3(2H)dionu) poskytne 150,2 g (57%) (S)—10,1 l,14,15-tetrahydro-2-methyl-13-[(trifenylmethoxy)methyl]

-10CZ 297524 B6

4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13H-dibenzo[E,K]-pyrrolo[3,4-H] [1,4,13]oxadiazacyklohexadecinl,3(2H)-dionu po vysušení (čistota stanovená HPLC vůči standardu 89 %).

(S)—1 0,11,14,15-Tetrahydro-2-methyl-l 3-[(trifenylmethoxy)methyl]^,9:16,21-dimetheno1 H,13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l ,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l ,3(2H)dion (32,7 g,

46,9 mol) se suspenduje v 1,6 1 ethanolu a 1,6 1 vodného 10N KOH. Vzniklá směs se zahřívá za mírného refluxování (78 °C) 19 hodin. Většina pevných složek se rozpustí při dosažení teploty zpětného toku. Reakční roztok se ochladí na 10 až 15 °C a pomalu se přidá vodná 10 N HC1 (1,2 1) při <15 °C k úpravě acidity na pH=l. Při okyselení vznikne červená kaše. Reakční směs se zředí 500 ml CH₂C1₂, míchá se 20 minut a zfiltruje se k odstranění většiny soli. Solí se promyje dalším podílem CH₂C1₂ (1,5 1) a filtrát se extrahuje dvakrát 1 1 vody. Spojené vodné vrstvy se reextrahují 1 1 CH₂C1₂ a organická vrstva se vysuší (MgSO₄). Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se 36,0 g (>100 %) (S)—10,1 l,14,15-tetrahydro-13-[(trifenylmethoxy)methyl]-4,9:16,21dimetheno-13H-dibenzo[E,K]furo[3,4-H][l,4,13]-oxa-diazacyklohexadecin-l,3-dionu ve formě purpurové pevné látky (80 % čistoty v plošném zastoupení HPLC).

(S)— 10,11,14,15-Tetrahydro-l 3-[(trifenylmethoxy)methyl]-4,9:16,21 -dimetheno-13H-dibenzo[E,K]-furo[3,4-H][l,4,13]-oxadiazacyklohexadecin-l,3-dion (36,0 g, představující

46,9 mmol) se rozpustí v atmosféře dusíku v 320 ml suchého DMF a zpracuje se s předem připraveným roztokem 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazanu (99 ml, 75,7 g, 0,469 mol, lOekv.) a methanolu (9,6 ml, 7,51 g, 0,235 mol, 5 ekv.). Získaný roztok se zahřívá 7 hodin při 45 °C. Průběh reakce lze sledovat HPLC. Většina DMF se odstraní ve vakuu, výsledný zbytek se extrahuje do 200 ml ethylacetatu a promyje se 200 ml vody a dvakrát 100 ml vodného 5% roztoku LiCl. Vodné vrstvy se reextrahují 100 ml ethylacetatu. Spojené organické vrstvy se promyjí 200 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Spojené organické vrstvy se vysuší (MgSO₄) a odpařením ve vakuu se získá 35,9 g (>100%) surového (S)—10,11,14,15— tetrahydro-13-[(trifenylmethoxy)methy 1]—4,9:16,21 -dimetheno-1 H, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dionu ve formě purpurové pevné látky.

(S)— 10,11,14,15-Tetrahydro-l 3-[(trifenylmethoxy)-methyl]-4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13 H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dion (34,0, představujících 46,8 mmol) se rozpustí v 350 ml CH₂C1₂ a ochladí se v atmosféře dusíku na -25 °C. Reakční roztok se probublává bezvodý plynný HC1 po dobu asi 1 až 2 minut při <0 °C. Získaná kaše se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se 1 hodinu. Průběh reakce lze sledovat HPLC. Kaše se odfiltruje a pevné látky se promyjí 200 ml CH₂C1₂. Pevná látka se vysuší ve vakuové sušárně při 50 °C a získá se 18,6g (90%) (S)-10,ll,14,15-tetrahydro-13-(hydroxymethyl)-4,9:16,21dimetheno-lH,13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dion ve formě purpurové pevné látky (93% čistoty) z plošného zastoupení při HPLC).

Suspenze (S)— 10,11,14,15-tetrahydro-l 3-(hydroxymethyl)-4,9-l 6,21 -dimetheno-1 Η, 13 H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dionu (18,2 g, 41,2 mmol) v 900 ml THF se zpracuje s pyridinem (9,78 g, 10,0 ml 0,124 mmol, 3 ekv.) a anhydridem kyseliny methansulfonové (14,3 g, 80,4 mmol, 2 ekv.) a zahřívá se 16 hodin v atmosféře N₂ při teplotě zpětného toku (67 °C). Průběh reakce lze sledovat HPLC. Reakční směs se pak ochladí a zředí se 600 ml ethylacetatu a extrahuje se dvakrát 300 ml 1N HC1 a jednou 600 ml vody. Vodné vrstvy se reextrahují 300 ml ethylacetatu a organická vrstva se vysuší (MgSO₄). Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se 19,0 g (S)-l 0,11,14,15-tetrahydro-l 3-[[(methylsulfonyl)oxy]methyl]-4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l ,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dionu, který se trituruje ve 190 ml teplého (40 °C) CH₂C1₂, zfiltruje se za tepla a promyje se dalšími 100 ml CH₂C1₂ o teplotě místnosti a získá se tak 17,3 g (81%) (S)10,11,14,15-tetrahydro-l 3-[[(methy lsulfonyl)oxy]methy I]—4,9:16,21 -dimetheno-1 Η, 13 H-dibenzo[[E,K]pyrrolo-[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dionu, ve formě purpurové pevné látky (96% čistoty při stanovení HPLC z plošného zastoupení).

-11CZ 297524 B6 (S)-l 0,11,14,15-Tetrahydro-l 3-[[(methylsulfonyl)oxy]methyl]^l,9:16,21-dimetheno-l H,13Hdibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dion (9,50 g, 18,3 mmol) se rozpustí ve 475 ml THF, přidá se 172 ml 40% vodného roztoku dimeethylaminu (0,173 mol, 75 ekv.) a získaný roztok se zahřívá 19 hodin při 65 °C v uzavřeném reaktoru za tlaku 55 až 69 kPa (8 až 10 psi). Reakční smě se pak ochladí a zředí se 900 ml ethylacetatu, organická vrstva se extrahuje dvakrát 450 ml vody a jednou 200 ml solného roztoku. Vodné vrstvy se reextrahují dalším 250ml podílem ethylacetatu, organická vrstva se vysuší (MgSO₄) a odpařením rozpouštědla ve vakuu se získá 7,82 g (S)-13-[(dimethylamino)methyl]-10,l 1,14,15-tetrahydro4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][ 1,4,13]oxadiazacyklohexadecinl,3(2H)-dionu (91 %)

Příklad 1

Mesylatová sůl (S)—13-[(Dimethylamino)methyl]-l 0,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-l H, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]-oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dion (3,0 g, 6,4 mmol) se suspenduje v 90 ml acetonu čistoty pro syntézu. V 10 ml deionizované vody se rozpustí kyselina methansulfonová (0,62 g, 1 ekv.) a přidá se ke kaši báze/aceton. Vzniklá oranžová kaše s odstínem do červena se promíchá a zfíltruje se s použitím 25 ml acetonu jako promývacího prostředku a získá se tak po vysušení 2,92 g (81 %) mesylatové soli. Všechny postupy včetně promývání se provedou při teplotě místnosti.

Příklad 2

Monohydrochloridová sůl

Monohydrochloridová sůl (S)-13-[(dimethylamino)methyl]-10,ll,14,15-tetrahydro-4,9:16,21dimetheno-lH,13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l,4,13]-oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)dion se připraví suspendováním báze (3,0 g, 6,4 mmol) ve 120 ml (1 ekv.) methanolu. Přidá se vodná 1N HC1. Vzniklá směs se míchá přibližně 16 hodin a pak se zfíltruje s použitím 25 ml methanolu jako promývacího prostředku. Získaná sůl se suší ve vakuové sušárně při 50 °C a získá se tak 2,65 g (82 %) HC1 soli. Všechny postupy včetně promývání se provedou při teplotě místnosti.

Příklady 3 až 8

Hydrochloridová, síranová, vinanová, jantaranová, octanová a fosforečnanová sůl

Hydrochloridová, síranová, vinanová, jantaranová, octanová a fosforečnanová sůl se připraví s použitím směsi rozpouštědel methanol/vody způsoby známými v oboru. Každá z těchto solí se připraví přídavkem vodného roztoku kyseliny kmethanolové suspenzi (S)-13-[(dimethylamino)methyl]-l 0,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-l Η, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4H] [ 1,4,13]-oxadiazacyklohexadecin-l ,3(2H)-dionu.

Velmi nečekaně bylo zjištěno, že solná forma podle vynálezu má zlepšenou rozpustnost, a co je nej důležitější, výrazně zlepšenou biologickou dostupnost pacientovi. Sůl je snadno připravitelná v jedné krystalické formě, což vede k většímu snížení obsahu nečistot. V následujících příkladech jsou uvedeny srovnávací analýzy demonstrující nečekané a výhodné vlastnosti soli podle vynálezu.

Příklad 9

Srovnání výtěžku, celkových příbuzných sloučenin a zbytkových rozpouštědel.

Údaj celkové příbuzné sloučeniny se týká relativních množství nečistot v konečném produktu a jedná se tedy o stanovení čistoty. Nejvyšší výtěžek při přípravě solí, 82 % byl zjištěn při přípravě

-12CZ 297524 B6 síranu (tabulka I) a nejnižší výtěžek, 52 %, byl zjištěn při přípravě jantaru. Ačkoliv při přípravě všech těchto solí došlo ke snížení celkových příbuzných sloučenin (TRS), nejvyšší snížení, o 5,26 % bylo zjištěno při přípravě mesylatové soli. Hydrochloridová sůl byla jediná, u které byl po sušení při 50 °C ve vakuové sušárně po dobu 16 hodin zjištěn obsah zbytkového methanolu 5 (0,62 % hmotn.). Jantaran, octan a fosforečnan obsahovaly 0,18 až 1,32 % THF zjištěných GC stanovením, který pravděpodobně pochází z předposledního stupně syntézy který se provádí ve vodném THF.

Tabulka I. Výsledky stanovení výtěžku, % TRS a zbytkových rozpouštědel u různých forem solí

sůl	výtěžek (%>	TRS (% HPLC)^a	zbytková rozpouštědla (%)*>
HC1	69	9,12	0,62 MeOH
síran	82	7,28	žádná
vinan	77	8,95	žádná
mesylat	63	4,72	žádná
jantaran⁰	52	7,86	1,32 THF
octan^c	68	8,05	1,12 THF
fosforečnan^ 79	6,28	0,18 THF

^a) Volná báze použití k přípravě těchto solí obsahovala 9,98 % celkových příbuzných sloučenin.

^b) Limit detekce při stanovení je 0,1 % (1000 ppm). Všechny soli byly připraveny v methanolu/ vodě a sušeny asi 16 hodin ve vakuové sušárně při 50 °C před stanovením.

^c) Jantaran a octan nebyly za podmínek zpracování plně vytitrovány jako bylo zjištěno práško vou rentgenovou difrakční analýzou.

^d) Fosforečnan byl vytitrován částečně jak bylo zjištěno práškovou rentgenovou difrakční analýzou.

Příklad 10

Srovnání pomocí práškové rentgenové difrakční analýzy

Tyto soli byly také porovnávány polarizační mikroskopií pro stanovení krystalinity (dvojlomu). 25 Z práškové rentgenové difrakční analýzy vyplývalo, že pouze hydrochloridová, mesylatová, jantaranová a octanová sůl jsou krystalické, co vyplývá z jejich charakteristických rentgenogramů. Jantarová a octanová sůl mají velmi podobné rentgenogramy, které korelují s charakteristickými znaky volné báze. Síranová, vinanová a fosforečná sůl jsou slabě krystalické a mají výrazně amorfní charakter. Výhodné jsou krystalické soli díky jejich snadnému přečišťování a násled30 nému zpracování.

Příklad 11

Porovnání rozpustností

Byly porovnány rozpustnosti stanovené UV analýzou těchto solí ve vodě (tabulka II). Nanejvýš nečekaně, nejvyšší rozpustnost ve vodě má mesylatová sůl, 1,76 mg/ml. Rozpustnost masylatu je významně vyšší než u ostatních solí. Z údajů uvedených v tabulce II vyplývá, že tato sůl podle vynálezu má šestkrát větší rozpustnost než nejobvyklejší farmaceuticky přijatelná sůl, hydrochlo40 ridová sůl (0,268 mg/ml). Následné studie souhlasně prokázaly dvou až šestinásobné zvýšení

-13CZ 297524 B6 rozpustnosti. Vysoké pH zjištěné u jantaranové a octanové soli indikuje přítomnost nevytitrované volné báze.

Tabulka II. Rozpustnost ve vodě

sůl	rozpustnost (p.g soli/ml h₂o)	rozpustnost (pg baze/ml h₂o)	pH (nasyceného vodného roztoku)
HC1	268	249	4,98
síran	14	12	2,57
mesylat	1760	1460	4,69
jantaran	0,5	0,4	7,72
vinan	71	54	3,77
octan	1	0,9	7,80
fosforečnan	736	609	3,78

Rozpustnost mesylatové soli ve vodě je velmi závislá na pH a optimální rozpustnost je zjištována při pH 4,0 až 5,0, výhodně při pH 4,5 (2,25 mg/ml). Rozpustnost výrazně klesá jak při vyšším, tak při nižším pH. Kromě této závislosti rozpustnosti na pH rozpustnost mesylatové soli ve vodě výrazně klesá s přídavkem chloridu ve formě chloridu sodného díky tvorbě hydrochloridové soli.

Příklad 12

Porovnání výsledků termogravimetrické analýzy (TGA), diferenční skanovací kalorimetrie (DSC) a mikroskopie ve vyhřívaném bloku Mettler

Každá z uvedených solí byla analyzována TGA, DSC a mikroskopicky ve vyhřívaném bloku Mettler a výsledky jsou porovnány v tabulce III. Při zahřívání v rozmezí od 20 do 100 °C vykazují tyto soli ztrátu hmotnosti 0,73 až 5,50 %. Síranová, vinanová a fosforečnanová sůl mají každá ztrátu hmotnosti 5,50 %. Při zahřívání na 100 až 200 °C vykazují další ztrátu hmotnosti pouze hydrochloridová, jantarová a octanová sůl. Při DSC analýze vykazuje mesylatová sůl ostrý endotermní tavný pík při 261,6 °C. Síranová sůl vykazuje poněkud širší endotermní pík při 267,4 °C. Hydrochloridová, jantaranová, vinanová, octanová a fosforečnanová sůl vykazující při DCS žádný tavný endoterm. Jantarová, octanová a fosforečnanová sůl vykazují DSC exotermy při asi 245 °C. Vzorky byly také hodnoceny mikroskopicky ve vyhřívaném bloku Mettler. Hydrochloridová sůl nevykazuje žádné skutečné tání až do teploty 300 °C. Zbytek zkoušených solí vykazuje znaky kapalnění při teplotách od 215 do 270 °C.

-14CZ 297524 B6

Tabulka III. Výsledky stanovení TGA, DSC a mikroskopie ve vyhřívaném bloku

sůl	TGA (% hmotn. úbytku) 20 až 100 °C	TGA (% hmotn. úbytku) 100 až 200 °C	DSC endotherm max. (°c)	mikroskopie ve vyhřívaném bloku (°C)
HCX	1,42	0,9	žádná	t.t.	žádná t.t.
síran	5,50	-	267,4		260 až 270
mesylat	3,97	-	261,6		230 až 264
jantaran	0,73	1,90	žádná	t.t.	230 až 270
vinan	5,50	-	žádná	t.t.	215 až 255
octan	0,77	1,44	žádná	t.t.	245 až 265
fosfo-
rečnan	5,50	—	žádná	t.t.	230 až 250

Příklad 13

Porovnání hygroskopických vlastností

Uvedené soli byly hodnoceny z hlediska jejich hygroskopičnosti při relativních vlhkostech (RH) 27 %, 35 %, 65 % a 80 % a výsledky jsou uvedeny v tabulce IV. Vzorky byly nejprve vystaveny vakuu pro získání referenčního stavu pro další hodnocení při relativní vlhkosti (RH). Obsah vody 10 v každé soli byl také stanoven způsobem podle Karl-Fischera (coulometricky).

Tabulka IV. Výsledky stanovení hygroskopičnosti a stanovení podle Karí-Fishera (K..F.)

sůl	hygroskopičnost (hmotn.% původní)	vakuum	RH 27	RH % 35	RH % 65	RH % 80 %	K.F (%)
HC1	100	98,7	98,2	99,3	100,4	100,6	1,3
síran	100	98,9	98,4	99,8	100,9	101,9	4,9
mesylat	100	99,0	98,5	99,4	100,7	104,4	3,6
jantaran	100	99,3	98,5	99,1	100,0	100,5	0,2
vinan	100	97,9	98,2	101,3	103,8	105,4	5,1
octan	100	99,4	98,6	99,2	100,2	100,6	0,3
fosfo-	100	98,2	98,6	102,6	105,5	106,6	4,6
rečnan

RH = relativní vlhkost

Soli při srovnání hmotností po expozici vakuu a expozici 80% relativní vlhkosti získaly od 1,2 do

8,4 % přírůstků hmotnosti. Nejvíce hygroskopická je fosforečnanová sůl, potom následuje

-15CZ 297524 B6 vinanová sůl, mesylat, síran, octan, hydrochlorid a jantaran. Výsledky stanovené způsobem podle Karl-Fishera se celkem dobře shodují s hygroskopickými výsledky u solí obsahujících nejvíce vody, tj. vinanu, síranu a fosforečnanu. Mesylatová sůl obsahuje nejvíce vody.

Příklad 14

Rozpouštědla pro přípravu soli

Mesylatová sůl byla připravena v methanolu/vodě, 100% acetonu, acetonu/vodě 9:1, acetonu/vodě 3:1a acetonu/vodě 1:1. Báze, která byla použita k přípravě těchto solí, obsahovala 9,98 % celkových příbuzných sloučenin. Výtěžky a celkové obsahy příbuzných sloučenin pro každou z těchto solí jsou uvedeny v tabulce V. Pro srovnání jsou uvedeny i údaje týkající se HC1 soli. Označení N.A. v tabulce V znamená, že údaj není k dispozici.

Tabulka V. Výtěžek a % TRC pro HC1 sůl a mesylatovou sůl

sůl	rozpouštědlo výtěžek (%) TRS (%, HPLC)^a	zbytková rozpouštědla (%)^c
HC1	30:1	MeOH/H₂O	69	9,12^a	0,62 MeOH
HC1	9:1	aceton/H₂0	83	4,73^a	N.A.
HC1	20:1	Me0H/H₂0	82	2,23^b	0,05 MeOH
mesylat	7:1	MeOH/H₂0	63	4,72^a	žádná
mesylat		aceton	85	9,80^a	N.A.
mesylat	9:1	aceton/voda	73	2,00^a	N.A.
mesylat	5:1	aceton/voda	39	0,69^a	N.A.
mesylat	1:1	aceton/voda	29	4,12^a	N.A.
mesylat	9:1	aceton/voda	81	0,91^b	0,69 aceton

^a) Báze použitá k přípravě těchto solí obsahovala 9,98 celkových příbuzných sloučenin.

^b) Báze použitá k přípravě těchto solí obsahovala 7,03 celkových příbuzných sloučenin ^c) Limit detekce pro stanovení je 0,1 % (1000 ppm).

Mesylatová sůl připravená z acetonu/vody 5:1 má 0,7 % celkových příbuzných sloučenin, což znamená snížení o 9,3 % vůči obsahu TRS ve volné bázi, nicméně výtěžek byl nízký 39 %. Výtěžek se zvýšil na 73 % s 2,0 % TRS při použití acetonu/vody 9:1. Obsah TRS hydrochloridové soli byl také snížen, na 4,7 %, tj. snížení o 5,3 %, nicméně zůstává přítomna neznámá příbuzná sloučenina v množství 2,4 %. Množství přípravy solí podle vynálezu s významně sníženým obsahem nečistot (TRS) vede k účinnější přípravě a omezuje nákladná postupná přečišťování.

Protože hydrochloridová sůl je nejběžnější farmaceuticky přijatelná sůl a je specificky uvedena v práci Heath a sp., 08/413735, publikované 14. června 1995 jako EP 0 657 458 (příklad 5) bylo provedeno biologické porovnání mesylatové a HC1 soli. Nanejvýš nečekaně se ukázalo, že mesylatová sůl podle vynálezu má významně vyšší biologickou dostupnost než HC1 sůl. Biologická dostupnost solných forem byla stanovena ve čtyřech psech (samcích) rasy beagle, kterým byla orálně podána jedna 20 mg/kg dávka HC1 soli a mesylatové soli podle vynálezu v 10 % suspenzi arabské gumy. Mezi dávkami bylo ponecháno jednotýdenní odbourávací období. Dávky byly

-16CZ 297524 B6 podávány podle zkříženého návrhu (2 psi/sůl/studie psa). Byla sledována koncentrace účinné složky rovněž jako aktivního metabolitu v plasmě. U každého psa bylo po podání orální dávky mesylatové soli podle vynálezu dosaženo vyšších koncentrací (S)-13-[(dimethylamino)methyl]10,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21 -dimetheno-1 Η, 13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H] [ 1,4,13]oxadiazacyklohexadecin-l,3(2H)-dionu a metabolitu v plasmě než po podání ekvivalentní dávky FICI soli. Střední maximální koncentrace v plasmě (c_max ± směrodatná odchylka) po podání HC1 soli byl 400±142 ng/ml (pro sloučeninu) a 862±255 ng/ml (pro metablit). Střední maximální koncentrace v plasmě (c_max ± směrodatná odchylka) po podání mesylatu podle vynálezu byla 896±243 ng/ml (pro sloučeninu) a 24551930 ng/ml (pro metabolit). To představuje přibližně 260% zvýšení koncentrací sloučeniny a metabolitu v plasmě.

Koncentrace sloučeniny rovněž jako metabolitu v plasmě byly ve studii vyhodnocovány také jako funkce času. Poměr plochy pod koncentrační křivkou (AUC) představuje míru biologické dostupnosti sloučeniny pro pacienta. Byl vypočten AUC poměr pro HC1 sůl a mesylat podle vynálezu a je uveden v tabulce VI.

Tabulka VI: AUC poměry po jedné orální 20mg/kg dávce podané ve formě HC1 soli a mesylatové soli

pes #	metabolit mesylat:HC1	sloučenina mesylat:HC1
1	2,77	3,89
2	2,97	1,62
3	2,02	2,14
4	2,74	2,56
průměr	2,62	2,55
směrodatná odchylka	0,21	0,49

Podle tabulky VI lze nanejvýš nečekaně prokázat, že mesylatová sůl má 2,58-krát větší biologickou dostupnost než HC1 sůl. Toto významné zvýšení biologické dostupnosti umožňuje, že pacientovi může být podávána nižší dávka s dosažením stejného farmaceutického účinku. Minimalizuje se tak expozice pacienta. Navíc, nižší jednotková dávková forma snižuje cenu sloučeniny a snižuje množství sloučeniny potřebné pro výrobu. Předpokládá se proto, že dávka mesylatové soli podle vynálezu bude 0,5 mg/kg/dávka až 0,25 mg/kg/dávka, výhodněji 0,1 až 0,2 mg/kg/dávka. Tato dávka je podstatně nižší než dávka HC1 soli, která vede ke stejným hladinám v krvi.

Ze souhrnu fyzikálních údajů uvedených sedmi solí vyplývá, že mesylatová sůl má významně zlepšené fyzikální vlastnosti vzhledem solím studovaným a uvedeným v práci Heath a sp., EP 0 657 458. Nejdůležitější je srovnání biologické dostupnosti soli podle vynálezu a HC1 soli, ze kterého vyplývá, že mesylatové soli podle vynálezu jsou výrazně zlepšenými terapeutickými prostředky. Výhody mesylatových solí podle vynálezu zahrnují:

(1) vysokou rozpustnost ve vodě;

(2) velké snížení celkových příbuzných sloučenin stanovených HPLC;

(3) žádná zbytková rozpouštědla stanovená GC;

-17CZ 297524 B6 (4) krystalickou strukturu stanovenou práškovou rentgenovou difrakční analýzou a polarizační mikroskopií;

(5) úzké rozmezí teploty tání stanovené DSC; a (6) více než 2,5 násobnou biologickou dostupnost vůči HC1 soli.

Jak již bylo uvedeno, sloučeniny podle vynálezu jsou aktivní jako selektivní inhibitor proteinkinázy C. Aktivita sloučeniny je uvedena v práci Heath a sp., EP 0 657 458, publikované 14. června 1995. Tato aktivita byla stanovena v testech „Calcium Calmodulin Dependent Protein Kinase Assay, Casein Protein Kinase II Assay, cAMP-Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit Assay a Protein-Tyrosin Kinase Assay“. Při těchto testech bylo zjištěno, že mesylatová sůl je účinná a isozym-selektivní při hodnotách IC₅o menších než 10 μΜ. Sloučeniny s takto prokázanou farmakologickou účinností jsou vhodné pro léčení stavů, ve kterých je prokázána patologická úloha proteinkinázy C. Tyto stavy, známé v oboru, zahrnují: diabetes mellitus a jeho komplikace (včetně retinopatie, neuropatie a nefropatie), ischemii, zánět, choroby centrálního nervového systému, kardiovaskulární chorobu, Alzheimerovu chorobu, dermatologické onemocnění a rakovinu.

Výhodné je sloučeniny podle vynálezu před podáváním zpracovat do formy přípravků. Dalším provedením podle vynálezu je tedy farmaceutický přípravek obsahující sloučeninu vzorce Ia a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, ředidel nebo přísad.

Tyto farmaceutické přípravky se připraví známými postupy s použitím velmi dobře známých a snadno dostupných složek. Při přípravě kompozic podle vynálezu se účinná složka obvykle smísí s nosičem, nebo se zředí s nosičem, nebo se obklopí nosičem který může být ve formě tobolky, sáčku, papíru nebo jiného obalu. Jestliže nosič má funkci ředidla, může být pevný, polotuhý nebo tekutý, a může působit jako vehikulum, přísada nebo médium pro účinnou složku. Tyto kompozice pak mohou být ve formě tablet, pilulek, prášků, pastilek, sáčků, oplatek, tinktur, suspenzí, emulzí, roztoků, sirupů, aerosolů (v pevném stavu nebo v tekutém médiu), měkkých nebo tvrdých želatinových tobolek, čípků, sterilních injekčních roztoků a sterilních rozplněných prášků.

Dále jsou uvedeny některé příklady vhodných nosičů, přísad a ředidel, které zahrnují laktosu, dextrosu, sacharosu, sorbitol, manitol, škroby, arabskou gumu, fosforečnan vápenatý, alginaty, tragant, želatinu, křemičitan vápenatý, mikrokrystalickou celulosu, polyvinylpyrrolidon, celulosu, sirup na bázi vody, methylcelulosu, methyl- a propylhydroxybenzoat, talek, stearan vápenatý a minerální olej. Tyto přípravky mohou navíc obsahovat kluzné prostředky, smáčecí prostředky, emulgační a suspendační prostředky, konzervační prostředky, sladidla a čichová a chuťová korigens. Kompozice podle vynálezu lze také formulovat tak, aby umožňovaly rychlé, řízené nebo prodloužené uvolňování účinné složky po podání pacientovi. Výhodně se tyto kom pozice zpracují do jednotkové dávkové formy, kde každá dávka obsahuje od asi 1 do asi 20 mg, obvykleji od asi 2 do asi 10 mg účinné složky. Nicméně je nutné si uvědomit, že podávanou terapeutickou dávku určí lékař na základě důležitých okolností vztahujících se ke stavu určenému k léčení, k výběru sloučeniny určené k podávání, k zvolenému způsobu podání, a proto výše uvedená rozmezí dávek rozsah vynálezu nijak neomezují. Výraz Jednotková dávková forma“ se týká fyzikálně oddělených jednotek, vhodných pro jednotné dávkování lidským subjektům a dalším savcům, kde každá jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné složky odpovídající vyvolání požadovaného terapeutického účinku ve spojení s vhodným farmaceutickým nosičem.

Následující příklady těchto formulací jsou určeny pouze pro názornost a rozsah vynálezu tím nijak neomezují.

-18CZ 297524 B6

Formulace 1

Tvrdé želatinové tobolky se připraví s použitím následujících složek: množství (mg/tobolka) účinná složka5 škrob, sušený85 stearan hořečnatý10 celkem 100mg

Výše uvedené složky se smísí a rozplní se po lOOmg množstvích do tvrdých želatinových tobolek.

Formulace 2

Tableta se připraví s použitím následujících složek:

množství (mg/tobolka) účinná složka7 celulosa mikrokrystalická78 oxid křemičitý, koloidní10 kyselina stearová5 celkem 100 mg

Složky se smísí a slisují do formy tablet o hmotnosti každé z nich 100 mg.

Formulace 3

Tablety s obsahem účinné složky 10 mg v jedné teplotě se připraví následujícím způsobem: množství (mg/tobolka) účinná složka10 mg škrob 45mg celulosa mikrokrystalická 35mg polyvinylpyrrolidon (10% roztok ve vodě) 4mg sodná sůl karboxymethylškrobu 4,5 mg stearan hořečnatý 0,5 mg talek 1mg celkem 100 mg

Účinná složka, škrob a celulosa se prošijí přes síto č. 45 mesh U.S. (rozměr částice 0,300 mm) a důkladně se promísí. Se získaným práškem se smísí roztok polyvinylpyrrolidonu a pak se práškovitá směs prošije přes síto č. 14 mesth U.S. (rozměr částice 1,168 mm). Tyto granule se pak suší při 50 °C a prošijí se přes síto č. 18 mesh U.S. (rozměr částice 0,900 mm). Ke granulím se pak přidá sodná sůl karboxymethylškrobu, stearan hořečnatý a talek, které byly předem prosety sítem č. 60 mesh U.S. (rozměr částice 0,246 mm), promísí se a směs se slisuje na tabletovacím lisu a získají se tablety o hmotnosti každé tablety 100 mg.

-19CZ 297524 B6

Formulace 4

Tobolky s obsahem 8 mg léčiva v jedné tobolce se připraví následujícím způsobem:

účinná složka škrob mikrokrystalická celulosa stearan hořečnatý celkem

množství (mg/tobolka) 8 mg 95 mg 95 mg 2 mg 200 mg

Účinná složka, celulosa, škrob a stearan hořečnatý se smísí, prošijí se sítem č. 45 mesh U.S. (rozměr částice 0,300 mm) a rozplní se po 200 mg do tvrdých želatinových tobolek.

Principy, výhodná provedení a způsoby provedení podle vynálezu jsou uvedeny v předcházejícím popisu. Není však myšleno, aby tento vynálezu určený k patentové ochraně byl omezen jen na tyto jednotlivé formy, které je nutné podkládat spíše za ilustrativní než za restriktivní. Pracovníci v oboru mohou provádět variace a změny aniž by se odchýlili od podstaty vynálezu.

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

Claims

Sůl bis-indolylmaleimidu vzorce Ia (Ia) a její solváty.
2. Sůl podle nároku 1, vzorce Ia . CH₃SO₃H (Ia)

-20CZ 297524 B6 a její solváty.
3. Sůl podle nároku 1 nebo 2, která je v podstatě krystalická.
4. Sůl podle nároku 3, kterou je (S)-13-[(dimethylamino)methyl]-10,l 1,14,15-tetrahydro4,9:16,21-dimetheno-l H,13H-dibenzo[E,K]pyrrolo[3,4-H][l ,4,13]oxadiazacyklohexadecinl,3(2H)-dion-methansulfonát-monohydrát.
5. Methansulfonátová sůl bis-indolylmaleimidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo pro léčbu mikrovaskulámích komplikací diabetů.
6. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje sůl podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými ředidly, přísadami nebo nosiči.
7. Methansulfonátová sůl bis-indolylmaleimidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.
8. Způsob přípravy soli podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že reaguje sloučenina vzorce I s kyselinou methansulfonovou v nereaktivním organickém rozpouštědle.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je vodný aceton.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je aceton s vodou v objemovém poměru od 5:1 do 10:1.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je aceton s vodou v objemovém poměru 9:1.