CZ20033087A3

CZ20033087A3 - @}Fenylpiperidin@ylidenmethylB benzamidové deriváty a jejich použití pro ošetřování bolestiŹ úzkosti nebo gastrointestinálních poruch

Info

Publication number: CZ20033087A3
Application number: CZ20033087A
Authority: CZ
Inventors: Brownáwilliam; Walpoleáchristopher; Weiázhongyong
Original assignee: Astrazenecaáab
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2004-05-12
Also published as: IL158695A0; EE200300543A; IS7024A; BR0209667A; DE60202679T2; BG108328A; CA2446331A1; AR033756A1; JP2005507372A; ATE287400T1; PL366389A1; DE60202679D1; CO5540304A2; EP1395574B1; KR20030094423A; RU2003131968A; SE0101767D0; US20040138259A1; CN1547579A; NO20035118D0

Description

Oblast techniky

Přítomný vynález je zaměřen na nové sloučeniny, způsob jejich přípravy, jejich použití a farmaceutické prostředky obsahující tyto nové sloučeniny. Nové sloučeniny jsou vhodné pro terapii a zvláště pro léčení bolesti, úzkosti a funkčních gastrointestinálních poruch.

Dosavadní stav techniky

Bylo identifikováno, že δ-receptor má určitou roli v mnoha tělesných funkcích, jako v oběhovém systému a systému bolesti. Proto ligandy δ-receptoru mohou nalézt potenciální využití jako analgetika a/nebo antihypertenzivní prostředky. Dále se ukázalo, že ligandy δreceptoru mají imunomodulační účinky.

Nyní je dobře ustanovena identifikace alespoň tří různých populací opioidních receptorů (μ, δ a κ) a všechny tři zmíněné populace jsou patrné jak v centrálním, tak v periferním nervovém systému mnoha druhů včetně člověka. Při aktivaci jednoho či více z těchto receptorů byla na různých zvířecích modelech pozorována analgézie.

S několika výjimkami platí, že v současné době dostupné selektivní ligandy opioidních δ-receptorů jsou svou povahou peptidické sloučeniny a nejsou vhodné pro podávání systémovými cestami. Jedním příkladem nonpeptidického agonisty δ-receptoru je sloučenina SNC80 (E.

• · • · • · · · • ·

J. Bilsky a kol., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 273(1), 359 až 366 (1995)). Nicméně nadále existuje potřeba selektivního agonisty δ-receptoru, který by měl ne pouze zlepšenou selektivitu, ale též vylepšený profil vedlejších účinků.

Proto cílem přítomného vynálezu je nalezení nových analgetických prostředků s lepšími analgetickými účinky a též s vylepšeným profilem vedlejších účinků při porovnání s nyní používanými agonisty μ-receptoru, stejně tak se zdokonalenou systémovou účinností.

Analgetika, která byla identifikována a patří k dosavadnímu stavu techniky, mají mnoho nevýhod v tom smyslu, že mají špatnou farmakokinetiku a nemají analgetické účinky, pokud se podají systémovou cestou. Též je zdokumentováno, že výhodné sloučeniny, které jsou agonisty δ-receptoru, popsané v dosavadní stavu techniky, vykazují při systémovém podávání významné konvulzivní účinky.

Původci přítomného vynálezu nyní nalezli určité sloučeniny, které vykazují překvapivě zdokonalené vlastnosti, mimo jiné lepší δ-agonistickou účinnost, lepší účinnost in vivo, lepší farmakokinetiku, biologickou dostupnost, stabilitu in vitro a/nebo nižší toxicitu.

Podstata vynálezu

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou definovány obecným vzorcem I

ve kterém

R¹ je vybrán z jakékoliv

i) fenylové skupiny ii) pyridylové skupiny iii) thienylová skupiny iv) furylové skupiny

v) imidazolylové skupiny

vi) triazolylové skupiny

ΙΟ » φ · · · · · · ·· · • · » · ·· · · · · ···· ·· · ···· • »· ·«· · ··· · ··· ···· ···· ·· · »· ·· ·· ·* ·· ♦ vii) pyrrolylové skupiny viii) thiazolylové skupiny ix) pyridyl-N-oxidu;

kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být popřípadě a nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty vybranými z přímé nebo rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, N0₂, CF3, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu; přičemž substituenty na fenylovém kruhu a na heteroaromatickém kruhu mohou být umístěny v jakékoliv poloze zmíněného kruhového systému.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ má význam vymezený výše a každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh mohou být nezávisle dále substituovány methylovou skupinou.

• · • · • · · ·

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina, pyridylová skupina, thienylová skupina nebo furylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹heteroaromatickém kruhu.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina nebo pyridylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹ heteroaromatickém kruhu.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je thienylová skupina nebo furylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹heteroaromatickém kruhu.

V případě, kdy jsou R¹ fenylový kruh a R¹heteroaromatický (-é) kruh (kruhy) substituovány, výhodné substituenty se nezávisle vyberou z jakéhokoli substituentu z CF₃, methylové skupiny, atomu jodu, atomu bromu, atomu fluoru a atomu chloru.

Reakční krok A ve schématu 2 znázorněném dále se provádí reakcí intermediární sloučeniny obecného vzorce II • · · · • · • · · • ·· · ·

I

PG ve kterém

PG je skupina chránící urethanovou skupinu, jako je Boc a CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná skupina chránící benzylovou skupinu, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina;

s kyselinou 3-hydroxyfenylboritou, za použití palladiového katalyzátoru, například Pd(PPh₃)₄, za přítomnosti báze, například Na₂CO₃, čímž se připraví sloučenina obecného vzorce III

OH

I

PG · (III) ze které se posléze za standardních podmínek sejme chránící skupina a alkyluje se za redukčních podmínek sloučeninou obecného vzorce R^X-CHO, čímž se dostanou sloučeniny obecného vzorce I.

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro terapii, obzvláště pro terapii různých bolestivých stavů, jako je chronická bolest, neuropatická bolest, akutní bolest, rakovinná bolest, bolest zapříčiněná revmatoidní artritidou, migréna, viscerální bolest atd. Tento výčet by neměl být nicméně považován za vyčerpávající.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné jako imunomodulátory, obzvláště v případě autoimunních onemocnění, jako je artritida, pro kožní štěpy, orgánové transplantáty a obdobné chirurgické potřeby, v případě kolagenóz, různých alergií, pro použití jako antitumorózní a antivirové prostředky.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro chorobné stavy, u kterých je přítomna či na jejichž patogeneze se podílí degenerace nebo dysfunkce opioidních receptorů. Použití může zahrnovat užití izotopově značených verzí sloučenin podle přítomného vynálezu v diagnostických technikách a zobrazovacích metodách, jako je například pozitronová emisní tomografie (PET).

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro léčení průjmu, deprese, úzkosti a se stresem souvisejících poruch, jako jsou posttraumatické stresové poruchy, panická porucha, generalizovaná anxiozní porucha, sociální fóbie a obsedantně kompulzivní porucha; inkontinence moči, různé mentální choroby, kašel, edém plic, různé gastrointestinální poruchy, například zácpa, funkční gastrointestinální poruchy, jako je syndrom dráždivého tračníku a funkční dyspepsie, • *· · * 9 9 · 9 9 · ♦ · · · • · · · . · · · 9 9 · «9 9 9 «· 99 · 9 ·

Parkinsonova nemoc a další motorické poruchy, traumatické poškození mozku, mrtvice, kardioprotekce po infarktu myokardu, poranění míchy a závislost na návykových látkách, včetně léčení zneužívání alkoholu, nikotinu, opioidních a jiných látek, a pro léčení poruch sympatického nervového systému, například hypertenze.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné jako analgetický prostředek pro použití v průběhu celkové anestézie a monitorované anestetické péče. Často se používají kombinace těchto prostředků s různými vlastnostmi za účelem dosáhnout vyvážených účinků nutných pro udržení stavu anestézie (například amnézie, analgézie, svalové relaxace a sedace). Do této kombinace patří inhalační anestetika, hypnotika, anxiolytika, neuromuskulární blokátory a opioidy.

Do rozsahu přítomného vynálezu patří též použití jakýchkoliv sloučenin obecného vzorce I uvedeného výše, pro výrobu léčiva pro léčení jakéhokoliv ze stavů vyčtených výše.

Dalším aspektem přítomného vynálezu je způsob léčení subjektu trpícího jakýmkoliv ze stavů vyčtených výše, přičemž se pacientovi, který zmíněnou léčbu potřebuje, podá účinné množství sloučeniny obecného vzorce I uvedeného výše.

Další aspekt přítomného vynálezu představují meziprodukty obecného vzorce II ve kterém • · · « • « · • · · · ·

PG je skupina chrániči urethanovou skupinu, jako je

Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo skupina chránící substituovanou benzylovou skupinu, jako je 2,4-dimethoxybenzylová s kupina.

Dále jsou uvedeny způsoby přípravy.

Příklady provedení vynálezu

Přítomný vynález bude nyní detailněji popsán následujícími příklady, které nejsou zamýšleny jako limitující pro přítomný vynález.

·· · · ·· ···· ·· ·

1Λ ·····♦ ····

IU « · «· · ® · · · · · • · · · « · * · · · ··<· * *· «· ·» ·· ·· Schéma 1

Syntéza vinylbromidového meziproduktu vzorce 6

Meziprodukt 3 terc-Butylester kyseliny 4-(4-methoxykarbonylbenzyliden)piperidin-1-karboxylové

Směs 11,2 g (49 mmol) výchozí látky 1 a 25 ml trimethylfosfitu se zahřívá pod dusíkem při zpětném toku po dobu 5 hodin. Přebytek trimethylfosfitu se odstraní současnou destilací s toluenem, čímž se dostane sloučenina 2 v kvantitativním výtěžku:

^XH NMR (CDC1₃) δ 3,20 (d, 2H, J = 22 Hz, CH₂) , 3,68 (d,

3H, J = 10,8 Hz, OCH₃), 3,78 (d, 3H, J = 11,2 Hz, OCH₃) , 3,91 (s, 3H, OCH₃), 7,38 (m, 2H, Ar-H), 8,00 (d, 2H, J =

Hz, Ar-H).

K roztoku sloučeniny 2 ve 200 ml suchého THF se při teplotě -78 °C přikape 32,7 ml (49 mmol) 1,5M lithiumdiisopropylamidu v hexanech. Reakční směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a potom se přidá 9,76 g (49 mmol) N-terc-butoxykarbonyl-4-piperidonu ve 100 ml suchého THF. Po 12 hodinách se reakce přeruší přidáním 300 ml vody a extrahuje se třikrát 300 ml ethyl-acetátu.

Spojené organické fáze se vysuší MgSO₄ a odpaří se, čímž se dostane surový produkt, který se čistí velmi rychlou chromatografií, a tím se připraví 5,64 g (35 %) sloučeniny 3 jako bílé pevné látky.

IR (NaCl) 3424, 2974, 2855, 1718, 1688, 1606, 1427,

1362, 1276 cm¹;

¹H NMR	(CDCI3) δ 1,44	(s,	1H), 2,31 (t, J = 5,5	Hz, 2H),
2,4	2 (t	, J = 5,5 Hz,	2H) ,	3,37 (t, J = 5,5 Hz,	2H), 3,48
(t,	J =	5,5 Hz, 2H),	3,87	(s, 3H), 6,33 (s, 1H)	, 7,20
(d,	J =	6, 7 Hz, 2H) ,	7,94	(d, J = 6,7 Hz, 2H) ;
¹³c	NMR	(CDCI3) δ 28,3	, 29	, 2, 36, 19, 51, 9, 123,7	, 127,8,
128	,7,	129,4, 140,5,	142,	1, 154,6, 166,8.

Meziprodukt 4 terc-Butylester kyseliny 4-brom-4-[brom-(4-methoxykarbonylfenyl)methyl]piperidin-l-karboxylové

Ke směsi 5,2 g (16 mmol) sloučeniny 3 a 1,0 g K2CO3 ve 200 ml suchého dichlormethanu se při teplotě 0 °C přidá roztok 2,9 g (18 mmol) bromu ve 30 ml CH₂C1₂. Po 1,5 hodině při teplotě místnosti se roztok po odfiltrování Κ₂ΟΟ₃ odpaří. Odparek se poté rozpustí ve 200 ml ethyl-acetátu, promyje se 200 ml vody, 200 ml 0,5M HCl, 200 ml vodného roztoku chloridu sodného a vysuší se MgSO₄. Odstranění rozpouštědel poskytne surový ·· • · · · φ φ • φ φ φ φφφφ produkt, který se rekrystalizuje z methanolu, čímž se dostane 6,07 g (78 %) sloučeniny 4, jako bílé pevné látky.

IR (NaCl) 3425, 2969, 1725, 1669, 1426, 1365, 1279, 1234 cm'¹ ;

NMR (CDC1₃) δ 1,28 (s, 9H) , 1,75 (m, 1H) , 1,90 (m,

1H), 2,1 (m, 2H), 3,08 (široký, 2H), 3,90 (s, 3H, OCH₃), 4,08 (široký, 3H), 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H), 7,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H);

¹³C NMR (CDCls) d 28,3, 36, 6, 38, 3, 40, 3, 52,1, 63,2, 72,9, 129,0, 130,3, 130,4, 141,9, 154,4, 166,3.

Meziprodukt 5 terc-Butylester kyseliny 4-[brom-(4-karboxyfenyl)methylen]piperidin-1-karboxylové

Roztok 5,4 g (11 mmol) sloučeniny 4 ve 300 ml methanolu a 100 ml 2,0M NaOH se zahřívá na teplotu 40 °C po dobu 3 hodin. Pevná látka se zachytí filtrací a suší se ve vakuu přes noc. Suchá sůl se rozpustí ve směsi 40 % acetonitrilu a vody a její pH se upraví na hodnotu 2 za použití koncentrované HCl. Filtrací se izoluje 3,8 g (87 %) sloučeniny 5 jako bílý prášek.

^XH NMR (CDCls) d 1,45 (s, 9H, ^fcBu) , 2,22 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 2,64 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H) , 3,34 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H) , 3,54 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H), 8,08 (d, J =

6,7 Hz, 2H, Ar-H);

·♦ · © · © © © · © · © © · © ··© ·· · · · ·

¹³C NMR (CDC1₃) δ 28,3, 31, 5, 34,2

44,0, 115,3, 128,7

129,4, 130,2, 137,7, 145,2, 154,6, 170,3.

Meziprodukt 6 terc-Butylester kyseliny 4-[brom-(4-diisopropylkarbamoylf enyl )methylen]piperidin-l-karboxylové

Do řídké suspenze 50,27 g (0,127 mol, 1,0 ekvivalent) kyseliny 5 v 350 ml ethyl-acetátu se při teplotě místnosti přidá 71,10 ml (0,510 mol, 4,0 ekvivalenty) diisopropylaminu a 44,90 g (0,140 mol, 1,1 ekvivalentu) 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborátu (TBTU). Po míchání výsledné řídké bílé suspenze po dobu 2 dnů se reakce přeruší přidáním 200 ml vody a získané dvě fáze se oddělí. Vodná fáze se extrahuje dvakrát 100 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se promyjí 150 ml 1M vodného roztoku HC1 a 100 ml vodného roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným, filtruje se a odpaří se za sníženého tlaku na řídký žlutý olej. Surový olej se rekrystaluje ve 300 ml terc-butyl(methyl)etheru. Filtrát se čistí velmi rychlou chromatografií při eluování směsí 30 % ethyl-acetátu a hexanů a rekrystaluje ze směsi ethyl-acetátu a hexanů v poměru 10 : 90. Bílé pevné látky o hmotnosti 47,28 g (78 %) se spoj i.

··*·

9 · 9 · · 9 · · · ···· 9 · · 9 9 9 9 • · · · 9 · · «99 9 9999

9999 999· ·· · · 9 ·· · · 9 · ·

Schéma 2

Palladiem katalyzovaná kondenzace a sejmutí chránící skupiny na meziprodukt vzorce 8

terc.-Butylester kyseliny 4-[1-(4-diisopropylkarbamoylfenyl)-1-(3-methoxyfenyl)methylen]piperidin-l-karboxylové

Do roztoku 8,26 g (17,2 mmol, 1,0 ekvivalent) vinylbromidu 6 ve 130 ml toleunu při teplotě místnosti se přidá 3,14 g (20,7 mmol, 1,2 ekvivalentu) kyseliny 3-methoxyfenylborité a potom 27 ml ethanolu a 21,5 ml (43,0 mmol, 2,5 ekvivalentů) 2,5M roztoku uhličitanu sodného ve 27 ml ethanolu. Po propláchnutí systému dusíkem během 15 minut se ke směsi přidá 1,43 g (1,24 ··♦· ·· · ··«· · · · ··· • · ·· ·· · ···· • · · · · · · ··· ··«·· • · · · · · « · ·· · • t · · *· · · * · · mmol, 0,072 ekvivalentu) tetrakis(trifenylfosfin) palladia a směs se potom uvede na teplotu 90 ’C, Po míchání přes noc se reakční směs ochladí na teplotu místnosti, reakce se přeruší přidáním 100 ml vody a fáze se oddělí. Organická fáze se promyje 100 ml vody a potom 50 ml roztoku chloridu sodného a vysuší se síranem sodným, filtruje se a odpaří za sníženého tlaku. Surový produkt se čistí velmi rychlou chromatografii při eluování směsí 50 % ethyl-acetátu a hexanů. Tak se dostane 7,5 g (86 %) sloučeniny.

Meziprodukt 8

4-[1-(3-Hydroxyfenyl)-l-piperidin-4-ylindenmethyl]-N,N-diisopropylbenzamid

K roztoku 5,61 g (11,05 mmol, 1,0 ekvivalent) karbamátu 7 ve 200 ml dichlormethanu se za teploty -78 °C přidá 110,7 ml (160,7 mmol, 10,0 ekvivalentů) 1M roztoku bromidu boritého v dichlormethanu při teplotě -78 °C. Reakční směs se potom nechá pomalu ohřát na teplotu místnosti. Po míchání během celé noci se reakce přeruší pomalým přidáváním methanolu za teploty 0 °C.

Směs se odpaří za sníženého tlaku. Surový olej se čistí velmi rychlou chromatografii za eluování směsí 15 % ethyl-acetátu v hexanech. Frakce se odpaří a rozpustí ve směsi 200 ml 0,lM vodné kyseliny chlorovodíkové a 200 ml dichlormethanu. Fáze se oddělí. Vodná fáze se upraví na hodnotu pH 9 přidáním l,0M vodného hydroxidu sodného s extrahuje se třikrát 200 ml ethyl-acetátu. Organické fáze se spojí a odpaří za sníženého tlaku, čímž se získá 2,88 g požadované sloučeniny v krystalické formě.

Výtěžek činí 66 %.

·· ···· • · · · · · · · · · • · ·· · · * ···· * · · · · · · · » · · ··· • · · · ···© ·· · • · · · ·· · · · · ©

320 mg (0,82 mmol) alikvotu aminu 8 zbaveného chrániči skupiny se čistí velmi rychlou chromatografií za eluování směsí 5% methanolu v dichlormethanu. Frakce se odpaří za sníženého tlaku a zředí diethyletherem a dichlormethanem. K této směsi se potom přidají asi 4 ml (přibližně 3,5 ekvivalentů) 1M HCI v diethyletheru.

Výsledná směs se potom odpaří za sníženého tlaku. Bílá pevná látka se rozetře s diethyletherem a odpaří se za sníženého tlaku, čímž se dostane 180 mg sloučeniny 8.

^XH NMR (400 MHz, DMSO) δ 7,19 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H),

7,12 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar-H), 7,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H,

Ar-H), 6,61 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,54 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,48 (široký s, 1H, NCH), 3,58 (široký s,

2H, NCH), 3,10 (široký s, 4H, CH₂), 2,46 (s, 2H, NCH₂) ,

2,40 (m, 2H, NCH₂) , 1,24 (široký s, 12H, CH₃) .

Sloučeniny z příkladů 1 až 12 se připravují syntézou podle obecného způsobu syntézy popsaného dále.

Schéma 3

Redukční aminace meziproduktu vzorce 8 na sloučeniny podle tohoto vynálezu

Způsob syntézy z příkladu 1 uvedeného dále je typický.

•4 ···· • 4

4 4 4 44 4 4 4 · • 4 44 44 · 444· • 44 ··· 4 444 44··· ···· 4 4 · · 4 4 4 • 4 4 4 44 4 4 ·· 4

Schéma 4

Redukční aminace meziproduktu vzorce 8 benzaldehydem k dosažení příkladu 1

Příklad 1

4-[1-(l-Benzylpiperidin-4-ylinden)-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid

K roztoku 390 mg (0,99 mmol, 1,0 ekvivalent) aminu ve 20 ml tetrahydrofuranu se přidá 121 μΐ (1,19 mmol,

1,2 ekvivalentu) benzaldehydu za teploty místnosti. Po míchání během 10 minut se k roztoku přidá 276 mg (1,30 mmol, 1,3 ekvivalentu) triacetoxytetrahydroboritanu sodného. Poté, co se reakční směs míchá přes noc, zředí se 10 ml dichlormethanu a 15 ml 2M vodného roztoku hydroxidu sodného. Fáze se oddělí a organická fáze se promyje 15 ml roztoku chloridu sodného. Dříve získaná vodná fáze se extrahuje třikrát 15 ml dichlormethanu. Organické fáze se spojí, vysuší se síranem sodným, filtruje se a odpaří za sníženého tlaku. Surový produkt se čistí velmi rychlou chromatografií za eluování směsí 5 % methanolu a dichlormethanu. Frakce se odpaří za sníženého tlaku a zředí diethyletherem a dichlor00 0000 methanem. K této směsi se přidají 4 ml (přibližně 3,5 ekvivalentu) 1M roztoku HCl v diethyletheru. Výsledná směs se potom odpaří za sníženého tlaku. Bílá pevná látka se rozetře s diethyletherem a odpaří se za sníženého tlaku, čímž se dostane 183 mg (36 %) sloučeniny z příkladu 1.

Elementární analýza pro C3₂H₃₈N₂O2.1,80 HCl:

Nalezeno: 70,16 % C, 7,21 % H, 4,55 % N,

Vypočteno: 70,10 % C, 7,32 % H, 5,11 % N.

Sloučeniny z příkladů 2 až 12 se připraví analogicky. Analytické údaje z příkladů 1 až 10 jsou uvedeny v tabulce 1 dále.

Tabulka 1

Analytické údaje pro sloučeniny z příkladů syntézy

Př. č.	R¹	Název	NMR údaje (400 MHz)
1	Ό	4-[1-(1-benzyl- (4001 piperidin-4-yliden) -1- 7,44^ -(3-hydroxyfenyl)- 7,15( ;657 methyl]-N,N-diiso- 1H propylbenzamid (brs, 3,02( l_ř22 (	4Hz, DMSO) 7,55 (m, 2H, Ar-H); X 3H, Ar-H); 7/23 (m, 2H, Ar-H); X 3H, Ar-H) ;6,65 (d, 1=8,0Hz, 1H) (d, 1=7,6Hz, 1H, Ar-H); 6,49 (s, σ-Η); 4,30 (s, 2H, NCH₂Ar); 3,.62 2H, NCH); 3,38 (m, 2H, CH₂); , X 2H, CH₂); 2,50 (m, 4H, NCH₂); m. 12H. CH?)

• * *

9 9

9 9 9

99999

9 9

9« 9 ·· 99 • 9 9 · • 9 99 • 9 · 9

9 9 ·

99 • 9

9

2		4-[1-(3-hydroxyfenyl)- -1-(l-thiofen-2-yl- methylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν,N- -diisopropylbenzamid	(400MHz, DMSO) 7,66 (m, 1H, Ar-H); 7,32 (br s, 1H, Ar-H); 7/6 (m, 2H, Ar-H) ; 7,09 (m, 4H, Ar-H); 6,64 (dd, J=l_zS_a8,4Hz, 1H, Ar-H) ; 6/4 (d, >8,4Hz, 1H, Ar-H); 6,46 (m, 1H, Ar-H); 4,52 (m, 2H, NCH₂Ar); 3,59 (br s, 2H, NCH); 3,38 (m 3H, CH₂) ; 2,97 (m, 1H, CH₂); 2/0 (br s, 4H, NCH₂) ; 1,24 (br s, 12H, 0%)
3	ω Ρ	4- [1- (3-hydroxyfenyl)- -1-(l-thiofen-4-yl- methylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν,N- -diisopropylbenzamid	(4001 7,61 ; 7/0 3H,/ Ar-H (brs, ,-3,59 CH₂) (brs,	4Hz, DMSO) 7,71 (m, 1H, Ar-H).; m, 1H, Ar-H); 7/6 (brs, 1H, Ar-H) (d, >8,4Hz, 2H, Ar-H); 7,12 (m, ď-H); 6,62 (dd, >1,9,7,4Hz, 1H, ; 6,54 (d, >7,4Hz, 1H, Ar-H); 6,46 1H, Ar-H); 4,27 (br s, 2H, NCH₂Ar) (br s, 2H, NCH) ; 3,38 (m, 3H, ; 2_f94 (m, 2H, CH₂, NC%); 2/5 3H, NCH₂) ;l/4( brs, 12H, CH₃)
4	G	4-[1-(3-hydroxyfenyl)- -1-(l-pyridin-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diisopropylbenzamid	(400: 7/8 2H,y >8Á 1H,7 2H,Í 3,40 2,54 CH₃)	SdHz, DMSO) 8,82 (m, 2H, Ar-H); (br s, 2H, Ar-H); 7/0 (d, >8,4Hz, ' ^r-H); 7,10 (m, 3H, Ar-H); 6,62 (d, Hz, 1H, Ar-H); 6,54 (d, >7,4Hz, : kr-H); 6,47 (m, 1H, Ar-H); 4,45 (s, lCH₂Ar); 3/8 (br s, 2H, NCH); (m, 2H, CH₂); 3,03 (br s, 2H, CH₂) ; (br s, 4H, NCH₂); 1,18 (br s, 12H,
5		4-[1-(3-hydroxyfenylh —1-(l-pyridin-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diisopropylbenzamid	(400MHz, DMSO) 8,63 (d, J=4,6Hz, 1H, Ar-H) 7?86 (dd, J=2,0, 7,4Hz, 1H, Ar-H) ; 7.58 (d, >7_f4Hz, 1H, Ar-H); 7,44 (dd, 1=4,6, 8,4Hz, 1H, Ar-H); 7,20 (d, J=8,4Hz, 2H, Ar-H); 7,08 (m, 3H, Ar-H); 6,62 (dd, >2,8, 7,4Hz, 1H, Ar-H); 6/4 (d, >7,4Hz, 1H, Ar-H) ; 6,47 (m, 1H, ArH); 4 84 (s, 1H, OH); 4,43 (m, 2H, NCH₂Ar); 3 59 (br s, 2H, NCH); 3 26 (br s, 4H, CH₂); 2/5 (br s, 4H, NCH₂) 1,22 (
	br s, 12H, CH₃).

·· · • · · • · · · • · ···· • · · ·· <

•4 ···· ·* «· • · · · • · »· • · · · • · » » ·· ·· ·· ··

6		4- [1-(l-furan-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)-1-(3-hydroxyfenyl) methyl]-N,N- -diisopropylbenzamid	(400J 7,24 3H,x 6,49 NCH (m,2 (brs,	sdHz, DMSO) 7,80 (m, 1H, Ar-H); (d, >8,.4Hz, 2H, Ar-H); 7_r15 (xn, Ar-H); q.71 (xn, 1H, Ar-H); 6,65 (d, >Hz, 1H, Ar-H); 6,56 (xn, 2H, Ar-H); (xn, 1H, Ar-H); 4,39 (br s, 2H, .₂Ar); 3,61 (br s, 2H, NCH); 3,44 H, CH₂); 2.99 (m,2H,CH₂); 2,49 4H, NCH₂); 1,22 (m, 12H, CH₃)
7	\ S-Jx	4-[1-(3-hydroxyfenyl)- -1-(l-thiazol-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν,N- -diisopropylbenzamid	(4003 7,93 2HJ 1H, · 6,49 ;3,5C 233,( brs,	Affifc, DMSO) 7,97 (m, 1H, Ar-H); (m, IH, Ar-H); 7_f24 (d, J=7,6Hz, Ar-H); 7,19 (m, 3H, Ar-H); 6,65 (m, Ar-H); 6,57 (d, J=7,6Hz, 1H, Ar-H); (s, 1H, Ar-H); 4,72 (s,.2H, N.CH₂Ar)· >(br s, 4H, NCH, CH₂); 3,15 (br s, 3H₂); 2,53 (br s,'4H, NCH₂); 1.20 ( 12H, CH₃)
8		4-[1-(3-hydroxyfenyl)- -1-[1-(lH-imidazol-2- -ylmethyl)piperidin-4~ -yliden]methyl]-Ν,N- -diisopropylbenzamid	.(4003 7,23 3HJ (d,J= H)X 2H,1 s,4H	SdHz, DMSO) 7,69 (s, 2H, Ar-H) ; (d, J=8,0Hz, 2H, Ar-H); 7,/4 (m, Ar-H); 6,66 (d, >7,6Hz, 1H); 6,58 =7,6Hz, 1H, Ar-H); 6,49 (s,,lH, Ar1,46 (br s, 2H, NCH₂Ar); 3,58 (br s, ÍCH) ; 3,20 (br s, 4H, CH₂); 2,55 (br , NCH₂); 1,02 (br s, 12H, CH₃)'
9	ÚX	4-[1-[1-(4-brom- benzyl)piperidin-4- -yliden]-1-(3-hydroxyfenyl) methyl] -N,N -diisopropylbenzamid	(400MHz, DMSO) 7,66 (d, J=8,4Hz, 2H, Ar-H); 7,51 (d, J=8.0Hz, 2H, Ar-H); 7/22 (d, >8,4Hz, 233, Ar-H) ; 7,15-(m, 3H, Ar-H) ;^65 (d, J=8,4Hz, 1H); 6,57 (d, J=7,2Hz, 1H, Ar-H); 6,49 (s, 1H, Ar-H); 4,29 (s, 2H, NCH₂Ar) ; 3,58 (br s, 2H, NCH); 3,36 (m, 2H, CH₂); 3,00 (m,2H, CH₂); 2,49 (m 4H, NCH₂); 117- ( br s, 12H, CH₃)

ni ·· ·· ······ ···

Z i · · · · Φ Φ · Φ · · ···· φφ φ φ φ · · ··· · · · · φ φ φ ····· • ••Φ φφφφ φ· φ • φ ·· φφ φφ φ· ·

10	XX 1	4 - [ 1 - [ 1 (4 -methoxy- (400MHz, DMSO) 7,44 (d, I=8_f0Hz, 2H, i benzyl) pyridin-4- Ar-H); 7,23 (d, I=8,0Hz, 2H, Ar-H); 7,15 _η. , . _n , , (m, 3H, Ar-H); §.99(d, I=8«8Hz, 2H, Ar- yliden) -1- (3-hydro- ,^_{65 J==8},_{0Hz> 1H)}. ^₇ xyfeny 1) methyl ] -N, N- 1=7,6Hz, 1H, Ar-H); 6,49 (s, 1H, Ar-H) ;> ... 4.23 (s, 2H, NCH₂At) ; 3,76 (s, 3H, OMe) -diisopropylbenzamid .^^^^^11)^,38(^2¾ CH₂); 2,99 (m, 2H, CH₂); 2,55 (br s, 4H, NCH₂); 1,15 (br s, 12H,C%)
11	b	4- [1- (l-furan-3-yl- (400MHz,DMSO) 7,81 (s, 1H, Ar-H) ; methylpiperidin-4- 7/71 (^s> Ar-H); 7,20 (d, 1=7,4Hz, 2H, Ar-H); 7,10 (m, 3H, Ar-H) ;6,69.(s·, 1H, -yliden) -1- (3- . ₆,₆₂ j₌₁,_9j g^_{4Hz> 1Hj}Ar-H). hydroxy fenyl) methyl ] - > 6,54 (d, 1=8,4Hz, 1H, Ar-H); 4^13 (s, 2H, NCH₂Ar); 3,59 (br s, 2H, NCH); -N, A-dn sopropy 1- _{3 37 Sj 2Hj} .^₉₂ (m, 2H, CH₂) ; b e n z ami d 2,49 (br s, 4H, NCH₂); ^.22 (br s, 12H, CH₃)
12	X H	4-[1-(l-pyrrol-2-yl- methylpiperidin-4- -yliden)-1-(3-hyd- roxyfenyl) methyl ] -N, N- -diisopropylbenzamid	(400MHz, CD3OD) 1,13 (br s, 6H, CEL) ; 1 48 (br s, 6H, CEL)'; 2,40-2,50 (m, 2H, CH_Z) ; 2,70-2,81 (m, 2H, (¾) ; 2,943.0<? (m, 2H, CH/ ; 3,46-3,50' (m, .2H, CH/; 3/2 (br s, 1H, NCH); 3,83 (br s, 1H, NCH) ; 6,13-6,15 (m, 1H, Ar-H) ; 6,32-6,34 (m, 1H, Ar-H) 6,50-6/2 (ra, 1H, Ar-H) ; 6/8-6,61 (m, 1H, Ar-H) ; 6,65-6.68 (m, 1H, Ar-H) ; 6,85-6,86 (m,
Poznámka: br = široký signál	1H, Ar-H) ; 7,12 (t, I=8Hz, 1H, Ar-H) ; 7,19-7/8 (m, 4H, Ar-H)

Farmaceutické prostředky

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu mohou být podány perorálně, intramuskulárné, subkutánně, topicky, intranazálně, intraperitoneálně, intrathorakálně, intravenózně, epidurálně, intrathekálně, intracerebroventrikulárně a injekcí do kloubů.

Výhodná cesta podání je perorální, intravenózní • · • · • · • · ·· ·· · · · · · • ·· · · · · ··· ···· ···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· · nebo intramuskulární.

Dávka bude závislá na způsobu podání, závažnosti onemocnění, věku a hmotnosti pacienta a dalších faktorech běžně posuzovaných ordinujícím lékařem při sestavování individuálního režimu a dávkové hladiny, tak aby toto bylo pro konkrétního pacienta nejvhodnější.

Pro výrobu farmaceutických prostředků ze sloučenin podle přítomného Vynálezu, mohou být inertní farmaceuticky přijatelné nosiče buď pevné nebo kapalné.

Pevné formy prostředků zahrnují prášky, tablety, dispergovatelné granule, kapsle, sáčky a čípky.

Pevným nosičem může být jedna nebo více látek a mohou též fungovat jako ředidla, ochucovací přípravky, rozpustnost podporující přípravky, lubríkační přípravky, suspendující přípravky, pojidla nebo přípravky podporující rozpadání tablet; mohou též být použity jako materiál pro enkapsulaci.

V případě prášků je nosičem jemně rozmělněná pevná látka, která je ve směsi s jemně rozmělněnou účinnou složkou. U tablet se účinná složka ve vhodných poměrech smísí s nosičem majícím nezbytné vazebné vlastnosti a stlačí se do požadovaného tvaru a velikosti.

Pro přípravu prostředků ve formě čípků se vosk s nízkou teplotou tání, jako je směs glyceridů mastných kyselin a kakaového másla, nejprve roztaví a do této hmoty se například mícháním disperguje účinná složka.

Roztavená homogenní směs se poté vlije do forem vhodné velikosti a nechá se ochladit a ztuhnout.

φ φφ φ φ · · · φ · ·· φφ» φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φ φφ φ φ φ ΦΟ « φ < · ·

Vhodnými nosiči jsou uhličitan hořečnatý, stearát hořečnatý, mastek, laktóza, cukr, pektin, dextrin, škrob, tragant, methylcelulóza, natrium-karboxymethylcelulóza, vosk s nízkou teplotou tání, kakaové máslo a látky jim podobné.

Soli zahrnují, avšak bez omezení na ně, farmaceuticky přijatelné soli. Příklady farmaceuticky přijatelných solí v rámci přítomného vynálezu zahrnují octan, benzensulfonát, benzoát, hydrogenuhličitan, hydrogenvinan, bromid, octan draselný, kamsylát, uhličitan, chlorid, citrát, dihydrochlorid, edetát, edisylát, estolát, esylát, fumarát, glukaptát, glukonát, glutamát, glykolylarsanilát, hexylresorcinát, hydrabamin, hydrobromid, hydrochlorid, hydroxynaftoát, isethionát, laktát, laktobionát, malát, maleát, mandlát, mesylát, methylbromid, methylnitrát, methylsulfát, mukát, napsylát, dusičnan, pamoát (embonát), pantothenát, fosfát/pyrofosfát, polygalakturonát, salicylát, stearát, subacetát, sukcinát, síran, tannát, tartarát, teoklát, triethiodid, benzathin, chlorprokain, cholin, diethanolamin, ethylendiamin, meglumin, prokain, hliník, vápník, lithium, hořčík, draslík, sodík a zinek.

Příklady farmaceuticky nepřijatelných solí v rámci přítomného vynálezu zahrnují hydrojodid, perchlorát, tetrafluorboritan. Farmaceuticky nepřijatelné soli mohou být použitelné pro jejich výhodné fyzikální a/nebo chemické vlastnosti, například krystalinitu.

Výhodné farmaceuticky přijatelné soli jsou hydrochloridy, sírany a hydrogentartaráty. Hydrochloridové a • · «444 · · · · • 4 44 4 4 4 4 • 44 444 4 444 • 4 4 4 4 44 4 4

4 4 4 4>> 4 4 síranové soli jsou obzvláště výhodné.

Termín prostředek zahrnuje formulaci zahrnující účinnou složku s enkapsulačním materiálem jako nosičem poskytujícím kapsli, ve které účinná složka (s nebo bez dalších nosičů) je obklopena nosičem, který je tímto s účinnou složkou v kontaktu. Obdobným způsobem jsou zahrnuty sáčky.

Tablety, prášky, sáčky a kapsle lze použít jako pevné dávkové formy vhodné pro perorální způsob podáni.

Prostředky v kapalné formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad kapalných prostředků vhodných pro parenterální podávání mohou být uvedeny roztoky účinných sloučenin ve sterilní vodě nebo směsi vody a propylenglykolu. Kapalné prostředky mohou být také formulovány jako vodný polyethylenglykolový roztok.

Vodné roztoky pro perorální podávání mohou být připraveny rozpuštěním účinné složky ve vodě a přidáním vhodných barvidel, ochucovacích přípravků, stabilizátorů a zahušťovacích přípravků, jak je třeba. Vodné suspenze pro perorální použití mohou být připraveny dispergováním jemně rozmělněné účinné složky ve vodě společně s viskózní látkou, jako jsou například přírodní a syntetické gumy, pryskyřice, methylcelulóza, natriumkarboxymethylcelulóza a jiné suspendační přípravky, které jsou ve farmaceutickém oboru známé.

Farmaceutické prostředky jsou s výhodou ve formě jednotkové dávky. V takovéto formě je prostředek rozdělen do jednotkových dávek obsahujících příslušná • 44 • 4 4 · · ·· • · • · · • · · · · · · · • · ·· · · · · • ·· ··· · · · · «··· · ·· · · e · · · ·· · · množství účinné složky. Formou jednotkové dávky může být balený prostředek, balení obsahující oddělená množství prostředků, například balené tablety, kapsle a prášky v láhvích nebo ampulích. Forma jednotkové dávky může být také kapsle, sáček nebo tableta jako takové, nebo to může být příslušný počet jakékoliv z těchto balených forem.

Biologické hodnocení

Model in vitro

Buněčná kultura

A. Lidské 293S buňky exprimující nakloňované lidské μ, δ a κ receptory a resistentní na neomycin se pěstují v suspenzi při teplotě 37 °C a v 5% C0₂, v třepacích nádobách obsahujících DMEM10%FBS bez vápníku, 5% BCS, 0,1% Pluronic F-68 a 600 gg/ml geneticinu.

B. Myší a krysí mozky se zváží a propláchnou ledově studeným PBS (obsahujícím 2,5 mM EDTA, pH = 7,4). Mozky se homogenizují polytronem po dobu 15 sekund (myší) nebo po dobu 30 sekund (krysí) v ledové studeném lytickém pufru (50 mM Tris, pH =7,0, 2,5 mM EDTA s fenylmethylsulfonylfluoridem přidaným těsně před použitím, připraveným na koncentraci 0,5 MmM z 0,5M zásobního roztoku ve směsi DMSO a ethanolu).

Příprava membrán

Buňky se peletují a opětovně suspendují v lytickém pufru (50 mM TriS, pH = 7,0, 2,5 mM EDTA s PMSF přidaným • · • · · · ·· · · · · ··«· · · · · · · • · · ·♦« · ··· ·· ···· ···· · · ·« ·· ·· ·© <· těsně před použitím, připraveným na koncentraci 0,1 mM z 0,lM zásobního roztoku v ethanolu), inkubují se na ledu po dobu 15 minut, potom se homogenizují polytronem po dobu 30 sekund. Suspenze se odstřeďuje při max. 1000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Supernatant se uchová na ledu a pelety se resuspendují a odstředí jak je uvedeno výše. Supernatanty z obou odstředění se spojí a odstřeďují při max. 46 000 g po dobu 30 minut. Pelety se opětovně suspendují ve studeném Tris pufru (50 mM Tris/Cl, pH =7,0) a znovu se odstředí. Konečné pelety se opětovně suspendují v membránovém pufru (50 mM Tris,

0,32M sacharózy, pH = 7,0). Alikvoty o objemu 1 ml v polypropylenových zkumavkách se zmrazí v směsi suchého ledu a ethanolu a uchovají se při teplotě -70 °C do doby, kdy se použijí. Koncentrace proteinu se stanoví modifikovaným Lowreyho stanovením s SDS.

Stanovení vazby

Membrány se rozmrazí při teplotě 37 °C, ochladí se na ledu, třikrát se pasážují 25G jehlou a zředí se vazebným pufrem (50 mM Tris, 3 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7888), pH = 7,4, který se po filtraci přes 0,22m filtr uloží při teplotě 4 °C, a do kterého se čerstvě přidá 5 μg/ml aprotininu, 10 μΜ bestatinu, 10 μΜ diprotinu A, bez DTT), Alikvoty o objemu 100 μΐ se přidají do vymražených 12x75 mm polypropylenových zkumavek obsahujících 100 μΐ příslušného radioaktivního ligandu a 100 μΐ testované sloučeniny v různých koncentracích. Za přítomnosti 10 μΜ naloxonu se stanoví celkové (TB) a nespecifické (NS) vazby. Zkumavky se ve vířivce inkubují při teplotě 25 °C po dobu 60 až 75 minut a poté se jejich obsah rychle přefiltruje ve vakuu a každá zkumavka se promyje přibližně 12 ml ledově chladného pufru (50 mM Tris, pH = 7,0, 3 mM MgCU) přes GF/B filtry (Whatman) předem namočené po dobu alespoň 2 hodin v 0,1% polyethyleniminu. Radioaktivita (dpm) zachycená na filtrech se měří prostřednictvím betačítače po namáčení filtrů po dobu alespoň 12 hodin v mininádobách obsahujících 6 až 7 ml scintilační tekutiny. Pokud se stanovení provádí na plotnách s 96 hlubokými jamkami, provede se filtrace přes unifiltry napuštěné PEI s 96 místy, které se promyjí třikrát 1 ml promývacího pufru a suší se v sušárně při teplotě 55 °C po dobu 2 hodin. Filtrační plotny se po přidání 50 μΐ MS-20 scintilační tekutiny na jamku čítají pomocí přístroje TopCount (Packard).

Funkční stanovení

Agonistická aktivita sloučenin se měří cestou stanovení stupně, do kterého komplex sloučenin a receptoru aktivuje vázání GTP na příslušné G-proteiny, se kterými se receptory vážou. V GTP stanoveních vazby se GTP[y]³⁵S kombinuje s testovanými sloučeninami a membránami HEK-293S buněk exprimujícími klonované lidské opioidní receptory nebo s membránami z homogenizovaných krysích a myších mozků. Agonisté stimulují vázání GTP[y]³⁵S na tyto membrány. Hodnoty EC₅₀ a E_max pro sloučeniny se stanoví z křivek závislosti odpovědi na dávce. Pro ověření, že agonistický účinek je zprostředkován delta receptory, se provedou posuny doprava křivek závislosti odpovědi na dávce delta-agonistou naltrindolem.

Postup pro GTP z krysích mozků • · « · 9 0 « »3 · ♦ · · • · 9 0 ··

Krysí mozkové membrány se rozmrazí při teplotě 37 °C, třikrát se pasážují 25G jehlou s tupým koncem a zředí se pro GTPyS vázání (50 mM Hepes, 20 mM NaOH, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, pH = 7,4, čerstvé se přidá: 1 mM DTT, 0,1% BSA). Nakonec se do membránových ředění přidá 120 μΜ GDP. Hodnoty EC₅o a E_max pro hodnocené sloučeniny se stanoví z křivek závislosti odpovědi na dávce o 10 bodech získanými při 300 μΐ s příslušným množstvím membránového proteinu (20 μg na jamku) a 100 000 až 130 000 dpm GTP[y]³⁵S na jamku (0,11 až 0,14 nM). Bazální a maximální stimulované vazby se stanoví v nepřítomnosti a za přítomnosti 3 μΜ SNC-80.

Analýza dat

Specifické vazby (SB) se vypočítají jako TB-NS a SB za přítomnosti různých testovaných sloučenin se vyjádří jako procento z kontrolní SB hodnoty. Hodnoty IC₅₀ a Hillův koeficient (n_H) pro ligandy týkající se vytěsňování specificky vázaného radioaktivního ligandu se vypočítají z logit záznamů pro prokládání grafů nebo z křivek, jako jsou Ligand, GraphPad Prism, SigmaPlot nebo ReceptorFit. Hodnoty Ki se vypočítají z Cheng-Prussoffovy rovnice. Střední hodnoty + směrodatné odchylky IC₅₀, K± a n_H jsou uvedeny pro testované ligandy v alespoň třech vytěsňovacích křivkách. Biologická aktivita sloučenin podle přítomného vynálezu je znázorněna v tabulce 2.

Tabulka 2

Biologická data

Př. č.	HDELTA (nM)	Krysí mozek (nM)	Myší mozek	(nM)
	ic₅₀	ec₅₀	%E_max	C50	%E_max	EC50
I až II	0,36- 1,45	0,26- 0,91	91-97	0,85- 7,28	95-170	0,88- 6,28	96-163

Experimenty se saturací receptoru

Hodnoty Kg pro radioaktivní ligandy se stanoví provedením vazebných stanovení na buněčných membránách za použití vhodných radioaktivních ligandů v koncentracích pohybujících se v rozmezí 0,2- až 5-násobku stanovené Kg (až 10-násobek, pokud jsou požadovaná množství radioaktivního ligandu proveditelná).

Specifické vázání radioaktivního ligandu se vyjádří jako pmol/mg membránového proteinu. Hodnoty Kg a B_max z jednotlivých experimentů se dostanou z nelineárních grafů specificky vázaného (B) versus nM volného (F) radioaktivního ligandu z individuálních pokusů podle jednomístného modelu.

Stanovení mechano-alodynie za použití von Freyova testování

Testování se provede mezi 8:00 a 16:00 hodinou za použití metody popsané Chaplanem a kol. (1994). Krysy se umístí do plexisklových klecí na drátěné síťové dno umožňující přístup ke končetině a nechají se po dobu 10 až 15 minut přizpůsobit. Testovaná oblast je ve střední • · • 0

0 0

0 · · • · 0 0 · · * · ♦ 0 00 0 · · ·

00 000 0 «00 «000 «00· ·0 » • 0 0· «· ·· 0 · * plantární části levé zadní packy mimo méně senzitivní části plosky. Končetina je drážděna sérií osmi von Freyových vláken s logaritmicky rostoucí tuhostí (0,41, 0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51 a 15,14 gramů;

Stoelting, 111. USA). Von Freyovo vlákno se aplikuje zespoda přes síťové dno klece kolmo na plantární povrch dostatečnou silou tak, aby se dosáhlo lehkého ohnutí proti pacce, a tak se drží po dobu přibližně 6 až 8 sekund. Pozitivní odpověď se zaznamená v případě, kdy je packa prudce stažena. Škubnutí ihned po odstranění vlákna se též považuje za pozitivní odpověď. Pohyb jako takový se považuje za nejednoznačnou odpověď, a v tomto případě se stimulace opakuje.

Testovací protokol

Zvířata z FCA-léčené skupiny se testují v pooperační den 1. 50% práh pro prudké stažení packy se určí za použití „up-down metody podle Dixona (1980). Testování je zahájeno vláknem o hmotnosti 2,04 g uprostřed série. Stimuly jsou vždy aplikovány postupným způsobem, at už směrem nahoru či dolů. Při nepřítomnosti reakce - stažení packy při stimulaci iniciálně zvoleným vláknem, se aplikuje silnější stimulus; pokud se objeví reakce - stažení packy, zvolí se další slabší stimulus. Optimální vypočítání prahu touto metodou vyžaduje 6 odpovědí v bezprostřední blízkosti 50% prahu a čítání těchto 6 odpovědí se zahájí v momentě, kdy dojde k prvé změně odpovědi, například v momentě, kdy je práh poprvé překročen. V případech, kdy prahy spadají mimo rozmezí stimulů se přiřadí hodnoty 15,14 (normální citlivost) nebo 0,41 (maximálně alodynický). Výsledný vzor pozitivních a negativních odpovědí se vynese do tabulky • · · · • i · * · · · · » ··· · * * · ··*· « · · · < · * · · * · « tt · · ·· ·* * * * končetiny; O se interpoluje za za použití konvence X = žádné stažení stažení končetiny, a 50% práh stažení použití vzorce:

50% g práh = 10^{(xf + k5)}/10 000 kde

Xf = číslo posledního použitého von Freyova vlákna (log jednotky);

k = tabulková hodnota (Chaplan a kol. (1994)) pro vzor pozitivních/negativních odpovědí; a δ = střední odchylka mezi jednotlivými stimuly (log jednotky), zde δ = 0,224.

Von Freyovy prahy se převedou na procento maxima možného efektu (% MPE) podle Chaplana a kol. (1994). Pro vypočítání % MPE se použije následující rovnice:

léčivem léčený práh (g) - práh alodynie (g) %MPE =__:_ x 100 kontrolní práh (g) - práh alodynie (g)

Podání testované látky

Testovaná látka se před von Freyovým testováním krysám injikuje (subkutánně, intraperitoneálně, intravenózně nebo perorálně), časový odstup mezi podáním testované sloučeniny a von Freyovým testováním se liší v závislosti na povaze testované sloučeniny.

Writhingův test ·· · · • · · • · · · ·· · · * · • · «· · · · ··· • φ» ··· · · · · ·· « · · · « · * · * · • a a a ·· *» «*

Pokud se myši podá intraperitoneálně kyselina octová, vyvolají se abdominální křeče. Ty se dále šíří myším tělem typickým způsobem. Při podání analgetik se popsané křeče pozorují méně často a léčivo je vybráno jako potenciální dobrý kandidát. Za kompletní a typický Writhingův reflex se pokládá pouze v případě přítomnosti následujících prvků: zvíře se nehýbá, dolní část zad je v lehké depresi, lze sledovat plantární část obou pacek.

Při tomto stanovení demonstrují sloučeniny podle přítomného vynálezu signifikantní inhibici Writhingova reflexu při perorálním dávkování 1 až 100 gmol/kg.

i) Příprava roztoků

Kyselina octová (AcOH): 120 μΐ kyseliny octové se přidá do 19,88 ml destilované vody za účelem získání konečného objemu 20 ml roztoku o konečné koncentraci 0,6 % AcOH.

Tento roztok se poté míchá (vířením) a připraví se pro injekci.

Sloučenina (léčivo): Každá sloučenina se připraví a rozpustí se v nejvhodnějším vehikulu standardními postupy.

ii) Podání roztoků

Sloučenina (léčivo) se podává perorálně, intraperitoneálně (i.p.), subkutánně (s.c.) nebo intravenózně (i.v.) v množství 10 ml/kg (pro průměrnou tělesnou hmotnost myši) 20, 30 nebo 40 minut (podle třídy sloučeniny a jejich charakteristik) před testováním. Pokud se sloučenina podává centrálně, podá se intraventrikulárně (i.c.v.) nebo intrathekálně (i.t.)

4 4 4

4

4 4

4 4 4 4 objem 5 μΐ.

Kyselina octová se podává intraperitoneálně (i.p.) do dvou míst v množství 10 ml/kg (pro průměrnou tělesnou hmotnost myši) těsně před testováním.

iii) Testování

Zvíře (myš) se sleduje po dobu 20 minut a na konci experimentu se zaznamená a shromáždí se počet příhod Writhingova reflexu. Myši se udržují v individuálních krabicových klecích s kontaktní podložkou. Většinou se současně sledují celkem 4 myši - jedna kontrolní a tři s různými dávkami léčiva.

U úzkosti a v případě anxiosních indikací se účinnost u krysy stanovuje Geller-Seifterovým konfliktním testem.

U indikace v případě funkční gastrointestinální poruchy se účinnost u krysy určuje stanovením popsaným v publikaci S. V. Coutinho a kol., American Journal of Physiology - Gastrointestinal & Liver Physiology, 282(2), G307 až 316 (únor 2002).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina obecného vzorce I (I) ve kterém

R¹ je vybrán z jakékoliv

i) fenylové skupiny ii) pyridylové skupiny iii) thienylové skupiny iv) furylové skupiny • · · · • · · · • · · · «

H

N ·· · ·

v) imidazolylové skupiny vi) triazolylové skupiny

Ar vii) pyrrolylové skupiny viii) thiazolylové skupiny ix) pyridyl-N-oxidu;

kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty vybranými z přímé nebo rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, N0₂, CF₃, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu;

stejně tak jako její soli.

• · ·· • · · · · · • · · · · · · © · · ♦ · ··«·© © · · · · © ♦ • · © · © · ·
2. Sloučenina podle nároku 1, kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými z methylové skupiny, CF₃, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu.
3. Sloučenina podle nároku 1, kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován methylovou skupinou.
4. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina, pyridylová skupina, thienylová skupina nebo furylová skupina.
5. Sloučenina podle nároku 1, která je vybraná z jakékoli z těchto sloučenin:

4-[1-(l-benzylpiperidin-4-yliden)-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-(l-thiofen-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-(l-thiofen-3-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-(l-pyridin-4-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-(l-pyridin-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(l-furan-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-(l-thiazol-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(3-hydroxyfenyl)-1-[1-(lH-imidazol-2-ylmethyl)piperidin-4-yliden]methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-[1-(4-brombenzyl)piperidin-4-yliden]-1-(3-hydroxy• · · fenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-(l-pyrrol-2-ylmethyIpiperidin-4-yliden)-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid;

4-[1-[1-(4-methoxybenzyl)piperidin-4-yliden]-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid; a 4-[1-(l-furan-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)-1-(3-hydroxyfenyl)methyl]-N,N-diisopropylbenzamid.
6. Sloučenina podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, která je ve formě hydrochloridové, dihydrochloridové, síranové, tartaratové, ditrifluoracetatové nebo citratové soli.
7. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci sloučeniny obecného vzorce II ve kterém

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná chránící skupina benzylové skupiny, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina;

s kyselinou 3-hydroxyfenylboritou, za použití palladiového »· 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 999 « · katalyzátoru, například Pd(PPh₃)₄, za přítomnosti báze, jako je například Na₂CO₃, za získání sloučeniny obecného vzorce III (III) ze které se posléze za standardních podmínek sejme chránící skupina a alkyluje se za redukčních podmínek sloučeninou obecného vzorce R¹-CHO, za získání sloučeniny obecného vzorce I.
8. Sloučenina podle nároku 1 pro použití v terapii.
9. Sloučenina podle nároku 8, kde terapií je snaha o zvládnutí bolesti.
10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t i m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 obecného vzorce I jako účinnou složku společné s farmaceuticky přijatelným nosičem.
11. Způsob léčení bolesti, vyznačující se tím, že se subjektu potřebujícímu léčbu bolesti podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce

I.
12. Způsob léčení funkčních gastrointestinálních r · · * tím, že se subjektu poruchou podává účinné • o • · · • »· · poruch, vyznačující se trpícímu funkční gastrointestinální množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I.
13. Způsob léčení úzkosti, vyznačující se tím, že se subjektu trpícímu úzkosti podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I.

ve kterém

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná benzylová chrániči skupina, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina.
15. Sloučenina obecného vzorce III ·· ···· ·· · • ·

4o ; :: : · i ϊ· ί * ί ί *’· «· ·· ·· ·· ♦· ·

A?

ve kterém

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo chránící skupina substituované benzylové skupiny, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina.