CZ20021891A3

CZ20021891A3 - Amycomycin, způsob jeho přípravy a farmaceutické prostředky, které ho obsahují

Info

Publication number: CZ20021891A3
Application number: CZ20021891A
Authority: CZ
Inventors: Cordula Hopmann; Michael Kurz; Heinrich Decker; Beller Dominique Le; Jozsef Aszodi
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-11-25
Publication date: 2002-08-14
Also published as: ES2243332T3; YU13102A; SK7872002A3; EP1237866A1; HU225194B1; ZA200204420B; US6642391B2; US20010018450A1; EE05219B1; BR0016223A; CA2393518C; PL355627A1; SI1237866T1; NO20022654L; CN1377341A; MEP28508A; AU781398B2; RU2002118116A; HUP0203593A3; CZ294370B6

Description

Amycomycin, způsob jeho přípravy a farmaceutické prostředky, které ho obsahuji

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sloučeniny nazvané amycomycin, kterou lze získat kultivací mikroorganismu Amycolatopsis sp., ST101170 (DSM 12216), a jejích farmaceuticky přijatelných solí a derivátů. Dále se předkládaný vynález týká způsobu přípravy amycomycinu, použití amycomycinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů jako léčiv, zejména jejich použití jako antibiotik, a farmaceutických kompozic obsahujících amycomycin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo derivát.

Dosavadní stav techniky infekcích způsobených kmeny Staphylococcus aureus resistentními vůči methicillinu je známo, že jsou u určitých stavů, jako např. ran a popálenin, převládající. Vancomycin a teicoplanin, které náleží ke glykopeptidové skupině antibiotik, jsou jedinými dvěma antibiotiky klinicky používanými k léčení infekcí způsobených kmeny Staphylococcus aureus resistentními vůči methicillinu. Neboť se však v nedávné době objevily kmeny resistentní vůči vancomycinu a kmeny resistentní vůči teicoplaninu, jsou tyto infekce považovány za nebezpečné a fatální. Proto započalo intenzívní hledání strukturálně odlišné skupiny sloučenin účinných proti těmto kmenům resistentním vůči vankomycinu a teicoplaninu. Dříve byl, jako antibiotikum účinné proti kmenům resistentním vůči vankomycinu a teicoplaninu, popsán například cyklický thiopeptid methylsulfomycin I (EP-A-0818539 ze dne 11. července 1996).

• ·· · ·♦ • « • » »* · ♦ · · · · ·· • · · * ♦ * · * • · · ♦ · ♦ «· ·

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že nová sloučenina nazvaná amycomycin má antibiotickou účinnost. Předkládaný vynález se proto týká sloučeniny vzorce:

a jejích farmaceuticky přijatelných solí a derivátů, jako jsou estery, ethery a další odvoditelné chemické ekvivalenty, což zahrnuje i všechny stereoisomerní formy a všechny tautomerní formy.

Amycomycin obsahuje charakteristický zbytek kyseliny tetramové s vysoce oxygenovaným bočním řetězcem obsahujícím 45 uhlíkových atomů. Její molekulový vzorec je C65H115NO18, a lze ji získat kultivací mikroorganismu Amycolatopsis species ST101170 (DSM 12216) za aerobních podmínek v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, následované izolací a purifikací známými způsoby. Mikroorganismus ST101170 patří do řádu Actinomycetales, rodu Amycolatopsis a byl uložen 4 června 1998 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH), Braunschweig, Německo a bylo mu uděleno číslo DSM č. 12216.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy sloučeniny nazvané amycomycin pomocí mikroorganismu amycolatopsis species ST101170, jeho mutací a variací, za aerobních * · » · 99 • 9

9999

9

9 99 podmínek v živném prostředí obsahujícím jeden nebo více zdrojů uhlíku a jeden nebo více zdrojů dusíku a popřípadě živné anorganické soli nebo/a stopové prvky, následné izolace uvedené sloučeniny a purifikace obvyklými způsoby.

Mutace a variace mikroorganismu ST101170 mohou být také schopné syntetizovat sloučeninu podle předkládaného vynálezu. Tyto mutace lze vytvořit známými způsoby pomocí fyzikálních prostředků, například záření, jako jsou ultrafialové záření a paprsky X, nebo pomocí chemických mutagenů, jako jsou ethylmethylansulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-methoxy-benzofenon (MOB), nebo N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG).

Vyhledávání vhodných mutací a variací, které mohou vytvářet sloučeninu podle předkládaného vynálezu, lze provádět pomocí stanovování biologické účinnosti účinných sloučenin hromadících se v kultivačním bujónu, například pomocí testování antibakteriálního účinku, zejména proti kmenům resistentním vůči vancomycinu (viz. tabulka 2 níže).

Výhodnými zdroji uhlíku vhodnými pro aerobní fermentaci jsou asimilovatelné uhlovodíky a cukerné alkoholy, jako jsou glukóza, laktóza nebo D-Mannit, a rovněž tak přírodní produkty obsahující uhlovodíky, jako je sladový výtažek. Vhodnými zdroji dusíku jsou například aminokyseliny, peptidy a proteiny, což zahrnuje i jejich degradační produkty, jako jsou peptony a tryptony, masový výtažek, mletá semena, například kukuřice, bílé fazole, sójy nebo bavlníku, destilační zbytky z výroby alkoholu, masná močka a kvasnicové extrakty, avšak také ammoniové soli a nitráty. Vhodnými anorganickými solemi, které může živný roztok obsahovat, jsou například chloridy, uhličitany, sírany a fosforečnany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, iontů, zinku, kobaltu nebo hořčíku.

Tvorba amycomycinu probíhá obzvláště dobře například v živném prostředí obsahujícím přibližně 0,5 až 5 % škrobu

4444 44 • «

44 4 • 4 44 · 4 4

4 4 (rozpustného), výhodně 1 až 2 %, přibližně 0,5 až 5 % glukózy, výhodně 1 až 3 %, přibližně 0,5 až 5 % glycerinu, výhodně 1 až 2 %, přibližné 0,1 až 0,5 % kukuřičného výluhu, výhodně 0,2 až 0,3 %, přibližně 0,2 až 1 % peptonu, výhodně 0,4 až 0,6 %, přibližně 0,1 až 0,5 % kvasnicového extraktu, výhodně 0,2 až 0,4 %, přibližně 0,05 až 0,2 % chloridu sodného, výhodně 0,1 až 0,2 % a přibližně 0,1 až 0,5 % uhličitanu vápenatého, výhodně 0,2 až 0,3 %. Tato množství jsou hmotnostní a jsou vztažena k celému živnému prostředí.

Kultivace ST101170 se provádí za aerobních podmínek, například submerzně pomocí protřepávání nebo míchání v protřepávacích nádobách nebo laboratorních fermentačních nádobách, popřípadě se zavedením vzduchu nebo kyslíku. Kultivaci pomocí fermentace lze provádět například ve sterilních lahvích se širokým hrdlem nebo nádobách s kruhovým dnem rozličných objemů, ve skleněných fermentačních nádobách nebo V₂A-ocelových nádržích.

Kultivaci ST101170 lze provádět při teplotách, které se pohybují přibližně mezi 20 a 35° C, výhodně mezi přibližně 25 a přibližně 30° C, a pH pohybujícím se mezi 4 a 10, výhodně mezi 6 a 8. Za těchto podmínek se mikroorganismy kultivují obvykle po dobu 20 až 200 hodin, výhodné 24 až 150 hodin.

Kultivace se výhodně provádí v několika stupních. Nejprve lze připravit jednu nebo více předkultur v kapalném živném prostředí. Hlavní kultura, t j. aktuální produkční prostředí se poté inokuluje předkulturou například v objemovém poměru činícím 1:10. Předkultura se získá například inokulací živného prostředí sporifikovaným myceliem a kultivací po dobu přibližně 20 až 120 hodin, výhodně 24 až 90 hodin. Sporifikované mycelium lze získat například růstem mikroorganismů po dobu přibližně 1 až 40 dní, výhodné 5 až 12 dní, na pevném či kapalném živném prostředí jako je kvasnico-sladový agar nebo bramboro-dextrózový agar.

···· 9« • ·

Průběh fermentace a tvorbu amycomycinu lze monitorovat způsoby odborníkovi známými, jako například pomocí měření biologické aktivity kultivačního bujónu v bioanalýzách nebo pomocí chromatografických metod jako jsou tenkovrstevná chromatografie (DC) nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC).

Sloučenina zvaná amycomycin je přítomna v kultivačním filtrátu a rovněž tak v myceliu. Obvykle je však významné množství obsaženo v myceliu. Sloučeninu lze izolovat pomocí známých separačních technik. Z kultivačního filtrátu ji lze tedy získat například filtrací nebo odstřeďováním. Filtrát lze získat pomocí rozpouštědla nemísitelného s vodou jako jsou 1-butanol, ethylacetát, chloroform, dichlormethan apod., výhodně butanol nebo ethylacetát.

Účinnou látku lze také získat z mycelia pomocí extrakce rozpouštědlem mísitelným s vodou jako jsou methanol, aceton, acetonitril, n-propanol nebo isopropanol, výhodně methanol nebo aceton, nebo rozpouštědlem nemísitelným s vodou jako jsou t-butanol, ethylacetát, chloroform, dichloromethanol apod., výhodně butanol nebo ethylacetát.

Extrakci kultivačního filtrátu lze provádět v širokém rozmezí pH. Je však výhodné extrakci provádět v neutrálním nebo v lehce kyselém prostředí, výhodně při pH pohybujícím se mezi 4 a 9. Organický extrakt lze koncentrovat ve vakuu a sušit za vzniku účinné surové látky.

Izolaci a purifikaci sloučeniny zvané amycomycin lze provádět známými způsoby, které berou v úvahu chemické, fyzikální a biologické vlastnosti přírodní sloučeniny.

Jednou z metod izolace amycomycinu podle vynálezu je dělení roztoku způsoby o sobě známými.

• 999 99 • 9 ·«·· • 9 9* • · · 9 » · · · ♦ · 9 · 9 · * • 9 9 9 * · « · · · ·· ··«

9· ·· * »9 9 • · · « · • · # • · «···

Jinou metodou purifikace amycomycinu je chromatografie na adsorpčních pryskyřicích jako Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), na Amberlite® XAD 7 (Rohm and Haas, USA), on Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) nebo na podobných pryskyřicích. Separaci lze provádět v širokém rozmezí pH. Výhodně toto rozmezí pH činí 1 až 9, výhodněji činí 2 až 8. Vhodné jsou též četné nosiče pro chromatografii s reversní fází, například RPe a RPie, které byly publikovány ve spojení s vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC). Další z možností purifikace sloučeniny podle vynálezu spočívá v použití tzv. nosičů pro chromatografii s normální fází jako jsou silikagel nebo AI2O3 (oxid hlinitý) či jiné, způsoby o sobě známými. K tomuto účelu jsou vhodné mnohé eluenty jako jsou dichlormethan, chloroform, methanol, ethylacetát, aceton, petrolether nebo jejich kombinace. Hodnotu pH lze upravovat například přidáním triethylaminu.

Alternativním způsobem izolace sloučeniny zvané amycomycin je použití melokulárních sít jako jsou Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 a jiné, způsoby o sobě známými. Dále je také možné získat sloučeninu zvanou amycomycin ze surového materiálu krystalizací. K tomu jsou vhodná například organická rozpouštědla a jejich směsi, bezvodá nebo s přídavkem vody.

Dalším způsobem izolace a purifikace sloučeniny podle předkládaného vynálezu spočívá v použití aniontových měničů, výhodně v rozmezí pH činícím 7 až 10, a kationtových měničů, výhodně v rozmezí pH činícím od 3 do 7. Obzvláště vhodné k tomuto účelu je použití pufrovacích roztoků k nimž se přidá určité množství organického rozpouštědla.

Dalším možným způsobem purifikace je protisměrná chromatografie s použitím dvoufázových eluačních systémů zhotovených ze dvou nebo více rozpouštědel jako jsou voda, ·· ♦♦·· • « • *·· * · · · ·· » 9*9

99 99 ·♦* *t methanol, ethanol, butanol, isopropanol, aceton, dichlormethan, ethylacetát nebo petrolether.

Sloučeninu zvanou amycomycin nebo její chemické deriváty lze přeměnit na odpovídající farmakologicky přijatelné soli způsoby odborníkovy v oboru známými.

Farmakologicky přijatelnými solemi sloučenin podle vynálezu jsou anorganické soli nebo organické soli jako například ty popsané v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydání, str. 1418, 1985). Možnými solemi jsou soli alkalických kovů, ammoniové soli, soli kovů alkalických zemin, soli s fysiologicky přijatelnými aminy a soli s anorganickými a organickými kyselinami jako jsou kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina maleinová a kyselina fumarová.

Odvoditelnými chemickými ekvivalenty sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny s drobnými chemickými odlišnostmi, které však mají shodné nebo podobné účinky, nebo sloučeniny, které lze lehce přeměnit na sloučeniny podle vynálezu. Příklady odvoditelných ekvivalentů jsou estery, ethery, aminoderiváty, komplexy nebo addukty sloučenin podle vynálezu nebo se sloučeninami podle vynálezu.

Estery lze připravit například reakcí amycomycinu s karboxylovými kyselinami v přítomnosti činidel jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), nebo podrobením této sloučeniny působení acylačníhočinidla jako je chlorid kyseliny.

Ethery lze z amycomycinu připravit například reakcí s alkylačními činidly za bazických podmínek.

Další způsoby přípravy esterů a etherů jsou popsány v literatuře, například v Advanced Organic Synthesis, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons., 1992.

φ· • * • ΦΦΦ · · φ φ * · φφ φφ ·· φ*· *· «φφφ

Chemickými ekvivalenty mohou být stabilní komplexy s ionty kovů, např. přechodných kovů jako jsou La³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, které jsou typické pro deriváty kyseliny tetramové a lze je připravit způsoby popsanými v literatuře (K. Tanaka a kol., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901, K. Matsuo, Chem. Pharm.

Bull. 1980, 28, 2494).

Dvojné vazby bočních alkylových řetězců lze redukovat způsoby, které jsou popsány v literatuře, například v P. N. Rylander, „Hydrogenation Methods, Academie Press, New York, 1985, kapitola 2, nebo je lze hydrohalogenovat způsoby popsanými v H. O. House, „Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, lne., New York, 1972, str. 446 až 452. Hydroxylované deriváty lze připravovat reakcí dvojných vazeb s činidly jako je OsO₄, jak je popsáno v literatuře, např. v Chem. Rev. 1980, 80, 187.

Deriváty lze vytvořit také konverzí dvojných vazeb na epoxidy pomocí oxidace, např. m-chlorperoxybenzoovou kyselinou (MCPBA), jak je popsáno v Advanced Organic Synthesis, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons., 1992.

Fyzikáně-chemické a rovněž tak spektroskopické charakteristiky sloučeniny zvané amycomycin podle předkládaného vynálezu jsou následující:

Vzhled: bezbarvá pevná látka, rozpustná v methanolu, dimethylsulfoxidu (DMSO), pyridinu

Molekulový vzorec: C65H115NO18

HPLC (vysokotlaká kapalinová chromatografie):

Sloupec: Purospher Star RP.18e (Merck), 55 x 4 mm, 3 pm

Eluent: CH₃CN/0,01 % H₃PO₄ (85%)

4444

Gradient:

4444 44 • 4 ·

4 4

4 4 • 4 4 4 • 4 44

4-44 4

4 « ♦ 444 · * « 4

4 4 « 4

Čas (min)	% ch₃cn
0,00	5,0
3,00	95,0
5,00	95,0
6, 00	5,0
10,00	5,0

Tok: 2 ml/min Teplota: 40° C

Detekce: 210 nm, 254, 280, 320, 380 t_R: 2,67 min

Molekulová hmotnost: 1198,64

Hmotová spektrometrie (HR-FAB-MS): 1220,801187 [M+Na]⁺a ¹³C-NMR: viz tabulka 1

UV/VIS (viditelné světlo):

methanol (MeOH) , _max(log ) = 229 nm (3,29), 281 (3,16)

Tabulka 1

Chemický posun amycomycinu v deuteromethanolu (MeOD) při 300 K

	¹H	¹³c

1	0.86	14.76
2	0.97	20.83
3	1.89	31.20
4	3.41	82.20
5	1.70	39.55

4»

- 10 4444 ♦* • 4 4

4 ·

4 4

4 4 4 • 4 4«

4 ► 444

4«

4 4

4 • 4

4 ► «444

6	0.77	13.63
7	3.54	80.19
8	1.65	36.32
9	0.86	12.71
10	1.43	31.20
11	1.44	36.46
12	3.75	71.98
13	1.62/1.54	44.79
14	3.74	72.22
15	1.58/1.37	36.46
16	1.63/1.14	29.27
17	1.51	40.69
18	0.90	15.70
19	3.70	72.90
27	1.51/1.46	42.12
28	4.07	66.31
29	1.52	42.12
30	3.80	72.54
31	4.33	73.26
32	6.62	142.18
33	-	138.47
34	1.83	12.75
35	-	206.04
36	4.21	41.00
37	1.14	17.77
38	5.36	128.37
39	-	138.72
40	1.69	12.75
41	3.98	80.54
42	1.64	41.25
43	0.88	8.02

···· ·· ♦ · · • · · * · · • · · · ♦ 4 ·· ♦♦ ·-*·« • · * • · *♦· • · · • · * ·♦ ·»* ··

4 » · • * * • · » »* «444

44	3.59	73.88
45	1.49	36.46
46	1.62/1.32	23.50
47	1.55/1.32	33.34
48	3.80	75.09
49	1.74	42.71
50	0.77	11.92
51	3.41	77.87
52	1.61	36.46
53	0.86	12.75
54	1.55/1.32	31.37
55	1.61/1.44	36.46
56	3.77	71.83
57	1.67	44.53
58	3.92	71.12
59	2.30	37.54
60	5.84 (b)	-131.7 (c)
61	-	(c)
62	1.82	13.81
63	-	(c)
64	-	(c)
65	3.24 (b)	27.91
66	-	(c)
67	-	(c)
68	-	(C)
69	5.50 (b)	-119.3 (c)
70	3.09	26.52
71	1.10	24.31
72	1.10	24.31

b) široké signály

C)

4··4 *· ♦ 4 · « · 4

4 · • · · * ♦ 4 44 ·* • »4 • 4 ♦*· • 4 4 4 • · · ·· ·*·

4» ·· • ♦ ♦ · • · 4 * 4 4 4

4*4 * * ··««

Tyto signály nejsou viditelné pouze spektrem HMQC.

C60 a C69 lze určit

Amycomycin vykazuje mimořádné antibakteriální účinky, zejména vůči grampositivním bakteriím jako jsou, například, stafylokoky a enterokoky. Minimální inhibiční koncentrace amycomycinu vůči širokému spektru bakterií jsou uvedeny v tabulce 2 níže. U těchto kmenů se zejména v poslední době stále více ukazuje, že jsou kmeny problematickými, tj., že jsou mikroorganismy, které se stali resistentními vůči existujícím antibiotikům. Lepší účinky sloučeniny podle vynálezu v porovnáni s jinými antibiotiky ukazuje například inhibice kmenů resistentních vůči vankomycinu a teicoplaninu, jako jsou například E. faecalis, E. Faecium nebo E. gallinarium.

Tabulka 2

Minimální inhibiční koncentrace (mg/1) (mikrodiluční test)

Grampos it ivní kmeny	Kód	Amycomycin	Vancomycin
S.aureus	011HT3	oxa S ery S	0.08	0.3
S.aureus	011HT18	ATCC 1.3709 Smith	0.08	0.3
S.epidermidis	012G020	oxa S ery S tet R	0.3	0.6
S.aureus	011HT1	nov R	<=0.04	0.08
S.aureus	011DU5	nov R tet R	0.08	0.15
S.aureus	011CB20	oxa R ery Rc tet R	0.08	0.15
S.aureus	011GO71	ofi S oxa R ery S tet R	0.15	0.6
S.aureus	Q11GO64	ofi R oxa R ery Rc tet R	0.3	1.2
S.epidermidis	012GO42	oxa R	0.3	1.2
Staph.coag.négative	012HT5	ofi R oxa R tet R	0.15	0.6
S.aureus	011GR91	pri R oxa R ery R nov R	1.2	1.2
S.pyogenes	O2A1SJ1	van S ery Rc	0.3	0.15
S.pyogenes	O2A1UC1	van S ery S	0.6	0.15
S.pyogenes	O2A1F16	ery R	0.6	0.08
Strepto gr.G	O2G0CB2	tet R rif R nov R	0.6	0.15
S.pneumoniae	030BI2	ery R	0.15	0.15

··♦· 4 • 4 < · ··· · • ♦ ·

S.milleri

S.mitis

E.faecium

E.gallinarium

E.faecalis

Gramnegatívní kmeny

E.coli

P.aeruginosa

O2milGRl2

O2mitGR16

O2D3AP9

O2D3HT12

O2D3IP2

O2D3HM3

O2D0HM8

O2D2HM9

O2D2UC5

O2D2DU18

O2D2HT10

Kód

DB10 250IP5 1771 391HT2 1771m391HT3

ery S van S	1.2	0.3
ery Ri van S	1.2	0.3
nov S van R ery S tei R	0.6	>40
tei R van R ery R tet R	0.6	>40
tei R van R ery R tet R	ND	>40
novS van A eryR tei R	1.2	>40
van C tet R ery S	1.2	>40
nov R van B ery R tei S	2.5	>40
ATCC 29212 nov R	2.5	2.5
tet R nov R	1.2	0.3
nov R van S tet R	1.2	0.6
ery S fuc S novS	ND	>40
	>40	>40
mutant perméable	>40	>40

Amycomycin a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty lze podávat zvířatům, výhodně savcům, a zejména lidem jako farmaceutika jako taková, ve směsích s jinými léčivy, a ve formě farmaceutických kompozic, které umožňují parenterální nebo jiné způsoby podávání. Proto se předkládaný vynález také týká amycomycinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů pro použití jako léčiva, a použití amycomycinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů k přípravě léčiv s antibakteriálními účinky. Předkládaný vynález se dála týká farmaceutických kompozic obsahujících účinné množství amycomycinu nebo/a jedné či více jeho farmaceuticky přijatelných solí nebo/a jeho derivátů, společné s farmaceuticky přijatelným nosičem.

·««· • · · « · e • « · • · ♦ « ·· 99

9 9

9 999

9 9

999

99

9 * * · 9

9 9

9999

Amycomycin lze podávat enterálně (orální cestou), parenterálně (intravenózně nebo intramuskulárně), rektálně či lokálně (topicky). Farmaceutické kompozice obsahující amycomycin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo jeho derivát s dalšími farmaceuticky účinnými látkami lze připravit smícháním účinných sloučenin s jednou nebo více farmakologicky tolerovanými pomocnými látkami nebo/a excipienty, a poté převedením směsi do vhodné farmaceutické formy vhodné pro podávání, jako jsou roztoky, prášky (tablety, kapsle včetně mikrokapslí), masti (krémy nebo gely), liposomové přípravky, lipidové komplexy, koloidní disperze nebo čípky.

Možnými pomocnými látkami nebo/a excipienty pro přípravky tohoto typu jsou obvyklá farmaceutická, kapalná nebo pevná plnidla a extendery, rozpouštědla, emulzifikátory, lubrikanty, činidla upravující chuť, barviva nebo/a pufrovací látky.

Jak je obvyklé, konkrétní galenický přípravek a konkrétní způsob podávání a rovněž tak konkrétní rozmezí dávek, které jsou vhodné v určitém případě, závisí na druhu, který má být léčen, a na stadiu dotyčného stavu nebo onemocnění, a lze optimalizovat způsoby v oboru známými. Jako příklad může být vhodná dávka pohybující se v rozmezí 0,001 až 10 mg, výhodně 0,1 až 5 mg, výhodněji 1,0 mg, na tělesnou hmotnost činící přibližně 75 kg. Dávka by měla být dostatečná alespoň k dosažení požadovaného účinku.

Následující příklady provedení předkládaného vynálezu slouží pro ilustraci vynálezu, a v žádném případě nikterak neomezují jeho rozsah.

4<44 *4 44 ·♦·* ·· ·· • φ» 44· 4444

4« 44 «44 4 4 4 «4 444 4 4 4 4 4 4

4444 44 4 44«

4« 44 *44 4» 4444

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava očkovacího materiálu

100 ml živného roztoku (4 g/1 g/1 rozpustného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, doplněné vodou na 1000 ml, pH 7,0 sterilní 300 ml Erlenmeyerově baňce sp kvasnicového extraktu, 0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, před sterilizací) ve se inokuluje kmenem

Amycolatopsis při 28 °C a na minutu. Následně glycerinu a uchovává se při 20 °C.

(DSM 12216) a poté inkubuje po dobu 5 dní rotačním protřepávadle při 180 otáčkách za se 1,5 ml této kultury rozředí 1,5 ml 99%

Příklad 2

Příprava kultury nebo předkultury Amycolatopsis sp., ST101170 (DSM 12216) v Erlenmeyerových baňkách

Sterilní Erlenmeyerova baňka obsahující 100 ml následujícího živného prostředí: 10 g/1 roztoku škrobu, 10 g/1 glukózy, 10 g/1 99% glycerinu, 2,5 g/1 kukuřičného výluhu, 5 g/1 peptonu, 2 g/1 kvasnicového extraktu, 1 g/1 NaCl a 3 g/1 CaCO3, se inokuluje kličkou s narostlou kulturou (stejný živný roztok, avšak s 2 % agaru) nebo 1 ml glycerinové kultury (viz příklad 1), a poté se inkubuje na protřepávadle při 180 otáčkách za minutu a 28° C. Maximální tvorby sloučeniny zvané amycomycin se dosáhne po 72 hodinách.

Submerzní kultura stará 72 hodin (připravená podle způsobu popsaného pro protřepávané kultury, příklad 1, avšak s následujícím prostředím: 15 g/1 glukózy, 15 g/1 sojové moučky, 3 g/1 CaCO₃ a 5 g/1 NaCl, pH 7,5) postačuje k inokulaci 10 a 200 1 fermentačních nádob při inokulačním množství činícím 10 %.

·<«· *· ·* ··»· *# *· ·+» * ♦· ·«·· • » · · · ·«♦ · · · t · · · · « « · · · « • > 4 · · ♦ · · · · «· ·« ·· ♦·· ·· ····

Příklad 3

Příprava sloučeniny zvané amycomycin

Ve 200 1 fermentační s následujícími parametry:

nádobě se spustí fermentace

Živné prostředí:

Inokulum: Inkubační doba: Inkubační teplota Protřepávání: Provzdušňování:

g/1 škrobu g/1 glukózy g/1 99% glycerinu

2,5 g/1 kukuřičného výluhu 5 g/1 peptonu g/1 kvasnicového extraktu 7 g/1 NaCl g/1 CaCO₃ pH 7,2 (před sterilizací) % objemu fermentační nádoby 60 až 80 hodin

28° C otáček za minutu

150 1/min

Přidáním 1 až 2 ml ethanolového polyolového roztoku lze omezit tvoření pěny. Maximální tvorby se dosáhne po 69 hodinách.

Příklad 4

Izolace sloučeniny zvané amycomycin

200 ml roztoku kultury získaného v příkladu 3 se odstřeďuje a mycelium se zcela extrahuje pomocí methanolu. Methanolový extrakt se poté koncentruje na poměr činící přibližně 1 ku 10 a získá se bezbarvý precipitát, který se vyfiltruje. Tato procedura se opakuje, dokud lze látku zvanou »4 • 444 4* • 4 ·

4 4

4 *

4 4 4

44

4··4

4 4 • 4 444

4 4 4 • · ·

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 44 4444 amycomycin detekovat ve filtrátu (HPLC). Zůstatek se suší mrazením a následně purifikuje pomocí HPLC:

1. Sloupec: Fractogel® TSK-HW 40 (4 1, 500x100 mm)

Eluent: methanol

Rychlost toku: 20 ml/min

Detekce: 204 a 236 nm

Frakce obohacené amycomycinem eluují po 125 minutách. Frakce se spojí na základě HPLC (za podmínek uvedených výše). Spojené účinné frakce s požadovanou sloučeninou se koncentrují ve vakuu a suší mrazením.

2. Sloupec: Fractogel® TSK-HW 40 (1 L, 500x50 mm)

Eluent: methanol

Rychlost toku: 5 ml/min

Detekce: 204 a 236 nm

Účinná složka zvaná amycomycin se eluuje po 112 minutách.

Z 200 1 fermentačního bujónu lze podle výše uvedených způsobů získat 110 mg amycomycinu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina vzorce a její farmaceuticky přijatelné soli, estery, ethery a další odvoditelné chemické ekvivalenty, ve všech jejich stereoisomerních a tautomerních formách.
2. Sloučenina molekulového vzorce C65H115NO18 získatelná kultivací mikroorganismu Amycolatopsis species ST101170, DSM 12216, za aerobních podmínek v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, následované izolací a purifikací obvyklými způsoby, a její farmaceuticky přijatelné soli a deriváty, ve všech jejich stereoisomerních a tautomerních formách.
3. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci mikroorganismu Amycolatopsis species, ST101170, DSM 12216, za aerobních podmínek v živném prostředí obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, následované izolací a purifikací sloučeniny obvyklými způsoby.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přeměnu výsledné sloučeniny na farmakologicky tolerovatelnou sůl, ester, ether nebo jiný odvoditelný chemický ekvivalent.
5. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester, ether nebo jiný odvoditelný chemický ekvivalent pro použití jako léčiva.
6. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 nebo/a její farmaceuticky přijatelnou sůl, ester, ether nebo jiný odvoditelný chemický ekvivalent, a farmaceuticky přijatelný nosič.
7. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester, ether nebo jiný odvoditelný chemický ekvivalent pro použití jako antibiotika.