CN86105218A

CN86105218A - 抗寄生虫药剂的制备方法

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Publication number: CN86105218A
Application number: CN86105218.8A
Authority: CN
Inventors: 保罗·斯蒂芬·吉布森; 凯尔文·斯科特·霍尔多姆; 亚利山大·克罗桑·古迪博士; 约翰·德斯蒙德·布洛克教授
Original assignee: Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp SRL
Priority date: 1985-07-27
Filing date: 1986-07-25
Publication date: 1987-03-04
Also published as: PL153429B1; NO1995009I1; SU1560059A3; AP37A; PL260806A1; JPS6229590A; UA6345A1; IL79523A; ES556466A0; FI863065A7; YU44294B; OA08370A; DK353486A; DK353486D0; AP8600040A0; YU134186A; IE861983L; HK65793A; CN1007266B; ES8800986A1

Abstract

本发明提供了具有下式的新型化合物，其中22-23位之间的虚线表示一个选择性的双键，而其中R¹，R²，R³和R⁴的含义分别和本专利说明部分相应符号的含义一致。

Description

本发明涉及一些抗寄生虫药剂，更详细地说与avermectins和milbemycins有关但在25位上有一新取代基的化合物，以及它们的制备方法。

化合物avermectins是一组广谱抗寄生虫药剂，以前称做C-076化合物。它们是在含有无机盐和可吸收的碳和氮的来源的含水营养介质中，在有氧气的条件下，使微生物Streptomyces aver-mitilis ATCC 31267，31271或31272的菌株发酵制得的。在英国第1573955号专利说明书中详细叙述了菌种ATCC 31267，31271和31272的形态学和培养方面的性质，该专利还叙述了组成C-076复合物的八个个别组分的分离方法和化学结构。化合物milbemycins在结构上与大环内酯抗生素有关，但在13位上缺少糖基。它们可以通过发酵法制得。例如象英国专利第1390336号说明书和欧洲专利申请公开号0170006中所叙述的方法。

现已发现，若将某些特定的羧酸或其衍生物加入到能生成aver-mectin的一种生物体的发酵液中，可得到新的化合物，它与avermectins有关，但在25位上有一奇异的取代基，代替通常存在的异丙基或仲-丁基。这种新型化合物是有很高活性的抗寄生虫药剂，作为驱肠虫药（anthelmintics），杀外寄生物剂，杀虫剂和杀螨剂特别有用。

于是，根据本发明的一个方面的内容，提出了生产在25位有奇异取代基的新型的avermectin衍生物的方法。包括将一种羧酸，或者它的盐，酯或酰胺或者其氧化的前身，加入到一种能产生avermectin的生物体的发酵液中，以及分离出这种新型avermectin的衍生物。

通过通常的化学转换反应，可以从这些化合物制得进一步的衍生物。于是，本发明进一步的目标就是提供具有式（Ⅰ）的化合物：

其中第22-23位间的虚线表示一个选择性的双键，并且其中R¹是H或OH而双键不存在，或者，双键存在而R¹不存在;

R²是一个α分支的C₃-C₈烷基，链烯基，炔基，烷氧烷基或烷硫烷基;C₅-C₈环烷基烷基，其中的烷基是一个α分支的C₂-C₅烷基;C₃-C₈环烷基或C₅-C₈环烯基，二者都可任意被亚甲基或者一个或多个C₁-C₄烷基或卤原子取代;或含氧或硫的3到6员杂环，它可以是饱和的，也可是全部或部分不饱和的，并且它可被一个或多个C₁-C₄烷基或卤原子任意地取代;

R³是氢或甲基;

R⁴是H或具有下式的4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基：

但要满足以下的条件，当R²是烷基时，它不是异丙基或仲-丁基;当R⁴是H，R¹是H，且双键不存在时，R²不是甲基或乙基;当R⁴是H，R¹是OH，且双键不存在时，R²不是2-丁烯-2-基，2-戊烯-2-基或4-甲基-2-戊烯-2-基。

在上述规定中，含有3个或更多个碳原子的烷基可以是直链的或带支链的。卤表示氟，氯，溴或碘。α-分支表示连在25环位上的碳原子是连接着另外两个碳原子的二级碳原子。当R²是5个或更多个碳原子的烷基时，烷基链的其余部分可以是直链或带支链的。

优选的式（Ⅰ）的化合物是那些R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基的化合物。还有一些式（Ⅰ）的化合物也是优选的，即其中R²是C₅或C₆环烷基或环烯基（环戊基是特别优选的），这些基团可以任意地被一个或多个C₁-C₄烷基取代。在另一组优选的化合物中，R²是环丁基。还有一组优选的化合物中，R²是一个五或六员的含氧或硫的杂环，特别是3-噻吩基，或3-呋喃基，这些环可以被一个或多个C₁-C₄烷基或卤原子任意取代。还有一组优选的化合物，其中R²是一个C₃-C₈的烷硫烷基，尤其是1-甲硫乙基。

按照本发明的方法，具有式（Ⅰ）的化合物（其中R¹是OH而双键不存在，或其中双键存在而R¹不存在，而且R⁴是4′-（α-L齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基）可通过使一种能生成avermectin的生物体发酵制得，例如在具有R²COOH（其中R²前面已有规定）结构的羧酸或者它的盐，酯或酰胺，或其氧化的前体存在时，使生物体Strepto myces avermitilis ATCC 31267，31271或31272的菌株发酵可制得式（Ⅰ）化合物。酸可在接种时加入，也可在发酵期间随时加入。用有机溶剂从发酵物中萃取样品，再用色谱法例如高压液相色谱鉴测具有式（Ⅰ）的化合物，控制式（Ⅰ）化合物的生产。培养过程延续到式（Ⅰ）化合物的产率达到最大，一般需要4到6天。

每次加入羧酸或其衍生物的量最好是在0.05-1.0克/升。在发酵物中逐步地加入（例如在几天内每天加入）酸或其衍生物，得到的式（Ⅰ）化合物的产率最好。最好加入酸的盐，例如钠盐或铵盐，但也可以加入酯，例如甲酯或乙酯，或者加入酰胺。在发酵中可以使用的其他基质是一些羧酸的氧化前体衍生物;因此，合适的基质例如是具有式R²CH（NH₂）CO₂H氨基酸，具有式R²COCO₂H的乙醛酸，具有式R²CH₂NH₂的甲胺衍生物，具有式R²（CH₂）_nCO₂H（其中n是2，4或6）的被取代的低级链烷酸，具有式R²CH₂OH的甲醇衍生物，或具有式R²CHO的醛类，其中R²的意义前面已定义。发酵使用的介质可以是通常的含有可吸收的碳，氮和其他痕量元素来源的复合介质。但已发现，为了取得较好的结果，可以使用从Strep-tomyces avermitilis ATCC 31271衍生的生物体菌种，它在半确定的介质中培养时，可以改进式（Ⅰ）化合物的产率，这还有一个优点是在粗的溶剂萃取物中，所不期望有的物质的含量明显减少，这就大大简化了以后的分离和纯化步骤。这一菌株已于1985年7月19日存放在国家工业细菌收集（中心）（NCIB），登记号是NCIB 12121。另一方面，这一菌株的形态学的和培养的特征与英国专利说明书1573955号对菌株ATCC 31267的叙述大体相同。

在24-33℃温度下经过几天的发酵之后，将发酵物中的液体培养基离心分离或滤除，菌丝体的饼状物用丙酮或甲醇萃取。将溶剂萃取液浓缩，再将所期望的产品萃取到一种与水不混溶的有机溶剂中，如二氯甲烷，乙酸乙酯，氯仿，丁醇或甲基异丁基酮。将溶剂萃取液浓缩，含有式（Ⅰ）化合物的粗产品需要时用色谱法进一步纯化，例如用制备反相高压液相色谱。

一般情况下，得到的产品是具有式（Ⅰ）的一些化合物的混合物，其中R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖基，R¹是OH而双键不存在或R¹不存在而双键存在，R³是H或CH₃;但是它们之间的比率可随着所用个别羧酸及使用的条件而改变。

我们已发现，由R²CO₂H限定的范围广的羧酸都可以加到发酵物中，以便产生在25位上具有新型取代基的avermectins。可以使用的羧酸可举例如下：

2-甲基戊酸

2-甲基戊-4-烯酸

2-甲硫基丙酸

2-环丙基丙酸

环丁烷羧酸

环戊烷羧酸

环己烷羧酸

环庚烷羧酸

2-甲基环丙烷羧酸

2-环己烯-1-羧酸

和噻吩-3-羧酸。

根据本发明的一个特别的和优选的方面，在环戊烷羧酸钠盐存在下进行发酵，得到占优势的具有式（Ⅰ）的化合物，其中R¹是OH，双键不存在，R²是环戊基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-4-齐墩果糖氧基。

根据本发明优选的另一方面，在噻吩-3-羧酸钠盐存在下进行发酵，占优势的具有式（Ⅰ）的化合物中R¹是OH，不存在双键，R²是噻吩-3-基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-4-齐墩果糖氧基。

根据本发明更优选的一面在2-甲硫基丙酸钠盐存在下进行发酵，占优势的具有式（Ⅰ）的化合物中R¹是OH，不存在双键，R²是1-甲硫乙基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-4-齐墩果糖氧基。

具有双键而R¹不存在的具有式（Ⅰ）的化合物也可以通过脱水反应由相应的没有双键，其中R¹是OH的式（Ⅰ）的化合物制得。进行这一反应时，首先要选择性地保护5位和4″位上的羟基，例如作为叔-丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰基衍生物，然后再和被取代的卤硫化硫（如（4-甲基苯氧基）氯硫化碳）反应，接着在高沸点溶剂如三氯苯中加热，促进脱水作用。产品最终经过去保护反应得到不饱和化合物。美国专利4328335号叙述了这一反应的步骤和所用的试剂以及反应条件。

具有式（Ⅰ）的化合物（其中R³是H）也可以由相应的化合物（其中R³是CH₃）通过去甲基化作用制得。完成这一反应要用乙酸汞处理5-甲氧基化合物或其被适当保护的衍生物，并将生成的3-乙酰氧基烯醇醚用烯酸水解，得到5-酮基化合物。该化合物然后再用例如硼氢化钠还原，得到5-羟基衍生物。在这些步骤中使用的反应试剂和反应条件在美国专利号4423209中都有叙述。

式（Ⅰ）化合物（其中R¹是H而无双键）可以由相应化合物（有双键而无R¹）用适当的催化剂经过选择性的催化氢化制得。例如，这一还原反应可以根据欧洲专利申请公开号0001689的叙述，用三（三苯膦）氯化铑（Ⅰ）来完成。

具有式（Ⅰ）的化合物（其中R⁴是H）由相应的化合物（R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基）制备，即在含水有机溶剂中，用一种酸，通过温和的水解反应消除4′-（α-L-齐墩果糖基）α-L-齐墩果糖基，生成在13位上具有羟基的糖苷配基;然后将其卤化，例如和苯磺酰氯反应，生成13-脱氧-13-卤衍生物，该衍生物最后被选择性地还原，例如用三丁基氢化锡还原。为了避免不期望的副反应发生，希望将所有其他羟基保护起来，例如用叔-丁基二甲基甲硅烷基。这一保护基在卤化或还原步骤完成以后可以很容易地用含有痕量酸的甲醇处理而除去。在欧洲专利申请公开号0002615中叙述了所有这些步骤以及所用试剂和各步反应条件。

在产生milbemycin生物体的发酵过程中加入羧酸或其盐，酯或酰胺，或其氧化前体，再将在25位上具有奇异取代基的预期的milbemycin衍生物分离出来，也可以制得式（Ⅰ）化合物（其中R⁴是H，R¹是H或OH，无双键）。能产生milbemycin的生物体的例子包括，英国专利1390336号说明书叙述的吸水链霉菌株NRRL 5739，欧洲专利申请公开号0170006叙述的兰灰链霉菌（Streptomy ces cyaneogriseus subsp noncy-anogenus NRRL 15773）以及英国专利2166436A中叙述的Streptomyces thermoarchaenis NCIB 12015。

本发明的化合物是具有高活性的抗寄生虫剂，作为驱肠虫药，抗外寄生物药，杀虫剂和杀螨剂特别有用。

因此，这些化合物治疗由内寄生物引起的各种疾病是有效的，特别是蠕虫病，它最经常是由称为线虫的一组寄生虫引起的，它能对猪、羊、马和牛引起严重经济损失，还影响家畜和家禽。该化合物在对付影响各种动物的其它线虫方面也是有效的，例如，狗中的恶丝虫属和能够传染于人类的各种寄生虫，包括胃肠寄生虫，如钩口线虫属，板口线虫属，蛔虫属，圆线虫，毛细虫类，毛细线虫属，鞭虫属，蛲虫属，以及在血液或其他组织和器官中发现的寄生虫，如丝虫类寄生虫和肠外阶段的圆线虫和毛细虫类。

该化合物在治疗外寄生物传染病也是有意义的，特别包括动物和鸟类的节肢动物型外寄生物，如蜱，螨类，虱子（Lice），跳蚤类，丽蝇，叮咬害虫和迁涉双翅目幼虫，它们都能影响到牛和马。

该化合物也是一种杀虫剂，用以对付室内害虫，如蟑螂，衣物蛀虫，毛毯甲虫，家蝇等，并且也用以对付贮存粮食中的害虫和农作物中的害虫，如蜘蛛螨，蚜虫，毛虫，还用于对付迁涉的直翅类的昆虫如蝗虫。

按照设想的特殊用途以及被处理的宿主动物和涉及的害虫或寄生虫的特殊种类，式（Ⅰ）化合物可以配成制剂引入机体，作为驱肠虫药使用时，该化合物可以制成胶囊、丸剂、片剂或最好以液体灌服药形式口服，也可通过注射或作为植入物引入体内。这些制剂都是用通常的方式按照标准的兽医惯例制备的。因此将活性组分和适当的细碎的稀释剂或载体相混合，此外还含有分散剂和/或粘合剂，如淀粉，乳糖，滑石，硬脂酸镁等，就可以制得胶囊、丸剂或片剂。将活性组分分散在水溶液，还有分散剂或润湿剂等，便制得灌服药制剂。注射用的制剂可以用无菌溶液，溶液中可以含有其他物质，如足够的盐或葡萄糖，以使溶液和血液是等渗的。根据治疗宿主动物的种类，感染的严重程度和类型以及宿主的体重，这些制剂中活性组分的重量可以改变。一般口服时，作为单次剂量或1-5天期间内的分次剂量，大约0.001-10毫克/千克动物体重的用量是满意的，但是，当然有些例子中指出更高或更低的剂量范围，这在本发明的范围之内。

还可将此化合物与动物饲料一起引入体内，为此目的，可以制备一种浓缩的食物添加剂或预混合料，以便与通常的动物饲料混合。

当用作杀虫剂或用以消灭农业害虫时，该化合物可以按照标准的农业操作制成喷雾剂，粉剂，乳剂和类似物。

下面通过例子对本发明进行说明，其中，例1-19说明式（Ⅰ）化合物的制备，例20说明灌服药制剂，例21和22说明化合物的抗寄生虫和杀害虫的活性。

例1

25-环戊基-avermectin A2

将链霉菌S.avermitilis NCIB 12121的浆状培养基的悬浮液接种到600毫升的含有乳糖（12.0克），酒糟（8.0克）和酵母抽提物（3.0克）的介质中，盛于3升烧瓶中，在28℃培养3天。这种接种物用以接种16升的含有可溶淀粉（640克），硫酸铵（32克），磷酸氢二钾（16克），氯化钠（16克），七水硫酸镁（16克），碳酸钙（32克），可溶性酵母抽提物（6.4克），七水硫酸亚铁（0.016克），七水硫酸锌（0.016克）和四水氯化锰（0.016克）的介质，盛于20升的发酵器中。发酵物在28℃下培养，用250转/分的速度搅拌，并且以15升/分速率充气。分别在培养过程进行到24、48和72小时后加入环戊烷羧酸的钠盐（1.6克），发酵持续120小时，此后通过过滤分出菌丝体，并进行萃取，萃取溶剂为丙酮：1当量浓度稀盐酸（100∶1;3×7升）。萃取液减压浓缩到大约2升，再用二氯甲烷萃取（2×5升）。二氯甲烷萃取液浓缩至干得到粗产品，是一种流动性油，将该油溶于乙醚后加入到硅胶柱中（1千克硅胶）。用乙醚洗脱，收集100毫升的级分。将级分20-40合并，蒸去溶剂，得到部分纯化的物质。将产品溶于甲醇和水（4∶1）的混合液中，在Waters Prep 500型高压液相色谱仪的C18 Micro-Bondapack柱（50毫米×50厘米）上用相同的溶剂进行分离，流速为100毫升/分。将含有预期产品的35-50级分合并在C18 Zorbax ODS（商标，杜邦）柱上（21毫米×25厘米）用甲醇和水（4∶1）的混合液洗脱，流速为9毫升/分。将有关级分合并，蒸去溶剂，得到具有式（Ⅰ）的化合物，其中R¹是OH，不存在双键，R²是环戊基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末。熔点：150.5-151℃。产品的结构由质谱和C13核磁共振谱得到证实：

在VG 7070E型质谱计上进行快速原子轰击质谱测定，样品基体为三甘醇和固体氯化钠。在质荷比939处观察到（M+Na）⁺离子（理论值939）。

在VG 7070F型质谱计上进行电子轰击质谱测定，主要碎片的质荷比值为335，317，275，257，251，233，205，181，179，145，127，113，111，95和87。

在Brucker WM-250型核磁共振仪上测定了C13核磁共振谱数据，样品浓度为20毫克/毫升，溶剂为氘代氯仿。相对于四甲基硅烷，用ppm表示的化学位移值是14.1，15.3，17.8，18.5，19.9，20.3，24.6，25.9，26.2，29.3，34.4（2C），34.7，36.7，37.8，39.8，40.5，41.0，41.3，45.8，56.4，56.6，57.8，67.4;67.6，68.0，68.3，68.7，69.9，70.5，76.0，77.6（2C），78.3，79.5，80.7（2C），81.8，94.9，98.7，99.8，117.7，118.5，119.8，125.0，135.8，136.3，137.8，140.1和173.8。

例2

将S.avermitilis ATCC 31271的浆状培养基的悬浮液接种到含有乳糖（1.0克），酒糟（0.75克）和酵母抽提物（0.25克）的50毫升的介质中，盛于350毫升的烧瓶中，在28℃培养3天。这一接种物用以接种另一种介质，这种介质分盛于50个350毫升的烧瓶中，分别含有50毫升介质，介质中含有玉米淀粉（2.0克），大豆面粉（0.35克）和酵母抽提物（0.25克），每瓶接种4毫升，烧瓶在28℃培养。

24小时后，各瓶都加入环戊烷羧酸钠盐5毫克，再连续培养5天。此后，瓶中物料变成大块，通过离心分出菌丝体。用丙酮∶1当量盐酸（100∶1）的混合液萃取菌丝体，丙酮萃取液浓缩至干。高压液相色谱分析表明，萃取物中含有与例1产品相同的产品。

例3

用按照例1叙述的方法制得的接种物接种到例1所用的介质中，盛于350毫升烧瓶中，培养24小时后，加入2-氨基环戊基乙酸（环戊基甘氨酸）（5毫克），再持续发酵5天。通过用丙酮和二氯甲烷萃取菌丝体来回收产品。萃取物经高压液相色谱分析表明，产品中含一种与例1产品相同的化合物。

例4

除了用环戊基甲醇作基质以外，遵照例3的条件，得到相似的结果。

例5

除了用溶于甲醇的环戊烷羧酸甲基酯作基质以外，遵照例3的条件，得到相似的结果。

例6

除了用溶于甲醇的环戊烷甲酸作基质外，遵照例3的条件，得到相似的结果。

例7

25-（噻吩-3-基）avermectin

将S.avermitilis NCIB 12121的浆状培养基的悬浮液接种到600毫升的含有乳糖（12.0克），酒糟（8.0克）和酵母抽提物（3.0克）的介质中，盛于3升的烧瓶中，在28℃培养3天。该接种物用以接种16升的含有可溶淀粉（640克），硫酸铵（32克），磷酸氢二钾（16克），氯化钠（16克），七水硫酸镁（16克），碳酸钙（32克），可溶酵母抽提物（6.4克），七水硫酸亚铁（0.016克），七水硫酸锌（0.016克）和四水氯化锰（0.016克）的介质，盛于20升的发酵器中，发酵物在28℃培养，以250转/分速度搅拌，并以15升/分速度充气，在培养过程进行到24、48和72小时后，分别加入噻吩-3-羧酸钠盐（1.6克），发酵持续120小时。此后，将菌丝体过滤出来，并用丙酮∶1当量盐酸（100∶1;3×7升）萃取，将萃取液减压浓缩到大约2升并用二氯甲烷萃取（2×5升）。二氯甲烷萃取液浓缩至干，得到粗产品，是一种流动性的油，该油溶于乙醚，加到硅胶（1千克）柱中。用乙醚洗脱，收集200毫升级分。级分32-45合并，蒸去溶剂，得到部分纯化的物质。产品溶于甲醇和水（3∶1）的混合液中，在Watersprep 500型高压液相色谱仪的C18 Micro-Bonda-pack柱上（50毫米×50厘米）进行色谱分离，使用同样的溶剂洗脱，流速为100毫升/分。将含有预期产品的级分27-36合并，在C18 Zorbax ODS（商标，杜邦）柱（21毫米×25厘米）上，用甲醇和水混合液（3∶1），以9毫升/分速度洗脱，进行色谱分离。有关级分合并，溶剂蒸发至得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，双键不存在，R²是噻吩-3-基，R³是CH₃以及R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末。熔点167℃。产品的结构由下面的质谱数据证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠为样品基体进行快原子轰击质谱测定。在质荷比953处观察到（M+Na）⁺峰（理论值953）。

在VG 7070F型质谱计上还进行了电子轰击质谱测定，主要碎片的质荷比值是：349，331，275，265，257，247，237，219，195，145，127，113，95和87。

例8

将保持在-60℃的10%（体积/体积）甘油水溶液（2毫升）中的S.avermitilis NCIB 12121的生长细胞悬浮液接种到50毫升介质中，介质中含有乳糖（1.0克），酒糟（0.75克）和酵母抽提物（0.25克），盛于300毫升锥形烧瓶中，在28℃培养24小时，不断摇动。再将这一接种物加到600毫升的上述介质中，盛于3升的烧瓶中，该混合物在不断摇动中于28℃培养24小时。得到的产物用以接种到10升的上述介质中，盛于16升的发酵器中，以350转/分的速度搅拌，10升/分的速度充入空气，在28℃培养24小时。再将此发酵物（600毫升）接种到16升的含有部分水解的淀粉（640克），硫酸铵（32克），磷酸氢二钾（16克），氯化钠（16克），七水硫酸镁（16克），碳酸钙（32克），可溶性酵母抽提物（6.4克），七水硫酸亚铁（0.016克），七水硫酸锌（0.016克）和四水氯化锰（0.016克）的介质中，盛于20升的发酵器中。发酵物在28℃培养，以350转/分速度搅拌并以15升/分的速度充气。在培养进行到24、48和72小时后的三个时刻，分别加入1.6克的环丁烷羧酸钠盐，发酵持续120小时。然后将菌丝体过滤出来，用丙酮（3×7升）萃取。萃取液减压浓缩到大约2升，再用二氯甲烷（2×5升）萃取。将二氯甲烷浓缩至干得到粗产品是一种流动性的油。该油溶于150毫升异辛烷中，该溶液再用甲醇（95毫升）和水（5毫升）的混合液萃取。甲醇萃取物经蒸发后得到部分纯化的物质，经高压液相色谱将该物质的各个组分分开如下：残余物溶于少量甲醇，在Waters Prep 500型高压液相色谱仪的C18 Micro-Bondapack柱（50毫米×50厘米）上进行分离，用甲醇/水（4∶1）混合物洗脱，流速为100毫升/分。级分1-4合并一起用于例9，级分5-9合并一起用于例10，级分10-19合并一起用于例11，级分20-35合并一起用于例12。

例9

25-环丁基avermectin B2（R¹＝OH，R³＝H）

例8中合并的级分1-4蒸发至干，残余物再在C18 Zorbax ODS（商标，杜邦）柱（21毫米×25厘米）上，用甲醇和水（3∶1）的混合液以9毫升/分的速度洗脱，进行色谱分离。将有关级分合并，蒸去溶剂，产品进行最后纯化，纯化方法是用Silica Spherisorb 5 micron（商标，HPLC技术）柱（10.5毫米×25厘米），以二氯甲烷和甲醇（98∶2）的混合物为洗脱剂，流速为4毫升/分，进行色谱分离。将有关级分合并，蒸除溶剂至得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，双键不存在，R²是环丁基，R³是H和R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点：110-112℃。产品的结构由如下质谱数据证实。

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠作样品基体进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比911处观察到（M+Na）⁺离子峰（理论值911）。

在VG 7070F型质谱计上进行电子轰击质谱测定。主要碎片的质荷比值如下：321，303，261，257，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。

例10

25-环丁基-avermectin A2（R¹＝OH，R³＝CH₃）

例8中合并的级分5-9蒸发至干，残余物在C18 Zorbax ODS（商标，杜邦）柱上（21毫米×25厘米），用甲醇和水（77∶23）混合液以9毫升/分的速度洗脱，重复两次色谱分离。将适当的级分合并，蒸发至得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，双键不存在，R²是环丁基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点：135-140℃。

产品的结构由如下质谱数据证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠为样品基体进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比925处观察到（M+Na）⁺离子峰（理论值925）。

在VG 7070F型质谱计上进行了电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：596，454，321，303，275，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。

例11

25-环丁基-avermectin B1（22，23-双键存在，R³＝H）

例8中合并的级分10-19蒸发至干，残余物溶于甲醇，在C18 Zorbax ODS（商标，杜邦）柱上进行色谱分离，柱尺寸为21毫米×25厘米，甲醇和水（4∶1）的混合液为洗脱剂，流速为9毫升/分。有关级分合并，蒸除溶剂，得到的产品在SiLica Zorbax SIL（商标，杜邦）柱（21毫米×25厘米）上再一次色谱分离，用二氯甲烷和甲醇（98.5∶1.5）的混合液洗脱，流速为9毫升/分。将有关组分合并，蒸去溶剂得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹不存在，有双键，R²是环丁基，R³是H，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点：135-138℃。产品的结构由如下质谱数据证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠为样品基体进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比893处观察到（M+Na）⁺离子峰（理论值893）。

在VG 7070F型质谱计上进行电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：303，261，257，219，191，167，145，127，113，111，95和87。

例12

25-环丁基-avermectin A1（22，23-双键存在，R³＝CH₃）

将例8中合并的级分20-35蒸发至干，残余物在C18 Zor-bax ODS（商标，杜邦）柱（21毫米×25厘米）上，以9毫升/分流速洗提，进行色谱分离。将有关级分合并，蒸除溶剂，产品在-Silica Sperisorb 5 micron（商标，HPLC技术）柱上，用二氯甲烷和甲醇混合液（98.5∶1.5），以4毫升/分速度洗脱，进行色谱分离。有关级分合并并蒸发后得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹不存在，有双键，R²是环丁基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-L-齐墩果糖氧基，是一白色粉末，熔点：120-124℃。产品的结构由以下质谱数据给予证实：

在VG 7070E质谱计上用三甘醇和固体氯化钠作样品基体进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比907处观察到（M+N_a）+离子峰（理论值907）。

在VG 7070F型质谱计上进行电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：578，303，275，257，219，191，167，145，127，113，111，95和87。

例13

25-（环己-3-烯基）avermectin A2

除了用3-环己烯酸钠盐作为基质以外，遵照例1的介质和条件，得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，双键不存在，R²是环己-3-烯基，R³是CH₃和R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点：131-5℃。该产物的结构由以下质谱数据进一步证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠作为样品基体，进行了快速原子轰击质谱测定，在质荷比951处观察到（M+N_a）⁺离子峰（理论值951）。

在VG 7070F型质谱计上进行电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：624，480，347，329，275，263，245，235，217，205，193，179，145，127，113，111，95和87。

例14

25-环己基avermectin A2

除了改用环己烷羧酸钠盐作为基质以外，根据例1的介质和条件，得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，R²是环己基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点112-117℃。

产品的结构由质谱数据得到进一步证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠作为样品基体，进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比953处看到（M+N_a）⁺离子峰（理论值953）。

在VG 7070F型质谱计上进行了电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比是：624，482，349，331，275，265，247，237，219，207，195，179，145，127，113，111，95和87。

例15

25-（1-甲硫乙基）avermectin A2

除了改用2-甲硫基丙酸钠盐作为基质以外，按照例1的介质和条件得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，R²是1-甲硫基乙基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-齐墩果糖氧基氧代，是一种白色粉末，熔点134-138℃。

产品结构由下列质谱数据进一步证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠为样品基体，进行快速原子轰击质谱测定，在质荷比945处看到（M+N_a）⁺离子峰（理论得945）。

在VG 7070F型质谱计上进行了电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：341，323，275，263，257，239，211，187，179，145，127，113，111，95和87。

例16

25-（2-甲基环丙基）avermectin A2

除了改用2-甲基环丙烷羧酸钠盐作为基质以外，按照例1的介质和条件得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹是OH，R²是2-甲基环丙基，R³是CH₃，R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-齐墩果糖氧基，是一种白色粉末，熔点：147-150℃。

产品结构由下面的质谱数据得到进一步证实：

在VG 7070E型质谱计上用三甘醇和固体氯化钠作样品基体进行了快速原子轰击质谱测定，在质荷比925处看到了（M+N_a）⁺离子峰（理论值925）。

在VG 7070F型质谱计上进行了电子轰击质谱测定，主要碎片离子的质荷比值是：596，454，303，275，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。

例17

按照例1的步骤，但要下列酸的钠盐作基质以代替环戊烷羧酸，得到相应的具有结构式（Ⅰ）的25位上被取代的avermectins，其中R¹是OH而双键不存在或双键存在而R¹不存在，R³是H或OH而R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基：

2-甲基戊酸

2，3-二甲基丁酸

2-甲基己酸

2-甲基戊-4-烯酸

2-甲基戊酸

2-环丙基丙酸

环庚烷羧酸

4，4-二氟环己烷羧酸

4-亚甲基环己烷羧酸

3-甲基环己烷羧酸

环戊烯-1-羧酸

1-环己烯羧酸

四氢吡喃-4-羧酸

噻吩-2-羧酸

3-糠酸

及2-氯-噻吩-4-羧酸

例18

25-环丁基-22，23-二氢-avermectin B1

按照欧洲专利（EP-A-）0001689号申请说明书叙述的方法，在三（三苯基膦）氯化铑（Ⅰ）存在下，将例11的产品在苯中氢化，得到相应的式（Ⅰ）化合物，其中R¹是H，双键不存在。

例19

13-脱氧-25-环戊基-avermectin A2-糖苷配基

将例1产品在室温下用稀硫酸处理，分离出得到的糖苷配基产物，并在二甲基甲酰胺中与叔-丁基二甲基氯化硅反应，得到23-0-叔-丁基二甲基硅基糖苷配基衍生物。该产物溶于含有4-二甲基氨基吡啶和二异丙基乙基胺的二氯甲烷中，用冰冷却并逐滴加入4-硝基苯磺酰氯进行反应，得到13-氯-13-脱氧产物。最后按照欧洲专利申请说明书0002615号叙述的步骤，将上述产物与三丁基氢化锡反应脱卤，并与含有痕量对甲苯磺酸的甲醇作用去保护基，得到式（Ⅰ）化合物，其中R¹和R⁴均为H，R³是OH，双键不存在，R²是环戊基。

例20

灌服药制剂

将前面任一实例的产物溶于聚乙二醇（平均分子量300）得到含量为400微克/毫升的溶液，用作灌服药。

例21

抗肠虫活性

按照K.G.Simpkin和G.L.Coles在Parisitology中（1979，第79卷，19页）叙述的方法，通过对Caenor-habditis ele ans进行体外用药筛选试验评价了它们的抗肠虫活性。例1，7和9-16的产品都100%地杀死了蠕虫，而它们的浓度仅为0.1微克/毫升。

例22

杀虫活性

使用标准的试验程序，即将家蝇用二氧化碳麻醉，将含有试验化合物的丙酮（0.1微升）置于雌蝇的胸部，试验证明了对成年家蝇（Musca domestica）的活性。例1，7和9-16的产品将受处理的家蝇100%地杀死，所用剂量是每只家蝇0.01微克。

勘误表

Claims

1、生产一种在25位上具有奇异取代基的新型avermectin衍生物的方法，包括在产生avermectin的生物体的发酵过程中加入一种羧酸或其盐、酯或酰胺，或者其氧化的前体，以及分离该新型avermectin衍生物。

2、生产具有下式的化合物的方法：

其中22-23位之间的虚线代表一个选择性的双键，R¹是H或OH而双键不存在，或者，双键存在而R¹不存在;

R²是一个α-分支的C₃-C₈烷基，链烯基，炔基，烷氧烷基或烷基硫烷基;一个C₅-C₈环烷基烷基，其中烷基是一个α分支的C₂-C₅烷基;一个C₃-C₈环烷基或C₅-C₈环烯基，其中任何一个都可以被亚甲基或者一个或多个C₁-C₄烷基或者卤原子任意性地取代;或一个含氧或含硫的3到6员杂环，它可以是饱和的，或完全或部分地不饱和的，它可以被一个或多个C₁-C₄烷基或卤原子任意地取代;

R³是氢或甲基;

R⁴是H或一个具有下式的4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基：

其前提条件是R²是烷基时，它不是异丙基或仲-丁基;R⁴是H，R¹是H，且双键不存在时，R²不是甲基或乙基;当R⁴是H，R¹是OH，且没有双键时，R²不是2-丁烯-2-基，2-戊烯-2-基或者4-甲基-2-戊烯-2-基;这个方法包括在具有式R²CO₂H的羧酸（其中R²的意义前已限定）或其盐，酯或酰胺，或其氧化的前体存在时，使可以生成avermectin的生物体菌株Streptomyces avermitilis发酵，以及分离出具有式（Ⅰ）的化合物，其中R¹是OH而双键不存在或者双键存在而R¹不存在以及R⁴是4′-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基;还有，如果需要，可将化合物（其中双键存在而R¹不存在）还原得到式（Ⅰ）化合物（其中R¹是H而双键不存在）;或者，如果需要，经水解消除4′（α-L-齐墩果糖基）-αL-齐墩果糖氧基，再卤化和还原得到式（Ⅰ）化合物（其中R⁴是H）。

3、按照权利要求2的方法，其中生物体是Streptomyces avermitilis NCIB 12121。

4、按照权利要求2的方法，其中酸以盐的形式加入。

5、按照权利要求2的方法，其中R⁴是4¹-（α-L-齐墩果糖基）-α-L-齐墩果糖氧基，而不进行选择性的消除步骤。

6、按照权利要求5的方法，其中R²是一个C₅或C₆环烷基或环烯基，它们可以被一个或多个C₁-C₄烷基任意地取代。

7、按照权利要求6的方法，其中R²是环戊基。

8、按照权利要求5的方法，其中R²是环丁基。

9、按照权利要求5的方法，其中R²是3-噻吩基。

10、按照权利要求5的方法，其中R²是1-甲硫乙基。