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CN1918305A - 核酸检测方法及其应用 - Google Patents

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CN1918305A
CN1918305A CNA2005800043364A CN200580004336A CN1918305A CN 1918305 A CN1918305 A CN 1918305A CN A2005800043364 A CNA2005800043364 A CN A2005800043364A CN 200580004336 A CN200580004336 A CN 200580004336A CN 1918305 A CN1918305 A CN 1918305A
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nucleic acid
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松久明生
山本诚司
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Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
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Abstract

本发明提供检测灵敏度比传统方法高，同时可准确且迅速地检测出靶核酸的核酸检测方法及使用该方法的基因检测试剂盒。将包含细胞的试料固定于支持体，以这样的状态在支持体上扩增核酸，并检测扩增的核酸。由于不从试料抽取核酸，可防止伴随核酸抽取过程的核酸损耗的检测灵敏度的下降。另外，由于检测扩增后的核酸，即便试料中包含的靶核酸微量，也可检测出。

Description

核酸检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及核酸检测方法及其应用，具体涉及高效率地扩增试料中微量核酸，并准确且迅速地检测的方法，以及涉及应用该方法的基因检测试剂盒。
背景技术
在调查有无某一特定核酸或基因的存在时，采用扩增靶核酸或基因，并检测其扩增产物的方法。作为将靶核酸或基因特异性扩增的方法，公知有PCR法(例如参照非专利文献1、2)、RT-PCR法(例如参照非专利文献1、2)、ICAN法(例如参照专利文献1)、LAMP法(例如参照非专利文献3)、RCA法(例如参照非专利文献4)、引子延伸(primer extension)法(例如参照非专利文献5)等。其中最常用PCR法、RT-PCR法。这些方法是使用包含目标核酸的盐基序列的短的核酸作为引子，用体外(in vitro)进行DNA聚合酶或RNA聚合酶的铸模特异性核酸合成反应的方法。
另外，在上述核酸扩增方法中，通过利用适当的手段对在扩增反应中或扩增反应后扩增的核酸片断进行标记，能够检测出试料中仅存少量的核酸。另外，已知有使用随机的盐基序列的引子并非特异性地扩增及标记核酸，并用它检测核酸的DNA微阵列(Microarray)法或差异显示法等。近年，网罗地检测与各式各样的疾病相关联的基因的DNA微阵列非常受人们注目。
另外，在调查某一特定核酸或基因时，作为上述核酸扩增方法以外的方法，有将组织或细胞中成为靶的核酸，以包含与其互补的盐基序列的标记的核酸作探针杂交的ISH法(原位(in situ)杂交法)或FISH法(荧光原位杂交法)(例如参照非专利文献1)。ISH法广泛用于组织内特定基因的发现有无或量的比较。FISH法广泛用于染色体上特定基因区域的判别。
另外，也有用PCR法扩增靶核酸，并通过ISH法利用探针杂交，最终用显微镜检测的原位PCR法(例如参照非专利文献2)，但由于很难给出反应最适条件，缺乏再现性，没有得到普及。
本申请人，作为体外诊断用药品(认证号：AMZ00620000)销售基于ISH法的末梢血白血球中的细菌检测试剂盒(“ハイブリゼツプ(注册商标)”)。当采用该试剂盒(“ハイブリゼツプ(注册商标)”)时，与以往采用的血液培养法相比，可以约4倍的灵敏度检测菌，至少可将需要3日以上的检查在1日内进行，因此登上感染症领域的舞台(例如，参照非专利文献6)。还有，本申请人提出了基于ISH法用以检测及鉴定被吞噬细胞贪食的外来微生物的方法(参照专利文献2)及其改良方法(参照专利文献3)，该试剂盒(“ハイブリゼツプ(注册商标)”)是基于这些发明开发的商品。
(专利文献1)日本专利第3433929号公报(登记日：2003年5月30日，发行日：2003年8月4日)
(专利文献2)国际公开WO89/10411(国际公开日：1989年11月2日，对应公告公报：日本特公平07-40号)
(专利文献3)国际公开WO02/099133(国际公开日：2002年12月12日)
(非专利文献1)J.Sambrook et al.“Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition”Cold Spring Harbor Laboratory(2001)
(非专利文献2)主编：真木寿治，“PCR Tips-用以运用自如的要点与启示-”(PCR Tips-使いこなすためのコツとヒント-)秀润社(1999)
(非专利文献3)Tsugunori Notomi et al.Loop-mediated isothermalamplification of DNA.Nucleic Acids Research，vol.28，No.12：e63(2000)
(非专利文献4)Lizardi PM et al.Mutation detection and single-moleculecounting using isothermal rolling-circle amplification.Nature Genetics，jul；19(3)：225-32.(1998)
(非专利文献5)B.D.Hames，S.J.Higgins：著，堀越正美：译“基因发现与转录因子”Medical Sciences International(1996)
(非专利文献6)松久明生、荒木宏昌，“基于原位杂交法的败血症诊断的临床有用性”，BIO Clinica，北隆馆，1999年，14卷、1号，p.97-101
这里，用于调查有无某一特定核酸或基因存在的场合。在采用上述PCR法等的核酸扩增方法或ISH法等杂交法的方法中，若在试料中作为靶的核酸或基因只微量存在，则有不能实现充分的检测灵敏度、再现性、简便性等场合的课题。
首先，在采用PCR法等核酸扩增方法的方法中，需要从试料抽取核酸。在抽取该核酸的过程中，难以避免发生核酸的损耗。例如，即便试料中包含作为扩增用的铸模所必要的量的靶核酸，也因核酸抽取过程的损耗而不能回收作为铸模所必要的量的场合，扩增效率下降，因此不能将靶核酸充分扩增，出现不能检测出试料中靶核酸的场合。在这种情况下，成为假阴性，得不到准确的结果。另外，即便在采用同一试料的场合，根据核酸抽取过程的损耗程度，可能得到不同的结果，缺乏再现性。即，在需要抽取核酸的核酸扩增方法中，若试料中包含的靶核酸非常微量，则存在因核酸抽取过程的核酸损耗而导致扩增效率下降带来检测灵敏度下降的问题。
另外，在试料溶液中也有包含阻碍扩增反应的物质(例如肝素、界面活性剂、蛋白质变性剂、有机溶剂等)的场合，与上述同样，存在因扩增效率的下降而导致检测灵敏度下降的问题。
接着，在采用ISH法等杂交法的方法中，由于无需从试料抽取核酸，不会出现核酸的损耗，但试料中包含的靶核酸非常微量时，存在难以检测出靶核酸与形成杂种的探针核酸的问题。
另外，本申请人开发的试剂盒(“ハイブリゼツプ(注册商标))可基于ISH法高灵敏度且迅速检测出末梢血的白血球中的细菌，但其要克服的课题可列举以下两点：
1)菌的信号的有无依赖于用显微镜的肉眼观察，要求一定程度的熟练度；
2)只有被白血球贪食的细菌才为检测靶，因此对于白血球数减少的患者的临床检体来说检测率下降。
本发明鉴于上述问题构思，其目的在于：提供即便试料中包含的靶核酸非常微量，也能准确且迅速地检测出靶核酸的核酸检测方法。
发明的公开
本发明人为解决上述课题积极研究的结果，发现将试料固定于支持体中，并且不从试料抽取核酸而直接在支持体上扩增核酸，从而不会招来伴随试料中核酸损耗的检测灵敏度的下降，可简便且迅速地检测出试料中的靶核酸，以至完成本发明。即本发明包括以下的发明。
(1)一种核酸检测方法，其特征在于包括：将包含细胞的试料固定于支持体的试料固定化工序；将试料中的核酸在支持体上扩增的核酸扩增工序；以及判定扩增的核酸是否为靶核酸的判定工序。
(2)根据(1)所述的核酸检测方法，其特征在于：在上述核酸扩增工序的前段，包括使试料中包含的核酸露出的核酸露出工序。
(3)根据(2)所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述核酸露出工序中的核酸露出方法，采用界面活性剂处理法、加酶处理法或加热处理法中任一种方法，或者组合两种以上方法加以使用。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述核酸扩增工序中的核酸扩增方法，采用PCR(聚合酶连锁反应)法。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：上述核酸扩增工序中标记扩增的核酸。
(6)根据(5)所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述判定工序中的判定方法，将核酸扩增工序中扩增且标记的核酸作探针，以该探针与已知基因片断的互补的杂交为指标判定是否为靶核酸。
(7)根据(6)所述的核酸检测方法，其特征在于：上述已知基因片断预先固定于支持体。
(8)根据(5)所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述判定工序中的判定方法，将核酸扩增工序中扩增且标记的核酸作探针，利用DNA微阵列判定是否为靶核酸。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：上述试料为生物源试料。
(10)根据(9)所述的核酸检测方法，其特征在于：上述生物源试料源自人体。
(11)一种基因检测试剂盒，用以实施(1)至(10)中任一项所述的核酸检测方法，该试剂盒用于检测试料中的靶基因。
(12)一种基因检测试剂盒，用以实施(10)所述的核酸检测方法，该试剂盒用于检测人体的疾病关联基因。
(13)根据(12)所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为人体感染的感染症原因微生物的基因。
(14)根据(13)所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体感染的感染症原因微生物的基因为药剂耐性基因。
(15)根据(13)所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体感染的感染症原因微生物的基因为药剂感受性基因。
(16)根据(12)所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为癌标准基因。
(17)根据(12)所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为遗传性疾病关联基因。
(18)根据(11)至(17)中任一项所述的基因检测试剂盒，其特征在于：至少包括靶基因扩增引子、PCR反应用缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合液、标记脱氧核苷三磷酸、耐热性DNA合成酶、试料固定化用支持体、扩增核酸检测用指示药。
依据上述构成，即便试料中包含的靶核酸非常微量，也能不引起由核酸抽取导致的核酸损耗而高灵敏度、高精度且再现性良好地检测出靶核酸。另外，可简便且迅速地实施，且结果的判定不需要熟练度。
本发明的其它的目的、特征及优点，根据以下所示的记载将充分给出。另外，本发明的优点，通过借助附图的以下说明将更加清晰。
附图的简单说明
图1是一例本发明的核酸检测方法的示图。
图2是表示试料采用贪食样品，并通过本发明的核酸检测方法检测被白血球贪食的微生物的结果的电泳图像。
图3是表示试料采用败血症患者的临床检体，并通过本发明的核酸检测方法检测被白血球贪食的微生物的结果的电泳图像。
图4是表示试料采用败血症血液模型，并通过本发明的核酸检测方法检测白血球中的IL6的发现增加的结果的电泳图像。
实施本发明的最佳方式
说明本发明的一实施方式，则如下。还有，本发明并不限于此。
1.本发明的核酸检测方法
本发明的核酸检测方法的特征在于包括：将包含细胞的试料固定于支持体的试料固定化工序；在支持体上扩增试料中的核酸的核酸扩增工序；以及判定扩增的核酸是否为靶核酸的判定工序。另外，核酸扩增工序的前段，可包括使试料中包含的核酸露出的核酸露出工序。图1示出本发明的核酸检测方法的一实施方式。在图1所示实施方式中，在支持体上固定生物源试料(试料固定化工序)，加上包含疾病关联基因源的引子的PCR混合料进行PCR(核酸扩增工序)。在该核酸扩增工序中对与核酸扩增同时，或在核酸扩增后扩增的核酸进行标记(将在后面详细说明)。最后，利用电泳(琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳等)、定量PCR、斑点杂交(宏阵列、微阵列等)等的核酸检测方法，判定扩增的核酸是否为靶核酸(判定工序)。还有，本发明的核酸检测方法并不限于图1所示实施方式。以下就本核酸检测方法详细说明其特征。
(1)试料固定化工序
试料固定化工序是将试料固定于支持体的工序。通过将试料固定于支持体，可省略一般在核酸扩增或标记时进行的核酸精制工序。另外，当试料溶液中含有阻碍核酸的扩增反应的物质(例如，肝素、EDTA-2Na、阳离子、高蛋白溶液、高盐浓度溶液、界面活性剂含有溶液、蛋白变性溶液(尿素、胍盐酸等)、有机溶剂等)时，由于这些扩增阻碍物质不会滞留在普通细胞内，可通过将试料固定于支持体来容易除去。而且，通过将试料固定于支持体，可稳定地保存核酸。
(试料)
在本发明的核酸检测方法(以下适当简化成“本检测方法”)中使用的试料，只要是包含细胞的试料即可。由本检测方法检测的靶核酸可为DNA(脱氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)的任一种。由于在细胞中含有这些核酸(DNA及RNA)，可用本检测方法检测出其中的靶核酸。关于细胞的种类并无限定，可将动物细胞、植物细胞、微生物细胞等所有细胞作为对象。另外，试料的细胞以外的部分可在后述的核酸露出工序中通过化学处理、加酶处理、加热处理等来消化，只要包含的细胞的核酸可以露出即可。作为本检测方法中使用的试料，优选包含细胞的生物源试料，但并不限定于此，在不源自生物的试料上也可适用本检测方法。
作为不源自生物的试料，可列举例如包含细胞的食品材料、土、水、纤维、灰尘等。作为生物源试料，可优选使用动物及植物的生物构成组分。作为包括人体在内的动物源的试料，可列举例如血液、组织液、淋巴液、脑脊髓液、脓、黏液、鼻涕、吐痰、尿、粪便、腹水等体液类；皮肤、肺、肾、黏膜、各种内脏器官、骨等组织；鼻腔、支气管、皮肤、各种内脏器官、骨等清洗后的清洗液。另外，人体的场合也可将渗析排泄作为试料。
另外，本检测方法中作为靶的核酸并不限于试料中包含的细胞固有的核酸，也可适用细胞中感染的病毒的核酸或细胞贪食的微生物等的核酸。因而，含有感染症患者的贪食细胞(白血球等)的生物源试料适合作为本检测方法的试料。
(支持体)
支持体用于在其表面固定试料，同时在该支持体上扩增试料中的靶核酸。因而，只要是能够达成这样目的的支持体，其材质、形状等并无特别限定。作为材质可列举例如玻璃、金属、合成树脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龙、聚缩醛、氟化树脂等)、多糖类(纤维素、琼脂糖等)、滤纸等。另外，作为形状可为例如片状、盆状、球状、纤维状、棒状、盘状、容器状、盒、管状等各种形状，只要对照实施本检测方法的条件选择合适的形状即可。
对一个支持体固定1试料，使用对应于试料数的数量的支持体即可，但为了有效率地进行操作，优选可对一个支持体固定多个试料的情况。另外，在本检测方法中，在同一支持体上将试料固定化工序→核酸扩增工序或者试料固定化工序→核酸露出工序→核酸扩增工序作为一系列的操作进行，因此在一个支持体上固定多个试料的场合，需要使相邻的试料不会混合。因而，作为本检测方法中使用的支持体，优选一个支持体上具有多个分离区域的支持体。还有，在本检测方法的核酸扩增工序中，若利用PCR法扩增核酸，则优选耐热性素材。另外，尤其优选适合市售的PCR用基因扩增设备(热循环控制器)的形状。
(固定)
在本发明的核酸检测方法中，固定指的是用某种方法将试料固接并保持在支持体上。在本检测方法中使用的固定方法并无特别限定，只要适当选择使用传统公知的固定方法即可。作为公知的固定方法，可列举利用共价键或离子键等结合到不溶性载体的载体结合法；通过交联试剂利用共价键结合并不溶化的交联法；用高分子凝胶或半透膜等包进去的包括法；利用脱水使蛋白迅速变性并固接在载体上的方法等。更具体地说，可列举卡诺(carnoy)固定、酒精固定、火焰固定、戊二醛固定、干燥固定、丙酮固定、甲醇固定、福尔马林固定等。
另外，在支持体表面上粘接试料的情况也包括在固定。因而，可在支持载体表面预先涂敷粘接性高的物质例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、聚L-赖氨酸、凝胶等。若使用经过这种处理的支持体，则根据试料的种类能够充分地在支持体上固接并保持。另外，在支持体上粘接并固定的基础上，也可并用上述例示的固定方法。
(2)核酸露出工序
在核酸扩增工序中为扩增试料中包含的核酸，必须使引子或核酸合成酶到达靶核酸。根据试料也有靶核酸露出在试料表面的情况，对于这种试料能够从试料固定化工序进行直接核酸扩增工序。因而，本核酸露出工序并非本检测方法的必须工序。但是，靶核酸不在试料表面露出时，需要设置核酸露出工序，使靶核酸露出。
作为在核酸露出工序中使用的方法，可列举界面活性剂处理法(SDS、TRITON-X、TWEEN-20、BRIJ、NP-40、CHAPS等)、蛋白酶等的加酶处理、加热处理法等。但是，并不限定于此，按照所使用的试料及靶核酸，可适当选择最佳方法。例如，在细菌感染引起的败血症中，检测被白血球贪食的细菌的基因时，作为消化细菌的细胞壁的酶使用溶葡球菌酶、溶菌酶、N-乙酰胞壁质酶、ZAIMORAZE等，从而能够使细菌、真菌等微生物的基因露出。
(3)核酸扩增工序
核酸扩增工序为在试料固定的支持体上扩增靶核酸的工序。这里，本发明的核酸检测方法的最大特征在于不对试料中的核酸进行抽取、精制，而在试料固定的支持体上进行靶核酸的扩增。从而，即使靶核酸在试料中只微量存在，因不发生抽取及精制过程的损耗，也可不使检测灵敏度下降而检测出微量的靶核酸。另外，可实现操作的简便化，并可缩短操作时间。
核酸扩增指的是利用对靶核酸的任意序列特异性的引子或随机序列的引子和DNA聚合酶或RNA聚合酶，扩增试料中的核酸。作为扩增方法，适合采用传统公知的扩增方法。具体地说，可列举例如PCR法、Nested-PCR法、RT-PCR法、ICAN法、UCAN法、LAMP法、引子延伸法、转录(transcription)、复制(replication)等。
在上述例示的扩增方法中PCR法适合作为检测方法中使用的扩增方法。以下，就本检测方法的核酸扩增工序中使用PCR法的场合进行说明。
PCR法指的是通过夹有特定DNA区域的2种引子与DNA合成酶(耐热性DNA聚合酶，以下酌情记为“Taq聚合酶”。)的DNA合成反应在实验管内的反复进行，扩增其特定DNA区域的方法，是一般在基因工学领域使用的公知技术。PCR法还包括Nested-PCR法、RT-PCR法等。
Nested-PCR法指的是使用外侧的引子与内侧的引子进行2阶段的PCR的方法，是以来自目标区域的最初扩增产物为铸模，从最初使用的引子位置两侧均在内侧设定引子进行的方法。通过使用Nested-PCR，在第1次的PCR没有充分扩增到可检测出靶核酸的量时，能够通过第2次的PCR扩增到可检测的量。另外，在第1次的PCR中产生非特异性的扩增产物时，这些非特异性扩增产物具有与第2次的PCR中的引子类似的序列的概率极低。因而，在第2次的PCR中只将具有靶的序列的片断扩增的概率变高，从而消除因非特异性扩增产物而发生的弊端，可更准确地检测出靶核酸。
RT-PCR法指的是用以对mRNA适用PCR的变法，是作为PCR的前阶段，包括利用逆转录酶进行逆转录反应的工序的PCR法。若在本检测方法中使用RT-PCR法，可将靶核酸作为mRNA。即，可将本检测方法应用在基因发现的检测。
如在上述(支持体)一项中所描述的那样，本检测方法中在固定试料的支持体上进行PCR，因此支持体优选具有多个分离区域的支持体。作为采用具有多个分离区域的支持体时的PCR具体步骤，可将PCR混合料(混合了缓冲液、dNTPmix、Taq聚合酶等)添加在支持载体上的各区域的试料中，再加引子后利用PCR用基因扩增设备(热循环控制器)等进行PCR。关于引子，对于1个PCR采用将各式各样的靶核酸特异性地扩增的引子组。对于PCR的条件(反应液的量、酶或基质的浓度、反应温度等)并无特别限定，可根据所使用的试料及靶核酸，适当选择最佳条件。
当进行Nested-PCR时，可在支持体上进行第1次的PCR，且第2次的PCR利用PCR管等进行。还有，在第2次的PCR中使用的引子必须设计成两侧均与最初使用的引子位置相同，或者设计在内侧。
由PCR扩增的片断最好是靶核酸具有特异性的序列部分。试料中包含的核酸大多数为靶部分以外的部分，因此若不在靶微生物中特异性的序列部分设计引子，则产生非特异性扩增产物的可能性变高。因而预先调查靶核酸的特异性序列，并设计引子以扩增该序列部分变得很重要。
扩增的片断长度最好在50bp～5,000bp的范围内，若为100bp～2,000bp的范围内则更好。若在该范围以外，则有可能不能有效地获得特异性的扩增产物。
在核酸扩增工序中，最好标记扩增的核酸。从而，能够高效率地实施后段的判定工序。核酸的标记可与扩增同时或在扩增后进行。作为标记方法，可列举放射性标记、半抗源(生物素、地谷新配基等)标记、萤光标记等，但并不限定于此。
作为核酸扩增方法，在与核酸的扩增同时进行的场合，进行上述的PCR法、Nested-PCR法、RT-PCR法、ICAN法、UCAN法、LAMP法、引子延伸法、转录(transcription)、复制(replication)等的扩增反应时，例如将由地谷新配基或生物素等的半抗源、FITC、放射性同位素标记的核苷模拟物为基质，能够在扩增反应中标记靶核酸。另外，在扩增反应时，通过使用将末端标记的引子，可标记靶核酸。在扩增反应后标记的场合，能够采用缺口平移(Nick Translation)法或随机引物法、引子延伸法、TdT法、5’运动法等。该场合也可将标记的核苷模拟物作为基质，或者通过使用将末端标记的引子来标记。
在核酸扩增工序中，对靶核酸的任意序列使用特异性的引子时，可将具有已知盐基序列的核酸片断扩增。另一方面，当使用随机序列的引子时，由于非特异性地核酸扩增，不能预测会生成具有何种盐基序列的核酸片断。若在核酸扩增工序中使用已设计成扩增具有已知盐基序列的核酸片断的引子，则在后述的判定工序中，通过盐基序列的确认或与具有已知盐基序列的核酸片断的杂交，能够判定是否为靶核酸。当使用随机序列的引子时，在后述的判定工序中，通过采用DNA微阵列等，能够判定试料中是否含有靶核酸。
(4)判定工序
判定工序是判定核酸扩增工序中扩增的核酸是否为靶核酸片断的工序。本发明的核酸检测方法中，由于在扩增核酸后进行检测，不会发生靶核酸微量而难以检测的问题。另外，由于能够适当选择公知的方法，判定不需要熟练度。
显然判定包括确认扩增的核酸片断长度或盐基序列的情况，但也可包括确认扩增的DNA片断的转录产物即RNA的情况或基于扩增的核酸片断确认发现的蛋白质的情况。作为在判定工序中采用的方法的具体例，确认核酸(DNA或RNA)的方法可列举琼脂糖凝胶电泳、定量PCR、序列(sequence)、斑点杂交、DNA微阵列、南方(southern)杂交、北方(northem)杂交等；确认蛋白质的方法可列举SDS-PAGE、西方(western)印迹法、质量分析法(MALDI-TOF-MS、LC-MS、LC-MS/MS等)等。但是，并不限定于这些方法，可选择适当的方法加以使用。
作为最简便的判定方法，可列举琼脂糖凝胶电泳。但是，由于该方法对从试料扩增的核酸片断的长度与仅以靶核酸为铸模扩增时的核酸片断的长度进行比较，确认是否一致，所以当非特异性的扩增产物偶然为类似的长度时会导致错误的结果(拟阳性)。为了准确判定扩增的核酸是否与靶核酸一致，可靠性最高的方法为确认扩增核酸的盐基序列的方法(序列)。如果采用该方法，能够检出SNP(single nucleotide polymorphism)。
作为简便且准确判定靶核酸是否扩增的方法，优选采用将标记的扩增核酸作探针，以该探针与已知基因片断的互补的杂交为指标判定是否为靶核酸的方法。另外，当采用该方法时，作为探针的核酸最好采用设计成具有作为杂交对象的上述已知基因片断的盐基序列的引子进行扩增。另外，作为杂交对象的上述已知基因片断最好预先固定于支持体上。通过预先将已知基因片断固定于支持体，可准确捕捉与探针的杂交。另外，能够使已知基因片断带上位置信息，并通过使各式各样的已知基因片断排列，可一次检出许多基因。
具体地说，例如将靶核酸预先定位(固定)于尼龙膜片等，以扩增的核酸为探针进行杂交。若定位的核酸与扩增的核酸之间杂交成立，可判定试料中存在靶核酸。另一方面，在核酸扩增工序中核酸不扩增时，或者非靶核酸的核酸非特异性地扩增时，杂交不成立，可判定试料中存在靶核酸。
作为杂交的对象的上述已知基因片断，如果包含通过核酸扩增工序扩增的预定的盐基序列部分，就无特别限定，但最好只是扩增的预定的盐基序列部分或者是扩增的预定盐基序列部分的一部分。这是由于当包含扩增的预定盐基序列部分以外的盐基序列序列时，若扩增的核酸为不具备目标序列的非特异性扩增产物，则有可能进行杂交。
杂交可将对已知基因片断标记的扩增核酸为探针，用公知的方法进行。作为公知的方法，例如，可列举J.Sambrook et al.Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)所述的方法等，但并不限定于此。
另外，也可采用以在核酸扩增工序中扩增且标记的核酸为探针，利用DNA微阵列判定有无靶核酸存在的方法。这里，DNA微阵列中包含所谓低聚DNA型和cDNA型的任一种。另外，DNA微阵列可采用市售的，也可用自制的。在判定工序中使用DNA微阵列时，如上所述，可判定核酸扩增工序中利用随机序列的引子非特异性地扩增的核酸中是否存在靶核酸。
(5)本发明的核酸检测方法的适用范围
本检测方法可在传统的称为基因诊断的所有领域适用。其例示如下，但并不限定于此。
a)病原微生物(细菌、真菌、病毒、寄生虫等)的检测，即感染症的分子诊断
b)癌症的分子诊断
c)出生前的遗传性疾病等的分子诊断
d)药物代谢相关的基因的分子诊断
e)来自法医学样品的分子诊断
f)疾病标准基因的分子诊断
g)移植时的组织分型
h)适合性测试
i)SNPs检测
认为本发明的核酸检测方法最适合用于上述a)所示的感染症的分子诊断。以下说明其理由。
病原微生物在血液中或体液中悬浮存在的可能性低，侵入宿主细胞才开始出现感染症的症状。因而，作为检出感染症的病原微生物的试料，白血球等的免疫类细胞合适。还有，作为检测被细胞贪食的细菌或侵入细胞的病毒等的方法，在从试料抽取核酸后扩增的传统的PCR法或不扩增核酸而进行靶核酸的检测的ISH法中，有时不能实现充分的检测灵敏度、再现性、简便性等。另一方面，本发明的核酸检测方法中，将贪食细菌的细胞或病毒等侵入的细胞直接固定于支持体，在这种状态下扩增细胞中的细菌或病毒等的核酸并加以检测，因此清楚比上述传统的方法显著提高了检测灵敏度及精度。
另外，传统的检测细胞内病原微生物等的方法有原位PCR法。该方法中，将细胞固定于承物玻璃片，在细胞内进行PCR，通过用ISH法使探针杂交来使细胞内扩增的产物视觉化，用显微镜检测。因而，原位PCR法可期待与本发明的核酸检测方法相同的检测灵敏度，但存在条件设定难、缺乏再现性的问题。而且，存在非特异性反应较多，且在细胞内难以区别非特异性扩增产物与靶的特异性扩增产物的问题。
由此，本发明的核酸检测方法作为检测被细胞贪食的细菌或侵入细胞的病毒等的方法，可称得上是非常优秀的方法。
2.本发明的基因检测试剂盒
将本发明的基因检测试剂盒(以下适当简化为“本试剂盒”)是利用本发明的核酸检测方法检测试料中靶基因用的试剂盒。通过将本检测方法中使用的试剂、器具类试剂盒化，可简便地实施本检测方法，可在更短时间获得准确的检测结果。还有，基因中包含DNA及RNA。
(1)本试剂盒的构成
本试剂盒中最好至少包括：在试料固定化工序中使用的试料固定化用支持体；在核酸扩增工序中使用的引子、核酸合成酶、基质(核苷三磷酸)、缓冲液等的试剂；在判定工序中使用的扩增核酸检测用指示药等的试剂及器具等。另外，在将所使用的试料作为特定的试剂盒而需要核酸露出工序的场合，可包含核酸露出用试剂(界面活性剂或蛋白质分解酶等)。另外，可包含适合所使用的试料的固定用试剂。例如，特定为包含白血球的生物源试料，且将被白血球贪食的细菌等微生物的基因组作为靶核酸的试剂盒的场合，最好包含固定用试剂(例如卡诺固定液等)及核酸露出用试剂(微生物的细胞壁分解酶等)。
还有，通过将核酸扩增方法及判定方法特定，可将试剂盒中包含的试剂的构成具体化。例如，将核酸扩增方法作为PCR法的场合，核酸扩增工序中使用的试剂为PCR反应用缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合液、耐热性DNA合成酶(Taq聚合酶)。另外，如果需要用PCR标记核酸，只要再包含标记脱氧核苷三磷酸即可。
当判定方法采用琼脂糖凝胶电泳法时，只要试剂盒中包含琼脂糖凝胶、电泳用缓冲液、分子量标准、核酸染色用试剂等即可。当判定方法采用斑点杂交时，只要试剂盒中包含将靶核酸定位(固定)的1-苯基-2，3-二甲基吡唑啉酮碳酸钠、杂交用缓冲液、对应于核酸的标记的检测用指示药(例如，在采用地谷新配基标记时酶标记的抗地谷新配基抗体、使标记的酶发色的基质等)、杂交袋(Hybri-Bag)、其它必要的试剂、器具等即可。当核酸检测方法采用DNA微阵列时，只要试剂盒包含对应于靶核酸的DNA微阵列及必要的试剂、器具等即可。
即，通过具体地特定本发明的核酸检测方法中使用的试料、靶基因、核酸扩增方法、核酸检测方法，可将所使用的试剂、器具等各式各样组合而构成试剂盒。还有，本试剂盒的构成并不限于上述例示的试剂、器具等，可根据目的适当地选择合适的公知试剂、器具等。
(2)靶基因
一个试剂盒中包含的靶基因无需限于1基因，通过使试剂盒包含多个引子组(primer set)，可作成可检出多个靶基因的试剂盒。例如，以疾病关联基因为靶的试剂盒中，可将由同一试料能够检测的多个疾病关联基因作为靶。更具体地说，以感染症的原因微生物的基因为靶的场合，只要使试剂盒包含可将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肠球菌、大肠菌等特异性地检测的引子组即可。作为这种感染症的原因微生物的靶基因，最好是药剂耐性基因或感受性基因。
另外，以癌标准基因为靶的场合，只要使试剂盒包含可将p53、MDM2、H-ras、K-ras、N-ras、APC、Myc、HER2/neu、BRCA1、BRCA2、erbB、src、fos、jun、raf、fes、erb-A、fms、sis、Rb、WT1等特异性地检测的引子组即可。另外，以遗传性疾病关联基因为靶的场合，只要使试剂盒包含可将例如色素性干皮症关联基因(XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF/ERCC1、XPV)、家族性大肠癌关联基因(APC)、老年痴呆病关联基因(apoE4)、冠状动脉性疾病关联基因(apoE2)、Von Hippel-Lindau病关联基因(VHL)、筋萎缩关联基因(dystrophyin)等特异性地检测的引子组即可。
还有，本试剂盒的适用范围与上述“1.(5)本发明的核酸检测方法的适用范围”相同，可适用于传统的称为基因诊断的所有领域。因而，本试剂盒的靶基因可从所有基因诊断领域选择，并不限于上述例示。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于实施例。
<实施例1.使用贪食样品的核酸的检测>
(试料调制)
预先将外来微生物(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus、以下SA)ATCC 126000、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermdis、以下SE)ATCC14990、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa、以下PA)ATCC 10145、肠球菌(Enterococcus faecalis、以下EF)ATCC 19433、大肠菌(Escherichia coli、以下EC)ATCC 11775)植菌在脑心浸液(BHI)培养液(DIFCO)中，在37℃培养8小时以上。
将培养的菌液，在4℃按2,000×g离心分离10分钟后集菌。弃上清后，将菌的颗粒用PBS 5mL悬浮，再次在4℃按2,000×g离心分离10分钟后集菌。将集菌的菌用PBS 5mL悬浮后，用PBS稀释而制作15mL的由吸光度计将菌液的浊度(OD＝600nm)调整为0.01～0.03的菌液。将制作的菌液移到各175cm2的培养用烧瓶中，约30分钟在室温中静放。
采集肝素加健常人体血液50mL，将血液分离试剂(氯化钠225mg及葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g用消毒纯净水溶解，并搅拌成25mL的)约按4∶1的比例加入，在37℃(20～40℃)静放30分钟，分取白血球片断。将分取的白血球片断用PBS作成50mL。
将装入上述菌液并静放的培养用烧瓶的上清悄悄除去，将用上述PBS稀释的白血球片断在每个烧瓶加入10mL，并在室温静放约10分钟。除去烧瓶内上清，将附着在烧瓶底部的白血球用0.02％EDTA含有PBS10mL回收到15mL的远沉管，并在4℃按140×g～180×g离心分离10分钟，并收集白血球。当确认收集的白血球中混入了红血球时，通过消毒纯净水1mL将白血球的沉渣平稳地悬浮并溶血后，加入PBS14mL，在等渗化后，再次在4℃按140×g～180×g离心分离10分钟，并收集白血球。
将收集的白血球用PBS悬浮，并由血球计测量细胞数，调整到1×104个/μL～5×104个/μL。将该样品称为贪食样品，并作为本实施例的试料。
(试料固定化工序)
对以上述各贪食样品为支持体加以使用的TopYield strips(NUNC：248909)的各槽分别涂上5μL，并风干。各槽中注入100μL的75％乙醇并5分钟固定及脱盐。然后，弃75％乙醇，用热循环控制器风干。
(核酸扩增工序)
用Nested-PCR法进行了靶核酸的扩增。首先，在固定了各贪食样品的槽中加入PCR关联试剂(每个槽，TaKaRa Ex Taq(5单位/μL)：0.5μL(final 2.5U)；10×Ex Taq Buffer：5μL；dNTP mixture(各2.5mM)：4μL；各细菌识别引子2种：0.4μM；消毒纯净水：up to 50μL)。第1次的PCR用引子中，作为SA识别引子使用以下所示SA1T(序列号1)及SA1B(序列号2)。
SA1T：5’-GAGGATGCAGCGAATTAAACAACGTACTGCTGTTCAACGC-3’
SA1B：5’-AATGAAACTTTACCAACAATTTGGTCTTCATCAATGAGGC-3’
作为SE识别引子，使用以下所示SE1T(序列号5)及SE1B(序列号6)。
SE1T：5’-ACTGGAATAATCATTGGTATTATTGCTTTAATTCTAGTAA-3’
SE1B：5’-CTAACAAAATCTAAGTAGAGTTTCAGGAATTTTTCTGGTT-3’
作为PA识别引子使用以下所示PA1T(序列号9)及PA1B(序列号10)。
PA1T：5’-ACCTTGCCGATGATCAGGTCGAGCAGCAGCAGTTCCGCCG-3’
PA1B：5’-GTGTTCACCGGCTCCACCGAGGTCGGCAAGTACTTCATGC-3’
作为EF识别引子使用以下所示EF1T(序列号13)及EF1B(序列号14)。
EF1T：5’-CTTTTGCTAGTTCATGTTTATTGATTTTTCGTTCGATTAT-3’
EF1B：5’-TACCATTTCTTGCATGCTCATTTCTCCTTACTACTGAAAC-3’
作为EC识别引子使用以下所示EC1T(序列号17)及EC1B(序列号18)。
EC1T：5’-CATTTGTGAATGAGATGCACTGACTAAATCAATTGGCCCC-3’
EC1B：5’-CCGAGATGGGCTTCACCTGTCTGCGTATTTCCATTGCCTG-3’
热循环控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)，在94℃保持1分钟后，在94℃中1分钟、68℃中3分钟的反应反复50周期，并在72℃保持1分钟而结束第1次的PCR。
第2次的PCR(Nested-PCR)在上述组分的PCR关联试剂进入的PCR管中加入第1次的PCR反应液5μL后进行。第2次的PCR用引子中，作为SA识别引子使用以下所示SA2T(序列号3)及SA2B(序列号4)。
SA2T：5’-TGTTCAACGCTTGATTAGTTTTATT-3’
SA2B：5’-TCAATGAGGCCAAACGCACGGCTAT-3’
作为SE识别引子使用以下所示SE2T(序列号7)及SE2B(序列号8)。
SE2T：5’-ATTCTAGTAATTATGCAAGGGTTTC-3’
SE2B：5’-TTTTCTGGTTCCTCGATATGTGGTG-3’
作为PA识别引子使用以下所示PA2T(序列号11)及PA2B(序列号12)。
PA2T：5’-AGTTCCGCCGAGAGGGCGAACATCG-3’
PA2B：5’-TACTTCATGCAGTATTCCGCGCAAT-3’
作为EF识别引子使用以下所示EF2T(序列号15)及EF2B(序列号16)。
EF2T：5’-GTTCGATTATCCCACAAGATTATAT-3’
EF2B：5’-CTACTGAAACATCGTCTTAAAAAAA-3’
作为EC识别引子使用以下所示EC2T(序列号19)及EC2B(序列号20)。
EC2T：5’-AATTGGCCCCCAACTGGTGTACCCC-3’
EC2B：5’-CCATTGCCTGGGCGCGAATTTTCCC-3’
热循环控制器与第1次同样使用GeneAmp PCR System9700(PE AppliedBiosystems)，在94℃保持1分钟后，在94℃中1分钟、68℃中1分钟的反应反复30周期，并在72℃保持1分钟而结束第2次的PCR。
(判定工序)
通过1％琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖：Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，将扩增的PCR产物分离，并用溴化乙锭染色。通过与以使用的各细菌为铸模使用同一引子进行的PCR的结果相比，确认靶核酸是否扩增。
(结果)
在图2示出结果。左侧表示以各细菌为铸模进行PCR的结果，右侧表示以各贪食样品为试料用本发明的核酸检测方法将各细菌的靶核酸扩增的结果。图中M表示分子量标准，左端的数值表示分子量(bp)。由图1可知：贪食样品的第2次的PCR(2ND-PCR(nested))的线条(band)的位置与以各细菌为铸模进行PCR时的第2次的PCR(2ND-PCR(nested))的线条位置相同，表示检出了靶核酸。
<实施例2.从败血症患者判定原因菌>
(试料调制)
从疑为败血症的患者采集血液5mL，并加入肝素(肝素加血液)。在肝素加血液中按约4∶1的比例加入血液分离试剂(将氯化钠225mg、葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g用消毒纯净水溶解，搅拌成25mL)，在37℃(20～40℃)静放30分钟，分取白血球片断。在4℃按140～180×g离心分离10分钟，并收集了白血球。当确认收集的白血球中混入了红血球时，用消毒纯净水1mL使白血球的沉渣平衡地悬浮而溶血后，加入PBS 14mL进行等渗化，然后再次在4℃按140～180×g离心分离10分钟，并收集了白血球。使收集的白血球在PBS150μL悬浮。将它称为临床检体，并作为试料。
(试料的固定)
对以上述试料为支持体加以使用的TopYield strips(NUNC：248909)各槽上分别涂上5μL，并利用热循环控制器(GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems))在42℃风干。向各槽注入100μL的75％乙醇进行5分钟的固定及脱盐。然后，弃75％乙醇，利用热循环控制器在42℃风干。
(试料的前处理(核酸露出工序))
向各槽加入酶试剂(在消毒纯净水1mL中溶解皂草苷125μg；t-辛基苯氧聚乙氧基乙醇(比重1.068～1.075(20/4℃)、pH(5w/v％)5.5～7.5)125nL；N-乙酰胞壁质酶(生化学工业社制)50单位；溶菌酶(生化学工业社制)5000单位；溶葡球菌酶(SIGMA社制)5单位而调制的试剂)10μL，利用热循环控制器，在37℃处理10分钟后，在95℃处理10分钟并使酶失活及槽风干。
但是，N-乙酰胞壁质酶将S.salivarius IF03350的热处理细胞在37℃、pH7.0的情况下1分钟溶菌1μg的酶活性为1单位。溶菌酶将M.luteus在35℃、pH6.2的情况下1分钟540nm的吸收降低0.001时的酶活性为1单位。溶葡球菌酶将S.aureus在37℃、pH7.5的情况下10分钟620nm的吸收从0.240降低到0.125时的酶活性为1单位。
(核酸扩增工序)
利用Nested-PCR法进行了靶核酸的扩增。首先，向试料固定的槽加入PCR关联试剂(每个槽，用消毒纯净水将TaKaRa LA Taq：0.2μL；10×LA Taq Buffer：2μL；25mM MgCl2：2μL；dNTP mixture(各2.5mM)：3.2μL；各细菌识别引子2种：各0.16μM调整为20μL)。
第1次的PCR用引子使用上述实施例1中使用的引子相同的引子。即，作为SA识别引子使用了SA1T(序列号1)及SA1B(序列号2)。作为SE识别引子使用了SE1T(序列号5)及SE1B(序列号6)。作为PA识别引子使用了PA1T(序列号9)及PA1B(序列号10)。作为EF识别引子使用了EF1T(序列号13)及EF1B(序列号14)。作为EC识别引子使用了EC1T(序列号17)及EC1B(序列号18)。
热循环控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)，在94℃保持1分钟后，98℃中20秒、68℃中3分钟的反应循环反复30周期，在72℃保持5分钟而结束了第1次的PCR反应。
第2次的PCR(Nested-PCR)是在装入上述组分的PCR关联试剂的PCR管加入第1次的PCR反应液1μL后进行。在第2次的PCR反应中使用以下的引子。
SA识别引子
SA3T：5’-ACTGTTCGTACAAACTTTTGTAATAGTTGGTCATG-3’(序列号21)
SA3B：5’-CTCGCCATCTTTCAAAGTTGGATCCATTGATTCAC-3’(序列号22)
SE识别引子
SE3T：5’-GGTATATAAATGACTAAAGGGAGGTGCCAAGATGA-3’(序列号23)
SE3B：5’-GCAATGCACGTACTGCAATTGCACTTTCTTCCGGAG-3’(序列号24)
PA识别引子
PA3T：5’-ATTCGATCGTCCTCTTGTTGTCGTTATCGGCATCG-3’(序列号25)
PA3B：5’-TGGTGGAGCGTTCGATCCACGACGAGTTCGTCGAG-3’(序列号26)
EF识别引子
EF3T：5’-ATCAGGCGTATCCATTATTGGATTAACCACGATTG-3’(序列号27)
EF3B：5’-TTGCTCCTGACGATATTCACGATTCCCTAAAATCC-3’(序列号28)
EC识别引子
EC3T：5’-AGATGCGGATTGGGGATCATATTCAGTATGTTGCC-3’(序列号29)
EC3B：5’-GATCACTTCGAACATTACGCCCGCACGGTCTTTAC-3’(序列号30)
热循环控制器与第1次同样使用GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems)，在94℃保持1分钟后，98℃中20秒、68℃中1分钟的反应循环反复30周期，在72℃保持5分钟而结束了第2次的PCR反应。
(判定工序)
通过1％琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖：Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，将扩增的PCR产物分离，并用溴化乙锭染色。以与使用的引子对应的各细菌为铸模进行PCR反应，确认了靶核酸扩增(正调节)。另外，在不将试料涂上的状态下进行PCR反应，确认了靶核酸非特异性地扩增(负调节)。
(结果)
在图3示出电泳的结果。图中左端的数值表示分子量(bp)。
由图3可知：由于可确认Lane13及Lane15上特异性的核酸的扩增，判定该临床检体被SA(金黄色葡萄球菌)及PA(绿脓假单胞菌)感染(阳性)。
还有，在表1示出对于包括该临床检体(临床检体1)在内的4个例的临床检体，用与上述相同的方法判定原因菌的结果。
[表1]
  SA   SE   PA   EF   EC   血液培养
 临床检体1   阳性   阴性   阳性   阴性   阴性   阴性
 临床检体2   阴性   阴性   阳性   阴性   阴性   阴性
 临床检体3   阴性   阴性   阳性   阴性   阴性   阴性
 临床检体4   阳性   阴性   阳性   阴性   阴性   阴性
由表1可知：本发明的核酸检测方法表示对判定败血症患者的原因菌有效。
<实施例3.从败血症血液模型检测生物因子(RNA)>
(败血症血液模型的调制)
预先将外来微生物(大肠菌(Escherichia coli、以下EC)ATCC11775)植菌到脑心浸液(BHI)培养液(DIFCO)，在37℃培养了8小时以上。将培养的菌液在4℃按2000×g离心分离10分钟后集菌。在弃上清后，将菌的颗粒用PBS 5mL悬浮，再次在4℃按2000×g离心分离10分钟后集菌。将集菌的菌用PBS 5mL悬浮后，用PBS稀释并用吸光度计将菌液的浊度(OD＝600nm)调整为0.1～0.15而制作5mL。采集肝素加健常人体血液8mL，在两个15mL的远沉管分别注入4mL。在肝素加血液4mL加入制作的菌液及PBS 400μL，在37℃静放3小时，诱导发现炎症性细胞素。
向上述肝素加血液按约4∶1的比例加入血液分离试剂(用消毒纯净水溶解氯化钠225mg、葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g，搅拌成25mL)，在37℃(20～40℃)静放30分钟，分取白血球片断。在4℃按140～180×g离心分离10分钟，并收集了白血球。当确认收集的白血球中混入了红血球时，用消毒纯净水1mL使白血球的沉渣平衡地悬浮而溶血后，加入PBS 14mL进行等渗化，然后再次在4℃按140～180×g离心分离10分钟，并收集了白血球。使收集的白血球在PBS 150μL悬浮。将它作为败血症血液模型，并作为试料。
(试料的固定)
对以上述试料为支持体加以使用的TopYield strips(NUNC：248909)各槽上分别涂上5μL，并利用热循环控制器(GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems))在70℃风干。向各槽注入100μL的75％乙醇进行5分钟的固定及脱盐。然后，弃75％乙醇，利用热循环控制器在42℃风干。
(试料的前处理)
向各槽加入DNA分解酶(DNasel，RNase-free(Roche Diagnostics GmbH社制)0.1单位/μL、Tris-HCl 10mM、MgCl2 10mM、DTT 1mM、消毒蒸留水)10μL，利用热循环控制器，在37℃处理10分钟并分解白血球基因组DNA后，在70℃处理10分钟并使酶失活及槽风干。
但是，以小牛胸腺DNA为基质在25℃、pH5.0的情况下1分钟将反应液260nm的吸光度增加0.001增加的酶活性为1单位。
(核酸扩增工序)
利用RT-PCR法进行了靶核酸的扩增。首先，进行了逆转录反应(reversetranscription：RT)。逆转录反应中使用上标第一链系统(RT-PCR用)(Invitrogen)。在试料固定的槽中加入Oligo(dT)12-18(0.5μg/μL)：1μL和消毒蒸留水：9μL，在70℃处理10分钟后，在4℃静放1分钟。接着加入10×PCR buffer[200mMTTris-HCl(pH8.4)，500mM KCl]：2μL；25mM MgCl2：2μL；10mM dNTP mix：1μL；0.1M DTT：2μL，在25℃静放5分钟。然后，加入SuperScript II RT：1μL(50单位)，在25℃处理10分钟、42℃处理50分钟、70℃处理15分钟后，在4℃静放5分钟。在逆转录反应结束后，加入E.coli RNaseH(2单位/μL)：1μL，在37℃处理20分钟，将RNA完全分解。
PCR反应中，对装入PCR关联试剂(每个槽，用消毒纯净水将TaKaRa LATaq：0.2μL；10×LA Taq Buffer：2μL；25mM MgCl2：2μL；dNTP mixture(各2.5mM)：3.2μL；IL6识别引子：各0.16μM调整为18μL)的PCR管，加入逆转录反应液2μL而加以进行。
还有，在PCR反应中使用以下的白细胞介素6(IL6)用引子。
IL6识别引子
IL6-T：5’-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGG-3’(序列号31)
IL6-B：5’-ATTCTTTGCCTTTTTCTGCAGGAACTGGAT-3’(序列号32)
热循环控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)，在94℃保持1分钟后，将94℃中30秒、55℃中30秒、72℃中30秒钟的反应循环反复50周期，并在72℃保持5分钟而结束了PCR反应。
(判定工序)
通过2％琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖：Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，将扩增的PCR产物分离，并用溴化乙锭染色。通过在电泳中获得特异性线条，确认靶核酸扩增。
(结果)
在图4示出电泳的结果。图中左端的数值表示分子量(bp)。
由图4可知：由于在Lane3可观察到来自IL6的特异性的核酸的扩增，大肠菌感染的血液中的IL6的发现上升，但证明了根据本发明的核酸检测方法能够检测。
还有，用以实施发明的最佳方式中呈现的具体实施方式或实施例只为使本发明的技术内容清楚，并不仅限定于这些具体例，不必作狭义的解释，可在本发明的精神与接着描述的权利要求的范围内，作各种变更而加以实施。
工业上的利用可能性
本发明的核酸检测方法，包括：将包含细胞的试料固定于支持体的试料固定化工序；将试料中的核酸在支持体上扩增的核酸扩增工序；以及检测扩增的核酸的核酸检测工序，不需要从试料抽取核酸的工序。因而，几乎不会发生因抽取核酸而导致的核酸的损耗，即便试料中包含的靶核酸非常微量，只要包含用以扩增的作为铸模所需要的量的靶核酸，就可检测出，伴随这样的效果，起到提高再现性及检测精度的效果。另外，由于不需要从试料抽取核酸的工序，具有操作简便，且可缩短到获得结果为止所需要的时间的效果。
本发明的核酸检测方法中，将试料固定地支持体上，因此在试料溶液中含有扩增阻碍物质的场合，也能容易除去细胞外存在的扩增阻碍物质。因而，具有不会随着扩增效率下降而导致检测灵敏度下降的效果。
本发明的核酸检测方法中，将试料固定于支持体上，并在该支持体上扩增核酸，因此无需将试料转移到PCR管等其它容器等。因而，不会出现试料移动而产生的核酸的损耗，因此具有不会导致检测灵敏度下降的效果。另外，具有操作变得简便，且能够缩短所需时间的效果。
本发明的核酸检测方法中，在扩增核酸后进行检测，因此不会发生因检测对象的靶核酸微量而难以检测的问题。因而，具有提高再现性及检测精度的效果。另外，由于检测方法不需要特别的工夫，具有可适当选择公知的检测方法加以使用的效果。另外，具有结果的判定不需要熟练度的效果。
本发明的基因检测试剂盒是利用本发明的核酸检测方法检测试料中的靶基因的试剂盒。因而，通过使用该试剂盒，具有可以非常简便且迅速实施本发明的核酸检测方法的效果。
如上所述，本发明可在传统的称为基因诊断的所有领域适用。因而，本发明可在以医疗、制药、试剂领域为首的广泛的生物关联产业利用。尤其，通过在医疗领域的临床检查中利用本发明，可对确切的治疗方针的选择作贡献。另外，也可在生物关联领域的基础研究中利用，可期待对生物学发展作大贡献。
                        序列表
<110>扶桑药品工业株式会社
<120>核酸检测方法及其应用
<130>FP0505
<150>JP 2004-32617
<151>2004-02-09
<160>32
<170>PatentIn Ver.2.1
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Claims (18)

1.一种核酸检测方法，其特征在于包括：
将包含细胞的试料固定于支持体的试料固定化工序；
将试料中的核酸在支持体上扩增的核酸扩增工序；以及
判定扩增的核酸是否为靶核酸的判定工序。
2.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于：在上述核酸扩增工序的前段，包括使试料中包含的核酸露出的核酸露出工序。
3.如权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述核酸露出工序中的核酸露出方法，采用界面活性剂处理法、加酶处理法或加热处理法中任一种方法，或者组合两种以上方法加以使用。
4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述核酸扩增工序中的核酸扩增方法，采用PCR(聚合酶连锁反应)法。
5.如权利要求1至4中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：上述核酸扩增工序中标记扩增的核酸。
6.如权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述判定工序中的判定方法，将核酸扩增工序中扩增且标记的核酸作探针，以该探针与已知基因片断的互补的杂交为指标判定是否为靶核酸。
7.如权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于：上述已知基因片断预先固定于支持体。
8.如权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：作为上述判定工序中的判定方法，将核酸扩增工序中扩增且标记的核酸作探针，利用DNA微阵列判定是否为靶核酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：上述试料为生物源试料。
10.如权利要求9所述的核酸检测方法，其特征在于：上述生物源试料源自人体。
11.一种基因检测试剂盒，用以实施权利要求1至10中任一项所述的核酸检测方法，该试剂盒用于检测试料中的靶基因。
12.一种基因检测试剂盒，用以实施权利要求10所述的核酸检测方法，该试剂盒用于检测人体的疾病关联基因。
13.如权利要求12所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为人体感染的感染症原因微生物的基因。
14.如权利要求13所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体感染的感染症原因微生物的基因为药剂耐性基因。
15.如权利要求13所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体感染的感染症原因微生物的基因为药剂感受性基因。
16.如权利要求12所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为癌标准基因。
17.如权利要求12所述的基因检测试剂盒，其中，上述人体的疾病关联基因为遗传性疾病关联基因。
18.如权利要求11至17中任一项所述的基因检测试剂盒，其特征在于：至少包括靶基因扩增引子、PCR反应用缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合液、标记脱氧核苷三磷酸、耐热性DNA合成酶、试料固定化用支持体、扩增核酸检测用指示药。
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