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CN1898395A - 基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒 - Google Patents

基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诊断或鉴别诊断疾病病原体和第二疾病病原体的新方法。所述公开的方法使用新的被称为TemPCR的扩增策略来容许从任何已知其核酸序列的疾病病原体和/或第二疾病病原体的灵敏性和特异性扩增靶序列。该TemPCR方法使用至少一组特异于待检测的疾病病原体或第二疾病病原体的靶序列富集引物(以低浓度存在)和至少一对共用靶序列扩增引物(以高浓度存在)。至少一对所述靶序列富集引物包括对于靶序列扩增引物的结合序列。因此，使用TemPCR方法容许进行多重扩增反应而不需要以经验优化多重扩增参数。还公开了与TemPCR方法一起使用的核酸分离和靶序列检测的方法。

Description

基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒
发明背景
对于有效防范和控制任何病原体的一个重要的问题是及时和准确地诊断感染该病原体的患者。这种诊断的一个方面包括鉴别诊断。所谓鉴别诊断，其意为确定和鉴定患有由目标疾病病原体导致的疾病状态或疾病的那些患者，和具有由一个或多个导致类似临床表现的第二病原体导致的疾病状态条件的那些患者。这种鉴别诊断是关键的，因为在由目标疾病病原体所导致的疾病中观察到的症状/临床表现也可以在由第二病原体所导致的疾病中观察到。因此，误诊的可能性是一个重大问题。这种误诊可以导致假阳性，和假阴性。这些误诊类型的每一种对疾病病原体的防范和控制具有不利影响。例如，假阴性将使被感染的个体在普通群体中继续传播这种疾病病原体。假阳性将导致增加保健系统和需要进行不必要的治疗的个体的负担。
假阳性和假阴性在生物恐怖主义的情形中可能会是一个特别的问题，其中对于防范，控制和有效的公众健康反应，需要精确和迅速鉴定疾病病原体。关于使用生物恐怖的正在增加的问题已经促使联邦健康机构加速采取措施来保护公众免于受到这种攻击。在2002年2月，国家过敏性和感染性疾病研究院(National Institute of Allergy and InfectiousDiseases)(NIAID)发布其关于CDC类别A，B和C病原体的生物防御研究议程。该研究议程的一个目标是开发可以用于病原体的诊断测试，所述病原体可以被用在生物恐怖中。该议程指出，“对生物恐怖威胁的成功应答要求可以鉴定涉及的病原体的诊断。然而，生物威胁所考虑的许多病原体的起初的临床体征和症状是非特异的并且与普通感染的那些类似。迅速鉴定生物恐怖生物或毒素的介入的能力将要求高度敏感，特异，廉价，易于使用和定位在最初保健设置中的诊断工具。
作为上述讨论的问题和难题的实例，考虑到最近爆发的严重急性呼吸综合症(SARS)。SARS的临床症状，特别是在早期，包括发烧，寒战和中度到严重的咳嗽。明显地，在由其它病原体导致的许多疾病中观察到这些症状。能够导致SARS-样症状的其它病原体包括，但不限于，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1型和3型，流感A和B型病毒，肠道病毒，腺病毒，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，和肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)。
存在三类诊断测试常用在疾病病原体的检测中：i)ELISA测试；ii)细胞培养方法；和iii)分子测试。这些测试的每一种都具有它们的优势和不利。ELISA(酶联免疫吸附测定)是抗体测试。其在临床症状出现后的第21天，可靠地检测患者血清中的疾病病原体的抗体。ELISA是特异性的，但是对于用在疾病处理中的检测而言，检测开始得太迟了。其不能提供对防范和控制疾病病原体所要求得更需要的早期信息。
细胞培养方法检测活的病原体的存在。从怀疑感染了疾病病原体的个体中采集样品并且在培养细胞中增殖该疾病病原体或按照限定的条件在选择性培养基上培养该疾病病原体。任一过程都是耗时，费力的和危险的任务，但是其是显示活病原体存在的唯一方法。与ELISA一样，该测试是相对特异性的，但是该检测对于用在疾病处理中的检测而言来得太晚。
分子测试通常应用在聚合酶链式反应(PCR)的许多变化形式中的任一种。PCR可以检测在来自怀疑由疾病病原体感染的个体的各种标本(血液，粪便，呼吸道分泌物或身体组织)中的遗传物质。存在的PCR测试是非常特异的，但是缺乏灵敏性。这是因为该病原体可能尚未存在于患者的标本中或该扩增和检测方案没有鉴定出遗传物质。因此，阴性测试不能排除疾病病原体在个体中的存在。
多重PCR容许使用多组基因座特异性引物在一个反应中从多个生物扩增靶序列。因此，多重PCR适合于鉴别诊断。然而，多重PCR方法具有限制。存在两个与多重PCR方法相关的主要问题。一个是每个待扩增的靶序列(或基因座)具有其自身的扩增效率。基因座特异的扩增效率由多个因子确定，所述因子包括引物靶的组成，引物与它们的靶标的结合亲和性，引物的引发效率，和反应组分的可利用率。在一个反应中多个靶基因座的组合可以在各个引物组中引入不相容性，其导致一些扩增反应的优先扩增或抑制。第二个问题是鉴定优化的引物与基因座的比率。如果引物浓度设定得太高，将发生引物二聚体和背景扩增。然而，如果引物浓度过低，将不会发生需要的靶序列的指数扩增。
为了优化多重PCR，对于每一组引物组合，需要根据经验来确定引物，缓冲液，dNTPs，酶和MgCl2的浓度。这是一个费时的过程，其对于每一批的延伸测定(produced assay)都需要进行。甚至在详尽的优化实验后也不能保证成功的多重PCR。
本公开内容提供一种迅速，准确的分子诊断方法用于诊断疾病病原体和/或在存在一种或多种第二疾病病原体时的对疾病病原体的鉴别诊断。简而言之，核酸样品获自被怀疑包含疾病病原体和/或第二疾病病原体的样品；该核酸可以是DNA或RNA(正链或负链)或其组合。多重扩增反应用于在一个小管中通过一个扩增反应从核酸中扩增预定的靶序列。使用多重检测策略来检测和鉴别包含靶序列的扩增产物。对疾病病原体或第二疾病病原体的靶序列的检测指示其在样品中的存在。使用本文公开的方法，疾病的诊断或鉴别诊断可以在少到3小时内进行。该高通量的能力容许每个引物组合每天分析数百个样品，而不需要复杂的和费时的优化方法。这些方法在本领域中是缺乏的。
附图说明
图1A和1B举例说明Tem-PCR扩增方法的两个实施方案。
图2图示直接检测方法的一个实施方案。
图3图示间接检测方法的一个实施方案。
发明详述
本文描述的被称为多重分析系统(MAS)的方法，提供了对于疾病病原体的诊断和/或对疾病病原体和第二疾病病原体的鉴别诊断的快速和方便的形式。用于本说明书时，“病原体”指任何生物，无论形式如何，其结合(incorporate)核酸，并且导致或有利于感染、症状、或情形，其包括，但不限于，细菌(列表分类)，病毒(病毒可以具有DNA基因组，负链RNA基因组或正链RNA基因组)或寄生虫。在本说明书中，将由寻求被诊断的疾病病原体引起或与之相关的感染，症状或情形称为“疾病状态”。当用在本说明书中时，“疾病病原体”指导致或有利于寻求被诊断的疾病状态的任何病原体。在一个实施方案中，寻求被诊断的疾病病原体和/或疾病状态将由保健人员或其它人预先确定。在一个实施方案中，疾病病原体可以涉及生物武器计划，诸如作为潜在生物威胁描述的生物，其在NIAID生物防御研究议程中有所描述。如在本文讨论，MAS可以用在鉴别诊断中。当讨论鉴别诊断时，将涉及疾病病原体和一种或多种第二疾病病原体。当用在本说明书时，“第二疾病病原体”意为呈现与由该疾病病原体导致或由其起作用的疾病状态的类似临床表现的任何病原体。结果，使用MAS的鉴别诊断将能够准确地确定疾病病原体的存在，如果疾病病原体存在的话；以及可能存在的任何第二疾病病原体的存在。
当互换用于本公开内容时，术语“核酸分子”，“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA或DNA(单链或双链，编码，互补或反义)，或以单链或双链形式存在的超过一种核苷酸的RNA/DNA杂交分子(尽管上述种类的每一个可以是特别说明的)。用于本文时，术语“核苷酸”作为描述以单链或双链形式存在的任何长度的包含RNA，DNA，或RNA/DNA杂交序列的分子的形容词。更精确地，表达“核苷酸序列”涵盖核酸物质本身并因此不限于序列信息(即，在四个碱基字母中选择的字母的次序)，该序列信息在生化上鉴定具体的DNA或RNA分子。术语“核苷酸”也在本文作为名词使用，指个体核苷酸或多种核苷酸，表示分子，或在更大的核酸分子中的各个单位，包含嘌呤或嘧啶，核糖或脱氧核糖糖部分，和磷酸盐基团，或在寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸情形中的磷酸二酯键。术语“核苷酸”在本文还用于涵盖“修饰的核苷酸”，其包含至少一种修饰，诸如(a)备选的连接基团，(b)嘌呤的类似形式，(c)嘧啶的类似形式，或(d)类似的糖。可以通过任何已知方法以及使用本领域已知的任何纯化方法来制备本发明的多核苷酸序列，所述已知方法包括合成的，重组的，离体(ex vivo)产生，或其组合。
本文所述的MAS能够检测导致或有利于各种状态的疾病病原体。MAS可以用在鉴别诊断中来确定是否存在特定的疾病病原体并且确定是否有第二疾病病原体存在。然而，不需将MAS用在鉴别诊断应用中。MAS还可以用于诊断与疾病状态相关的基因突变的存在或缺乏中，单核苷酸多态性(SNPs)的存在或不存在，确定基因表达图谱，并确定基因剂量突变。将MAS的这些备选用途的应用描述在共同待决的美国申请系列号10/284,656中。MAS的其它应用将被本领域的那些技术人员所了解。
所述的MAS可以包含三个步骤：i)核酸分离；ii)多重扩增以扩增来自包含靶序列的疾病病原体或第二疾病病原体中的扩增序列；和iii)对在步骤(ii)中扩增的靶序列的多重检测。在所述的MAS的实施方案中，提供RNA(正链和负链)和DNA的同时分离。由于疾病病原体和第二疾病病原体可以具有不同的核酸基因组，RNA和DNA的同时分离是有利的。在无DNA和RNA的双重扩增的情况下，将需要测试多个样品。在备选的实施方案中，其中疾病病原体和第二疾病病原体每个都具有相似类型的核酸基因组，核酸分离步骤可以分离仅一种类型的核酸。MAS可以是高度适用的，当它们通过适当的设计用在多重扩增步骤中的引物序列时，其容许新的病原体和已知的以及新病原体的突变体被包括进来。如将在下面更详细讨论的，在一个实施方案中，用在MAS中的多重扩增策略使用独特的和以前不受重视的方法来减少各种引物对之间的不相容性并与目前可用的那些方法相比，增加了多重扩增反应的灵敏性和特异性。整个MAS程序可以在少到3小时内完成。
按常规描述MAS从而使其应用可以被了解。MAS方法可以用于从获自被怀疑具有所述疾病病原体的个体的样品中确定疾病病原体的存在，并且因此鉴定和诊断那些具有由疾病病原体导致或由其起作用的疾病状态的个体。该MAS可以用在涉及疾病病原体和一种或多种第二疾病病原体的鉴别诊断中。尽管MAS可以用于确定任何疾病病原体的存在，本发明提供了一个实例，其举例说明了鉴别诊断，其中SARS是疾病病原体，并且其中呼吸道合胞病毒A和B，HPIV 1和3，流感病毒A和B，肠道病毒，腺病毒4和21，肺炎衣原体和肺炎支原体是第二疾病病原体。然而，MAS可以用于通过适当的设计多重扩增来确定任何疾病病原体和第二疾病病原体的存在。
MAS的各种组分在下面更详细地进行描述。应该理解的是，尽管关于这些组分讨论了某些实施方案，实现相同目的的本领域已知的其它方法应该被考虑在本公开内容的范围内。此外，取决于MAS的目的，疾病状态的性质，和疾病病原体和一种或多种第二疾病病原体的性质，MAS的各种实施方案可以使用不同的方法来进行在下面描述的步骤。
核酸分离
在MAS的一个实施方案中，使用核酸分离步骤，其在一个反应中分离RNA和DNA。在一个备选的实施方案中，RNA和DNA可以独立地进行分离并且接着进行组合用于MAS。在另一个备选实施方案中，当仅有一种类型的核酸需要被分离时(诸如当所有的目标疾病病原体和第二疾病病原体具有相同类型的核酸基因组)，可以使用仅分离RNA或DNA的核酸分离方法。在本领域中已知多种技术和方法用于同时分离RNA和DNA和单独分离每一种，并且可以使用这些技术和方法。所述的核酸分离可以用于从多种患者样品或来源中分离核酸。患者样品/来源的类型包括，但不限于，鼻/咽拭子，口水，唾液，血清，全血和粪便。
核酸分离可以满足一个或多个下列要求。首先，核酸分离方法可以使任何可以存在于患者样品中的疾病病原体和任何第二疾病病原体失活。结果，减少了对实验室和保健人员的危险。另外，如果需要，可以完成MAS的余下步骤而不需要严格的生物防范程序。此外，该方法可以容许从分离的核酸中去除PCR和RT-PCR的抑制剂以及其它不需要的化合物。
在一个实施方案中，使用基于trizol的试剂来将双重RNA/DNA分离方法用于从患者的样品中起始分离RNA和DNA。在接触患者样品后，在trizol中的苯酚和高盐试剂有效地使任何可以存在于患者样品中的疾病病原体或第二疾病病原体失活。为了容许在相同的阶段以单一步骤来分离RNA和DNA，可以将trizol溶液的pH调整为中性(取代酸性)。在RNA和DNA从患者样品中分离后，可以将硅基柱用于进一步分离RNA和DNA。硅基柱的使用使洗涤步骤迅速和有效地进行，同时使污染的可能性最小化。可以将洗涤步骤用于去除PCR和RT-PCR的抑制剂。核酸纯化的柱方法是有利的，因为其可以用于不同类型的患者样品并且自旋和洗涤步骤有效地去除了PCR或RT-PCR抑制剂。
在一个实施方案中，使用由Omega Bio-Tek提供的双重RNA/DNA分离试剂盒，按照生产商的说明书来进行核酸分离。简而言之，将250μl受试者样品加入1ml的核酸分离试剂(trizol试剂)，随后加入250μl氯仿。将该混合物彻底混合，诸如通过涡旋进行。以12,000×g将样品离心10分钟以分离水相和有机相。将上部的水相仔细地转移到新的1.5ml离心管中。加入等体积的70％乙醇并且混合该样品，诸如通过涡旋进行。将该样品施加到被置于收集管中的HiBind自旋柱上，并且以10,000×g离心15秒。将流通物(flow through)丢弃。将500μl的洗涤缓冲液I加到柱上并且将该柱离心15秒。用500μl洗涤缓冲液II洗涤该柱两次，每次15秒。通过加入50μl的无核酸酶的水来洗脱RNA/DNA并在最大速度离心1分钟。接着，可以将核酸样品用于如下所述的扩增步骤。
除了上述的trizol方法之外，可以将其它的方法用于分离RNA和/或DNA。在一个备选的实施方案中，使用LNA缀合的磁珠。LNA(锁定核酸)是一类包含被改变的核苷的核酸，其主要的区别特性是存在在核糖环中的2′-O和4′C原子之间的亚甲基桥。LNA核苷包含5个常见的出现在DNA和RNA中的核碱基(A，T，U，C，G)，其可以按照沃森-克里克规则与它们的互补核苷进行碱基配对。在正常核苷和LNAs之间出现的分子差异导致在包含LNA的核酸和在不包含LNA的核酸之间形成的核酸双链体的稳定性中的差异。典型地，与对应DNA/DNA复合体相比，结合的每一个LNA核苷增加了LNA/DNA核苷酸复合体的Tm 2-6℃。能够结合疾病病原体和第二疾病病原体(通过特异性或非特异性相互作用)的包含LNA的寡核苷酸可以与磁珠连接从而分离所述核酸。包含LNA的寡核苷酸将结合于疾病病原体或第二疾病病原体的核酸；接着可以通过简单磁力分离和洗涤步骤来完成分离。该方法还容许去除PCR抑制剂。可以将包含LNA的寡核苷酸/磁珠缀合物直接与PCR或RT-PCR试剂混和以用在多重扩增步骤中。使用包含LNA的寡核苷酸磁珠，可以有效处理具有高体积的患者样品。该LNA方法可以与上述的triazol双重抽提方法或用于分离DNA和/或RNA的或任何本领域已知的或描述在本说明书中的其它方法结合使用。
多重扩增
多种多重扩增策略可以与MAS一起使用。本领域已知许多这样的扩增策略。取决于包含在疾病病原体和第二疾病病原体中的核酸的类型，多重扩增策略可以使用PCR，RT-PCR或其组合。例如，如果存在RNA基因组，可以使用RT-PCR。PCR和RT-PCR的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，用在MAS中的多重扩增策略是独特的。该独特的多重扩增策略被称为靶序列富集多重PCR(termed target enriched mutiplexPCR)(Tem-PCR)并容许一种或多种靶序列在疾病病原体和/或第二疾病病原体中的有效扩增，而不需要如在本领域的其它已知的多重扩增方法中所需要的对引物组合和扩增条件的大量的依赖经验的测试。如在本说明书中使用的，“靶序列”是一种来自疾病病原体或第二疾病病原体的核苷酸序列，其将被扩增并最终被检测；由本文所述的引物组来扩增包含在更大的核酸序列中的靶序列。选择每一个靶序列用于扩增从而在检测后(如下面讨论)，其容许疾病病原体或第二疾病病原体的鉴定，如果其任一存在于该样品中的话。被扩增的靶序列的检测(直接地或间接地-见下面的讨论)将指示疾病病原体或第二疾病病原体的存在和鉴定并且由此诊断相关疾病状态。在一个实施方案中，选择单一的靶序列用于从待测试的每种疾病病原体和每种第二疾病病原体中进行扩增。在一个备选的实施方案中，选择超过一种的靶序列用于从每种疾病病原体和每种第二疾病病原体中进行扩增。在另一个实施方案中，选择超过一种靶序列来从疾病病原体中进行扩增并且选择单一的靶序列用于从每种第二疾病病原体中进行扩增。
将Tem-PCR的原理图示于图1A和1B。图1A举例说明使用3个引物寡核苷酸对用于靶序列的扩增。将引物寡核苷酸指示为Fout(外侧正向引物)，Fin(内侧正向引物)，Rout(外侧反向引物)，Rin(内侧反向引物)，FSP(正向超级引物)和RSP(反向超级引物)。图1中图示的3个引物对包含2对靶序列富集引物(target enrichment primer)(Fout和Rout；和Fin和Rin)和1对靶扩增引物(FSP和RSP)。如下面讨论，可以根据需要，掺入另外的靶序列富集引物和靶序列扩增引物。在该实施方案中，靶序列富集引物，Fout和Rout和Fin，和Rin被设计与包含靶序列的核酸特异性杂交并且如图1A所示将靶序列括起来。因此，第一组靶序列富集引物，Fout和Rout，结合包含靶序列的核酸并且将靶序列(Fout和Rout之一位于靶序列侧的5’或左侧，另一个位于靶序列侧的3’或右侧上)括起来。第二组靶序列富集引物，Fin和Rin，结合包含靶序列的核酸并且如对于第一组靶序列富集引物所述将靶序列括起来。第二组靶序列富集引物结合如图1A所示的第一组靶序列富集引物的内侧。将该定位限定为最接近靶序列；换句话说，第二组靶序列富集引物结合包含靶序列的核酸从而使得与第一组靶序列富集引物相比，第二组靶序列富集引物位于更接近靶序列的位置。
在第一或第二引物富集对的至少一个中的每一个引物在其5′末端上还包含超级引物结合标记物。该超级引物结合标志物是寡核苷酸序列，其与靶序列扩增引物(RSP和FSP)的序列具有同一性。在Tem PCR过程中的扩增过程中，将包含超级引物结合标志物的引物对复制到其补体从而产生对于至少一对靶序列扩增引物(FSP和RSP)的结合位点从而容许靶序列的指数扩增。在图1A中所示的实施方案中，第二靶序列富集引物对包含超级引物结合标志物，其中Fi包含与FSP的序列相似的超级引物结合标志物，而Ri包含与RSP的序列相似的超级引物结合标志物。外侧引物可以包含需要的超级引物寡核苷酸标志物，其中操作原理与上述相同。
在靶序列富集引物和它们的核酸序列之间杂交的特异性可以通过增加或减少如在本领域中已知的用于杂交的引物序列的长度来进行调整。通常，更短的引物序列将给出增加的特异性，而更长的引物序列将提供更大的杂交效率。此外，增加或减少用于杂交的引物序列的长度还可以确定哪一种引物在TemPCR的扩增过程中的各个阶段中是具有活性的(见下面的讨论)。在一个实施方案中，靶序列富集引物的长度是10-50个核苷酸。在一个备选的实施方案中，靶序列富集引物的长度是10-40个核苷酸。在另一个备选实施方案中，靶序列富集引物的长度是10-20个核苷酸。如果需要，在每一组靶序列富集引物中的引物可以具有不同的长度。例如，在一个实施方案中，靶序列富集引物Fout和Rout在长度上具有15-25个核苷酸，而靶序列富集引物Fin和Rin在长度上具有35-45个核苷酸(其中这样的长度不包含超级引物结合标志物)。
在图1A和1B中的第一组靶序列扩增引物，FSP和RSP，是常用的引物序列，并且用于在靶向序列富集步骤(其包含靶核酸)中的被扩增核酸的通用扩增。在一个实施方案中，靶序列扩增引物的长度从10-50个核苷酸。在一个备选实施方案中，靶序列扩增引物的长度是10-40个核苷酸。在另一个备选实施方案中，靶序列扩增引物的长度是从10-20个核苷酸。
靶序列富集引物以低浓度使用用于靶序列的富集(即，有限扩增)，而靶序列扩增引物以高浓度使用用于靶序列的指数扩增。由于可以选择任何方便的靶序列进行扩增和检测，可以仅通过在靶序列两侧的核酸序列的性质来指定嵌套引物的序列。因此，可以在对它们的组成具有最小限制的情况下，来设计靶序列富集引物。使用至少一组嵌套引物可以增加起始的反转录反应的效率，所述嵌套引物不包含寡核苷酸标志物(诸如在图1A中的Fout和Rout)。多组靶序列富集引物可以通过容许嵌套引物更多的机会和组合以在一起工作从而提供靶序列富集来增加测定的灵敏性和特异性。此外，由于靶序列富集引物以低浓度存在，没有被标记，并且不用于靶序列的指数扩增，靶序列富集引物的设计没有关于相容性产生明显的问题，所述相容性关于靶序列富集引物的各种组合。如下面所讨论，通过超级引物进行指数扩增。Tem-PCR的该方面容许该测定的简单和迅速的修改从而检测另外的疾病病原体和第二疾病病原体。
尽管在图1A和图1B中图示的实施方案显示使用一组或两组靶序列富集引物来扩增包含靶序列的给定的核酸，如果需要，可以使用超过2组的靶序列富集引物。在一个实施方案中，将3-6组的靶序列富集引物使用在Tem-PCR反应中。在另外的实施方案中，使用3-5组的靶序列富集引物。在备选的实施方案中，使用3-4组的靶序列富集引物。
还可以使用超过1组的靶序列扩增引物。当使用超过1组的靶序列扩增引物时，多组靶序列扩增引物的序列被选择从而使彼此在指数扩增步骤中相容。换言之，当将超级引物结合位点引入被扩增的靶核酸时，多组超级引物将具有相似的Tms，并且具有相似的扩增效率。当一种或多种疾病病原体或第二疾病病原体以不同滴度/浓度存在时，可以使用多个靶序列扩增引物。如果在滴度上存在明显不同，那么在仅有1组靶序列扩增引物的情况中，可能发生高滴度病原体的优先扩增。这会导致以更低滴度存在的病原体的假阴性诊断。可以通过使用多组靶序列扩增引物来避免这种有偏向的扩增。在一个实施方案中，使用2-8组靶序列扩增引物。在一个备选实施方案中，使用2-6组的靶序列扩增引物。在另一个备选的实施方案中，使用2-4组的靶序列扩增引物。
以高浓度使用靶序列扩增引物。如果使用一组靶序列扩增引物，该靶序列扩增引物的序列对于每一个待扩增的靶序列是相同的，或如果使用多组靶序列扩增引物时，设计靶序列扩增引物来使对于每一个待扩增的靶序列其具有相似的扩增特性。在一个实施方案中，靶序列扩增引物都掺入检测工具，所述工具能够使被扩增的产物如下所述被检测和/或被操作。在一个备选的实施方案中，两个靶序列扩增引物中仅有1个掺入检测的工具。在另一个备选实施方案中，仅有靶序列扩增引物中的RSP掺入检测的工具。当用在该说明书中时，检测的工具可以是本领域已知的任何元件，诸如化学元件，酶元件，荧光元件，或放射性标记元件。在一个实施方案中，检测的工具可以是荧光元件，诸如，但不限于，Cy-3标记。该荧光元件可以直接缀合于超级引物序列或可以间接进行缀合。在间接缀合的情形中，检测的工具可以是生物素分子(即，化学元件)，荧光元件可以缀合于抗生物素或链霉抗生物蛋白分子。该检测工具可以如下所述进行操作。
用在Tem-PCR方法中的靶序列富集引物不用在如本领域公知的针对嵌套引物应用的两步PCR反应中。在Tem-PCR中，靶序列富集引物用在一步PCR反应中。由于靶序列富集引物以低浓度存在，该靶序列引物富集服务于靶序列富集的目的，而不是靶序列扩增的目的。靶序列富集引物的浓度对于靶序列的指数扩增是不够的。该靶系列富集引物还作用于打开局部模板结构并因此增加扩增灵敏性和/或效率。使用FSP和RSP来实现有义靶序列的指数扩增。
用于该说明书中时，当用于描述靶序列富集引物的浓度时，“低浓度”指不足以进行给定靶序列的指数扩增，但是足以进行给定靶序列的靶富集的引物的浓度。该低浓度可以根据包含待扩增的靶序列的核酸的核苷酸序列而变化。在一个实施方案中，靶序列富集引物的浓度在0.002μM到少于0.2μM的范围内。在另一个实施方案中，靶序列富集引物的浓度在0.002μM到0.15μM的范围内。在备选的实施方案中，靶序列富集引物的浓度在0.002μM到0.1μM的范围内。在另一个实施方案中，靶序列富集引物的浓度在0.002μM到0.05μM的范围内。如果包含待扩增的靶序列的核酸序列的性质是这样的，其使得需要在指定范围以下或以上的靶序列富集引物的浓度以进行靶富集而不是指数扩增，则可以使用在上述那些之外的其它浓度范围。可以以不同浓度(即，比率)或相同的浓度使用各种靶序列富集引物。
用于该说明书时，当用于描述靶序列扩增引物(FSP和RSP)时，“高浓度”指足以进行给定靶序列的指数扩增的引物的浓度。在一个实施方案中，靶扩增的浓度在0.2μM到2.0μM范围内。在另一个实施方案中，靶序列扩增引物的浓度在0.2μM到1.0μM范围内。在备选实施方案中，靶扩增引物的浓度在0.2μM到0.8μM范围内。在另一个备选实施方案中，靶扩增引物的浓度在0.2μM到0.4μM的范围内。如果包含待扩增的靶序列的核酸序列的性质是这样的，其使得需要在指定范围以下或以上的靶序列扩增引物浓度来进行指数扩增，则可以使用在上述那些之外的其它浓度范围。可以以不同浓度(即，比率)或相同的浓度来使用超级引物。
作为一般规则，通常使用0.2μM范围内的引物浓度来作为引物浓度的起点，从而获得给定靶序列的指数扩增。可以将靶序列富集引物和靶序列扩增引物以本文讨论的彼此之间的各种比率进行使用。
在扩增过程中，当使用两组靶序列富集引物时(图1A)，2组靶序列富集引物将产生四种可能的扩增产物，每种包含靶序列：Fout/Rout；Fout/Rin；Fin/Rout；和Fin/Rin。将使用包含超级引物结合标志物的靶序列富集引物，诸如在图1A中的Fin或Rin引物来将超级引物结合标志物掺入任何被扩增的扩增产物。然而，超级引物结合标志物对于由在该点的靶序列扩增引物进行的指数扩增是无效的，因为超级引物结合标志物与靶序列扩增引物的序列相似。为了产生超级引物结合位点，包含超级引物结合标志物的扩增产物必须以与第一次扩增相对的方向进行第二次扩增。多重扩增方法(下面讨论)使用多步骤程序，其容许将超级引物结合标志物掺入扩增产物。将这些步骤称为靶富集步骤和选择性扩增步骤。靶富集步骤可以单独使用或与选择性扩增步骤组合使用。对靶富集和选择扩增步骤进行优化从而提供对于低浓度的靶序列富集引物与它们的杂交靶杂交所需的条件以进行靶富集。这些步骤产生足够的扩增产物来作为指数扩增程序的基础，所述指数扩增由靶序列扩增引物进行。因此，在所用的低浓度，靶序列富集引物将产生具有被掺入其中的超级引物结合标志物的靶特异性序列。这些超级引物结合标志物将产生超级引物结合序列以用于由靶扩增引物进行的靶序列的指数扩增。可以使用如下所述的靶特异性报道基因(也被视为检测)的寡核苷酸检测得到的被扩增的靶序列。
Tem-PCR扩增程序的结果是由靶序列富集引物进行的靶序列的特异性富集，并且随后的由靶序列扩增引物进行的靶序列的指数扩增使用超级引物结合位点，所述超级引物结合位点由包含超级引物结合标志物的扩增产物的复制来进行提供。由于每个靶序列的指数扩增由一组或多组靶序列扩增引物进行，可以仅考虑靶序列扩增引物对扩增条件进行标准化和优化。因此，指数扩增反应条件的不相容性不象在本领域目前已知的多重扩增方法中那样成为问题。
因为仅有靶序列扩增引物以高浓度存在，Tem-PCR扩增策略产生减少的背景。结果，减少了引物二聚体形成和相关现象的发生。另外关于减少的背景，由于仅有超级引物(或每组超级引物的1个)与检测工具缀合，甚至即使发生引物二聚体的形成，其将不会被报道寡核苷酸检测得到。减少的背景将减少假阳性诊断的机会。
用在Tem-PCR扩增方法中的靶序列富集引物(Fout，Fin，Rout，Rin)的比率可以变化。不同的病原体基因组可以具有不同的靶序列富集引物需求。如前讨论，一些疾病病原体和第二疾病病原体可以具有DNA基因组或RNA基因组(正链或负链)。此外，靶序列扩增引物的浓度也可以变化，尤其是仅有1个超级引物缀合于检测工具。将其中以不同于1∶1的比率使用靶序列富集引物或超级引物的至少一个的多重扩增称为不对称的多重扩增。
在使用各种靶序列富集引物和靶序列扩增引物比率进行的实验中，确定的是来自负链RNA基因组的靶序列的增加的扩增发生在引物浓度的范围内。在一个实施方案中，Fout的浓度大于剩余的靶序列富集引物的浓度的1.0-8倍。典型的比率将是对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin为4∶1∶1∶1。对于负链RNA病毒而言，Fout的量可以在剩余的嵌套引物的比率范围内增加从而提供互补于基因组负链RNA的正RNA链的起始扩增。在一个实施方案中，当靶序列扩增引物的浓度大于Fout的浓度约1.25-32倍时，观察到增加的扩增。对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin∶FSP∶RSP而言，典型比率分别是4∶1∶1∶1∶10∶40。各个靶序列扩增引物的比率还可以相对彼此而变化。已经显示了这种不对称的变化从而提供在检测步骤中的增加的灵敏性(见表4)。在一个实施方案中，掺入检测的工具的超级引物以比其它超级引物更高的浓度被加入。在一个实施方案中，RSP包含检测的工具并且以更高的浓度被加入。当RSP的浓度大于FSP浓度的1.25到16倍时，观察到靶序列的增加的扩增。典型的比率对于FSP∶RSP分别是10∶40。
对于从具有正链RNA基因组的疾病病原体和第二疾病病原体中扩增靶序列而言，可以使用另外的引物比率。在一个实施方案中，Rout的浓度大于剩余的嵌套引物的浓度的1.0-8倍。典型的比率将是对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin为1∶1∶4∶1。对于正链RNA病毒而言，Rout的量可以在剩余的靶序列富集引物的比率范围内增加从而提供包含靶序列的RNA链的增加的扩增。在一个实施方案中，当靶序列扩增引物的浓度大于Rout的浓度约1.25-32倍时，观察到增加的扩增。对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin∶FSP∶RSP而言，典型比率分别是1∶1∶4∶1∶10∶40。各个靶序列扩增引物的比率还可以相对彼此而变化。已经显示了这种不对称的变化从而提供在检测步骤中的增加的灵敏性(见表4)。在一个实施方案中，掺入检测的工具的超级引物以比其它超级引物更高的浓度被加入。在一个实施方案中，RSP包含检测的工具并且以更高的浓度被加入。当RSP的浓度大于FSP浓度的1.25到16倍时，观察到靶序列的增加的扩增。典型的比率对于FSP∶RSP分别是10∶40。
对于从具有DNA基因组的疾病病原体和第二疾病病原体中扩增靶序列而言，可以使用另外的引物比率。在一个实施方案中，靶序列富集引物的浓度是基本上相等的。在一个备选的实施方案中，Fout或Rout之一的浓度大于剩余的嵌套引物的浓度的1.0-4倍。对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin而言，示范性比率将是1∶1∶1∶1。在一个实施方案中，当靶序列扩增引物的浓度大于Rout浓度的约1.25-128倍时，观察到增加的扩增。对于Fout∶Fin∶Rout∶Rin∶FSP∶RSP而言，示范性比率将分别是1∶1∶1∶1∶10∶40。各个靶序列扩增引物的比率还可以相对于彼此变化。已经显示了这种不对称的变化从而提供在检测步骤中的增加的灵敏性(见，表4)。在一个实施方案中，将掺入检测的工具的超级引物以比其它超级引物更高的浓度加入。在一个实施方案中，RSP包含检测工具并以更高的浓度被加入。当RSP的浓度大于FSP浓度的1.25-16倍时，观察到靶序列的增加的扩增。对于FSP∶RSP，示范性比率将分别是10∶40。
在其中仅使用1对靶序列富集引物的实施方案中，可以以上面讨论的不同比率来使用引物(包括被讨论的靶序列扩增引物比率)，其中上述Fout或Rout引物的比率为在1对靶序列富集引物中的对应引物的比率。靶序列富集引物的浓度是基本上相等的。
不被备选的解释所束缚，可能的是当靶序列富集引物的浓度增加时，靶序列在没有检测工具的情况下进行扩增，并且能够与包含检测工具的靶序列竞争结合报道寡核苷酸，其以FSP和/或RSP进行扩增。当以更高的浓度使用包含检测工具的超级引物时，使用靶序列扩增引物的不对称的扩增还可以增加扩增效率和灵敏性，因为产生了包含靶序列的更多的扩增产物和用于检测的工具并且其可用于检测。表1提供了对于Fout，Fin，Rout，和Rin以及FSP和RSP的浓度的一组示范性比率。
如上讨论，将靶序列扩增引物用于每种靶序列的指数扩增。选择靶序列扩增引物的序列从而使它们不与任何已知的GenBank序列具有明显的同源性。此外，选择靶序列扩增引物的序列从而使它们具有在结合扩增产物的超级引物结合位点上的可比较的Tm以提供有效的扩增反应。最后，可以选择靶序列扩增引物的序列从而使它们对于热稳定性DNA聚合酶的引发能力可能优于靶序列富集引物，其对于待扩增的每个靶序列具有特异性。
如在本领域已知的每一标准程序来进行多重扩增。在一个实施方案中，将RT-PCR或PCR用作扩增步骤。该PCR酶可以是具有反转录和聚合酶诸如Taq聚合酶的功能的酶。此外，PCR酶可能能够进行如本领域已知的“热启动”反应。RT-PCR或PCR的条件是本领域已知的。然而，申请人已经生产了被设计与TemPCR方法一起使用的RT-PCR和PCR条件的优化组。可以更改确切的时间和温度从而实现如下面讨论的将被本领域的技术人员已知的目标。在一个实施方案中，RT-PCR或PCR条件如下。下面的方法包括一组用于第一扩增反应的第一扩增条件，其发挥靶序列富集功能，和包含靶序列扩增功能的第二扩增反应。包含用于扩增的试剂的样品被置于循环变温器中，程序如下：(i)反转录-在50℃30分钟；(ii)起始PCR活化-在95℃15分钟；iii)包含第一个3-步骤循环的第一扩增反应(靶序列富集)-在92-94℃达0.5-1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5-1分钟；进行至少2个完整的循环，优选进行10-15个完整的循环；(iv)包含第二个3-步骤循环的第二扩增反应(靶序列扩增)-在92-94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒和在70-72℃达15到30秒；进行至少2个完整的循环，优选进行10-40个完整的循环；和(v)最终延伸-在72℃达3分钟。
步骤(i)容许在疾病病原体和/或第二疾病病原体的核酸不是DNA时的情形中，发生反转录反应。步骤(ii)容许PCR酶功能的活化。该技术被称为“热启动”PCR，其中在更低的温度(50℃)，PCR酶功能仅能进行反转录反应，但是在更高的温度，PCR酶功能可以是聚合酶功能。需要对PCR酶功能的温育来缓和聚合物酶功能的抑制。设计在步骤(iii)中的第一扩增从而容许靶序列富集引物以与它们的靶标杂交并且引发靶标富集步骤。如可观察到的，另外的时间容许靶序列富集引物与它们的靶标杂交(如与步骤(iv)中的15秒50-55℃比较的在50-55℃2.5分钟)。因为靶序列富集引物在更低的浓度进行使用，使用的时间增加。在步骤(iv)中的靶序列扩增反应是使用靶序列扩增引物的指数扩增阶段(其在更高的浓度)。由于靶序列扩增引物以高浓度存在，不需要在靶序列扩增引物和靶标之间的增加的杂交时间。步骤(v)是最终延伸步骤从而产生完整的双链扩增产物。步骤(v)是任选的并且不需要被包括进来。
在备选的实施方案中，RT-PCR或PCR条件如下。将包含扩增用试剂的反应管置于循环变温器中，其程序如下：(i)反转录-在50℃达30分钟；(ii)起始PCR活化-在95℃达15分钟；iii)包含首先的3-步骤循环的第一扩增反应(靶序列富集)-在92-94℃达0.5-1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5-1分钟；进行至少2个完整的循环，优选进行10-15个完整的循环；和第二个2-步骤循环(选择性扩增)-在92-94℃达15到30秒，在70-72℃达1到2分钟；进行至少2个完整的循环，优选进行4-8个完整的循环；(iv)包含第3个3-步骤循环的第二扩增反应(靶序列扩增)-在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒和在72℃达15到30秒；进行至少2个完整的循环，优选进行10-40个完整的循环；和(v)最终延伸-在72℃达3分钟。
在该实施方案中，各个步骤的功能如上所述。然而，已经加入包含另外的3步骤循环程序的第一扩增反应从而增加结合超级引物结合标志物的扩增产物的产生，其最终产生包含超级引物结合位点的扩增产物。在添加的3步骤循环程序中，杂交温度增加到70-72℃(如与在步骤(iii)中的50-55℃比较的)。杂交时间也如上讨论的增加以给低浓度的靶序列富集引物与它们的靶标杂交的机会。这种增加的杂交温度确保仅有某长度的靶序列富集引物足够稳定以与它们的靶标进行杂交。在该实施方案中，选择具有20个核苷酸或更少的长度的Fout和Rout引物，而Fin和Rin引物(其在该实施方案中包含超级引物结合标志物)具有至少30到40个核苷酸的长度。因此，Fout和Rout引物在70-72℃不是热稳定的，意味着它们将不与它们的靶标杂交。然而，Fin和Rin引物的增加的长度确保这些引物在70-72℃是热稳定的并且将与它们的靶标杂交。在选择性扩增步骤中，Fin和Rin引物沿着它们完整的长度(40个核苷酸)与在起始组的扩增产物的互补序列杂交，所述起始组的扩增产物由结合Fin和Rin引物的起始扩增产物以相对方向扩增所产生(在靶标富集步骤中，Fin和Rin引物产生增加量的包含超级引物结合标志物的扩增产物，其增加步骤(v)中的指数扩增的量。因此，步骤(iv)是偏向产生包含超级引物结合标志物的扩增产物的选择性扩增步骤。该选择性扩增是在不需要设计更高的GC含量或不需要使用修饰的核苷酸从而增加热稳定性来完成的。接着步骤(iv)的扩增产物如上所述进行指数扩增。
多重检测
有效的靶序列多重扩增方法提供了用于选择性和特异性多重检测的基础。用在MAS中的多重检测方法补充多重扩增以提供在扩增的靶序列的检测中的平衡(balanced)灵敏性和特异性。灵敏性和特异性是对于成功诊断测试或鉴别诊断测试的重要的问题。
用在MAS中的多重检测方法可以是直接检测或间接多重检测方法。靶序列的性质将部分确定是使用直接还是间接的检测。例如，如果靶序列彼此之间不具有广泛同源性，可以通过将报道寡核苷酸直接与靶序列杂交来获得需要的灵敏性和特异性。例如，在对于疾病病原体的诊断测试或对于疾病病原体和至少一种第二疾病病原体的鉴别诊断测试中，可以设计多重扩增从而使来自疾病病原体和第二疾病病原体的每个被扩增的靶序列不具有广泛的同源性从而可以使用直接的检测。然而，如果被扩增的靶序列彼此之间不具有广泛的同源性，可以将另外的步骤结合到多重检测步骤中从而在同源序列之间加入另外的辨别力从而获得需要的灵敏性和特异性。例如，在确定个体的等位基因的一个或多个单核苷酸多态性的存在的诊断测试中，直接的杂交可能不能提供特异性检测靶序列所需要的等位基因辨别，其仅通过一个核苷酸来进行区分。在该情形中，可以将间接检测方法用于将另外的鉴别力加入。
图2显示直接检测方法的实施方案。提供来自多重扩增反应中的包含靶序列(6)的扩增的核酸用于检测(扩增方法可以是本文所述的Tem-PCR方法)。提供包含特异于已知靶序列(6)的杂交结构域(3)的报道寡核苷酸(2)并将其缀合于第一信号产生的工具(4)。第一信号产生的工具能够产生可检测的第一信号。第一信号产生的工具(4)可以根据用在检测步骤中的技术平台而变化。例如，如果Luminex平台被用作检测步骤中的技术平台，第一信号产生的工具(4)可以是图2中显示的内部颜色标记的，可接收光谱的微球体。下面所述的直接检测方法的变化描述在共同待决的美国申请系列号10/284,656中，其中这些变化的实现对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
将报道寡核苷酸(2)设计为特异性杂交到由上面讨论的多重扩增步骤提供的特异性靶序列(6)上。在报道寡核苷酸(2)和靶序列(6)之间的杂交特异性可以通过增加或减少报道寡核苷酸的杂交结构域(3)的长度进行调节。通常，较短的杂交结构域(3)将会给出提高的特异性，并且作为靶序列(6)和杂交结构域(3)之间错配的差异将对于杂交效率具有显著影响。较长的杂交结构域(3)将会给出较小的特异性但更高的杂交效率并且因此给出提高的灵敏性。靶序列(6)的性质将会影响杂交结构域(3)的组成。本领域普通技术人员将能够改变杂交结构域(3)的参数以达到所需的杂交结构域(3)与靶序列(6)结合的特异性和灵敏性。在一个实施方案中，所述杂交结构域(3)的长度为10-50bp。在一个备选的实施方案中，所述杂交结构域(3)的长度为20-40bp。在又一个备选的实施方案中，所述杂交结构域(3)的长度为15-25bp。
通过杂交结构域(3)特异性杂交到已知靶序列(6)上的每种报道寡核苷酸(2)将与已知的第一信号产生的工具(4)(如颜色标记的珠)相关联。所以，通过测定第一信号产生工具(4)的身份，能够测定靶序列(6)的身份，因此可以确定疾病病原体或第二疾病病原体的身份。
如果需要，可以将含有靶序列(6)的扩增的核酸(1)在多重检测步骤之前或之间进行变性。变性作用不是必需的。利用不对称扩增条件(诸如以比FSP大的浓度存在的RSP，诸如40∶10的比率)的TemPCR扩增反应产生足够的单链扩增产物用于检测反应，所述检测反应中变性作用不是必需的步骤。在本说明书提到的这个和其它步骤中的变性作用，可以通过加热到足够的温度或通过化学方法(如，但不限于，加入诸如5N NaOH的试剂)而发生。对于下列实施方案来说，不使用含有靶序列(6)的扩增的核酸(1)的变性作用。不过，如果加入变性步骤，包含在下列步骤中的原理将不会有差别。
在适合的杂交缓冲液(诸如1X TMAC或1X TE)中将报道寡核苷酸(2)加入到变性的扩增核酸(1)中。报道寡核苷酸(2)的添加可以发生在变性作用(如果采用的话)之前或之后。所述报道寡核苷酸(2)在穿过杂交结构域(3)的扩增核酸(1)上结合靶序列(6)，形成核酸-报道寡核苷酸复合物(I)。可以使用本领域已知的杂交条件，如于52℃温育15分钟。在杂交完成后，如通过离心分离复合物I，并去除未结合的报道寡核苷酸(2’)和未结合的扩增核酸(1’)。随后利用适当的检测平台对复合物I进行检测。在一个实施方案中，第一信号产生工具(4)是内部颜色标记的可接收光谱的珠(Luminex)并且将Luminex平台用于检测。所述Luminex平台刺激第一信号产生工具(4)以产生可以检测到的第一信号。记录并解释所述第一信号。将第一信号产生工具(4)以及产生的第一信号用来测定被报道寡核苷酸(2)结合的靶序列(6)的同一性。一旦鉴定了所述靶序列(6)，则检测的疾病病原体或第二疾病病原体的同一性是已知的。
不过，扩增核酸(1)可以包含由FSP或RSP的至少一种提供的检测工具(8)。这种检测工具(8)可以是如上所述的或者可以直接或间接地缀合到扩增核酸(1)上。在图2中，由一种靶标扩增引物提供的生物素分子被图示为检测工具(8)。所述检测工具(8)可以用来掺入第二信号生成工具(10)，其能够生成可检测的第二信号。在一个实施方案中，第二信号产生工具(10)可以是一种结合到可检测的标记，如荧光标记、化学标记、酶标记或放射标记上的链霉抗生物素分子。适合的荧光标记，包括但不限于，PE或Cy-3。在一个实施方案中，第二信号产生工具(10)是链霉抗生物素-PE复合物。在一个备选实施方案中，所述第二信号产生工具(10)是可以直接缀合到扩增核酸产物上作为检测性手段的组分。将所述第二信号产生工具(10)加到核酸-报道寡核苷酸复合物中并进行温育以允许结合形成复合物(II)。在一个实施方案中，所述温育是于52℃持续5分钟，尽管如本领域已知的可以使用其它的时间和温度。
接着可以使用适合的平台来分析复合物(II)。在一个实施方案中，第一信号产生工具(4)是内部颜色标记的可光谱接收的珠(Luminex)并且第二信号产生工具(10)是荧光PE标记。在该实施方案中，将Luminex平台用于检测。该Luminex平台刺激第一(4)第二(10)信号产生工具来分别产生可检测的第一和第二信号。检测第一和第二信号产生工具从而使第一和第二细胞每个都可在另一个存在的情况下进行检测。记录并解释第一和第二信号。将第一信号产生工具和产生的第一信号用于确定由报道寡核苷酸(2)结合的靶序列(6)的身份。第二信号产生工具(10)和第二细胞用于证实与报道寡核苷酸(2)结合的靶序列(6)的存在(防止从任何游离的报道寡核苷酸(2)中的信号产生)。一旦已经鉴别了靶序列(6a)，就知道了被检测的疾病病原体或第二疾病病原体的身份。然而，应该注意复合体I可以进行如上所述的检测。
另外的技术平台也可以用在直接检测步骤中。在一个备选的实施方案中，当被置于检测和分析用的适合仪器中时，在报道寡核苷酸上的第一信号产生工具可以产生可检测的物理第一信号。该物理信号可以是颜色变化，给定波长的光在激发后的发射，或在电性质中的变化，诸如传导性，或在电磁或化学性质中的变化。还可以使用其它的物理信号。在一个实施方案中，第一信号产生的工具可以是在性质上占据空间的，诸如在固体支持体上的定位。例如，报道寡核苷酸可以在收集工具诸如芯片或其它固体支持体上的已知定位上，进行空间上的辨别。因此，第一信号是在性质上占据空间的。当包含靶序列的扩增产物与报道寡核苷酸杂交时，该结合可以通过由在扩增的核酸上的第二信号产生工具产生的第二信号的存在而确定。通过检测第二信号的空间定位(第一信号)，靶序列和疾病病原体/第二疾病病原体的身份被确定。在备选的实施方案中，报道寡核苷酸可以偶联于另外的第一信号产生工具从而产生两个第一信号，一个空间的和一个非空间的。因此，由第二信号产生工具产生的第二信号将信号传导靶核酸与报道的寡核苷酸的结合。在一个备选的实施方案中，靶序列与报道寡核苷酸的结合(biding)可以产生在报道寡核苷酸的特性中的可检测的变化(包括，但不限于在电性质诸如传导性中的变化)。那么这种特性中的变化将作为第二信号。
在间接检测方法的一个实施方案中，使用被称为ROCASH(在特异性杂交后报道寡核苷酸捕获)的新方法。该ROCASH方法描述在共同待决的美国申请系列号10/284,656中，将其全文并入本文作为参考。为了阐明的目的，描述了使用Luminex X-Map技术的ROCASH方法的一个实施方案。还可以使用如本领域已知的其它间接检测方法。了解的是ROCASH方法的变化可以被并入，如在共同待决的美国申请系列号10/284,656中所述的。不象现有技术方法，在ROCASH方法中，由报道寡核苷酸的不同核酸序列在ROCASH方法中的不同步骤杂交来提供在报道寡核苷酸和靶序列之间的杂交的特异性以及靶序列检测的灵敏性。因此，这些关键步骤的条件可以是彼此独立进行优化的从而提供在检测步骤中的增加的特异性和灵敏性。
将该Luminex xMAP技术和相关技术描述在本领域中和在美国专利号6,524,473，6,514,295，6,449,562，6,411,904，6,366,354，6,268,222，6,139,800，6,057,107，6,046,807和5,736,330中。该xMAP技术使用共价结合于靶标特异性捕获试剂(被称为cRTs，如下限定)的多个内部颜色标记的微球体。这种捕获试剂可以是寡核苷酸(如在下面描述的cRTs情形中)，但是也可以是多肽或被设计与区域标志物特异性相互作用的化学部分。当使用备选捕获试剂时，可以改变在报道寡核苷酸上的区域标志物从而提供互补结合配偶体。该内部颜色标记产生对于由Luminex平台激发后的每组珠的独特信号。
可以认为该ROCASH方法包含两个主要的成分：(i)报道寡核苷酸；和(ii)收集工具。报道寡核苷酸被设计从而与由上面讨论的多重扩增步骤提供的靶序列特异性结合。报道寡核苷酸包含被设计用于杂交靶序列的各种长度的杂交结构域(见，关于以上杂交结构域的长度对特异性和灵敏性的影响的讨论)，被称为与收集工具杂交的区域标志物的核酸序列，和第一信号产生工具。在一个实施方案中，在报道寡核苷酸上的区域标志物对于每个杂交结构域而言是独特的。换言之，具有与靶序列“A”结合的杂交结构域的报道寡核苷酸和具有与靶序列“B”结合的杂交结构域的报道寡核苷酸将具有不同的区域标志物。收集工具包括在该实施方案中被称为cRTs(互补区域标志物)的多种捕获试剂，和第二信号产生工具。CRTs是互补于区域标志物的核酸序列，所述区域标志物被包含在报道寡核苷酸中。第一和第二信号产生工具可以根据使用在检测平台中的技术的性质而变化。当使用Luminex X-Map技术时，第一信号产生工具可以是荧光标志物，诸如PE或Cy-3，并且第二信号产生方式可以是内部颜色标记的，可光谱接收的微球体。通过报道寡核苷酸的区域标志物和收集工具的cRTs的相互作用，每个报道寡核苷酸(其通过杂交结构域的方式特异于已知靶序列)将与第二信号产生的已知工具(诸如颜色标记Luminex的珠)相关。因此，通过确定第二信号产生工具的身份，可以确定靶序列的身份，这将容许疾病病原体或第二疾病病原体的鉴定。因此，通过在报道寡核苷酸的杂交结构域和靶序列之间的杂交来获得特异性(注意到可以通过减少或增加杂交结构域的长度来改变特异性)并且通过在报道寡核苷酸的区域标志物和收集工具的cRT之间的杂交来确定灵敏性。还可以使用纯化的工具，其被设计与扩增的核酸序列相互作用并且如下讨论协助未使用的扩增靶序列的去除。
在图3中举例说明ROCASH方法的一个实施方案。提供来自多重扩增反应的包含靶序列(6a)的扩增的核酸(1a)用于检测(扩增方法可以是本文所述的Tem-PCR方法)。如果需要，可以对包含靶序列(6a)的扩增的核酸(1a)进行变性。然而，变性步骤是任选的。图3显示在变性步骤后的扩增的核酸(1a)。如上讨论，扩增核酸的反链(reverse strand)将包含由FSP或RSP的至少一个提供的检测工具(8a)。该检测工具(8a)可以是连接于FSP和/或RSP的生物素分子或如上讨论的本领域已知的其它这样的工具。选择纯化工具(9a)来与检测工具(8a)相互作用。在一个实施方案中，纯化工具(9a)是缀合于链霉抗生物素的磁珠(诸如，Dynal270磁珠)，检测工具(8a)是生物素标记。将纯化工具(9a)加入扩增的核酸(1a)，其中其结合于检测工具(8a)以形成纯化复合物(复合物I)的核酸工具。将复合物I进行洗涤从而去除未结合的核酸和剩余的成分并且使用本领域已知的分离技术来进行分离，并且其与纯化的工具相容。在其中纯化的工具是磁珠的情形中，可以使用磁分离技术。将杂交缓冲液，诸如1X TMAC或1X TE加入复合物I从而备用于杂交。
接着，将报道寡核苷酸(2a)加入复合物I。然而，如果需要，报道寡核苷酸可以在前面的步骤加入，在扩增的核酸变性之前或之后。报道寡核苷酸(2a)通过杂交结构域(3a)结合靶序列，形成纯化-核酸-报道寡核苷酸复合物(复合物II)的工具。该报道寡核苷酸(2a)还包含区域标志物(12a)和第一信号产生的工具(4a)。杂交可以如本领域已知发生，诸如通过在52℃温育15分钟。结合后，复合物II可以进行洗涤(诸如在温1X SSC中)并使用如上讨论的适当的分离技术来进行分离。在去除未结合的报道寡核苷酸后，复合物(II)进行变性条件从而从靶序列(6a)中释放报道寡核苷酸(2a)。纯化复合物的核酸工具通过如上讨论的适合的分离技术进行去除。
将收集用工具(20a)混合以留在溶液中的报道寡核苷酸(2a)。收集用工具包括cRT(22a)和用于第二信号产生的工具(10a)。收集用工具(20a)的cRT(22a)与报道寡核苷酸的区域标志物(12a)相互作用，形成收集工具-报道寡核苷酸复合物(复合物III)。选择cRTs(22a)和区域标志物(12a)从而使每个cRT/区域标志物互补对具有相似的Tm以彼此结合。因此，每个区域标志物(12a)与其互补cRT(22a)的杂交条件是通用的。由于使用了一组杂交条件，这容许检测的增加的灵敏性，特别是在多重检测设置中。可以使用如上所述的杂交条件，以及其它本领域已知的杂交条件。接着，使用适合的检测平台来分离和分析复合物(III)。
在一个实施方案中，用于第一信号产生的工具(4a)是荧光PE标记，用于第二信号产生的工具(10a)是内部颜色标记的可光谱接收的珠(Luminex)。在该实施方案中，将Luminex平台用于检测。Luminex平台刺激用于第一(4a)第二(10a)信号产生的工具以分别产生可检测的第一和第二信号。记录和解释第一和第二信号。选择第一和第二信号产生工具从而使第一和第二信号可以每个都在另一个存在的情况下进行检测。用于第二信号产生的工具和产生的第二信号用于确定由报道寡核苷酸(2a)结合的靶序列(6a)的身份。用于第一信号产生的工具(10a)和第二信号用于间接证实靶序列(6a)的存在(为了防止从用于收集的任何游离工具10a产生信号)。一旦已经鉴定了靶序列(6a)，疾病病原体或第二疾病病原体的身份得以检测。
使用MAS的实施方案来鉴别诊断严重急性呼吸道综合症(SARS)
下面是使用本说明书的教授进行的MAS的几个实例以提供对于SARS的鉴别诊断分析(在这些实例中SARS-CoV)。在该实例中，SARS是疾病病原体，并且第二疾病病原体包括下列的一种或多种：呼吸道合胞病毒(RSV)A和B，副流感病毒(PIV)1型和3型，流感病毒(INF)A和B型，腺病毒毒株(ADV)，肺炎衣原体，和肺炎支原体，肠道病毒(ENT)，和肠病毒类型诸如柯萨奇病毒A(CVA)，柯萨奇病毒B(CVB)，鼻病毒(Rhv)和艾柯病毒(BV)。如上讨论，这些实例本质上作为典型进行提供并且不意欲限制本发明书到公开的鉴别诊断，因为来自其它疾病病原体和第二疾病病原体的其它靶序列可以进行扩增和检测。
表2和3列出用在TemPCR方法中的靶序列富集引物(分别将Fout Fin，Rout和Rin称为Fo，FI，Ro，和RI，如这样的术语在本文所限定)以从疾病病原体和第二疾病病原体中扩增靶序列，以及报道寡核苷酸的核酸序列(称为De)。在表2和表3中，Fi和Ri引物包含超级引物结合标志物。表2还提供疾病病原体和第二疾病病原体的核酸序列的Genbank接受号以及由引物和报道寡核苷酸结合的核酸的区域。靶序列扩增引物(FSP和RSP)的序列在表2和3的下部进行提供。
在这些实例中，对来自SARS病毒基因组的三个靶序列进行扩增和检测。已知SARS病毒具有高突变率。如果突变在引物结合位点或检测杂交位点发生，可以引入假阴性结果。检测来自SARS病原体的三个靶标增加了检测灵敏性并减少了假阴性结果。对于第二疾病病原体而言，对来自各个核酸的每个的核酸的一个区域进行扩增和检测。在一些情形中，可以将在表2中列出的靶序列富集引物用于检测病原体的多株。例如，用于扩增流感病毒A的靶序列富集引物产生包含靶序列的扩增核酸，其足以进行对各种毒株的检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)，包括，但不限于H1N1，H1N2，H2N2，H3N2，H4N6，H5N1和H9N2。用于扩增流感病毒B的靶序列富集引物产生包含靶序列的扩增核酸，其足以进行对各种毒株的检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)，包括但不限于，Lee40，Memphis 97，Saya 99和Taiwan 99。用于扩增腺病毒的引物产生包含靶序列的扩增的核酸，其足以进行检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)腺病毒毒株3，4，7，14，和21。在上述情形的每一种中，可以将特异于每个毒株的检测寡核苷酸用在检测步骤中以鉴定具体的毒株。用检测用工具，诸如生物素标记RSP(可以如上面讨论使用其它的标记分子)。
在表3中列出的靶序列富集引物，也在一些情形中可以用于检测病原体的多个毒株。表4显示通过在表3中显示的靶序列富集引物从各种病原体中扩增的基因。选择非结构基因(NS)作为从流感A病毒中的扩增。选择保守区域用于4个靶序列富集引物的设计和产生包含靶序列的扩增的核酸，其足以进行各种毒株的检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)，所述毒株包括，但不限于H1N1，H1N2，H2N2，H3N2，H3N8，H4N6，H4N8，H5N1，H5N2，H5N3，H6N1，H6N2，H6N4，H7N1，H7N2，H7N3，H7N7，H7N8，H9N2，H10N5，H11N1，H11N8，和H11N9(其包括目前流行的禽流感A毒株，H5N1)。还选择将非结构基因作为靶标用于流感B病毒的扩增和检测。存在腺病毒的至少51种已知的血清型。选择在六邻体基因中的保守区域用于靶序列富集引物系列的设计和产生包含靶序列的扩增的核酸，其足以用于各种毒株的检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)，所述毒株包括，但不限于，血清型3，4，7，14和21(其包括常与呼吸道感染相关的那些血清型)。检测寡核苷酸ADV3-3De检测毒株3，7和21，ADV4-3De检测毒株4，Adv14-3De检测毒株14。选择来自各种肠道病毒种类和家族成员的5′UTR区域的保守序列用于扩增。肠道病毒和鼻病毒是小RNA病毒科家族的成员。肠道病毒还包括不同的属，诸如柯萨奇病毒和艾柯病毒。这些病毒都与呼吸道感染相关。对于肠道病毒分类的各个成员的检测而言，设计一系列的靶序列富集引物，所述引物产生包含靶序列的扩增的核酸，其足以检测和鉴别(使用适当的检测寡核苷酸)各种毒株：鼻病毒包括，但不限于Ts，1a，1b，2，9，14，15，16，39，49，50，85，和89；柯萨奇(coxackie)病毒A，包括，但不限于A21和A24；柯萨奇病毒B包括，但不限于，B4和B5；和艾柯病毒，包括，但不限于11，20，和25。寡核苷酸Rhv2的检测特异于鼻病毒的检测，而检测寡核苷酸CVE2检测柯萨奇病毒A和B和艾柯病毒。
选择来自核衣壳蛋白质基因(N基因)的保守序列进行从副流感病毒1型和3型的扩增。选择非结构基因序列作为呼吸道合胞病毒A和B的靶标。为了减少背景扩增和假阳性检测，不选择rRNA基因用于从列出的细菌种类的扩增。相反，选择来自肺炎支原体的cytadhesin P1基因，和来自肺炎衣原体的尿苷激酶基因用于扩增。用检测用工具，诸如生物素(可以使用如上面讨论的其它标记分子)来标记RSP。
可以如上面更详细的讨论来改变用在本发明检测方法中的引物序列。此外，对于在公开的方法中的检测而言，可以通过设计特异于病原体的引物来将其它病原体包括在内。如果发现新的病原体导致SARS样疾病状态或如果分离了另外的SARS变体，这些改进可以是理想的。
实施例1
在该实施例中，获得来自每个疾病病原体和第二疾病病原体的核酸序列并如本文所述对其进行分离。通过本文描述的Tem-PCR方法来扩增来自每个病原体的核酸。将每种病原体的核酸置于单独的反应管中并且将在表2中详细说明的引物的完全混合物与RT-PCR的试剂一起加入。对于每个病原体，以在表5中具体说明的三种引物比率中的每一种进行单独的反应。尽管可以使用任何本领域已知的用于RT-PCR的程序，将下面的程序用在该实施例中。制备主要的rRT-PCR混合物，其包括5XRT-PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物(包含400μM的每种dNTP)，以表5中指明的比率在表2中显示的引物的完全的混合物，和RT-PCR酶制剂。如果需要，还以5-10单位/反应的浓度将核糖核酸酶抑制剂加入。将足以进行扩增的来自每种疾病病原体和第二疾病病原体的核酸序列或其部分加入包含RT-PCR主混合物的各个反应管中，所述序列或其部分包含靶序列。通过将无核糖核酸酶的水加入一个反应管中取代核酸模板来制备RT-PCR的空白。将反应管置于循环变温器中，其程序如下：(i)反转录-在50℃达30分钟；(ii)起始PCR活化-在95℃达15分钟；(iii)第一扩增反应，其包含第一个3-步骤循环(靶标富集)-在94℃达1分钟，在55℃达2.5分钟并且在72℃达1分钟，进行10个完整的循环；(iv)第二个3步骤循环(靶标扩增)-在94℃达30秒，在55℃达15秒和在72℃达15秒，进行40个完全的循环；和(v)最终延伸-在72℃达3分钟。
使用如上所述并且在图2中图示的直接检测方法来检测扩增的产物的等分试样。在该实施例中，将特异于在每种待检测的病原体中扩增的靶序列的检测寡核苷酸(如在表2中列出的)与Luminex微球体进行偶联。将扩增的产物的等分试样在单独的管中，加入反应混合物中，所述混合物包含1X TE，杂交缓冲液和足以产生可检测的信号的每种检测寡核苷酸的量。在该实施例中，表2中的每种病原体的检测寡核苷酸存在于每个反应中，所述反应包含被扩增的核酸产物。对于检测寡核苷酸阴性对照而言，将1XTE加入取代被扩增的产物。立即将该样品置于52℃下达15分钟以进行在检测寡核苷酸和靶序列之间的杂交。将该样品进行离心以去除未结合的检测寡核苷酸和检测寡核苷酸尚未结合的核酸。接着，使用Luminex平台进行对该样品的检测。该Luminex平台刺激与检测寡核苷酸缀合的微球体(第一信号产生工具)从而产生可检测的信号。在该实施例中，第二检测用工具没有被包括进来，然而，第二信号可以如上讨论被掺入。
将结果表示于表3。行表示疾病病原体或第二疾病病原体的身份，其核酸被用在起始的扩增反应中且引物的比率被用在扩增步骤中。栏表示用在检测步骤中的检测寡核苷酸。例如，行5(称为RSVB 4∶1∶1∶1∶8∶16)表示呼吸道合胞病毒类型B的核酸被用在扩增反应中并且将嵌套引物和超级引物以4∶1∶1∶1∶8∶16的比率进行使用。行2(称为RSVB)指出特异于呼吸道合胞病毒类型B靶序列的检测寡核苷酸被用在检测步骤中。栏1(被称为Lum空白)表示检测寡核苷酸阴性对照，其中被扩增的产物被省略。行3-5(分别被称为空白4∶1∶8∶16，空白4∶1∶8∶24和空白4∶1∶8∶32)表示扩增阴性对照，其中特异性核酸序列被省略，但是扩增每种特异性靶序列的引物以指示的比率被包括进来。
如在表4中可见的，特异于给定的疾病病原体或第二疾病病原体的检测寡核苷酸在多个被扩增靶序列存在情况下，特异性地结合来自疾病病原体或第二疾病病原体的核酸。该结果指出在不特异于靶序列的多组引物存在的情况下，靶序列富集引物扩增正确的靶核酸序列，并且靶序列扩增引物(FSP和RSP)正确发挥功能来扩增如所述的靶序列，适当的检测寡核苷酸能够与被检测的靶序列杂交。检测寡核苷酸阴性对照和扩增阴性对照提供背景阅读并且显示在所有测试的样品中没有过量的背景信号。
作为一个实例，特异于RSVB的检测寡核苷酸特异性地与仅来自RSVB的靶序列结合，而不与任何其它病原体的靶序列结合。此外，检测的水平随RSP的浓度增加，显示不对称的扩增可以增加检测步骤的灵敏性。此外，在腺病毒的情形中，表4指出靶序列富集引物和靶序列扩增引物扩增正确的腺病毒靶序列且特异性检测寡核苷酸能够在腺病毒毒株之间进行区分。
实施例2
在该实施例中，获得来自每种疾病病原体和第二疾病病原体的核酸序列并如本文所述对其进行分离。通过本文描述的Tem-PCR方法来扩增来自每种病原体的核酸。将每种病原体的核酸置于单独的反应管中并且将在表3中详细说明的引物的完全混合物与RT-PCR的试剂一起加入。RT-PCR的条件如在上面的实施例1中所述。用在该实施例中的引物比率是1∶1∶1∶1∶10∶40(Fout∶Fin∶Rin∶Rout∶FSP∶RSP)。
检测包含靶序列的被扩增的产物如针对直接检测方法所述的进行，所述方法使用在实施例1中描述的Luminex珠。将表3列出每种病原体的检测寡核苷酸加入每个检测反应。
表6显示使用在表3中公开的靶序列富集和靶序列扩增引物的该实验的结果。所述行表示疾病病原体或第二疾病病原体的身份，其核酸用在起始的扩增反应中并且引物的比率被用在扩增步骤中。栏表示用在检测步骤中的检测寡核苷酸。在该实施例中，1号样品是包含靶序列富集和靶序列扩增引物的混和物的RT-PCR空白，并且与Luminex珠缀合的检测寡核苷酸与不包括模板的RT-PCR反应杂交。将该背景信号用于确定阳性反应的截断值(cut-off values)。在多重系统，诸如使用TemPCR的MAS中，每个珠组事实上是其本身的微小系统。最终信号，以及背景，被许多因素所影响，包括：将捕获寡核苷酸连接到珠组上的偶联反应的效率；在多重TemPCR反应中的靶序列富集的效率；和在检测过程中的杂交的效率。结果，每种病原体(由每个珠组代表)的截断值必须被分别决定。确定背景信号(通过平均获自RT-PCR空白的值和已知不包含靶病原体的样品来确定)并且获得标准偏差。标准偏差乘以五(5)并且将该值加入平均背景。认为高于平均背景的值为阳性结果，指示特定病原体的存在。
样品2-4分别是腺病毒亚型4，7，和21。样品5-11分别是肺炎衣原体(CPN)，肺炎支原体(MPN)，流感病毒A(INFA)，流感病毒B(INFB)，副流感病毒类型1(PIV-1)，副流感病毒类型3(PIV-3)，和呼吸道合胞病毒(RSV)。样品12是SARS-CoV。为了增加检测的灵敏性并使由靶突变引起的假阴性检测最少，我们选择了来自SARS-CoV的三个不同的靶序列用于扩增和检测。样品13-16是不同的肠道病毒，包括柯萨奇病毒A(CVA)，柯萨奇病毒B(CVB)，鼻病毒(RhV)和艾柯病毒(EV)。对于腺病毒和肠道病毒种类的检测而言，将腺病毒和肠道病毒种类的特异性检测核苷酸加入检测步骤中。
如在表6中可见的，本公开内容的TemPCR方法提供了靶序列的特异性扩增，其被相应的检测寡核苷酸所特异性检测。通过获自每个珠组的高信号与背景的比率，高检测特异性是显而易见的。该结果指出靶序列富集引物在非特异于靶序列的多重引物组存在的情况下，扩增正确的靶核酸序列并且靶序列扩增引物(FSP和RSP)正确发挥功能来扩增如上所述的靶序列，且适当的检测寡核苷酸能够与被检测的靶序列杂交。
实施例3
在上述的实施例1和2中，仅将1个核酸样品加入每个反应中(尽管在特异于多个病原体的靶序列富集引物存在的情况下)。表7显示当来自多个病原体的核酸样品被包括在单一样品中用于多重扩增和随后的检测时，TemPCR扩增方法的特异性。在该实施例中，将在表3中列出的每种生物的靶序列富集引物，以及来自指出的病原体的靶序列扩增引物和核酸包括在每个样品中。在表7中的行指出在多重检测步骤中被检测的检测寡核苷酸(注意特异于在表3中列出的所有生物的靶序列的检测寡核苷酸被包括在每个检测反应中)，而在表6中的行指出被加入每个样品的病原体核酸的身份。如上面的实施例2所述进行TemPCR扩增条件和多重检测。
样品1是阴性对照，其中在RT-PCR反应中不包括模板核酸。样品2包括三种病原体，SARS，CPN，和INFA；样品3包括ADV-7，RSVB，和INFB；样品4包括PIV-3，CPN，和INFA；样品5包括ADV-21，RSVB，和INFB；样品6包括RhV和PIV1；样品7包括SARS和INFB；样品8包括ADV-7和PIV1。将在表6中显示的截断值用在该实施例中并且该值高于在表7中突出的截断值。
该结果显示TemPCR正确扩增来自每种病原体的正确靶序列，且扩增靶序列能够被检测以提供在该样品中存在的病原体的准确和特异性读出。作为一个实例，在行2中，来自SARS，CPN和INFA的核酸被加入扩增反应中。在特异于表3中的所有病原体的靶序列富集引物存在的情况下，使用公开的引物的TemPCR方法扩增正确的靶序列。要获得三种病原体的正确的多重扩增并不需要对TemPCR扩增条件的修饰或优化。重要的是，TemPCR多重扩增条件的相同组容许使用标准化的扩增方法的多种病原体的特异性检测。所述的TemPCR方法是高度特异性的，并且可以检测各种组合的特异性病原体。没有观察到假阳性或假阴性。
实施例4
为了验证TemPCR方法的灵敏性，用在表8中列出的不同量的病毒或细菌病原体来制备1ml的血清样品。对于每种病原体而言，制备4个浓度：104pfu/ml，103pfu/ml，102pfu/ml，和101pfu/ml。为了观察测定的可重复性，在四个浓度的每一个，制备三个重复的样品并进行分析。某些样品，诸如ADV4和RhV，不具有高滴度的可获得贮存物，并且起始浓度是103pfu/ml。对于SARS而言，病毒贮存物是有限的，并且因此，对于每个浓度仅研究了两个样品(而不是三个)。对于每种病原体，还将包括以高浓度存在的阳性对照样品(未穿刺到血清中)。
对于每个1ml的穿刺(spiked)样品血清，将200μl用于核酸分离。使用本文所述的triazol方法来进行核酸分离。在分离步骤结束的时候，将核酸洗脱到50μl无核糖核酸酶水。在随后的TemPCR反应中，将来自该洗脱液的5μl的体积用作模板。因此，如果起始浓度是104pfu/ml，该TemPCR扩增反应仅包括约200个拷贝的病原体基因组。类似地，在103pfu/ml水平，仅有20个拷贝被包括在反应系统等等。如上所述，将TemPCR扩增反应的条件是实施例2中的并使用直接检测方法如在实施例2中所述进行多重检测。
表8显示灵敏性研究的结果。对于每种靶标，具体确定截断值，并且将该截断值设定为平均值加标准变差的5倍。将上述的值认为是阳性的并且在表8中突出。通常，该测定可以检测存在于血清样品中的20-200个拷贝的病原体。应当注意的是，用在该实施例中的TemPCR条件没有结合本文讨论的选择性扩增步骤。预期应用选择性扩增的步骤来显著增加反应的灵敏性。
实施例5
实施例5举例说明使用TemPCR方法的备选实施方案的实验的结果。在该实施例中，获得了来自每种疾病病原体和第二疾病病原体的核酸序列并如本文讨论进行分离。通过Tem-PCR方法来扩增每种病原体的核酸。在该实施方案中，对TemPCR的扩增反应条件进行改变从而包括靶序列富集步骤和选择性扩增步骤。将每种病原体的核酸置于单独的反应管中并将在表3中详细说明的引物的完全混合物与RT-PCR的试剂一起加入。用在该实施例中的引物比率是1∶1∶1∶1∶10∶40(Fout∶Fin∶Rin∶Rout∶FSP∶RSP)。
在下面给出扩增条件。将反应管置于循环变温器中，其程序如下：(i)反转录-在50℃达30分钟；(ii)起始PCR活化-在95℃达15分钟；iii)第一扩增反应，其包含首先的3-步骤循环(靶序列富集)，-在94℃达0.5分钟，在52℃达1分钟和在72℃达1分钟，进行15个完整的循环，并包含第二2-步骤循环(选择性扩增)-在94℃达15秒，在70℃达1.5分钟；进行6个完整的循环，优选进行4-8个完整的循环；(iv)第二扩增反应，其包含第三个3步骤循环(靶序列扩增)-在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒和在72℃达15到30秒；进行至少2个完整的循环，优选进行10-40个完整的循环；和(v)最终延伸-在72℃达3分钟。如针对直接检测方法所述进行包含靶序列的扩增产物的检测，所述直接检测方法使用如在实施例1中所述并在图2中举例说明的Luminex珠进行。将在表3中列出的每种病原体的检测寡核苷酸用于每个检测反应中。
表9显示使用在表3中公开的靶序列富集和靶序列扩增引物的该实验的结果。行代表疾病病原体或第二疾病病原体的身份，其核酸用在起始的扩增反应中。如在表9中可见，使用备选扩增策略的TemPCR方法提供靶序列的特异性扩增，其被相应的检测寡核苷酸所特异性检测。通过获自每个珠组的高信号与背景比率，高检测特异性是显而易见的。该结果指出靶序列富集引物在非特异于靶序列的多个引物组存在的情况下，扩增正确的靶核酸序列，并且靶序列扩增引物(FSP和RSP)正确发挥功能以扩增如所述的靶序列并且适当的检测寡核苷酸能够与被检测的靶序列杂交。
本发明公开内容的主题还是试剂盒，所述试剂盒包含进行在举例说明的所有实施方案中公开的方法中所必须的成分。该试剂盒可以包含下列的一个或多个：用于从在来自被怀疑含有疾病病原体的个体的样品中的疾病病原体和第二疾病病原体扩增靶序列的至少一组引物，用于分离核酸(RNA，DNA或两者)的试剂，用于从所述样品中扩增靶核酸(通过PCR，RT-PCR或其它本领域已知的技术)的试剂，微球体，具有或不具有缀合的捕获试剂(在一个实施方案中，cRTs)，靶序列特异性检测寡核苷酸，阳性/阴性对照所需要的试剂和第一和第二信号的产生。
本文引用的所有参考文献(包括文章，专利和url地址)以允许的程度被结合到本文作为参考。本文讨论的参考文献仅对于在它们本发明的提交日期之前的公开内容进行提供。本发明没有什么内容将被解释为承认本发明人没有权利通过在先的公布来先于这些公开的内容。仅出于外国优先权的目的附加下列的权利要求。
 DNA   RNA(+)   RNA(-)
  Fout  1   1   4
  Rout  1   4   1
  Fin  1   1   1
  Rin   1   1   1
  FSP   8   8   8
  RSP   32   32   32
表1-对于疾病病原体和第二疾病病原体的嵌套引物和超级引物与指定的基因组的典型比率。嵌套引物和超级引物的比率可以如在本说明书中讨论的进行变化。
表5被包括的病原体靶标和可检测的毒株的描述
  编号  病原体   产物名称   靶基因   可检测的类型/毒株
  1  SARS-Cov   SARS 1   5’末端多蛋白
  SARS 2   聚合酶基因
  SARS 3   N基因
  2  流感病毒A   INFA   NS基因   H1N1，H1N2，H2N2，H3N2，H3N8，H4N6，H4N8，H5N1，H5N2，H5N3，H6N1，H6N2，H6N4，H7N1，H7N2，H7N3，H7N7，H7N8，H9N2，H10N5，H11N1，H11N8，H11N9
  3  流感病毒B   INFB   NS基因
  4  腺病毒   ADV   六邻体基因   类型3，4，7，14和21
  5  副流感病毒1   PIV1   N基因
  6  副流感病毒3   PIV3   N基因
  7  呼吸道合胞病毒   RSV   NS基因   RSVA和RSVB
  8  肺炎支原体   MPN   CytadhesinP1基因
  9  肺炎衣原体   CPN   尿苷激酶基因
  10  肠道病毒   ENT   5’UTR   鼻病毒Ts，1a，1b，2，9，14，15，16，39，
 49，50，85，89；柯萨奇病毒A：A21，A24；柯萨奇病毒B：B4和B5：艾柯病毒：s11.20和25
表2-在公开的方法的一个实施方案中用在多重扩增中的引物序列和检测寡核苷酸序列
GenBank ID      靶标名称   寡核苷酸序列   位点
AY278491M11486D00736AF457102     SARSSARS1FoSARS1FiSARS1RoSARS1RdSARS1DeSARS2FoSARS2FiSARS2RoSARS2RiSARS2DeSARS3FoSARS3FiSARS3RoSARS3RiSARS3DeRSVARSVAFoRSVAFiRSVARoRSVARiRSVADeRSVBRSVBPoRSVBPiRSVBRoRSVBRiRSVBDePIV-1PIV1FoPIV1FiPIV1Ro ACCGTAGACTCACTCTATGATGCAGGCCACGTTTTGTCATGCGAAGCTATTCGTCACGTTCGTTGCATTAACTCTGGTGAATTCTGTTCTTTGCGTTATGTCTFCTGTAGAAAATCCTAGCTGGTAGAGGGCTGTCATGCAACTATGCCTAACATGCTTAGGATAATGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTTTCTACAGCTAACGATACATTGGCTGTAACAFCTTGACTTCTTTGCGTTATGTCTCTGAGCATAAGCAGTTGTAGCATCGTGAGATGGTCATGTGTGGCACAATGCTGCCACCGTGCTACCAGGCCACGTTTTGTCATGCCCTCAAGGAACAACATTGCCTAGCGCGAGGGCAGTTTCACTTCTTTGCGTTATGTCTCTGCCGCTAGCCATTCGAGCAGGATCATCACGTAGTCGCGGTAAATTGGCATTAAGCTACAAACAGGCCACGTTTTGTCATGCGGGCAAATACAAAGATGGCTCGACATAGCATATAACATACCTATTTTCTTTGCGTTATGTCTGGGAGTRTCAATAYTATCTCCTGTCACTCAACAAAGATCAACTTATTGGCATTAAGCCTACAAACAGGCCACGTTTTGTCATGCGGGCAAATAAATGGCTCGACATAGCATATAACATACCTATTTTCTTTGCGTTATGTCTCTGGGAGTRTCAATAYTATCTCCTGTCATTAAATAAGGATCAGCTGCACAATTGATAATGAATTATTGGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTGATGAAATAATTAGACAACTAGCTATTWATATCATCATCATTT 18121-1814318201-1822018384-1836118309-18290l8241-1826015246-1526915323-1534315482-1546015440-1542015361-1538028580-2860028606-2862528785-2876628760-2874128681-18700899-9181082-11021310-12871202-11801127-1146888-9071071-10911299-12761191-11691116-113513037-1305813064-1308713186-13166
Z11575NC_000912AE001618AY027864AJ344037AF492482   PIV1RiPIV1DePIV-3PIV3FoPIV3FiPIV3RoPIV3RiPIV3De肺炎支原体MPMFoMPMFiMPMRoMPMRiMPMDe肺炎衣原体CPMFoCPMFiCPMRoCPMRiCPMDe肠道病毒ENTVFoENTVFiENTVRoENTVRiENTVDe流感病毒AINFAFoINFAFiINFARoINFARiINFADe流感病毒BINFBFoINFBFiINFBRo   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGTGCTATCATTTCTTTAAGATTGCAGCTATGACTATTGCAGACCACAATTGATATGAATTATTGGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTACTGACATCATACATGCAATTTCCTATTWATATCATCATCATTTTTCTTTGCGTTATGTCTCTGTAACTATTATCTCTTTTAAATTCTGCAATTACAATAGCAGATACCAGCATAAGAACCTCCTGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTCAAGTCACGTACTCGCCATCTTAAACTGTTACTGTTGTGCTTCTTTGCGTTATGTCTCTGTTTGCGAGATCTCGAGGGGTCGCTGAATAAACCGGGTATTAGCCTGCCCTATGAAAACGATGCAGGCCACGTTTTGTCATGCCGTGATCCACACGAGTCATACTAAAGCTGCTTCGGGAACGTGTTCTTTGCGTTATGTCTCTGTATCGGGGTTGTATTTCCTTCATCGGAAGTCGCTCTATCTTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCAGGCCACGTTTTGTCATGCCCTAACTGTGGAGCACATGCCTGTCACCATAAGCAGCCAATGTTCTTTGCGTTATGTCTCTGTAGTCGGTTCCGCTGCAGAGCCAGAGGGTAGTGTGTCGTATGCAATTGGGGTCCTCATCGGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTTGAATGGAATGATAACACAGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCTTCTTTGCGTTATGTCTCTGGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTCTACAGAGATTCGCTTGGTGAAGGGTTTGAGCCATACTGCAGGCCACGTTTTGTCATGCTACAATTGGACCGATTACCCTTGAGTGTTTACTTCCTCCTTTATC   13160-1313913096-1311512911-1293212938-1296113060-1304013035-1301412970-12989323867-323886323891-232911324086-324067324039-324019323961-3239806780-68006850-68706970-69506943-69236885-69041-2026-46152-132100-8153-72528-548554-574826-806674-654591-609291-311346-366497-474
AF542122AY008279AF542129AF542122AF515814AB018425   INFBRiDNFBDe腺病毒ADVFoADVFiADVRoADVRiADV21DeADV3DeADV4DeADV7DeADV14De   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGTTGTTCATGTCCCTTAATACTCCTTGATGACATAGAAGAAGAACAGACCCAAYTACATTGGCAGGCCACGTTTTGTCATGCATGTACTACAACAGTACTGGTATGACAGTTCWGTGTTTCTGTCTTCTTTGCGTTATGTCTCTGGCAAGTCAACCACHGCATTCGAGTGCTGGCAGGTCAAGCAGAGTTTTGGCTGGCCAAGCAGGGTACTGGCCGGTCAGGCCGAGTTTTGGCCGGCCAAGCAGGGTGCTGGCTGGCCAAGCA   456-435384-403910-929955-9741052-10331030-10111034-10531016-1035983-10021131-1150717-736
超级引物序列
FSP-CAGGCCACGTTTTGTCATGC
RSP-TTCTTTGCGTTATGTCTCTG
表3在公开的方法的一个实施方案中用在多重扩增中的引物序列和检测寡核苷酸序列
  SARS   序列5′-3′
  SARS1Fo   ACCGTAGACTCATCTCTATGATG
  SARS1Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCGAAGCTATTCGTCACGTTCG
  SARS1Ro   TTGCATTAACTCTGGTGAATTCTG
  SARS1Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCTGTAGAAAATCCTAGCTGG
  SARS2Fo   ATGCCTAACATGCTTAGGATAATG
  SARS2Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCTTTCTACAGGTTAGCTAACGA
  SARS2Ro   TACATTGGCTGTAACAGCTTGAC
  SARS2Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGAGCATAAGCAGTTGTAGCATC
  SARS4Fo   ACAATGCTGCCACCGTGCTAC
  SARS4Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCCCTCAAGGAACAACATTGCC
  SARS4Ro   TAGCGCGAGGGCAGTTTCAC
  SARS4Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCCGCTAGCCATTCGAGCAGG
  SARS1De   TAGAGGGCTGTCATGCAACT
  SARS2De   GTGAGATGGTCATGTGTGGC
  SARS4De   TCATCACGTAGTCGCGGTAA
  RSV A
  RSVAFo   AAGAATTTGATAAGTACCAC
  RSVAFi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCACTCCCTTGGTTAGAGATGG
  RSVARi   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCAATGCTACTTCATCATTGTC
  RSVARo   TATGTATCACTGCCTTAGCC
  RSVADe   GCAGCAATTCATTGAGTATG
  RSV B
  RSVBFo   AATAAGAATTTGATAAGTGC
  RSVBFi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCACCTTTTCAATCAGAAATGG
  RSVBRi   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCAATGCTACTTCGTCATTGTC
  RSVBRo   TGCTTTGGCTAATGCATTGG
  RSVBDe   GGTGCAATTCACTGAGCATG
  PIV1
  PIV1Fo   AGTATCACTCCTTGCAATGG
  PIV1Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCATCTCACTACAAACGGTGTC
  PIV1Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGTTTGACAATGAACCCATCTG
  PIV1Ro   GTTCTTTCATACTCCATGTC
  PIV1De   GCTGATGTCAAGTATGTGAT
  PIV3
  PIV3Fo   TCAATGGCTTATGCCAATCC
  PIV3Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCACAACAAATGGAAGTAATGC
  PIV3Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCTCGTCTTAACCACAAATCC
  PIV3Ro   CAGGTCACTTCCAAATATCC
  PIV3De   CTAAAACGGCAAAAGTATGG
  InfA
  INFAFo   TGCAATTGGGGTCCTCATCGG
  INFAFi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCTTGAATGGAATGATAACACAG
  INFARo   AAACGAGAAAGTTCTTATCTC
  INFARi   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGTTCTCGCCATTTTCCGTTTC
  INFADeC   TCTACAGAGATTCGCTTGG
  INFB
  INFBFo   AGTCTTATCCCAATTTGGTC
  INFBFi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCAGAGCACCGATTATCACCAG
  INFBRi   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGCATGTCAGCTATTATGGAGC
  INFBRo   AAGCACTGCCTGCTGTACAC
  INFBDe   TTCCACAAAACAGTAATAGC
  MPN
  MPNFo   ATCACCTTTAACCCCTTTGG
  MPNFi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCCGGCTTTGGTTTGAGTGGG
  MPNRi   TTCTTTGCGTATGTCTCTGCGCGGCACGAGTAAAACGGC
  MPNRo   TGCAACTGCTCATAGTACAC
  MPNDe   TGCACCCCAACAGTGAAACG
  CPN
  CPN 5 Fo   GAAATTTATAGAGCCGACTCG
  CPN 5 Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCGCTGATATCATTGTACATGG
  CPN 5 Ro   GTTGACCATATAATACGTCTC
  CPN 5 Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGCTTTCCAGGGCATTCTC
  CPN5 De   ACCGACAAAACGTAGTAACA
  ENTV
  CVA2 Fo   CAAGGTGTGAAGAGCCTATTG
  CVBEV Fo   CATGGTGCGAAGAGTCTATTG
  RhV2 Fo   GTGAAGAGCC(GC)CGTGTGCTC
  ENT3 Fi   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATG
  ENT3 Ri   CAGGCCACGTTTTGTCATGCAAACACGGACACCCAAAGTAG
  CVEV Ro   ATTGTCACCATAAGCAGCC
  RhV2 Ro   TATATATTGTCACCATAAGC
  CVEV De   GTTAGGATTAGCCGCATTCA
  RhV2 De   GTTGGTCCCATCCCGCAATT
  ADV
  ADV3-3Fi   CAGGCCACGTTTTGTCATGCCCCATGGATGAGCCCACCC
  ADV3-3Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGCTGGTGCACTCTGACCACG
  ADV4-3Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGCTGGTGCACTCGGACGACG
  ADV14-3Ri   TTCTTTGCGTTATGTCTCTGGCTGATGCACTCTGACCACG
  ADV3-3Fo   AGCAACTTCATGTCYATGGG
  ADV3-3Ro   GTGCGCAGGTAGACGGCCTC
  ADV14-3Ro   GTACGCAGGTAGACTGTCTC
  ADV3-3De   GCTTTATCTTCTTTTCGAAG
  ADV4-3De   TCTCTATGTTGTCTTCGAAG
  ADV14-3De   GCTTTATCTTCTCTTCGAAG
  超级引物
  FSP   CAGGCCACGTTTTGTCATGC
  RSP   TTCTTTGCGTATGTCTCTG
表4
  样品 RSVB SARS1 SARS2 SARS3 PIV-1 MPN CPN ENT INFA INFB ADV3 ADV7 ADV14 ADV21
  1   LUM空白   20   12   16   24   21   16   19   17   20   22   25   25   25   32
2   空白4:1:1:1:8:16 16 7 8 13 15 16 12 16 12 19 10 13 11 14
  3   空白4:1:1:1:8:24   16   25   10   10   15   15   16   12   22   14   16   15   14   18
  4   空白4:1:1:1:8:32   16   26   21   13   4   10   13   24   16   18   14   17   14   24
  5   RSVB 4:1:1:1:8:16   1102   14   20   13   14   7   10   16   14   17   13   17   17   19
  6   RSVB 4:1:1:1:8:24   1377   12   8   10   14   7   14   12   19   24   17   11   11   28
  7   RSVB 4:1:1:1:8:32   1496   26   10   10   11   13   10   13   15   14   9   12   16   19
  8   PIV1 4:1:1:1:8:16   19   22   10   11   311   18   12   19   10   15   10   18   26   18
  9   PIV1 4:1:1:1:8:24   9   19   15   12   298   12   18   19   13   12   13   13   12   20
  10   PIV1 4:1:1:1:8:32   13   38   17   9   514   20   22   29   15   23   11   13   16   16
  11   INFA 4:1:1:1:8:16   10   31   15   17   8   13   14   119   260   19   18   11   22   30
  12   INFA 4:1:1:1:8:24   26   46   23   8   9   10   13   186   454   15   9   9   15   23
  13   INFA 4:1:1:1:8:32   21   91   28   17   7   10   16   323   630   42   10   16   22   29
  14   INFB 4:1:1:1:8:16   10   22   18   27   14   9   6   13   16   677   12   21   16   23
  15   INFB 4:1:1:1:8:24   6   14   12   37   6   11   7   16   14   1162   10   15   12   23
  16   INFB 4:1:1:1:8:32   5   29   21   51   11   9   13   23   12   1480   11   14   13   20
  17   ADV21 4:1:1:1:8:16   8   10   19   9   13   19   13   21   13   17   11   13   12   286
  18   ADV21 4:1:1:1:8:24   9   18   12   8   12   10   15   21   13   17   13   15   14   452
  19   ADV21 4:1:1:1:8:32   12   43   17   8   11   6   11   25   13   19   11   10   10   543
  20   MPN 4:1:1:1:8:16   16   16   8   19   4   330   16   16   20   16   19   17   13   25
  21   MPN 4:1:1:1:8:24   15   29   27   15   3   1182   21   19   21   17   18   20   16   23
  22   MPN 4:1:1:1:8:32   10   30   21   16   14   1317   12   27   13   25   15   19   20   23
  23   CPN 4:1:1:1:8:16   14   22   12   12   7   19   1109   19   17   25   13   13   13   19
  24   CPN 4:1:1:1:8:24   23   27   15   12   7   10   1342   18   16   21   19   13   17   23
  25   CPN 4:1:1:1:8:32   13   43   30   13   8   20   1828   18   13   30   11   15   17   17
  26   SARS 4:1:1:1:8:16   11   857   768   227   12   17   11   14   20   20   14   17   21   20
  27   SARS 4:1:1:1:8:24   11   1251   1097   376   15   17   11   18   17   17   15   19   15   24
  28   SARS 4:1:1:1:8:32   7   1638   1528   693   9   13   6   20   16   19   14   13   14   17
RSV＝呼吸道合胞病毒；PIV＝副流感病毒；INF＝流感病毒；ADV+腺病毒；
MPN＝肺炎支原体；CPN＝肺炎衣原体；SARS＝严重急性呼吸道综合症病毒
表6
RSV＝呼吸道合胞病毒；PIV＝副流感病毒；INF＝流感病毒；ADV+腺病毒；MPN＝肺炎支原体；CPN＝肺炎衣原体；SARS＝严重急性呼吸道综合症病毒
Figure A20048003716200541
表7
RSV＝呼吸道合胞病毒；PIV＝副流感病毒；INF＝流感病毒；ADV+腺病毒；
MPN＝肺炎支原体；CPN＝肺炎衣原体；SARS＝严重急性呼吸道综合症病毒
Figure A20048003716200542
表8
表4分析系统的灵敏性
表4续
Figure A20048003716200561
表9
样品   SARS1   SARS2   SARS4   RSVA   RSVB  PIV-1   PIV-3   INFA   INFB   MPN   CPN   CVEV   ADV3-7-21   ADV4   ADV14
  SARS   688   614   183   6   11  12   0   22   10   0   7   3   12   4   9
  RSVA   25   39   17   3388   24  33   11   12   18   32   21   34   71   24   15
  RSVB   13   19   27   20   2538  18   8   29   25   27   25   26   43   22   6
  PIV-1   33   7   33   19   14  2008   19   23   13   19   28   23   13   19   5
  PIV-3   15   21   29   20   12  25   1189   14   22   22   29   24   49   15   22
  InfA   29   29   29   8   19  39   29   759   19   27   28   19   34   9   19
  InfB   17   22   15   19   11  35   11   34   795   11   32   14   20   19   22
  MPN   7   25   31   20   31  22   18   29   27   2304   37   21   41   27   9
  CPN   22   11   18   18   23  20   23   18   14   21   1626   34   32   22   3
  跳过的样品   9   28   16   31   17  30   17   16   14   11   28   25   26   8   11
  CVA-21& EV-11   25   22   24   12   24  28   24   25   35   18   16   1376   32   5   15
  CVB-4   25   17   22   19   25  21   23   30   28   25   18   1276   28   24   12
  RhV   32   23   29   18   14  35   28   18   21   32   27   18   24   36   20
  ADV3   19   36   21   39   23  23   24   35   15   16   26   19   2458   15   88
  ADV4   20   12   18   24   18  26   7   20   29   29   37   28   520   1242   26
  ADV7   31   11   27   31   21  22   29   26   39   28   20   29   1758   21   28
  ADV14   36   20   16   23   15  18   21   24   13   20   17   19   654   9   1697
  ADV21   17   20   26   19   18  29   19   9   9   21   23   14   2235   15   90
  RT-PCR空白1   22   6   14   20   18  24   15   31   14   26   18   4   28   9   10
  RT-PCR空白2   15   13   30   6   17  7   27   23   9   6   24   24   13   2   15
                              序列表
<110>格纳科生物医疗产品公司
<120>基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒
<130>P7064WO00GP
<150>60/510,762
<151>2003-10-13
<160>148
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>1
accgtagact catctctatg atg                                    23
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>2
caggccacgt tttgtcatgc gaagctattc gtcacgttcg                  40
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>3
ttgcattaac tctggtgaat tctg                                   24
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>4
ttctttgcgt tatgtctctg ctgtagaaaa tcctagctgg                  40
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>5
tagagggctg tcatgcaact                                      20
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>6
atgcctaaca tgcttaggat aatg                                 24
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>7
caggccacgt tttgtcatgc tttctacagg ttagctaacg a              41
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>8
tacattggct gtaacagctt gac                                  23
<210>9
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>9
ttctttgcgt tatgtctctg agcataagca gttgtagcat c              41
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>10
gtgagatggt catgtgtggc                                      20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>11
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<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>12
caggccacgt tttgtcatgc cctcaaggaa caacattgcc                  40
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>13
tagcgcgagg gcagtttcac                                        20
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>14
ttctttgcgt tatgtctctg ccgctagcca ttcgagcagg                  40
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>15
atcatcacgt agtcgcggta a                                      21
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>16
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<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>17
caggccacgt tttgtcatgc gggcaaatac aaagatggct c                41
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>18
gacatagcat ataacatacc tatt                                   24
<210>19
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>19
ttctttgcgt tatgtctctg ggagtrtcaa taytatctcc tgt              43
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>20
cactcaacaa agatcaactt                                        20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>21
attggcatta agcctacaaa                                        20
<210>22
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>22
caggccacgt tttgtcatgc gggcaaatac aaagatggct c                41
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>23
gacatagcat ataacatacc tatt                                   24
<210>24
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>24
ttctttgcgt tatgtctctg ggagtrtcaa taytatctcc tgt              43
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>25
cattaaataa ggatcagctg                                        20
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>26
cacaattgat atgaattatt gg                                     22
<210>27
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>27
caggccacgt tttgtcatgc tgatgaaata attagagcaa ctag             44
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>28
ctattwatat catcatcatt t                                      21
<210>29
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>29
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<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>30
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<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>31
cacaattgat atgaattatt gg                                     22
<210>32
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>32
caggccacgt tttgtcatgc tactgacatc atacatgcaa tttc             44
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>33
ctattwatat catcatcatt t                                      21
<210>34
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>34
ttctttgcgt tatgtctctg taactattat ctcttttaaa tt               42
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
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ctgcaattac aatagcagat                                        20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>36
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<210>37
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>37
caggccacgt tttgtcatgc tcaagtcacg tactcgccat  c               41
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>38
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<210>39
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>39
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<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>40
gctgaataaa ccgggtatta                                        20
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>41
gcctgcccta tgaaaacgat g                                      21
<210>42
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>42
caggccacgt tttgtcatgc cgtgatccac acgagtcata c                41
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>43
taaagctgct tcgggaacgt g                                      21
<210>44
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>44
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<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>45
atcggaagtc gctctatctt                                        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>46
cctccggccc ctgaatgcgg                                        20
<210>47
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>47
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<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>48
tgtcaccata agcagccaat g                                      21
<210>49
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>49
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<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>50
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<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>51
tgcaattggg gtcctcatcg g                                      21
<210>52
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>52
caggccacgt tttgtcatgc ttgaatggaa tgataacaca g                41
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>53
aaacgagaaa gttcttatct c                                      21
<210>54
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>54
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<210>55
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>55
tctacagaga ttcgcttgg                                         19
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>56
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<210>57
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>57
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<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>58
tgagtgttta cttcctcctt tatc                                   24
<210>59
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>59
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<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>60
ccttgatgac atagaagaag                                        20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>61
aacagaccca aytacattgg                                        20
<210>62
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>62
caggccacgt tttgtcatgc atgtactaca acagtactgg                  40
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>63
tatgacagtt cwgtgtttct gtc                                    23
<210>64
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>64
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<210>65
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>65
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<210>66
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>66
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<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>67
gagttttggc tggccaagca                                        20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>68
gggtactggc cggtcaggcc                                        20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>69
gagttttggc cggccaagca                                        20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>70
gggtgctggc tggccaagca                                        20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>71
caggccacgt tttgtcatgc                                        20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>72
ttctttgcgt tatgtctctg                                        20
<210>73
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>73
accgtagact catctctatg atg                                    23
<210>74
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>74
caggccacgt tttgtcatgc gaagctattc gtcacgttcg                  40
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>75
ttgcattaac tctggtgaat tctg                                   24
<210>76
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>76
ttctttgcgt tatgtctctg ctgtagaaaa tcctagctgg                  40
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>77
tagagggctg tcatgcaact                                        20
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>78
atgcctaaca tgcttaggat aatg                                   24
<210>79
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>79
caggccacgt tttgtcatgc tttctacagg ttagctaacg a                41
<210>80
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>80
tacattggct gtaacagctt gac                                    23
<210>81
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>81
ttctttgcgt tatgtctctg agcataagca gttgtagcat c                41
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>82
gtgagatggt catgtgtggc                                        20
<210>83
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>83
acaatgctgc caccgtgcta c                                      21
<210>84
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>84
caggccacgt tttgtcatgc cctcaaggaa caacattgcc                  40
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>85
tagcgcgagg gcagtttcac                                        20
<210>86
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>86
ttctttgcgt tatgtctctg ccgctagcca ttcgagcagg                  40
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>87
tcatcacgta gtcgcggtaa                                        20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>88
aagaatttga taagtaccac                                        20
<210>89
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>89
caggccacgt tttgtcatgc actcccttgg ttagagatgg                  40
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>90
tatgtatcac tgccttagcc                                        20
<210>91
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>91
ttctttgcgt tatgtctctg caatgctact tcatcattgt c                41
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>92
gcagcaattc attgagtatg                                        20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>93
aataagaatt tgataagtgc                                        20
<210>94
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>94
caggccacgt tttgtcatgc accttttcaa tcagaaatgg                  40
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>95
tgctttggct aatgcattgg                                        20
<210>96
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>96
ttctttgcgt tatgtctctg caatgctact tcgtcattgt c                41
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>97
ggtgcaattc actgagcatg                                        20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>98
agtatcactc cttgcaatgg                                        20
<210>99
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>99
caggccacgt tttgtcatgc atctcactac aaacggtgtc                  40
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>100
gttctttcat actccatgtc                                        20
<210>101
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>101
ttctttgcgt tatgtctctg tttgacaatg aacccatctg                  40
<210>102
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>102
gctgatgtca agtatgtgat                                        20
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>103
tcaatggctt atgccaatcc                                        20
<210>104
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>104
caggccacgt tttgtcatgc acaacaaatg gaagtaatgc                  40
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>105
caggtcactt ccaaatatcc                                        20
<210>106
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>106
ttctttgcgt tatgtctctg ctcgtcttaa ccacaaatcc                  40
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>107
ctaaaacggc aaaagtatgg                                        20
<210>108
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>108
tgcaattggg gtcctcatcg g                                      21
<210>109
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>109
caggccacgt tttgtcatgc ttgaatggaa tgataacaca g                41
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>110
aaacgagaaa gttcttatct c                                      21
<210>111
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<223>引物序列
<400>111
ttctttgcgt tatgtctctg gttctcgcca ttttccgttt c                41
<210>112
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>112
tctacagaga ttcgcttgg                                         19
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>113
agtcttatcc caatttggtc                                        20
<210>114
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>114
caggccacgt tttgtcatgc agagcaccga ttatcaccag                  40
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>115
aagcactgcc tgctgtacac                                        20
<210>116
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>116
ttctttgcgt tatgtctctg catgtcagct attatggagc                  40
<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>117
ttccacaaaa cagtaatagc                                        20
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>118
atcaccttta acccctttgg                                        20
<210>119
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>119
caggccacgt tttgtcatgc cggctttggt ttgagtggg                   39
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>120
tgcaactgct catagtacac                                        20
<210>121
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>121
ttctttgcgt tatgtctctg cgcggcacga gtaaaacggc                  40
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>122
tgcaccccaa cagtgaaacg                                        20
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>123
gaaatttata gagccgactc g                                      21
<210>124
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>124
caggccacgt tttgtcatgc gctgatatca ttgtacatgg                  40
<210>125
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>125
gttgaccata taatacgtct c                                      21
<210>126
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>126
ttctttgcgt tatgtctctg gctttccagg gcattctc                    38
<210>127
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>127
accgacaaaa cgtagtaaca                                        20
<210>128
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>128
caaggtgtga agagcctatt g                                      21
<210>129
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>129
catggtgcga agagtctatt g                                      21
<210>130
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>130
gtgaagagcc gccgtgtgct c                                      21
<210>131
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>131
ttctttgcgt tatgtctctg agtcctccgg cccctgaatg                  40
<210>132
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>132
caggccacgt tttgtcatgc aaacacggac acccaaagta g                41
<210>133
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>133
attgtcacca taagcagcc                                       19
<210>134
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>134
tatatattgt caccataagc                                      20
<210>135
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>135
gttaggatta gccgcattca                                      20
<210>136
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>136
gttggtccca tcccgcaatt                                      20
<210>137
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>137
agcaacttca tgtcyatggg                                      20
<210>138
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>138
caggccacgt tttgtcatgc cccatggatg agcccaccc                 39
<210>139
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>139
ttctttgcgt tatgtctctg gctggtgcac tctgaccacg                  40
<210>140
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>140
ttctttgcgt tatgtctctg gctggtgcac tcggacgacg                  40
<210>141
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>141
ttctttgcgt tatgtctctg gctgatgcac tctgaccacg                  40
<210>142
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>142
gtgcgcaggt agacggcctc                                        20
<210>143
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>143
gtacgcaggt agactgtctc                                        20
<210>144
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>144
gctttatctt cttttcgaag                                        20
<210>145
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>145
tctctatgtt gtcttcgaag                                        20
<210>146
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>146
gctttatctt ctcttcgaag                                        20
<210>147
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>147
caggccacgt tttgtcatgc                                        20
<210>148
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>148
ttctttgcgt tatgtctctg                                        20

Claims (88)

1.一种基于多重引物扩增的方法，其中所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包含至少第一和第二对靶序列富集引物和至少第一对靶序列扩增引物，所述靶序列扩增引物包含FSP和RSP，所述方法包括：
a.第一扩增反应，其使用
i)来自至少一种病原体的核酸作为模板，所述核酸包含来自所述病原体的至少一个靶序列；
ii)所述第一对靶序列富集引物与所述核酸杂交并且将所述至少一个靶序列包括在内；
iii)所述第二对靶序列富集引物与所述核酸杂交，并且将所述至少一个靶序列包括在内，所述第二对靶序列富集引物位于最接近至少一个靶序列位置，并且第二对靶序列富集引物的每一个在其5′末端包含对应于靶序列扩增引物的一个的序列的超级引物结合标志物；和
iv)对于所述第一扩增反应的扩增试剂和条件从而使第一扩增反应产生多个第一扩增产物，其中第一扩增产物的至少一个部分包含超级引物结合标志物的至少一个补体由此形成至少一个超级引物结合位点；和
b.第二扩增反应，其使用
i)包含所述至少一个超级引物结合位点的第一扩增产物的所述部分作为模板；
ii)所述第一对靶序列扩增引物结合于在第一扩增产物的所述部分上的所述超级引物结合位点；和
iii)用于所述第二扩增反应的扩增试剂和条件从而使第二扩增反应产生多个包含至少一个靶序列的第二扩增产物。
2.权利要求1的方法，其中所述第一对靶序列富集引物包含Ro和Fo引物，所述第二对靶序列富集引物包含Fi和Ri引物并且所述第一对靶序列扩增引物包含FSP和RSP。
3.权利要求2的方法，其中在Fi上的所述超级引物结合标志物与FSP的序列相同从而使FSP结合在所述Fi引物上的超级引物结合标志物的补体；在Ri上的超级引物结合标志物与RSP的序列相同从而使RSP结合在所述Ri引物上的超级引物结合标志物的补体。
4.权利要求1的方法，其中第一对靶序列富集引物的每一个的长度选自由下列的组成的组：10-40个核苷酸，10-30个核苷酸和10-20个核苷酸。
5.权利要求1的方法，其中第二对靶序列富集引物的每一个的长度选自由下列的组成的组：10-40个核苷酸，10-30个核苷酸和10-20个核苷酸。
6.权利要求1的方法，其中第一对靶序列富集引物的每一个的长度是10-20个核苷酸，第二对靶序列富集引物的每一个的长度是30到40个核苷酸。
7.权利要求1的方法，其中第一对靶序列扩增引物的每一个的长度是10-20个核苷酸，第二对靶序列富集引物的每一个的长度是30到40个核苷酸。
8.权利要求1的方法，其中所述靶序列富集引物以低浓度存在，而所述靶序列扩增引物以高浓度存在。
9.权利要求8的方法，其中所述低浓度是0.002μM到0.2μM的浓度，而所述高浓度是0.2μM到1.0μM的浓度。
10.权利要求1的方法，其中所述靶序列富集引物以不足以进行所述靶序列的指数扩增的浓度存在，而所述靶序列扩增引物以足以进行所述靶序列的指数扩增的浓度存在。
11.权利要求1的方法，其中以相同的浓度来使用靶序列富集引物的每一个。
12.权利要求1的方法，其中将所述靶序列富集引物的至少一个以比其它的靶序列富集引物更高的浓度进行使用。
13.权利要求1的方法，其中以相同的浓度来使用靶序列扩增引物的每一个。
14.权利要求1的方法，其中将所述靶序列扩增引物的至少一个以比其它的靶序列扩增引物更高的浓度进行使用。
15.权利要求14的方法，其中以所述更高浓度存在的所述靶序列扩增引物包含检测用工具。
16.权利要求1的方法，其中所述第一扩增反应的条件包含至少两个靶序列富集过程的完整的循环，并且所述第二扩增过程的条件包含靶序列扩增过程的至少两个完整循环。
17.权利要求16的方法，其中所述靶序列富集过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达0.5到1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5到1分钟，并且所述靶序列扩增过程包括下列条件用于扩增：在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒，和在72℃达15到30秒。
18.权利要求1的方法，其中所述第一扩增反应的条件包括靶序列富集过程的至少两个完整的循环，和选择性扩增过程的至少两个完整的循环，所述第二扩增过程的条件包括靶序列扩增过程的至少两个完整的循环。
19.权利要求18的方法，其中所述靶序列富集过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达0.5到1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5到1分钟，所述选择性扩增过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达15到30秒，和在70-72℃达1到2分钟，并且所述靶序列扩增过程包括下列条件用于扩增：在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒，和在72℃达15到30秒。
20.权利要求19的方法，其中所述选择性扩增偏向包含所述超级引物结合位点的第一扩增产物的产生。
21.权利要求19的方法，其中第一对靶序列富集引物的每一个的长度是10-20个核苷酸，并且第二对靶序列富集引物的每个的长度是30到40个核苷酸。
22.权利要求1的方法，其还包含三对或更多对的靶序列增加引物。
23.权利要求1的方法，其还包含两个或更多的靶序列扩增引物。
24.权利要求24的方法，其中所述病原体选自由下列组成的组：病毒和细菌。
25.权利要求24的方法，其中所述病原体是选自由下列组成的组中的病毒：腺病毒，流感病毒A，流感病毒B，副流感病毒类型1，副流感病毒类型3和呼吸道合胞病毒，SARS和肠道病毒，包括柯萨奇病毒A，柯萨奇病毒B，鼻病毒和艾柯病毒。
26.权利要求24的方法，其中所述病原体是细菌，其选自由支原体种类和衣原体种类组成的组。
27.权利要求24的方法，其中所述病原体通过第一和第二对靶序列富集引物的适当设计来进行选择。
28.权利要求1的方法，其中所述正向或反向超级引物的至少一个还包含检测用工具。
29.权利要求28的方法，其中所述检测用的工具选自由下列组成的组：化学元件，酶元件，荧光元件，或放射性标记元件。
30.权利要求1的方法，其还包含检测所述靶序列。
31.权利要求30的方法，其中所述检测方法是直接检测方法。
32.权利要求30的方法，其中所述检测方法包括：
a.提供检测寡核苷酸的至少一个组，检测寡核苷酸的每个组具有能够结合所述扩增产物中的特异性靶序列的核苷酸序列并且包含用于信号产生的第一工具；
b.用所述第二扩增产物接触并温育所述检测寡核苷酸；
c.刺激用于信号产生的第一工具以产生第一信号；和
d.检测所述第一信号。
33.权利要求32的方法，其中所述第一信号对于所述病原体是独特的，并且所述第一信号用于鉴定所述病原体。
34.权利要求32的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光标记，化学标记，酶标记，或放射性标记。
35.权利要求32的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光微球体。
36.权利要求30的方法，其中所述方法是间接检测方法。
37.一种基于多重引物扩增至少一个靶序列的方法，其中所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包括至少第一对的靶序列富集引物和至少第一对的靶序列扩增引物，所述靶序列扩增引物包括FSP和RSP，所述方法包括：
a.第一扩增反应，其使用
i)包含至少一个靶序列的核酸作为模板；
ii)所述第一对靶序列富集引物与所述核酸杂交并且将所述靶序列包括起来；第一对靶序列富集引物的每一个在其5′末端包含对应于靶序列扩增引物的一个的序列的超级引物结合标志物；和
iii)用于所述第一扩增反应的扩增试剂和条件，从而其使第一扩增反应产生多个第一扩增产物，其中第一扩增产物的至少一个部分包含超级引物结合标志物的至少一个补体由此形成至少一个超级引物结合位点；和
b.第二扩增反应，其使用
i)包含所述至少一个超级引物结合位点的第一扩增产物的所述部分作为模板；
ii)所述第一对靶序列扩增引物，其结合于在第一扩增产物的所述部分上的所述超级引物结合位点；和
iii)用于所述第二扩增反应的扩增试剂和条件，从而其使第二扩增反应产生多个包含所述靶序列的第二扩增产物。
38.权利要求37的方法，其中所述第一对靶序列富集引物包括Fi和Ri引物，并且所述第一对靶序列扩增引物包含FSP和RSP。
39.权利要求38的方法，其中在Fi上的所述超级引物结合标志物与FSP的序列相同，从而使所述FSP结合在所述Fi引物上的超级引物结合标志物的补体，且在Ri上的超级引物结合标志物与所述RSP的序列相同从而使所述RSP结合在所述Ri引物上的超级引物结合标志物的补体。
40.权利要求37的方法，其中第一对靶序列富集引物的每一个的长度选自由下列组成的组：10-40个核苷酸，10-30个核苷酸和10-20个核苷酸。
41.权利要求37的方法，其中所述靶序列富集引物以低浓度存在而所述靶序列扩增引物以高浓度存在。
42.权利要求41的方法，其中所述低浓度是0.002μM到0.2μM的浓度，而所述高浓度是0.2μM到1.0μM的浓度。
43.权利要求37的方法，其中所述靶序列富集引物以不足以进行所述靶序列的指数扩增的浓度存在，而所述靶序列扩增引物以足以进行所述靶序列的指数扩增的浓度存在。
44.权利要求37的方法，其中以相同的浓度来使用靶序列富集引物的每一个。
45.权利要求37的方法，其中将所述靶序列富集引物的至少一个以比其它的靶序列富集引物更高的浓度进行使用。
46.权利要求37的方法，其中以相同的浓度来使用靶序列扩增引物的每一个。
47.权利要求37的方法，其中将所述靶序列扩增引物的至少一个以比其它的靶序列扩增引物更高的浓度进行使用。
48.权利要求47的方法，其中以所述更高浓度存在的所述靶序列扩增引物包含检测用工具。
49.权利要求37的方法，其中所述第一扩增反应的条件包含至少两个靶序列富集过程的完整的循环，并且所述第二扩增过程的条件包含靶序列扩增过程的至少两个完整循环。
50.权利要求49的方法，其中所述靶序列富集过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达0.5到1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5到1分钟，并且所述靶序列扩增过程包括下列条件用于扩增：在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒，和在72℃达15到30秒。
51.权利要求37的方法，其中所述第一扩增反应的条件包括靶序列富集过程的至少两个完整的循环，和选择性扩增过程的至少两个完整的循环，所述第二扩增过程的条件包括靶序列扩增过程的至少两个完整的循环。
52.权利要求51的方法，其中所述靶序列富集过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达0.5到1分钟，在50-55℃达1-2.5分钟和在70-72℃达0.5到1分钟，所述选择性扩增过程包括下列条件用于扩增：在92-94℃达15到30秒，和在70-72℃达1到2分钟，并且所述靶序列扩增过程包括下列条件用于扩增：在94℃达15到30秒，在50-55℃达15到30秒，和在72℃达15到30秒。
53.权利要求52的方法，其中所述选择性扩增偏向包含所述超级引物结合位点的第一扩增产物的产生。
54.权利要求52的方法，其中第一对靶序列富集引物的每一个的长度是10-20个核苷酸，并且第二对靶序列富集引物的每个的长度是30到40个核苷酸。
55.权利要求37的方法，其还包含两个或更多靶序列扩增引物。
56.权利要求37的方法，其中所述病原体选自由下列组成的组：病毒和细菌。
57.权利要求37的方法，其中所述病原体是选自由下列组成的组中的病毒：腺病毒，流感病毒A，流感病毒B，副流感病毒类型1，副流感病毒类型3和呼吸道合胞病毒，SARS，和肠道病毒，包括柯萨奇病毒A，柯萨奇病毒B，鼻病毒和艾柯病毒。
58.权利要求37的方法，其中所述病原体是细菌，其选自由支原体种类和衣原体种类组成的组。
59.权利要求37的方法，其中所述病原体通过第一和第二对靶序列富集引物的适当设计来进行选择。
60.权利要求37的方法，其中所述正向或反向超级引物的至少一个还包含检测用工具。
61.权利要求60的方法，其中所述检测用的工具选自由下列组成的组：化学元件，酶元件，荧光元件，或放射性标记元件。
62.权利要求37的方法，其还包含检测所述靶序列。
63.权利要求62的方法，其中所述检测方法是直接检测方法。
64.权利要求62的方法，其中所述检测方法包括：
a.提供检测寡核苷酸的至少一个组，检测寡核苷酸的每个组具有能够结合所述扩增产物中的特异性靶序列的核苷酸序列并且包含用于信号产生的第一工具；
b.用所述第二扩增产物接触并温育所述检测寡核苷酸；
c.刺激用于信号产生的第一工具以产生第一信号；和
d.检测所述第一信号。
65.权利要求64的方法，其中所述第一信号对于所述病原体是独特的，并且所述第一信号用于鉴定所述病原体。
66.权利要求64的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光标记，化学标记，酶标记，或放射性标记。
67.权利要求64的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光微球体。
68.权利要求62的方法，其中所述方法是间接检测方法。
69.一种诊断受试者中疾病病原体存在的方法，所述方法包括：
a.从需要所述诊断的所述受试者提供样品，所述样品被怀疑包含所述疾病病原体；
b.从所述样品中分离核酸，所述核酸包含来自所述疾病病原体的靶序列；
c.使所述核酸进行权利要求1或37任一项的基于引物的扩增方法；
d.从所述疾病病原体中检测所述靶序列。
70.权利要求69的方法，其中疾病病原体选自由下列组成的组：病毒和细菌。
71.权利要求69的方法，其中所述疾病病原体是选自由下列组成的组中的病毒：腺病毒，流感病毒A，流感病毒B，副流感病毒类型1，副流感病毒类型3和呼吸道合胞病毒，SARS和肠道病毒，包括柯萨奇病毒A，柯萨奇病毒B，鼻病毒和艾柯病毒。
72.权利要求69的方法，其中所述疾病病原体是细菌，其选自由支原体种类和衣原体种类组成的组。
73.权利要求69的方法，其中所述检测方法是直接检测方法。
74.权利要求69的方法，其中所述检测方法包括：
a.提供检测寡核苷酸的至少一个组，检测寡核苷酸的每个组具有能够结合所述扩增产物中的特异性靶序列的核苷酸序列并且包含用于信号产生的第一工具；
b.用所述第二扩增产物接触并温育所述检测寡核苷酸；
c.刺激用于信号产生的第一工具以产生第一信号；和
d.检测所述第一信号。
75.权利要求74的方法，其中所述第一信号对于所述疾病病原体是独特的，并且所述第一信号用于鉴定所述疾病病原体。
76.权利要求74的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光标记，化学标记，酶标记，或放射性标记。
77.权利要求74的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光微球体。
78.权利要求69的方法，其中所述方法是间接检测方法。
79.一种用于差异诊断受试者中疾病病原体和第二疾病病原体的存在的方法，所述方法包括：
a.从需要所述诊断的所述受试者提供样品，所述样品被怀疑包含所述疾病病原体或第二疾病病原体；
b.从所述样品中分离核酸，所述核酸包含来自所述疾病病原体或第二疾病病原体或两者的靶序列；
c.使所述核酸进行权利要求1或38任一项的基于引物的扩增方法；
d.从所述疾病病原体或第二疾病病原体或两者中检测所述靶序列。
80.权利要求79的方法，其中疾病病原体或第二疾病病原体选自由下列组成的组：病毒和细菌。
81.权利要求79的方法，其中所述疾病病原体或第二疾病病原体是选自由下列组成的组中的病毒：腺病毒，流感病毒A，流感病毒B，副流感病毒类型1，副流感病毒类型3和呼吸道合胞病毒，SARS和肠道病毒，包括柯萨奇病毒A，柯萨奇病毒B，鼻病毒和艾柯病毒。
82.权利要求79的方法，其中所述疾病病原体或第二疾病病原体是细菌，其选自由支原体种类和衣原体种类组成的组。
83.权利要求79的方法，其中所述检测方法是直接检测方法。
84.权利要求79的方法，其中所述检测方法包括：
a.提供检测寡核苷酸的至少一个组，检测寡核苷酸的每个组具有能够结合所述扩增产物中的特异性靶序列的核苷酸序列并且包含用于信号产生的第一工具；
b.用所述第二扩增产物接触并温育所述检测寡核苷酸；
c.刺激用于信号产生的第一工具以产生第一信号；和
d.检测所述第一信号。
85.权利要求84的方法，其中所述第一信号对于所述疾病病原体和第二疾病病原体是独特的，并且所述第一信号用于鉴定所述病原体。
86.权利要求84的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光标记，化学标记，酶标记，或放射性标记。
87.权利要求84的方法，其中所述用于第一信号产生的工具是荧光微球体。
88.权利要求79的方法，其中所述方法是间接检测方法。
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