CN1500887A - 引物伸长反应检测方法、碱基种类判别方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种判别核酸碱基序列中的碱基种类的简便技术。包括：工序(a)，调制含有核酸、具备含有与上述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列引物、以及核苷酸的试料溶液；工序(b)，将该试料溶液置于发生伸长反应的条件下，在该条件下生成焦磷酸；工序(c)，使该试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+－焦磷酸酶的H+难透性膜表面接触的；工序(d)，在将上述H+－焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定上述H+难透性膜表面侧溶液或其内面侧溶液中至少任一侧的H+浓度；基于工序(d)的测定结果检测上述伸长反应的工序(e)；和基于工序(e)的检测结果判别上述核酸的碱基序列中的碱基种类的工序(f)。
Description
技术区域
本发明涉及检测引物(primer)伸长反应的伸长反应检测方法、判别核酸的碱基序列中的碱基种碱基种类判别方法、判别核酸的碱基序列中的碱基种碱基种类判别装置、焦磷酸的检测装置、核酸的检测方法以及试料溶液导入芯片(チツプ)。
背景技术
现有技术1
调查是否存在具有特定碱基序列的核酸的技术是非常重要的技术。例如在遗传病的诊断、对由细菌以及病毒等造成的食品污染的检测、细菌以及病毒等对人体的感染检测等中，是必需的技术。
已知重症复合型免疫不全症、家族性高胆固醇血症等遗传病是由特定遗传基因的缺损而引起的。因此，通过调查是否存在具有成为上述遗传病因的特定的碱基序列的遗传基因，就能诊断有无遗传病。
近年来，由大肠菌O157等造成的食品污染已成为社会问题。对由这样的细菌以及病毒造成的食品污染的检测是通过分析是否存在受疑细菌或病毒特有的DNA或RNA碱基序列，判断有无污染。对人体的感染检测也是一样的。
通常，在上述这种特定核酸的碱基序列的检测技术中，因为大多数情况下，试料中含有特定碱基序列的核酸是微量，所以要求检测感度非常高。现在，最常使用的检测技术是利用具有标的碱基序列的核酸的放大法的技术。例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等。通过这些核酸的放大法，大量增加试料中具有标的碱基序列的核酸，即可检测出具有标的碱基序列的核酸。上述放大法能很容易地对具有标的碱基序列的核酸放大。但是，检测具有受到放大的标的碱基序列的核酸的方法还有些不足之处。
最广泛使用的用于检测具有受到放大的标的碱基序列的核酸方法之一是通过电泳分离具有受到放大的标的碱基序列的核酸后，使用溴乙啶等荧光嵌入剂的方法。该方法简便，但另一方面，因为荧光嵌入剂是致癌物质，所以操作时要非常注意。
另外，作为其它的方法，可以举出点印迹法。点印迹法首先通过热处理使具有受到放大的标的碱基序列的双链DNA或RNA改性为单链DNA或RNA，并固定在尼龙等膜上。接着，在膜上，使经过放射性标识或荧光标识的核酸探测器与上述单链DNA或RNA进行特定反应的杂交。最后，通过检测放射性标识或荧光标识而检测具有受到放大的标的碱基序列的双链DNA或RNA。但是，在该方法中，当使用经放射性标识的核酸探测器时，通常要花1～5天左右的时间。另外，即使使用荧光标识核酸探测器时，也需要几小时～十几小时。而且，需要根据具有受到放大的标的碱基序列的核酸的不同，调制被标识的核酸探测器，所以是非常复杂的。
PCR法通常使用DNA聚合酶一边反复进行由引物开始的DNA伸长反应(以下称“引物伸长反应”)，一边对具有标的碱基序列的核酸进行放大的技术。使用引物伸长反应的应用不局限于检测具有标的碱基序列的核酸。
近年来，渐渐可知，被称为SNP(Single Nucleotide Polymorphism：单核苷酸多态型)中的单碱基对的多型易于导致糖尿病或高血压等疾病或易于对药效等造成影响。因此，分析每个人的SNP类型的所谓SNP定型(typing)技术很受重视。另外，例如已知，染色体DNA中的碱基序列中，仅单碱基对的置换都会导致危重疾病。因此，有无这种单碱基对的置换就变得格外重要。SNP定型技术在判别是否存在这样的单碱基对的置换中是非常有效的技术。
现在，各种各样的SNP定型技术已被开发或已付诸实施。在这些技术中，最简便的技术之一是利用引物伸长反应。在该技术中，通过判定是否发生引物伸长反应，进行SNP定型。
现在，利用引物伸长反应的SNP部位的碱基种类判别技术分为两大类。一种是利用使用4种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的引物伸长反应的方法，另一种是利用只使用一种dNTP或ddNTP的引物伸长反应的方法。
下面，一边参照图19和图20一边说明利用使用4种dNTP的引物伸长反应的方法。在该方法中，使用具有与邻近标的DNA的SNP部位的碱基序列互补的碱基序列、根据标的DNA的SNP部位的碱基种类进行伸长反应时会产生差异的引物(以下称为“分型引物”(typingprimer))。以下为其具体实施方式。
首先，在图19(a)所示工序中，调制含有具备SNP部位S1的标的DNA1的试料溶液。同样，在图20(a)所示的工序中，调制含有具备SNP部位S2的标的DNA2的试料溶液。
接着，在图19(b)所示的工序中，通过对DNA1热改性等形成单链DNA3和单链DNA4。同样，在图20(b)所示的工序中，通过对DNA2热改性等形成单链DNA5和单链DNA6。
接着，在图19(c)所示的工序中，将分型引物7、DNA聚合酶8以及4种dNTP添加到含有单链DNA3以及4的试料溶液中。同样，在图20(c)所示的工序中，将分型引物7、DNA聚合酶8以及4种dNTP添加到含有单链DNA5以及6的试料溶液中。在此，除其3′末端的碱基(此处为“胸腺嘧啶”、以下记为“T”)以外，分型引物7与比单链DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端侧的区域为完全杂交。
在图19(c)所示的工序中，SNP部位S1为腺膘呤(以下记为A)的单链DNA4与分型引物7完全杂交。因此，在图19(d)所示的工序中，产生引物伸长反应，通过DNA聚合酶8消耗dNTP。
另一方面，在图20(c)所示的工序中，只有SNP部位S2为鸟膘呤(以下记为G)单链DNA6与分型引物7的3′末端的碱基(T)不能杂交。因此，在图20(d)所示的工序中，难以产生正常引物伸长反应。因此，几乎没有消耗dNTP。
因此，通过分析这些伸长反应的进行差异，就能判别SNP部位的碱基。这样，就能根据是否产生引物伸长反应，进行SNP部位的碱基判别。用该方法，即使SNP部位的碱基有3种或4种可能性，只要准备有分别与之对应的分型引物同样能够进行分析。
关于分型引物，除上述的3′末端碱基与DNA的SNP部位的碱基对应的引物以外，也开发有其它分型引物。例如，可以举出由东洋纺绩(株)开发的ASP(Allele Specific Primer)等(参照非专利文献1)。ASP是从其3′末端数第2位的碱基对应于SNP部位、而且从其3′末端数第3位的碱基与标的碱基必须为非互补方式的引物。
已知，通过同时使用ASP与校正活性的强α型DNA聚合酶，由上述图19以及图20所示的方法也能正确判别SNP部位的碱基种类。即，在与从ASP的3′末端数第2位的碱基互补的情况下，SNP部位可产生良好的伸长反应；在不互补的情况下，不会产生正常的伸长反应。另外，已知，在产生伸长反应的情况下和不产生伸长反应的情况下，伸长反应进行差异与上述图19以及图20所示的方法相比要大。
接着，一边参照图21以及图22一边说明使用1种dNTP(或ddNTP)利用引物伸长反应的方法。在该方法中，使用在标的单链DNA中与SNP部位邻接区域杂交的方式设计的引物进行伸长反应。即引物序列中不存在与SNP部位对应的部位。以下说明具体实施工序。
首先，在图21(a)所示的工序中，调制含有具备SNP部位S1的标的DNA1的试料溶液。同样，在图22(a)所示工序中，调制含有具备SNP部位S2的标的DNA2的试料溶液。
接着，在图21(b)所示的工序中，通过对DNA1热改性等形成单链DNA3以及4。同样，在图22(b)所示的工序中，通过对DNA2热改性等形成单链DNA5以及6。
接着，在图21(c)所示的工序中，将引物9、DNA聚合酶8以及dCTP(或ddCTP)添加到含有单链DNA3以及4的试料溶液中。同样，在图22(c)所示的工序中，将引物9、DNA聚合酶8以及dCTP(或ddCTP)添加到含有单链DNA5以及6的试料溶液中。在此，引物9与比单链DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端侧的区域为完全杂交。因此，单链DNA4、6与引物9完全杂交。
接着，在图21(d)所示的工序中，单链DNA4的SNP部位S1为A、只供给dCTP(或ddCTP)，所以不产生引物伸长反应。因此，通过DNA聚合酶8几乎没有消耗dCTP(或ddCTP)。
另一方面，在图22(d)所示的工序中，单链DNA6的SNP部位S2为G，通过供给dCTP(或ddCTP)产生正常的引物伸长反应。因此，通过DNA聚合酶8消耗dCTP(或ddCTP)。
另外，当SNP部位的碱基有三种或四种可能性时，只要准备有分别与之对应的dNTP或ddNTP，同样能够进行分析。
这样，只使用1种dNTP或ddNTP的方法与使用所有上述4种dNTP的方法不同，使用dNTP时通常为一个到几个碱基，使用ddNTP时只向引物附加单碱基。因此，检测伸长反应进行差异是非常困难的。因此，在以下所示的专利文献1以及2中，为了检测伸长反应进行差异，使用将随引物伸长反应进行而生成的焦磷酸转换为ATP、然后利用虫荧光素酶反应测定焦磷酸量的方法。作为只使用1种dNTP的方法的优点，可以举出通过引物的设计的办法、通过反复进行以图21或图22所示的各工序为标准的工序不仅能判别SNP部位、而且能判别SNP部位附近的碱基序列的优点。
利用上述引物伸长反应的SNP部位碱基判别技术有多种，在任一SNP部位碱基判别技术中，共通之处在于，都是分析引物伸长反应进行差异、以进行SNP部位碱基判别。
这样的SNP部位碱基判别技术不只应用于所谓SNP部位，也可用于所期望的特定碱基的判别，这是非常有用的技术。在不远的将来，很有可能用于大大小小、各种规模的医院的日常应用中。因此，有必要发明能够更安全更正确地分析引物伸长反应差异的方法。
现有技术2
已知，焦磷酸与细胞内的酶反应密切相关。例如在蛋白质的合成过程中，在氨基酸经氨酰基腺苷酸形成氨酰基tRNA的反应中生成焦磷酸。另外，例如可在植物等中发现的淀粉合成过程中，通过葡萄糖-1-磷酸和ATP反应生成ADP-葡萄糖时，生成焦磷酸。除此以外，已知多种酶反应与焦磷酸有关。因此，定量检测焦磷酸的技术在分析细胞状态或上述酶反应等方面是非常重要的技术。
作为现有焦磷酸检测方法，已知有Grindley等人所用的化学方法(参照非专利文献2)。但在该方法中使用浓硫酸，所以非常危险。
在专利文献3中揭示有不使用浓硫酸等危险药品、而是利用酶的三种焦磷酸检测方法。对此在下文进行说明。
方法1是在磷酸烯醇丙酮酸以及磷酸腺苷的存在下、使焦磷酸与丙酮酸正磷酸盐二激酶作用的方法。因为通过该反应生成丙酮酸，所以通过测定丙酮酸量能算出焦磷酸量。另外，测定丙酮酸量的方法有两种提案。一种是利用乳酸脱氢酶的催化作用而用NADH还原丙酮酸时，对NADH的减少进行比色定量的方法。另一种是将丙·酮酸化酶与生成的丙酮酸作用而生成的过氧化氢引入色素而比色定量的方法。
方法2是在胞苷二磷酸甘油的存在下、使焦磷酸与甘油-3-胞苷磷酸酯·移酶作用的方法。通过该反应生成甘油三磷酸。因此通过测定甘油三磷酸的生成量就能算出焦磷酸量。另外，测定甘油三磷酸量的方法有两种。一种是利用甘油-3-磷酸酯脱氢酶的催化作用而用NAD(P)氧化甘油三磷酸时，对NAD(P)H的增加进行比色定量的方法。另一种是将甘油-3-磷酸酯氧化酶与生成的甘油三磷酸作用而生成的过氧化氢引入色素而比色定量的方法。
方法3是在胞苷二磷酸核糖醇的存在下、使焦磷酸与核糖醇-5-胞苷磷酸酯转移酶作用的方法。通过该反应生成D-核糖醇-5-磷酸，所以通过测定其生成量可算出焦磷酸量。另外，有人提出测定D-核糖醇-5-磷酸的方法是：在NAD(或NADP)存在下，通过核糖醇-5-磷酸酯脱氢酶的作用，NADH(或NADPH)的增加进行比色定量的方法。
非专利文献1
东洋纺织(株)网站，平成14年10月1日检索URL(http：//www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product/custom/snps/snps.html)
专利文献1：特表2001-506864号公报(摘要栏)
专利文献2：特表2001-501092号公报(摘要栏)
非专利文献2：G.B.Grindley and C.A.Nichel，Anal.Biochem，.vol33.p114(1970)
专利文献3：特开昭61-12300号公报。
发明内容
如上述现有技术1中所述，利用引物伸长反应的SNP部位的碱基种类的判别技术有多种，在任一SNP部位碱基判别技术中，通过分析引物伸长反应的进行差异来判别SNP部位的碱基种类，在这一点上是共通的。
分析引物伸长反应差异的方法有两种。一种是利用PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等标的碱基序列的放大法和核酸检测技术的技术。即，作为引物的一种，利用上述分型引物放大含有SNP部位的碱基序列。其结果是，当分型引物的3′末端碱基与分析对象SNP部位互补时，具有标的碱基序列的核酸可很好地被放大；但是在不互补的情况下，核酸难以被放大。因此，使用荧光嵌入剂等标识物质，通过测定目的碱基序列断片量，就能判别SNP部位的碱基种类。但是，如上所述，荧光嵌入剂是致癌物质，所以需要非常危险的操作，因此是不合适的。
另一种是利用PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等标的碱基序列的放大法和焦磷酸检测技术的技术。即，作为引物的一种，与上述技术一样，也利用上述分型引物放大含有SNP部位的碱基序列，但该方法不是通过检测核酸而是通过检测随引物伸长而生成的焦磷酸进行标的碱基序列的放大量分析，即SNP部位的碱基种类的判别。作为此时所用的焦磷酸检测方法，已知有将焦磷酸转换为ATP、然后利用虫荧光素酶反应进行测定的方法。但是，当引物伸长反应中使用dATP时，dATP与ATP一样成为虫荧光素酶反应的基质。因此，不能正确地判别SNP部位的碱基种类。因此，有必要采用特殊的dATP类似体以代替dATP用作DNA聚合酶的基质，且该基质应不与虫荧光素酶反应，这是不可取的。另外，该方法与上述方法不同，只使用分型引物，分析由此引发的引物伸长反应，也能判别SNP部位的碱基。
另外，如上述现有技术2所述，即使在其它焦磷酸的检测技术中，也需要多种酶、试剂等，导致成本增加、工序复杂化，这是不可取的。
本发明就是为解决上述问题，提供检测引物伸长反应的简便技术、判别核酸碱基序列中的碱基种类的简便技术以及核酸的检测技术。
本发明的检测引物伸长反应的伸长反应检测方法包括：调制含有核酸、具备含有与上述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液的工序(a)；将上述试料溶液置于发生上述伸长反应的条件下，在发生上述伸长反应的情况下生成焦磷酸的工序(b)；使上述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触的工序(c)；在将上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定上述H+难透性膜表面侧溶液或上述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一方的H+浓度的工序(d)；以及基于工序(d)的测定结果，检测上述伸长反应的工序(e)。
本发明的判别核酸碱基序列中的碱基种类的碱基种类判别方法包括：调制含有核酸、具备含有与上述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液的工序(a)；将上述试料溶液置于可发生上述引物伸长反应的条件下，在发生上述伸长反应的情况下生成焦磷酸的工序(b)；使上述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触的工序(c)；在将上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定上述H+难透性膜表面侧溶液或上述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一侧的H+浓度的工序(d)；基于工序(d)的测定结果，检测上述伸长反应的工序(e)；以及基于工序(e)的检测结果判别上述核酸的碱基序列中的碱基种类的工序(f)。
作为判别核酸的碱基序列中的碱基的方法，例如有一种如下所述的方法，即：当使用具有与欲判别的碱基的3′末端侧邻接的碱基序列完全互补的序列的引物、以及与欲判别的碱基的预想碱基种类互补的dNTP进行引物伸长反应时，通过引物伸长反应进行的程度，判别欲判别碱基的碱基种类。另外还有一种如下所述的方法，即：当使用具有与含有欲判别碱基的碱基序列互补的碱基序列、且同时使用4种dNTP进行引物伸长反应时，采用根据欲判别的碱基的碱基种类所进行的引物伸长反应的进行程度会产生差别的引物。无论哪一种方法，共同点在于，都是根据引物伸长反应进行的程度来判别特定的碱基的碱基种类。在本发明中，可通过检测由引物伸长反应生成的焦磷酸分析出引物伸长反应所进行的程度。因此，能判别核酸碱基序列中的碱基种类。本说明书中所说的“核酸的碱基序列中的碱基种类的判别”可以举出：例如判别DNA的SNP部位是否为特定的碱基，SNP部位的碱基种类的决定；是否存在突变部位；突变部位的决定以及突变部位的碱基种类的决定。
在自然界中，H+-焦磷酸酶具有如下的性质，即：该焦磷酸水解活性部位以露出在液泡膜的外侧(表面侧)的方式而被保持在液泡膜上，随着由1分子焦磷酸生成2分子磷酸的水解反应，由液泡膜的外侧向液泡膜的内侧(内面侧)输送H+。因此，通过H+-焦磷酸酶的酶反应，液泡膜内部H+浓度增大，而液泡膜外部H+浓度减少。根据本发明，在露出有H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位的第一区域，在进行伸长反应时，通过贮留含有焦磷酸的试料溶液，使得在进行伸长反应时由第一区域向第二区域输送H+，从而使液泡膜的表面侧和内面侧的H+浓度产生变化。因此，通过测定表面侧和内面侧的任一方的H+浓度，可检测试料溶液中的焦磷酸量。因此，当采用通过检测随着引物的伸长反应而生成的焦磷酸而判别核酸的碱基序列中的碱基种类的本发明的方法时，在焦磷酸的检测中，不需要很多种酶和试剂等，工序简单、成本降低。
例如，在工序(d)中，测定上述表面侧溶液的H+浓度与工序(b)之后、工序(c)之前的上述试料溶液的H+浓度之差。另外，在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，可检测上述伸长反应。当上述碱基种类的判别是SNP部位的碱基种类判别时，上述对照值可使用上述SNP部位没有变异的核酸作为上述核酸进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的测定结果。
另外，例如可在工序(d)中检测上述内面侧溶液的H+浓度，在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，检测上述伸长反应。当上述碱基的判别是SNP部位的碱基的判别时，可在工序(a)中使用作为上述核苷酸的一种核苷酸，上述对照值为使用与上述SNP部位的碱基种类不同的核酸作为上述核酸进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的测定结果。
在工序(d)中也可以采用光学方法测定H+的浓度。此时，例如，可将pH敏性色素或膜电位敏性色素添加到上述表面侧溶液和上述内面侧溶液中的至少任一方中，通过测定上述色素的光学反馈性，测定H+浓度。作为上述pH敏性色素，可以举出例如吖啶橙。作为膜电位敏性色素，可以举出例如OksorV(ォクソ一ルV)。
在工序(d)中也可以采用电学方法测定H+的浓度。
伸长反应例如也可以是根据PCR法的伸长反应。
判别本发明的核酸的碱基序列中的碱基种类的碱基种类判别装置的结构特点为，具有引物伸长反应中进行必要的温度调节的反应部和检测随着上述引物伸长反应而生成的焦磷酸的焦磷酸检测部；上述反应部具有用于贮留溶液的反应用贮留区域；上述焦磷酸检测部具有用于贮留溶液的检测用贮留区域、将上述检测用贮留区域分成第一区域和第二区域的H+难透性膜、用于测定贮留在第一区域和第二区域至少任一方的区域中的溶液的H+浓度的测定机构，H+难透性膜具有贯穿膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；在上述焦磷酸检测部中，由上述反应部送出的反应溶液贮留于第一区域。
作为判别特定碱基的碱基种类的方法，例如有一种如下所述的方法：即，当使用具有与欲判别的碱基的3′末端侧邻接的碱基序列完全互补的序列的引物和与欲判别的碱基的预想碱基种类互补的dNTP进行引物伸长反应时，通过引物伸长反应进行的程度，判别欲判别碱基的碱基种类。另外还有一种如下所述的方法，即：当使用具有与含有欲判别碱基的碱基序列互补的碱基序列、且同时使用4种dNTP进行引物伸长反应时，采用根据欲判别的碱基的碱基种类所进行的引物伸长反应的进行程度会产生差别的引物。无论哪一种方法，共同点在于，都是根据引物伸长反应进行的程度来判别特定的碱基的碱基种类。当发生引物伸长反应时将生成焦磷酸。根据本发明的碱基种类判别装置，可通过测定引物伸长反应生成的焦磷酸分析出引物伸长反应所进行的程度。因此，能判别特定碱基的碱基种类。
另外，欲判别试料溶液中是否存在具有特定碱基序列的核酸时，当引物伸长反应进行时，就可知溶液中存在着具有与引物互补的碱基序列的核酸。相反，如果引物伸长反应几乎不进行，就可知溶液中不存在具有与引物互补的碱基序列的核酸。这样，使用本发明的碱基种类判别装置，也能判别试料溶液中是否存在具有特定碱基序列的核酸，即也能检测特定的核酸。
上述测定机构为例如可用光学方法测定H+浓度的结构。另外，上述测定机构为例如可用电学方法测定H+浓度的结构。
上述碱基种类判别装置也可以是还设有控制上述反应部以及上述焦磷酸检测部、对由上述测定机构测定的结果进行分析的分析机构的结构。
上述碱基种类判别装置也可以是还设有能插入具有上述反应用贮留区域以及上述检测用贮留区域的芯片的插槽的结构。
本发明的焦磷酸检测装置设有容器、将上述容器内部分成第一区域和第二区域的H+难透性膜、与贮留于第一区域的溶液相接触的电极、与贮留于第二区域的溶液相接触的H+敏性电极，H+难透性膜具有贯穿内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的结构。
本发明的具有特定碱基序列的核酸的检测方法包括：调制含有试料、具备含有与上述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液的工序(a)；将上述试料溶液置于可发生上述引物伸长反应的条件下，在发生所述伸长反应的情况下生成焦磷酸的工序(b)；使上述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触的工序(c)；在将上述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定上述丁难透性膜表面侧溶液或上述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一侧的H+浓度的工序(d)；基于工序(d)的测定结果，检测上述伸长反应的工序(e)；以及基于工序(e)的检测结果检测上述核酸的工序(f)。
引物与具有互补的碱基序列的核酸杂交，通过引物伸长反应而伸长。产生伸长反应时生成焦磷酸。根据本发明，即通过检测焦磷酸量、通过具体地测定H+浓度就能分析引物伸长反应的进行程度。当引物伸长反应进行时，就可知试料溶液中存在具有与引物互补的碱基序列的核酸。相反，如果引物伸长反应几乎不能进行，就可知试料溶液中几乎不存在具有与引物互补的碱基序列的核酸。这样，就能判别溶液中是否存在具有特定碱基序列的核酸。
例如，在工序(d)中，测定上述表面侧溶液的H+浓度与工序(b)之后、工序(c)之前的上述试料溶液的H+浓度之差。另外，例如可在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，检测上述伸长反应。这时，上述对照值为使用不含核酸的上述试料进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的测定结果。
在工序(d)中可用光学方法测定H+的浓度。这时，例如，可将pH敏性色素或膜电位敏性色素添加到表面侧溶液和内面侧溶液中的至少任一方中，通过测定上述色素的光学反馈性，测定H+浓度。作为上述pH敏性色素，例如可以举出吖啶橙。作为膜电位敏性色素，例如可以举出OksorV。
另外，在工序(d)中可采用电学方法测定H+的浓度。
上述伸长反应例如也可是根据PCR法的伸长反应。
本发明的试料溶液导入芯片的结构为，设有用于进行引物伸长反应的反应槽；用于检测焦磷酸的焦磷酸检测槽；用于连接上述反应槽和上述焦磷酸检测槽的通路。
另外，上述通路可开关。这时可很容易地将反应槽和焦磷酸检测槽分开。因此，可以一个芯片进行反应温度条件相互不同的引物伸长反应和焦磷酸的检测。
上述焦磷酸检测槽优选具有由H+难透性膜分离的第一区域和第二区域；上述H+难透性膜具有贯穿膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在第一区域的H+-焦磷酸酶；在上述焦磷酸检测槽中，从上述反应槽经上述通路送出的反应溶液贮留于第一区域的结构。
向焦磷检测槽内注入试料溶液时，在试料溶液中存在焦磷酸的情况下，发生H+-焦磷酸酶的酶反应，由膜隔开的第二区域内H+浓度增大，在第一区域内H+浓度减少。因此，通过电极和H+敏性电极，能通过电学方法测定H+浓度、并检测出焦磷酸量。
本发明可提供检测引物伸长反应的简便技术、判别核酸碱基序列中的碱基种类的简便技术、检测焦磷酸的简便技术以及检测具有特定碱基序列的核酸的简便技术。
附图说明
图1为实施方式1的试料中的标的DNA的SNP部位的碱基种类判别方法的工序示意图。
图2为实施方式1的试料中的标的DNA的SNP部位的碱基种类判别方法的工序示意图。
图3为H+-焦磷酸酶的示意图。
图4为焦磷酸的检测方法的示意图。
图5为焦磷酸的检测装置的示意图。
图6为实施方式1的碱基种类判别装置的示意图。
图7(a)为实施方式1的芯片的俯视图，图7(b)为沿图7所示的X-X线的剖面图。
图8为实施方式1其它芯片的俯视图。
图9为实施方式1另一芯片的立体示意图。
图10为检测实施方式2的试料中是否含有具有特定碱基序列的DNA的方法的工序示意图。
图11为焦磷酸钠的浓度与540nm荧光强度变化的关系曲线图。
图12为焦磷酸钠的浓度与639nm的荧光强度变化的关系曲线图。
图13为焦磷酸钠的浓度与pH值的关系曲线图。
图14(a)为λDNA的特定碱基序列完全杂交得到的两种引物C和D的示意图，图14(b)为PCR反应液G和H的组成表，图14(c)为进行PCR反应的反应温度条件的流程图。
图15(a)为分别在PCR反应液G和H中混合H+-焦磷酸酶前后的荧光强度变化率的曲线图，(b)为荧光强度变化率表达式。
图16(a)为野生型λDNA、变异型λDNA以及分型引物的示意图，图16(b)为PCR反应液I和J的组成表，图16(c)为进行PCR反应的反应温度条件的流程图。
图17为PCR反应液I和J的各自混合前后的荧光强度变化率示意图。
图18(a)为引物示意图，图18(b)为PCR反应液K和L的组成表，图18(c)为进行PCR反应的反应温度条件的流程图。
图19为利用现有引物伸长反应的SNP部位的碱基种类判别技术的工序示意图。
图20为利用现有引物伸长反应的SNP部位的碱基种类判别技术的工序示意图。
图21为利用现有引物伸长反应的SNP部位的碱基种类判别技术的工序示意图。
图22为利用现有引物伸长反应的SNP部位的碱基种类判别技术的工序示意图。
符号说明
1、2：DNA；3、4、5、6：单链DNA；7：分型引物；8：DNA聚合酶；10：焦磷酸；11：H+-焦磷酸酶；12：磷酸；13：液泡膜；31：反应容器；32：试料溶液；33：膜小胞；34：容器35：电极；36：内部槽；37：膜；38：H+敏性电极；39：内部区域(第二区域)；50：焦磷酸测定装置；51：反应机构；51a：反应部；51b：焦磷酸测定部；52：分析机构；53、53a、53b、90：芯片；60：碱基种类判别装置；70：样品注入口；71：DNA萃取槽；72：DNA精制槽；73：PCR槽；74a、74b、74c：通路；75：开关部件；91：样品导入部；91a：样品导入槽；91b：DNA萃取柱；92：DNA精制部；92a：DNA精制槽；92b：DNA精制柱；93：PCR部；93a：PCR槽；93b：隔离部件；100：试料溶液；101：引物；102：单链DNA。
具体实施方式
以下一边参照图一边说明本发明的实施方式。另外，本发明说明书中所述的DNA、RNA等核酸没有特殊说明时则指双链。
(实施方式1)
在本实施方式中，说明判别试料中标的DNA的SNP部位的碱基种类的方法。一边参照图1以及图2一边说明使用4种dNTP利用引物伸长反应(例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等放大反应)的方法。图1以及图2为判别本实施方式的试料中的标的DNA的SNP部位的碱基种类的方法的工序示意图。
在本实施方式的方法中，使用与含有标的DNA的SNP部位的碱基序列进行实质性互补结合的、且根据标的DNA的SNP部位的碱基种类伸长反应进行会产生差异的引物(以下称“分型引物”)。另外，在本实施方式中，作用有分型引物的一方的单链状态的标的DNA中的SNP部位碱基有可能是A或G，如果是G的情况，引物伸长反应不进行，因此例示中为设计为A的情况下使用分型引物进行伸长反应。
首先，用图1(a)所示工序调制含有具备SNP部位S1的标的DNA1、分型引物7、DNA聚合酶8以及4种dNTP的试料溶液。同样，用图2(a)所示工序调制含有具备SNP部位S2的标的DNA2、分型引物7、DNA聚合酶8以及4种dNTP的试料溶液。在此，分型引物7除其3′末端的碱基(此处为“胸腺嘧啶”、以下记为“T”)以外，被设计为与比单链DNA4以及6的SNP部位更靠近3′末端侧的区域完全杂交。另外，本实施方式所用的DNA聚合酶8一般使用公知的具有用于PCR等时的耐热性的酶。
接着，在图1(b)所示的工序中，对试料溶液加温，对DNA1进行热改性，从而形成单链DNA3和4。同样，在图2(b)所示工序中，加温试料溶液，对DNA2进行热改性，从而形成单链DNA5和6。
而在图1(c)所示的工序中，冷却试料溶液，单链DNA4与分型引物7杂交。因为单链DNA4的SNP部位S1为腺膘呤(以下记为A)，所以单链DNA4与分型引物7完全杂交。同样，在图2(c)所示工序中，冷却试料溶液，单链DNA6与分型引物7杂交。因为单链DNA6的SNP部位S2为鸟膘呤(以下记为G)，所以单链DNA4中只有其3′末端的碱基(T)未与分型引物7杂交。
接着，在图1(d)所示工序中，调节试料溶液的温度至最适于引物伸长反应的温度。分型引物7与单链DNA4完全杂交。因此，产生引物伸长反应，通过DNA聚合酶8消耗dNTP、生成焦磷酸。
另一方面，在图2(d)所示工序中，调节试料溶液的温度至最适于引物伸长反应的温度。但是，分型引物7为不与单链DNA6的3′末端的碱基(T)杂交的状态。因此，难以产生正常的引物伸长反应。因此，几乎没有消耗dNTP，也几乎没有生成焦磷酸。
接着，通过反复进行从上述图1(b)～(d)所示工序以及从图2(b)～(d)所示工序，反复进行引物伸长反应。由此，图1(d)以及图2(d)所示引物伸长反应进行差异非常显著。
另外，不采用本实施方式的方法，也可采用将分型引物7作为PCR反应时所用2个引物中的一个使用，连同另一个引物，进行PCR反应。因此，引物伸长反应进行差异呈指数函数地扩大。另外，也适合使用PCR法以外的放大反应。
最后，通过焦磷酸的定量检测分析图1(d)以及图2(d)所示的引物伸长反应的进行差异。由此，能判别SNP部位的碱基种类。接着，一边参照图3一边说明本实施方式的焦磷酸的定量检测方法。
在本实施方式中，为了检测焦磷酸而使用H+-焦磷酸酶。H+-焦磷酸酶是通常存在于植物的液泡膜等中的膜蛋白质。图3为存在于植物液泡膜内的状态下的H+-焦磷酸酶的示意图。
如图3所示，H+-焦磷酸酶11具有随着由1分子的焦磷酸10生成2分子的磷酸12的水解反应、不使H+通过或使之难以通过液泡膜13的外侧(表面13a侧)向液泡膜13的内侧(内13b侧)输送H+的性质。因此，通过H+-焦磷酸酶的酶反应，液泡膜内部H+浓度增大，液泡膜外部H+浓度减少。
在本实施方式中，利用H+-焦磷酸酶的上述性质以及膜蛋白质这样的形态，进行焦磷酸的检测。即，用保持H+-焦磷酸酶的膜划分区域，测定任何一方H+浓度的变化，由此能检测供给H+-焦磷酸酶水解的焦磷酸量。这样，在本实施方式的方法中，通过检测与H+焦磷酸酶作用直接相关的H+浓度变化，进行焦磷酸的检测，所以能简便且高灵敏度地进行检测。另外，为了进行上述检测，必要条件是将H+输送源区域与H+输送目的区域分离，H+-焦磷酸酶为膜蛋白质，由此可将该形态用于区域分离。这能简化检测。
在本实施方式中，使含有焦磷酸的试料溶液与为在由植物细胞等离析出的液泡膜内的状态下的H+-焦磷酸酶接触。然后，测定液泡膜内侧或液泡膜外侧的H+浓度的变化。液泡膜内侧或液泡膜外侧的H+浓度的变化如下述实施例所述，因H+浓度变化与试料溶液中的焦磷酸量相关，所以通过H+浓度变化测定，可检测试料溶液中的焦磷酸量。焦磷酸量多的试料溶液是引物伸长反应进行的试料溶液，焦磷酸量少的试料溶液是引物伸长反应难以进行的试料溶液。即，根据引物伸长反应进行差异，可判别SNP部位的碱基种类。例如，比较图1(d)和图2(d)的溶液后可知，图1(d)一方可比图2(d)一方检测出更多的焦磷酸量。根据该结果，可判别DNA4的SNP部位S1是与引物7的3′末端碱基T互补的碱基A。而且，可判别DNA6的SNP部位S2不是与引物7的3′末端碱基T互补的碱基A。在本实施方式中，因为可知SNP部位的碱基是A或G，所以可确定DNA6的SNP部位S2是G。
另外，通过H+浓度的变化是否达到规定值可确定是否有焦磷酸存在，根据焦磷酸的有无可确定是否有引物伸长反应进行。在本发明说明书中，将通过H+浓度的变化是否达到规定值来决定焦磷酸是否存在的检测称为焦磷酸的定性检测。而将焦磷酸量值(例如浓度)的检测称为焦磷酸的定量检测。
根据引物伸长反应是否进行、即焦磷酸的定性检测，说明判别试料中所含SNP部位是否为与所用引物相应的碱基种类的情况。例如，根据图1(d)，判别引物伸长反应进行，可决定SNP部位是与所用引物3′末端的碱基T互补的碱基A。根据图2(d)，判别引物伸长反应没有进行，可决定SNP部位不是与所用引物的3′末端的碱基T互补的碱基A。在本实施方式中，如上所述，可知SNP部位的碱基可能是A或G，所以在图2(d)中，通过判别SNP部位的碱基不是A，而剩下的可能性就为G，就可由此决定SNP部位的碱基种类。
另外，如本实施方式所述，即使没有预先特定SNP部位的碱基为2种，使用多种引物进行通过判别上述引物的伸长反应有否进行而判别试料中含有的SNP部位是否对应所用引物的碱基的操作，由此也能最终决定SNP部位的碱基。
在本发明说明书中的“核酸的碱基序列中的碱基的判别”包括SNP部位的碱基是否为特定的碱基的判别和SNP部位的碱基种类的决定。
作为测定H+浓度变化的方法，可以举出将H+浓度变化转换为光学变化而测定的方法和电学测定方法。作为将H+浓度变化转换为光学变化而测定的方法，可以举出使用pH试纸或pH敏性色素、膜电位敏性色素等方法。作为电学测定方法，可以举出金属电极法(氢电极法、醌氢醌电极法、锑电极法等)、玻璃电极法、ISFET电极法、膜片钳法、LAPS(光可寻址电位传感器、Light-Addressable Potentiometric Sensor)法等。
通过并用测定上述H+浓度变化的方法和上述H+-焦磷酸酶反应，能将试料溶液中的焦磷酸转换为光学信号或电信号进行测定。
另外，测定H+浓度变化的方法不限于上述测定方法，只要是可将H+浓度变化转换为光学变化或电学变化、且该光学变化或电学变化为可测的方法即可。
接着，一边参照图4以及图5一边说明本实施方式的焦磷酸的检测方法。图4以及图5为焦磷酸的检测方法示意图。
如图4所示，H+-焦磷酸酶存在于膜内，内部含有pH敏性色素或膜电位敏性色素的膜小胞33悬浊液注入反应容器31中，接着，将由图1(d)或图2(d)得到的试料溶液32添加到反应容器31中。这时，H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位露出在膜小胞(H+难透性膜)33的外部。只要膜小胞33内部所含溶液不妨碍对由H+-焦磷酸酶输送引起的H+浓度变化的检测，就没有特别限定。另外，将膜小胞33的外面33a作为表面，内面33b作为内面。试料溶液32中也可以添加pH敏性色素或膜电位敏性色素。
试料溶液32中存在焦磷酸时，发生H+-焦磷酸酶的酶反应，此时，膜小胞33内部的H+浓度增大，膜小胞33外部的H+浓度减少。因此，通过膜小胞33内部的H+浓度增大，pH敏性色素或膜电位敏性色素的荧光强度发生变化。通过以光学方法测定该荧光强度的变化，就能进行焦磷酸的定性检测以及定量检测。
可将由从细胞分离的液泡调制成的产物用作膜小胞33。另外，作为膜小胞33，也可以使用离析或精制H+-焦磷酸酶后、通过以存在于人工形成的脂质双层膜或LB膜等不能通过H+或难于通过H+的膜内的方式再构筑而形成的产物。
另外，焦磷酸水解活性部位优选为膜小胞33中含有露出在内部的H+-焦磷酸酶。但是，当焦磷酸水解活性部位使用含有露出在内部的H+-焦磷酸酶的膜小胞33时，膜小胞33内部的焦磷酸浓度优选为低于膜小胞33外部的焦磷酸浓度，最优选为膜小胞33内部不含焦磷酸。由此，减少或停止从膜小胞33的内部向外部输送H+，从膜小胞33的外部向内部输送H+占优，膜小胞33的外部以及内部的H+浓度的变化大体上受到试料溶液32中含有的焦磷酸的限定。因此，能正确估计试料溶液32中含有的焦磷酸量。
另外，膜小胞33的膜中也可以含有除H+-焦磷酸酶以外的蛋白质。但是，这些蛋白质优选为与焦磷酸不反应或反应性低的蛋白质。之所以这样，是因为：当焦磷酸与除膜小胞33膜中的H+-焦磷酸酶以外的蛋白质反应时，与H+-焦磷酸酶反应的焦磷酸量减少，随之H+的输送量减少。另外，当膜小胞33的膜中含有通过不与焦磷酸反应且与除焦磷酸以外的物质的反应输送H+的蛋白质时，该蛋白质优选为试料溶液32中几乎不含有反应物。具体地，当膜小胞33的膜中含有通过与焦磷酸几乎不反应且与ATP反应输送H+的蛋白质ATPase时，优选为试料溶液32中几乎不含ATP。
另外，作为pH敏性色素，例如可以举出吖啶橙。另外，作为膜电位敏性色素，例如可以举出OksorV。上述任一种色素都是对微小的pH或膜电位的变化非常敏感的色素。因此，可以高灵敏度检测焦磷酸。
另外，也可以使用图5所示的焦磷酸检测装置。如图5所示，焦磷酸检测装置50具有容器34、电极35、和设于容器34内的内部槽36。在内部槽36中，形成内部有H+-焦磷酸酶的膜(H+难透性膜)37，内部槽36的底部设有H+敏性电极38。这时，H+-焦磷酸酶的焦磷酸水解活性部位露出在内部槽36的外部。以膜37的上面37a为表面，以膜37的下面37b为内面。
当将试料溶液32注入容器34内、试料溶液32中存在焦磷酸时，产生H+-焦磷酸酶的酶反应，由膜37隔离的内部槽36的内部区域(第二区域)39的溶液中H+浓度增大，而内部槽36外部的H+浓度减少。因此，使用电极35和H+敏性电极38，用电学方法测定H+浓度的变化，由此就能定性或定量检测焦磷酸。在本实施方式中，预先在容器34和内部区域39内贮留可测定pH的缓冲液(buffer)等溶液后，将试料溶液32注入容器34内，但并不局限于此。例如，也可以预先在内部槽36内的H+敏性电极38上配置膜37，将试料溶液32添加到容器34中。由此，向容器34内注入试料溶液32时，透过试料溶液32中的膜37的成份(即不含焦磷酸的溶液)充满内部区域39，使用电极35和H+敏性电极38，就可以电学方法测定H+浓度的变化。
另外，焦磷酸水解活性部位优选为膜37中含有露出在内部区域39的H+-焦磷酸酶。但是，当焦磷酸水解活性部位使用含有露出在内部区域39的H+-焦磷酸酶的膜37时，内部区域39的焦磷酸的浓度优选为低于内部槽36外部的焦磷酸浓度，最优选为内部区域39不含焦磷酸。由此，减少或停止从内部区域39向内部槽36外部输送H+，从内部槽36的外部向内部区域39输送H+占优，内部槽36的外部以及内部区域39的H+浓度的变化大体上受到试料溶液32中含有的焦磷酸的限定。因此，能正确估计试料溶液32中含有的焦磷酸量。
另外，膜37中也可以含有除H+-焦磷酸酶以外的蛋白质。但是，这些蛋白质优选为与焦磷酸不反应或反应性低的蛋白质。之所以这样，是因为：当焦磷酸与除膜37中的H+-焦磷酸酶以外的蛋白质反应时，与H+-焦磷酸酶反应的焦磷酸量减少，随之H+的输送量减少。另外，当膜37中含有通过不与焦磷酸反应且与除焦磷酸以外的物质的反应输送H+的蛋白质，该蛋白质优选为试料溶液32中几乎不含有反应物。具体地，当膜37中含有通过与焦磷酸几乎不反应且与ATP反应输送H+的蛋白质ATPase时，优选为试料溶液32中几乎不含ATP。
另外，焦磷酸检测装置50通过电极35和H+敏性电极38，用电学方法测定焦磷酸量，但不局限于此。例如，也可以将含有pH敏性色素或膜电位敏性色素的溶液添加到内部槽的内部区域39中。由此，随着内部H+浓度的增大，pH敏性色素或膜电位敏性色素的荧光强度产生变化。通过光学方法测定该荧光强度的变化，就能测定焦磷酸量。
如上所述，内部存在有用于检测焦磷酸的H+-焦磷酸酶的膜形状既可以是球状也可以是平面状。即，可根据由H+-焦磷酸酶使内部存在有H+-焦磷酸酶的膜隔离的两个区域之间的H+全部移动或大部分移动进行的条件构筑。
另外，应用本实施方式的判别试料中的标的DNA的SNP部位的碱基种类的方法，可判别试料中碱基序列中是否存在突变部位、决定突变部位以及突变部位的碱基种类。是否存在突变部位的判别是：通过使用与没有突变部位的目的碱基序列完全互补的引物进行引物伸长反应，根据由该反应生成的焦磷酸量是少于还是与含有目的碱基序列的试料和使用与该目的碱基序列完全互补的引物进行引物伸长反应时生成的焦磷酸量(对照值)同等程度来判别试料中碱基序列是否存在突变部位。即，当判别为与标准值同等程度时，判别为不存在突变部位；当判别为少于标准值时，判别为存在突变部位。
在决定突变部位的情况下，使用每个碱基错开地设计的多个引物进行引物伸长反应，测定生成的焦磷酸量，将对应于使焦磷酸量最小的引物的3′末端的部位进行特别限定，由此能决定突变部位。
突变部位的碱基种类的决定可在决定突变部位后，通过采用与决定上述SNP部位的碱基种类同样的方法决定。
本说明书中核酸的“碱基序列中的碱基种类的判别”包括碱基序列中是否存在突变部位的判别、突变部位的决定以及突变部位的碱基种类的决定中的任一项。
接着，说明判别试料中标的DNA的SNP部位的碱基种类的装置。图6为本实施方式的碱基种类判别装置的示意图。
如图6所示，碱基种类判别装置60设有具备进行引物伸长反应的反应部51a和检测焦磷酸的焦磷酸检测部51b的反应机构51和控制反应部51a与焦磷酸检测部51b并分析得到的结果的分析机构52。另外，反应机构51具有为导入试料溶液而可插入芯片53的插槽。
反应部51a的结构优选为可根据引物伸长反应的需要进行温度调节。例如，引物伸长反应使用PCR法时，反应部51a的结构优选设有：可通过分别设定的时间来控制试料溶液导入芯片53内的试料溶液的温度以分别适应核酸改性、引物退火以及通过聚合酶进行引物伸长反应的加热部以及程序控制部。另外，当使用ICAN法以及LAMP法等恒温反应时，反应部51a优选设有能保持一定温度(例如65摄氏度)的加热部以及温度控制部。另外，在本实施方式中，采用与PCR法所用热循环控制装置相同的结构。
焦磷酸检测部51b的结构根据测定H+浓度变化的测定机构的不同而不同。如上述图4所示，在使用pH敏性色素或膜电位敏性色素等的色素用光学方法测定H+浓度变化时，焦磷酸检测部51b优选设有激发荧光色素的光源部、测定产生的荧光的强度的荧光强度测定部。
另外，如上述图5所示，当使用电极用电学方法测定H+浓度变化时，焦磷酸检测部51b优选设有能测定分别与电极35以及H+敏性电极38电接的接点部或端子与电极35以及H+敏性电极38之间的电位差的电位差测定部。
用于导入试料溶液的芯片53设有PCR槽(反应用贮留区域)73、上述图5所示的焦磷酸检测装置(包括检测用贮留区域)50、连接PCR槽73和焦磷酸检测装置50的通路74c。
PCR槽73是用于在含有精制DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4种dNTP的试料溶液中进行PCR(引物伸长反应)的槽。另外，可以根据需要预先或在插入碱基种类判别装置60之前向PCR槽73中导入各种必要的试剂。
因焦磷酸检测装置50具有如上所述结构，所以在此省略说明。另外，也可不使用焦磷酸检测装置50，而是采用将H+浓度变化转换为光变化或电变化、可检测该光学变化或电变化的装置。
通路74c中设有开关部件，在开关部件的开状态下，允许通路74c中流体流通；在开关部件的关状态下，阻止通路74c中流体流通。根据这种结构，形成分别隔成PCR槽73与焦磷酸检测装置50的结构。开关部件为可由上述碱基种类判别装置60的反应机构51开关的结构。另外，在芯片53中，通路74c不一定必须具有开关部件，也可以是如下所述结构，即：在PCR反应工序中，将反应溶液保持在PCR槽73内，同时，阻止从外部流入溶液；在焦磷酸的检测工序中，将反应后的溶液保持在焦磷酸检测装置50内，同时，阻止从外部流入溶液。
另外，分析机构52与反应机构51相接，具体例为个人电脑(PC)等。
碱基种类判别装置60的动作如下。
首先，准备向PCR槽73导入含有具备SNP部位的标的DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4种dNTP的试料溶液的芯片53。
接着，将芯片53插入反应机构51的插槽。如图6所示，将芯片53插入反应机构51的插槽时，分别使PCR槽73位于反应部51a内(PCR槽73和反应部51a也合称为反应部)、焦磷酸检测装置50位于焦磷酸检测部51b内(焦磷酸检测装置50和焦磷酸检测装置51b也合称为焦磷酸检测部)，而将芯片53配置在反应机构51内。
然后，反应机构51在反应部51a中反复进行上述图1(b)～(d)所示工序和图2(b)～(d)所示工序，在导入到芯片53的PCR槽73中的试料溶液内发生引物伸长反应。另外，先行在分析机构52中设定反复进行上述图1(b)～(d)所示工序和图2(b)～(d)所示工序的次数。
当上述图1(b)～(d)所示工序和图2(b)～(d)所示工序结束时，通过反应机构51打开芯片53的通路74c，向焦磷酸检测装置50内导入试料溶液。焦磷酸检测部51b用于检测由引物伸长反应生成的焦磷酸量。具体的检测方法如上所述，故在此省略说明。
接着，分析机构52通过分析由焦磷酸检测部51b得到的结果，判别试料中的标的DNA的SNP部位的碱基种类。此处所述的碱基种类的判别包括判别是否为特定碱基种类以及决定碱基种类中的任一个。另外，使用图6所示的碱基种类判别装置60也能进行碱基序列中是否存在突变部位的判别、突变部位的决定以及突变部位碱基种类的决定。这时，在分析机构52中，通过分析由焦磷酸检测部51b得到的结果，进行是否存在突变部位的判别、突变部位的决定以及突变部位碱基种类的决定。
接着，说明可取代芯片53而使用的另一种芯片53a。图7(a)为本实施方式的另一种芯片的俯视图，图7(b)为沿图7所示X-X线的剖面图。
如图7(a)和图7(b)所示，芯片53a设有：样品注入口70，DNA萃取槽71，DNA精制槽72，PCR槽73，焦磷酸检测装置(包括检测用贮留区域)50，连接DNA萃取槽71和DNA精制槽72的通路74a，连接DNA精制槽72和PCR槽73的通路74b，连接PCR槽(反应用贮留区域)73和焦磷酸检测装置50的通路74c。即，芯片53a在图6所示芯片53的基础上，还设有样品注入口70、DNA萃取槽71、DNA精制槽72、通路74a以及通路74b。
样品注入口70与外部和DNA萃取槽71连接。从样品注入口70向DNA萃取槽71注入根据需要经药液处理过的血液、唾液、毛发以及毛根等试料溶液。
DNA精制槽72是用于精制DNA、进行除去杂质的药液处理的槽。当然，也可以设制成具有用于精制DNA的柱的结构。
PCR槽73是用于在DNA精制槽72中、在含有精制的DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4种dNTP的试料溶液中进行PCR(引物伸长反应)的槽。
另外，可以预先或在插入碱基种类判别装置60之前分别向DNA萃取槽71、DNA精制槽72和PCR槽73中导入各种必要的试剂。
焦磷酸检测装置50为如上所述结构，故在此省略说明。另外，也可不使用焦磷酸检测装置50，而是采用将H+浓度变化转换为光变化或电变化、可检测该光学变化或电变化的装置。
通路74a、74b以及74c中设有开关部件75，形成抬起各开关部件75时、可分别将DNA萃取槽71、DNA精制槽72、PCR槽73、焦磷酸检测装置50密封的结构。开关部件75为可由上述碱基种类判别装置60的分析机构52开关的结构。
另外，也可以不采用开关部件75，而是例如在通路74a、74b以及74c中设置逆流防止阀等。另外，也可设置与焦磷酸检测装置50相通的脱气孔，并在样品注入口70安装排气泵、在上述脱气孔安装吸气泵，由此形成将试料溶液输送到DNA萃取槽71、DNA精制槽72、PCR槽73、焦磷酸检测装置50各部分的结构。而且，还可将上述排气泵和吸气泵用作排出和吸引与试料溶液不相混的油的泵。无论何种结构，只要是在上述碱基种类判别装置60的反应机构51中，可将DNA萃取槽71、DNA精制槽72、PCR槽73、焦磷酸检测装置50各自隔开的结构即可。此处的“隔开”是指：在各槽71、72、73的处理中，各槽71、72、73保持有处理对象溶液，而阻止其它溶液流入的状态。因此，只要是可将各槽71、72、73隔开的结构，即使不设开关部件也可达到目的。例如，当各槽71、72、73比通路74a、74b、74c凹下一层，在各槽71、72、73中保持有溶液的状态下，形成可确保只要送液机构等不工作就不会有溶液流出、流入的状态的结构。由此，在一个芯片上就能进行酶反应条件(例如最适温度等)互不相同的引物伸长反应和焦磷酸的检测。
另外，在本实施方式的芯片53a中，也可形成DNA萃取槽71、DNA精制槽72、PCR槽73为各自分离的单个的槽，而DNA的萃取、DNA的精制以及PCR在一个槽内进行的结构。
图8为本实施方式其它芯片的俯视图。
如图8所示，芯片53b与图7所示的芯片53a一样，设有样品注入口70、DNA萃取槽71、DNA精制槽72、PCR槽(反应用贮留区域)73、焦磷酸检测装置(包括检测用贮留区域)50、连接DNA萃取槽71和DNA精制槽72的通路74a、连接DNA精制槽72和PCR槽73的通路74b、连接PCR槽73和焦磷酸检测装置50的通路74c。特别是通路74b分为两股而分设有两套PCR槽73、焦磷酸检测装置50、连接PCR槽73和焦磷酸检测装置50的通路74c。
使用芯片53b，与分别向两个PCR槽73导入互不相同的分型引物，由此就能同时判别两个SNP部位的碱基种类。另外，在一个SNP部位，能同时导入两种分型引物，这有益于SNP部位的碱基种类的决定。
图9为本实施方式的另一芯片(纵型芯片)的立体示意图。
如图9所示，芯片90设有样品导入部91、DNA精制部92、PCR部93、焦磷酸检测装置50。
样品导入部91包括样品导入槽91a和DNA萃取柱91b。将根据需要用药液处理的血液、唾液、头发以及毛根等试料溶液，注入样品导入槽91a，通过DNA萃取柱91b。另外，血液、唾液等液体也可不经药液处理注入样品导入槽91a。
DNA精制部92包括DNA精制槽92a和DNA精制柱92b。将通过DNA萃取柱91b的试料溶液导入DNA精制槽92a，然后再通过DNA精制柱92b。
PCR部93包括PCR槽(反应用贮留区域)93a和隔离部件93b。将含有利用通过DNA精制柱92b而精制的DNA的试料溶液导入PCR槽93a，并添加DNA、分型引物、DNA聚合酶以及4种dNTP。由此，产生PCR(引物伸长反应)。
隔离部件93b形成可由上述碱基种类判别装置60的反应机构51开关的结构。在PCR槽93a中，当PCR结束时，反应机构51打开隔离部件93b，使试料溶液通过焦磷酸检测装置(包括检测用贮留区域)。
另外，在上述芯片53a、53b、90中，为具备DNA精制槽72或92a的结构，在此，为防止试料溶液中含有PCR反应阻碍物或使PCR反的阻碍物不具有活性，需要对试料溶液进行充分处理。
因焦磷酸检测装置50具有如上所述结构，所以在此省略说明。另外，也可不使用焦磷酸检测装置50，而是采用将H+浓度变化转换为光变化或电变化、可检测该光学变化或电变化的装置。
在本实施方式中，通过检测焦磷酸量，分析引物伸长反应进行差异，当然，不局限于引物伸长反应，还能正确测定存在于试料溶液中的焦磷酸量。
另外，特别是在引物伸长反应中，ATP以及dATP为H+焦磷酸酶的阻碍剂，所以在试料溶液中存在ATP以及dATP且焦磷酸量少的情况下，H+浓度几乎没有变化。相反，在通过引物伸长反应消耗了试料溶液中的dATP且焦磷酸量大的情况下，H+浓度变大。即，能将更大的差异作为引物伸长反应进行差异的测定差。因此，能以很高的精度判别碱基种类。
(实施方式2)
在本实施方式中，说明判别试料中是否含有具有特定碱基序列的DNA的方法，即，具有特定碱基序列的DNA的检测方法。一边参照图10一边具体说明使用4种dNTP利用引物伸长反应的方法(例如PCR法、ICAN法、LCR法、SDA法、LAMP法等的放大反应)。图10为判别本实施方式的试料中是否含有具有特定碱基序列的DNA的方法的工序示意图。
在本实施方式的方法中，使用含有可与具有特定碱基序列的DNA互补结合的碱基序列的引物。
首先，在图10(a)所示工序中，将含有可与具有特定碱基序列的DNA互补结合的碱基序列的引物101、DNA聚合酶和4种dNTP添加到欲判别是否含有具有特定碱基序列的DNA溶液中，调制成试料溶液100。另外，使引物101可与具有特定碱基序列的单链DNA完全杂交。
接着，用如图10(b)所示的工序进行试料溶液100的热处理。由此，使试料溶液100中所含DNA大部分是单链DNA。
接着，用如图10(c)所示的工序冷却试料溶液100。由此，当试料溶液100中存在由具有特定碱基序列的DNA生成的单链DNA102时，引物101与单链DNA102杂交。
接着，用如图10(d)所示的工序，调节试料溶液100的温度到最适于引物伸长反应的温度。在存在单链DNA102的情况下，引物101与单链DNA102完全杂交，所以产生引物伸长反应。因此，由DNA聚合酶8消耗dNTP而生成焦磷酸。
另外，此时，在不存在具有特定碱基序列的单链DNA102的情况下，引物101不能杂交。因此，难以产生引物伸长反应。因此，几乎没有消耗dNTP，几乎没有生成焦磷酸。
接着，通过定性检测焦磷酸，判别有无进行引物伸长反应。当判别存在焦磷酸时，就可判定进行了引物伸长反应。而且，可判定试料中存在具有特定碱基序列的DNA。另一方面，当判别不存在焦磷酸时，就可判定引物伸长反应没有进行。而且，可判定试料中不存在具有特定碱基序列的DNA。即，能判别是否具有特定碱基序列的DNA。另外，本实施方式的焦磷酸的定性检测方法与上述实施方式1完全相同，故此处省略说明。
如上所述，通过使用试料中具有特定碱基序列的核酸的放大法中生成的焦磷酸、H+焦磷酸酶分析H+浓度变化，就能判别试料中是否存在具有特定碱基序列的核酸。另外，应用本实施方式的方法，将使用与具有某种特定碱基序列的核酸互补的引物进行引物伸长反应生成的焦磷酸量，与使用以通过反应生成的焦磷酸量为标准的序列的引物进行引物伸长反应生成的焦磷酸量相比，由此，也能对成为某种特定碱基序列的标准的碱基序列进行相对定量。
另外，由本实施方式说明的判别具有特定碱基序列的核酸是否存在的方法可使用上述实施方式1中说明的焦磷酸检测装置50、碱基种类判别装置60以及芯片53a、53b或90进行实施。
另外，在上述实施方式1和2中，说明使用4种dNTP利用引物伸长反应的方法，当然，也能利用现有技术中一边参照图21和22一边说明的、使用1种dNTP(或ddNTP)的引物伸长反应。另外，也可以与使用包括分型引物的两种以上引物的PCR法等具有特定碱基序列的核酸放大法并用。另外，分型引物也不限于具有3′末端对应于SNP部位、与SNP部位邻接的碱基序列完全互补的碱基序列的引物，只要是根据引物伸长反应进行程度可判别碱基种类的引物即可。例如，可使用具有3′末端对应于SNP部位、与SNP部位邻接的碱基序列除单碱基之外完全互补的碱基序列的引物，与3′末端邻接的部位与SNP部位对应的引物等公知的引物。即，可使用H+焦磷酸酶分析具有含有作为分析对象的SNP部位的碱基序列的核酸的放大，进行SNP部位的碱基种类的判别。
当然，根据上述实施方式1的方法，不仅能判别SNP部位的碱基种类，也能判别特定碱基序列。
另外，在上述实施方式1和2中，对DNA碱基序列中的碱基种类的判别以及DNA的检测作出了说明，当然，不局限于DNA，同样也能进行RNA碱基序列中的碱基种类的判别以及RNA的检测。而且，作为试料，使用单链DNA、双链DNA均可。
(焦磷酸的检测实验1)
本实施例以Shizuo Yoshida等人的方法(Masayoshi Maeshima andShizuo Yoshida、1989年、J.Biol.Chem.、264(33)、20068-20073页)为标准，如下所示进行。
首先，由源自绿豆的液泡膜构成的膜小胞溶于由Tris/Mes缓冲液(浓度5mM、pH7.0)、山梨糖醇(浓度0.25M)、DTT(浓度2mM)构成的溶液中而构成液泡膜的膜小胞悬浊液。
接着，将该悬浊液混合在由MgSO4(浓度1mM)、KCl(浓度50mM)、山梨糖醇(浓度0.25M)、吖啶橙(pH敏性色素、浓度3μM)、二羟乙基呱嗪乙烷磺酸(Hepes)/Bristris propane(浓度25mM、pH7.2)构成的反应液中，作为H+-焦磷酸酶液。
接着，将该H+焦磷酸酶液平均分注于4根试管中，分别添加焦磷酸钠溶液使其中焦磷酸钠最终浓度分别为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，开始由焦磷酸的H+-焦磷酸酶导致的水解反应。
在本实施例中，向上述各反应液照射493nm的激光，分析添加焦磷酸钠溶液前后的540nm的荧光强度变化。其结果如图11所示。
图11为焦磷酸钠的浓度与540nm荧光强度变化的关系曲线图。在此，用对应于各焦磷酸钠浓度的反应液中的每单位秒的消光率表示540nm的荧光强度变化。另外，以焦磷酸钠的最终浓度为100μM的反应液中每单位秒的消光率为100％，换算对应于各焦磷酸钠浓度的反应液中的每单位秒的消光率。
如图11所示，得到焦磷酸钠的浓度与吖啶橙的每秒消光率约呈双曲线函数关系而变化的结果。由此可知，通过测定吖啶橙的每秒消光率，能定量检测焦磷酸。
(焦磷酸的检测实验2)
本实施例，以Masasuke Yoshida等的方法为标准(MasaH.Sato、Masahiko Kasahara、Noriyuki Ishii、Haruo Homareda、Hideo Matsui以及Masasuke Yoshida、1994年、J.Biol.Chem.、269(9)、6725-6728页)，如下所示进行。
首先，由南瓜种子进行液泡膜H+-焦磷酸酶的精制。
接着，将精制得到的液泡膜H+-焦磷酸酶添加到由大豆的缩醛磷脂酰胆碱和胆固醇调制的脂质混合液中，调制成液泡膜H+-焦磷酸酶的蛋白核蛋白体液。该蛋白核蛋白体液混合在由山梨糖醇(浓度0.25M)、Tricime-Na(浓度10mM、pH7.5)、EGTA(浓度0.1M)、KCl(浓度50mM)、ォクソノ一ルV(膜电位敏性色素、浓度0.2μM)构成的反应液中后，平均分注于5根试管中。
接着，向5根试管中分别添加焦磷酸钠溶液使其中焦磷酸钠最终浓度分别为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM以及100μM，开始由焦磷酸的H+-焦磷酸酶导致的水解反应。
在本实施例中，向上述各反应液照射610nm的激光，通过测定添加焦磷酸钠溶液前后的639nm的荧光强度变化，分析添加焦磷酸钠溶液前后各反应液含有的蛋白核蛋白体的膜电位变化。其结果如图12所示。
图12为焦磷酸钠的浓度与639nm荧光强度变化的关系曲线图。在此，用对应于各焦磷酸钠浓度的反应液中的每单位秒的消光率表示639nm的荧光强度变化。另外，以焦磷酸钠的最终浓度为100μM的反应液中每单位秒的消光率为100％，换算对应于各焦磷酸钠浓度的反应液中的每单位秒的消光率。
如图12所示，得到焦磷酸钠的浓度与ォクソノ一ルV的每秒消光率约呈双曲线函数关系而变化的结果。由此可知，通过测定ォクソノ一ルV的每秒消光率，能定量检测焦磷酸。
(焦磷酸的检测实验3)
本实施例是以特开平6-90736号公报提出的方法为标准进行的。
首先，使用与上述实施例同样的来自南瓜种子液泡膜H+-焦磷酸酶，将含有液泡膜H+-焦磷酸酶的脂质双层固定在市售的ISFET-pH传感器上。但是，脂质二重层的外部充满由MgSO4(浓度1mM)、KCl(浓度50mM)、山梨糖醇(浓度0.25M)、Hepes/Bristris propane(浓度25mM、pH7.2)构成的反应溶液。
接着，使用固定有含有上述液泡膜H+-焦磷酸酶的脂质双层的ISFET-pH传感器，测定添加焦磷酸钠溶液、使上述反应溶液中的焦磷酸钠的最终浓度分别为20μM、40μM、60μM、80μM以及100μM时的pH值。其结果如图13所示。
如图13所示，得到根据焦磷酸钠的浓度pH值减少的结果。由此可知，通过测定pH值，能定量检测焦磷酸。
实施例1
在本实施例中，进行试料中的λDNA(λDNA的全碱基序列参照Gen Bank数据库的Accession No.V00636、J02459、M17233、X00906)的检测。
首先，准备λDNA(宝酒造(株)制)以10ng/μL的浓度溶解于蒸馏水中的试料溶液A以及只由蒸馏水构成的试料溶液B。另外，如图14(a)所示，准备将λDNA的特定碱基序列完全杂交得到的两种引物C以及引物D分别溶于蒸馏水的引物溶液E以及F(任一种都为20μM)。
分别向上述试料溶液A以及B中添加TaKaRa La Taq(5U/μL、宝酒造(株)制)、TaKaRa La Taq的专用缓冲剂2×GC缓冲液I(宝酒造(株)制)、dNTP混合物(各浓度2.5mM、宝酒造(株)制)以及引物溶液E和F，调制图14(b)示的组成的PCR反应液G和H。
接着，在图14(c)所示的反应条件下，分别对PCR反应液G和H进行PCR反应。
PCR反应结束后，使PCR反应液G以及H分别与上述实施例1所述的H+-焦磷酸酶液混合反应。
在本实施例中，分别对PCR反应液G以及H与H+-焦磷酸酶液混合前后的吖啶橙荧光强度变化进行分析。吖啶橙荧光强度分析是照射493nm的激光、对540nm的荧光强度进行分析。其结果如图15(a)所示。
图15(a)表示PCR反应液G以及H分别与H+-焦磷酸酶液混合前后的荧光强度变化率。另外，荧光强度变化率用图15(b)所示式子表示。
如图15(a)所示，PCR反应液G与PCR反应液H相比，明显荧光强度变化率大。即，可知，在PCR反应液G中生成焦磷酸、进行了引物伸长反应。根据该结果，可判定在PCR反应液G中存在标的核酸。因此可知，通过测定吖啶橙的荧光强度能检测标的核酸。
实施例2
在本实施例中，制作人为地将λDNA的碱基序列内的碱基置换为其它碱基变异型λDNA，研究是否能判别通常的λDNA和变异型λDNA。
首先，使用λDNA(宝酒造(株)制)制作变异型λDNA。变异型λDNA是用本领域从业人员都知道的方法将图16所示的λDNA(以下将通常的λDNA记为野生型λDNA)的双链DNA序列内存在的GC碱基对(图中的区域R1)人为地置换为AT碱基对(图中的区域R2)。
接着，将野生型λDNA以及变异型λDNA以最终浓度为10ng/μL的方式溶解于蒸馏水中的产物分别作为野生型λDNA液以及变异型λDNA液。
接着，为了判别上述碱基的不同，准备如图16(a)所示的分型引物。接着，调制成将分型引物以最终浓度为20μM的方式溶解于蒸馏水中得到的分型引物溶液。
另外，使如图16(a)所示的分型引物与野生型λDNA的下段所记录的单链DNA完全杂交。但是，该分型引物3′末端的G不能与变异型λDNA的下段所记录的单链DNA杂交。因此，使用该分型引物进行引物伸长反应时，野生型λDNA反应进行良好，但是变异型λDNA不怎么进行反应。
另外，还准备上述实施例4所用的引物溶液F。
接着，对野生型λDNA液以及变异型λDNA液分别使用TaKaRa LaTaq(5U/μL、宝酒造(株)制)、TaKaRa La Taq专用缓冲剂10×PCR缓冲液(宝酒造(株)制)、dNTP混合物(浓度各2.5mM、宝酒造(株)制)、分型引物溶液E以及引物溶液F，调制图16(b)所示组成的PCR反应液I以及J。
接着，使PCR反应液I以及J分别在图16(c)所示的反应条件下进行PCR反应。
PCR反应结束后，使PCR反应液I以及J分别与H+-焦磷酸酶·核蛋白体液混合反应。H+-焦磷酸酶·核蛋白体液是以Masasuke Yoshida等人的方法(Masa H.Sato、Masahiko Kasahara、Noriyuki Ishii、HaruoHomareda、Hideo Matsui、Masasuke Yoshida、1994年、J.Biol.Chem.、269(9)、6725-6728页)为标准调制的。
具体地是，首先，由南瓜的种子进行液泡膜H+-焦磷酸酶的精制。接着，将精制得到的液泡膜H+-焦磷酸酶添加到由大豆的缩醛磷脂酰胆碱和胆固醇调制的脂质混合液中，调制成液泡膜H+-焦磷酸酶的蛋白核蛋白体液。该蛋白核蛋白体液混合在由山梨糖醇(浓度0.25M)、Tricine-Na(浓度10mM、pH7.5)、EGTA(浓度0.1M)、KCl(浓度50mM)、ォクソノ一ルV(膜电位敏性色素、浓度0.2μM)构成的反应液中，将此作为H+-焦磷酸酶·蛋白核蛋白体液。
在本实施例中，向上述各PCR反应液照射610nm的激光，通过测定添加焦磷酸钠溶液前后的ォクソノ一ルV的639nm的荧光强度变化，分析各反应液所含蛋白核蛋白体液的膜电位变化。其结果如图17所示。
图17分别为PCR反应液I以及J混合前后的荧光强度变化率。如图17所示，明显地，PCR反应液I比变异型PCR反应液J荧光强度变化率大。这是因为：在PCR反应液J中PCR反应没有良好地进行，但是，在PCR反应液I中进行良好，其结果是，生成的焦磷酸与存在于核蛋白体中的H+-焦磷酸酶反应，H+被输送到核蛋白体内。
因此可知，通过本实施例能判别DNA特定碱基序列中的单碱基对的不同。即，本实施例的方法对于SNP部位的碱基种类的判别、由突变引起的单碱基对的变异等特定碱基种类的判别是非常有效的。
实施例3
本实施例与上述实施例5不同，用组合单碱基伸长反应和H+-焦磷酸酶的反应的方法，研究是否能判别野生型λDNA和变异型λDNA之间的单碱基对的不同。
首先，与上述实施例5相同，调制将野生型λDNA以及变异型λDNA以最终浓度为5mM的方式溶解于蒸馏水中的野生型λDNA(5mM)液以及变异型λDNA(5mM)液。
接着，准备如图18(a)所示的引物。该引物是在实施例5中图16(a)所示的野生型λDNA的下段侧单链DNA与除去5′末端的C的序列完全杂交而得到的。即，同样，实施例5所示的变异型λDNA序列的下段侧的单链DNA序列中，也与除去5′末端的T的序列完全杂交而得到引物。
接着，调制将该引物以最终浓度为0.2mM的方式溶解于蒸馏水中的引物溶液M。
接着，对野生型λDNA(5mM)液以及变异型液λDNA(5mM)液分别使用TaKaRa Taq(5U/μL、宝酒造(株)制)、TaKaRa Taq专用缓冲剂10×PCR缓冲液(宝酒造(株)制)、2.5mM的dNTP溶液以及引物溶液M，调制成图18(b)所示组成的伸长反应液K和L。
接着，分别对伸长反应液K以及L，在图18(c)所示的反应温度条件下进行单碱基的伸长反应。
单碱基伸长反应结束后，将各伸长反应液导入到固定H+-焦磷酸酶的修饰ISFET电极。修饰ISFET电极是上述实施例3中所用的电极。
使用该修饰ISFET电极，测定添加各伸长反应液时的各pH值。结果，相对于伸长反应液K时的pH6.89，伸长反应液L的pH为6.02。该结果是因为，在含有野生型λDNA的伸长反应液K中没有产生伸长反应，但在含有变异型λDNA的伸长反应液L中产生由dATP导致的单碱基伸长反应，其结果是生成的焦磷酸与修饰ISFET电极上的H+-焦磷酸酶反应，H+被输送到修饰ISFET电极侧。
由此可知，通过本方法能判别标的核酸的碱基序列中的单碱基对的不同。即，本方法对于SNP部位碱基种类的判别、因突变导致的单碱基对的置换等特定碱基序列的判别是非常有效的方法。
产业上的可利用性
本发明碱基种类判别方法以及碱基种类判别装置可用于SNP部位的碱基种类的判别，因此，对于基于SNP定型的投药这样的专门医疗非常有用。另外，本发明的碱基判别方法以及碱基种类判别装置对DNA碱基序列中的突变的分析非常有用，其分析结果可用于药物发明或临床。
本发明的核酸检测方法对遗传病的诊断、由细菌以及病毒等造成的食品污染检查和细菌以及病毒等对人体的感染检查非常有用。
Claims (30)
1.一种检测引物伸长反应的引物伸长反应检测方法，其特征在于，包括：
工序(a)，调制含有核酸、具备含有与所述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液；
工序(b)，将所述试料溶液置于发生所述伸长反应的条件下，在发生所述伸长反应的情况下生成焦磷酸；
工序(c)，使所述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触；
工序(d)，在将所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定所述H+难透性膜表面侧溶液或所述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一方的H+浓度；和
基于工序(d)的测定结果，检测所述伸长反应的工序(e)。
2.一种判别核酸碱基序列中的碱基种类的碱基种类判别方法，其特征在于，包括：
工序(a)，调制含有核酸、具备含有与所述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液；
工序(b)，将所述试料溶液置于发生所述引物伸长反应的条件下，在发生所述伸长反应的情况下生成焦磷酸；
工序(c)，使所述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触；
工序(d)，在将所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定所述H+难透性膜表面侧溶液或所述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一侧的H+浓度；
基于工序(d)的测定结果，检测所述伸长反应的工序(e)；和
基于工序(e)的检测结果判别所述核酸的碱基序列中的碱基种类的工序(f)。
3.如权利要求2所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中测定所述表面侧溶液的H+浓度与工序(b)之后、工序(c)之前的所述试料溶液的H+浓度之差。
4.如权利要求3所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，检测所述伸长反应。
5.如权利要求4所述的碱基种类判别方法，其特征在于，
所述碱基种类的判别是指SNP部位的碱基种类的判别，所述对照值为使用所述SNP部位没有变异的核酸作为所述核酸进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)得到的测定结果。
6.如权利要求2所述的碱基种类判别方法，其特征在于，
在工序(d)中，检测所述内面侧溶液的H+浓度；在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，检测所述伸长反应。
7.根据权利要求6所述的碱基种类判别方法，其特征在于，
所述碱基的判别是SNP部位的碱基的判别；在工序(a)中，使用所述核苷酸作为一种核苷酸；所述对照值为使用与所述SNP部位的碱基种类不同的核酸作为所述核酸进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的测定结果。
8.如权利要求2所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中，采用光学方法测定所述H+浓度。
9.如权利要求8所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中，将pH敏性色素或膜电位敏性色素添加到所述表面侧溶液和所述内面侧溶液中的至少任一方中。
10.如权利要求9所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中，将吖啶橙或OksorV添加到所述表面侧溶液和所述内面侧溶液中至少任一方中。
11.如权利要求2所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中，采用电学方法测定所述H+浓度。
12.如权利要求2所述的碱基种类判别方法，其特征在于，所述伸长反应是根据PCR法的伸长反应。
13.一种碱基种类判别装置，用于判别核酸的碱基序列中的碱基种类，其特征在于，
具有引物伸长反应中进行必要的温度调节的反应部和检测随着所述引物伸长反应而生成的焦磷酸的焦磷酸检测部；
所述反应部具有用于贮留溶液的反应用贮留区域；
所述焦磷酸检测部具有：用于贮留溶液的检测用贮留区域、将所述检测用贮留区域分成第一区域和第二区域的H+难透性膜、用于测定贮留在第一区域和第二区域至少任一方的区域中的溶液的H+浓度的测定机构；
所述H+难透性膜具有贯穿膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；
在所述焦磷酸检测部中，由所述反应部送出的反应溶液贮留于第一区域。
14.如权利要求13所述的碱基种类判别装置，其特征在于，所述测定机构采用光学方法测定H+浓度。
15.如权利要求13所述的碱基种类判别装置，其特征在于，所述测定机构采用电学方法测定H+浓度。
16.如权利要求13所述的碱基种类判别装置，其特征在于，还设有控制所述反应部以及所述焦磷酸检测部、对由所述测定机构测定的结果进行分析的分析机构。
17.如权利要求13所述的碱基种类判别装置，其特征在于，还设有可插入具有所述反应用贮留区域和所述检测用贮留区域的芯片的插槽。
18.一种焦磷酸检测装置，其特征在于，具有：
容器；将所述容器内部分成第一区域和第二区域的H+难透性膜；与贮留于第一区域的溶液相接触的电极；与贮留于第二区域的溶液相接触的H+敏性电极。
所述H+难透性膜具有贯穿膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶。
19.一种核酸检测方法，用于检测具有特定碱基序列的核酸，其特征在于，包括：
工序(a)，调制含有试料、具备含有与所述核酸互补结合的互补结合区域的碱基序列的引物、以及核苷酸的试料溶液；
工序(b)，将所述试料溶液置于发生所述引物伸长反应的条件下，在发生所述伸长反应的情况下生成焦磷酸；
工序(c)，使所述试料溶液与具有贯穿H+难透性膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶的H+难透性膜的表面接触；
工序(d)，在将所述H+-焦磷酸酶浸入溶液的状态下，测定所述H+难透性膜表面侧溶液或所述H+难透性膜内面侧溶液中至少任一侧的H+浓度；
基于工序(d)的测定结果，检测所述伸长反应的工序(e)；和
基于工序(e)的检测结果检测所述核酸的工序(f)。
20.如权利要求19所述的核酸检测方法，其特征在于，工序(d)中测定所述表面侧溶液的H+浓度与工序(b)之后、工序(c)之前的所述试料溶液的H+浓度之差。
21.如权利要求20所述的核酸检测方法，其特征在于，在工序(e)中，将工序(d)的测定结果与对照值比较，检测所述伸长反应。
22.如权利要求21所述的核酸检测方法，其特征在于，所述对照值为使用不含核酸的所述试料进行工序(a)、(b)、(c)、(d)、在工序(d)中得到的测定结果。
23.如权利要求19所述的核酸检测方法，其特征在于，在工序(d)中，所述H+浓度采用光学方法测定。
24.如权利要求23所述的核酸检测方法，其特征在于，在工序(d)中，将pH敏性色素或膜电位敏性色素添加到所述表面侧溶液和所述内面侧溶液中的至少任一方中。
25.如权利要求24所述的核酸的检测方法，其特征在于，在工序(d)中将吖啶橙或OksorV添加到所述表面侧溶液和所述内面侧溶液中至少任一方中。
26.如权利要求19所述的碱基种类判别方法，其特征在于，在工序(d)中，采用电学方法测定所述H+浓度。
27.如权利要求19所述的碱基种类检测方法，其特征在于，所述伸长反应是根据PCR法的伸长反应。
28.一种试料溶液导入芯片，其特征在于，设有：用于进行引物伸长反应的反应槽；用于检测焦磷酸的焦磷酸检测槽；用于连接所述反应槽和所述焦磷酸槽的通路。
29.如权利要求28所述的试料溶液导入芯片，其特征在于，所述通路可开关。
30.如权利要求28所述的试料溶液导入芯片，其特征在于，
所述焦磷酸检测槽具有由H+难透性膜分离的第一区域和第二区域；
所述H+难透性膜具有贯穿膜内外的、焦磷酸水解活性部位露出在表面的H+-焦磷酸酶；
所述焦磷酸检测槽中，由所述反应槽经所述通路送出的反应溶液贮留于第一区域。
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