JPH08173192A - 特定の塩基配列を有する遺伝子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 自動化が容易であり、かつ、精度良く迅速に
特定の塩基配列を有する遺伝子の検出が可能な特定の塩
基配列を有する遺伝子の検出方法を提供する。 【構成】 本発明の特定の塩基配列を有する遺伝子の検
出方法では、まず、測定対象の遺伝子を含む細胞もしく
はその細胞を含む組織切片を固定化するとともに、細胞
内の測定対象の遺伝子の存在する領域と細胞の外部領域
とを連通する。次に、細胞内に蛍光性の核酸塩基を含む
ポリメラーゼ連鎖反応による特定の塩基配列を有する遺
伝子の増幅に必要な反応液一式を導入する。引き続き、
細胞の周囲温度を調節して、特定の塩基配列を有する遺
伝子を選択的に細胞内で増幅する。この後、細胞から遺
伝子増幅に使用されなかった蛍光物質を洗浄して排出す
る。次いで、細胞で発生する蛍光を観察し、細胞内の特
定の塩基配列を有する遺伝子を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞内に存在する可能
性のある、特定の塩基配列を有する遺伝子を細胞から取
り出すことなく検出する、特定の塩基配列を有する遺伝
子の検出方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞もしくはその細胞を含む組織切片内
に特定の塩基配列を有する遺伝子（種特異遺伝子，突然
変異遺伝子，ウィルス遺伝子，ガン変異遺伝子等）が存
在するか否かの決定は、生物学の研究や医療診断の上で
重要である。そして、顕微鏡による形態観察や、抗体染
色法（ＥＬＩＳＡ法など）を施した後に顕微鏡観察して
染色状態で判断することが従来から行われてきた。ま
た、近年では遺伝子や遺伝子を直接検出する方法の実施
されているが、こうした場合には通常、細胞から遺伝子
を抽出後あるいは細胞から抽出した遺伝子をポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などにより遺伝子増幅した後に
ゲル電気泳動にかけ、発生するバンドパターンから特定
の塩基配列を有する遺伝子が存在するか否かを決定する
（特開平４−２６７８９５号公報、特開平５−０６８５
９６号公報など）。

【０００３】一方、ＰＣＲ法の改良や進展は近年目覚ま
しく、細胞から遺伝子を取り出さずに細胞内（細胞核
内）で遺伝子の増幅（いわゆる、in situ PCR ）が報告
されている（B.K.Patterson et al., SCIENCE, 1993.3.
14, vol.260, pp976-979）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来の特定の塩基配列
を有する遺伝子の検出は上記のようにして行われるの
で、操作が複雑であり、かつ、パターン（形態、染色状
態、およびバンドパターン）の認識にあたっては人間の
判断が必要となるため自動化が困難であり、精度良く迅
速に特定の塩基配列を有する遺伝子の検出できない、と
いう問題点があった。

【０００５】また、ゲル電気泳動後のバンドパターンの
観察に換って、遺伝子増幅を実施すると否とに拘らず、
アイソトープ、蛍光物質、または発光反応に関するラベ
ルされたプローブ（特定の遺伝子またはその一部に結合
可能な物質）を結合させ、未結合のプローブを洗浄後、
プローブをその特徴に従って検出する方法も提案されて
いる。この方法を採用した場合には、測定対象である特
定の遺伝子にプローブを結合させる工程が必要となる。

【０００６】本発明は、上記を鑑みてなされたものであ
り、自動化が容易であり、かつ、精度良く迅速に特定の
塩基配列を有する遺伝子の検出が可能な特定の塩基配列
を有する遺伝子の検出方法を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の特定の塩基配列
を有する遺伝子の検出方法は、特定の塩基配列から成る
遺伝子の増幅にあたって増幅遺伝子の構成の一部をラベ
ル化物質とし、遺伝子を構成しなかったラベル化物質を
洗浄後に、ラベル化特性を測定することを特徴とする。

【０００８】すなわち、本発明の特定の塩基配列を有す
る遺伝子の検出方法は、（ａ）測定対象の遺伝子を含む
可能性がある細胞もしくはその細胞を含む組織切片を固
定化するとともに、細胞内の測定対象の遺伝子の存在す
る可能性のある領域と細胞の外部領域とを連通する第１
の工程と、（ｂ）測定対象の遺伝子の存在する可能性の
ある領域と細胞の外部領域とが連通された細胞内に、ラ
ベル化核酸塩基を含むポリメラーゼ連鎖反応による特定
の塩基配列を有する遺伝子の増幅に必要な反応液一式を
導入する第２の工程と、（ｃ）反応液が導入された細胞
の周囲温度を調節して、特定の塩基配列を有する遺伝子
を選択的に細胞内で増幅する第３の工程と、（ｄ）選択
的に増幅された特定の塩基配列を有する遺伝子を有する
細胞から遺伝子増幅に使用されなかったラベル化核酸塩
基を洗浄して排出する第４の工程と、（ｅ）洗浄された
細胞で発生するラベル化特性を観察し、細胞内の特定の
塩基配列を有する遺伝子を検出する第５の工程と、を備
えることを特徴とする。

【０００９】ここで、第１の工程は、細胞もしくはそ
の細胞を含む組織切片をガラスの表面に固着し、細胞
もしくはその細胞を含む組織切片が固着したガラスを第
１の時間にわたって細胞固定液に浸した後にリンスし、
固定された細胞もしくはその細胞を含む組織切片をタ
ンパク質分解酵素の溶液で処理する、ことを特徴として
もよい。

【００１０】また、第１の工程は、細胞もしくはその
細胞を含む組織切片の懸濁液を遠心して前記細胞を集
め、集められた細胞もしくはその細胞を含む組織切片
を第２の時間にわたって細胞固定液に浸した後にリンス
し、固定された細胞もしくはその細胞を含む組織切片
を再度遠心して集め、再度遠心して集められた細胞も
しくはその細胞を含む組織切片をタンパク質分解酵素の
溶液で処理する、ことを特徴としてもよい。

【００１１】また、ラベル化特性は蛍光性であり、第５
の工程での蛍光観察は蛍光顕微鏡および高感度テレビカ
メラで行うことが好適である。

【００１２】

【作用】本発明の特定の塩基配列を有する遺伝子の検出
方法では、特定の塩基配列から成る遺伝子の増幅にあた
って増幅遺伝子の構成の一部をラベル化物質とし、遺伝
子を構成しなかったラベル化物質を洗浄後に、ラベル化
特性を測定する。以後、ラベル化特性を蛍光性として、
本発明の作用を説明する。

【００１３】図１および図２は、本発明の特定の塩基配
列を有する遺伝子の検出方法の概要工程図である。図１
は特定の塩基配列を有する遺伝子が細胞内に存在しない
場合であり、図２は特定の塩基配列を有する遺伝子が細
胞内に存在する場合である。本発明の特定の塩基配列を
有する遺伝子の検出方法では、まず、測定対象の遺伝子
を含む細胞を固定化するとともに、細胞内の測定対象の
遺伝子の存在する領域と細胞の外部領域とを連通する
（図１および図２の（ａ）参照）。こうした細胞の固定
化には、ガラス表面に細胞を固着し、細胞固定液に第
１の時間だけ浸した後に蛋白質分解酵素で第２の時間だ
け処理する方法、または、遠心により集められた細胞
を細胞固定液に第３の時間だけ浸した後に蛋白質分解酵
素で第４の時間だけ処理し、再懸濁して用いるする方法
がある。

【００１４】次に、測定対象の遺伝子の存在する領域と
細胞の外部領域とが連通された細胞内に、蛍光性の核酸
塩基を含むポリメラーゼ連鎖反応による特定の塩基配列
を有する遺伝子の増幅に必要な反応液一式を導入する
（図１および図２の（ｂ）参照）。引き続き、反応液が
導入された細胞の周囲温度を調節して、特定の塩基配列
を有する遺伝子を選択的に細胞内で増幅する（図１およ
び図２の（ｃ）参照）。この後、選択的に増幅された特
定の塩基配列を有する遺伝子を有する細胞から遺伝子増
幅に使用されなかった蛍光物質を洗浄して排出する（図
１および図２の（ｄ）参照）。

【００１５】次いで、洗浄された細胞で発生する蛍光を
観察し、細胞内の特定の塩基配列を有する遺伝子を検出
する。

【００１６】

【実施例】以下、添付図面を参照して本発明の特定の塩
基配列を有する遺伝子の検出方法の実施例を説明する。
なお、図面の説明にあたって同一の要素には同一の符号
を付し、重複する説明を省略する。

【００１７】（第１実施例）本実施例は、測定対象の細
胞をガラス表面に固着した後に、細胞内の特定の塩基配
列を有する遺伝子を自動的に検出する。

【００１８】図３は、本実施例の特定の塩基配列を有す
る遺伝子の検出方法で使用する自動化装置の構成図であ
る。この装置は、（ａ）検出動作を制御する検出制御部
２００と、（ｂ）検出制御部２００から出力された透過
観察用のプローブ光を測定対象の細胞９００へ導く光学
系３００と、（ｃ）検出制御部２００から出力された蛍
光観察用のプローブ光を測定対象の細胞９００へ導く光
学系６００と、（ｄ）細胞９００を保持するとともに、
検出制御部２００からの指示により細胞９００の温度制
御および観測位置の移動を行う観察ステージ４００と、
（ｅ）ＰＣＲ用試料を細胞に供給する試料注入器５３０
と、（ｆ）細胞９００の洗浄液を格納する洗浄液だめ５
１０と、（ｇ）観察ステージ４００から排出された廃液
を格納する廃液だめ５２０と、（ｈ）透過観察用のプロ
ーブ光または蛍光観察用のプローブ光の照射による細胞
９００の透過光像または蛍光像を撮像する高感度テレビ
カメラ７００と、（ｉ）高感度テレビカメラ７００の撮
像結果を収集して画像処理を行う画像処理器８００と、
（ｊ）画像処理器８００の処理結果を表示する表示装置
１００とを備える。そして、観察ステージ４００と洗浄
液だめ５１０とは検出制御部２００からの指示により開
閉する弁５１２およびガラス管５１２を介して接続さ
れ、観察ステージ４００と廃液だめ５２０とはガラス管
５２１を介して接続され、また、観察ステージ４００と
試料注入器５３０とはガラス管５３１を介して接続され
る。なお、光学系６００は、細胞９００を介した透過光
または細胞９００で発生した蛍光を高感度テレビカメラ
７００に導く光学系としても機能する。

【００１９】検出制御部２００は、透過光観察用プロ
ーブ光を発生する光源２１０と、弁５１１の開閉を指
示する開閉指示器２２０と、観測位置の指示をする位
置指示器２３０と、細胞９００の温度調整を指示する
温度指示器２４０と、落射蛍光観察用プローブ光を発
生する光源２５０と、これら〜を制御するととも
に画像処理器８００に動作指示を通知するマイクロプロ
セッサを備えた制御部２９０と、を備える。

【００２０】光学系６００は、対物レンズ６１０と、
蛍光および細胞９００の透過光を透過し、蛍光観察用
プローブ光を反射するダイクロイックミラー６２０とを
備える。

【００２１】光学系３００は、透過光観察用プローブ
光の進行方向を制御する偏向器３１０と、透過光観察
用プローブ光を集光するコンデンサレンズ３２０とを備
える。

【００２２】図４は、観察ステージ４００の詳細な構成
の説明図である。図２に示すように、観察ステージ４０
０は、位置指示器２３０からの指示で移動する基材プ
レート４３２と、温度指示器２４０からの指示により
細胞９００の温度を調整する基材プレート４３２上に配
置されたペルチェ素子入りヒートブロック４２０と、
ヒートブロック４２０上に配置された細胞９００が固着
されカバーガラス４１３と、カバーガラス４１３上に
配置されたチャンバスペーサ４１２と、チャンバスペ
ーサ４１２上に配置されたカバーガラス４１１と、カ
バーガラス４１１上に配置され、前述の〜を固定す
る押えプレート４３１と、を備える。

【００２３】本実施例では、以下のようにして、測定対
象の細胞９００内の特定の塩基配列を有する遺伝子を検
出する。

【００２４】まず、カバーガラス４１３単体をポリリジ
ンで処理（カバーガラス上に500 μg/mlのPoly-L-lysin
e の水溶液を数滴落とし、乾燥させる）する。

【００２５】次に、採取した細胞を遠心（5000rpm, 5mi
n ）した後に、ポリリジン処理したカバーガラス４１３
上に塗り付けて風乾し、このカバーグラス４１３を使用
して観察ステージ４００を構成する。ここで、採取細胞
９００を塗り付けたカバーガラス４１３をシャーレ内に
置き、細胞懸濁液をシャーレ内に入れて細胞培養を行っ
て観察ステージ４００を構成してもよいし、この後に風
乾して観察ステージ４００を構成してもよい。

【００２６】次いで、細胞の付着した注入器５３０から
細胞固定液であるストレックティッシュフィクサティブ
（Streck Tissue Fixative；ＳＴＦ）原液をチャンバス
ペース４１２内に供給し、カバーガラス４１３をＳＴＦ
原液中に約１５分間浸した後、開閉指示器２２０からの
指示により、洗浄液だめ５１０からリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）をチャンバスペース４１２内に供給して洗浄する。
なお、洗浄液には水もしくは洗剤を含む水ないし緩衝液
を採用することも可能である。

【００２７】引き続き、注入器５３０からプロテナーゼ
（Proteinase K）溶液（濃度＝１μg/ml）をチャンバス
ペース４１２内に供給し、細胞の付着したカバーガラス
４１３をProteinaseK 溶液中に、温度調整器２４０から
の指示により３７℃で１５分間の条件で浸す。この結
果、細胞９００の膜には細孔が形成される。この後、開
閉指示器２２０からの指示により、洗浄液だめ５１０か
らリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をチャンバスペース４１２内
に供給して洗浄する。

【００２８】次に、注入器５３０から表１の組成のＰＣ
Ｒ反応液をチャンバスペース４１２内に供給する。

【００２９】 表１ ＰＣＲ反応液の組成 10×PCR バッファ 5 μl 2.5mM 3dNTP (dATP, dCTP, dGTP) 5 μl 250 μM dTTP 8 μl 250 μM ロータ゛ミン-4-dUTP (FluoroRed) 2 μl 25μM ヒト型β-ク゛ロヒ゛ン フ゜ライマ KM29 2μl 25μM ヒト型βーク゛ロヒ゛ン フ゜ライマ KM38 2μl 5U/ μl AmpliTaq DNA ホ゜リメラーセ゛ 0.2 μl 超純水（MiliQ ） 23.8 μl 計 50.0 μl なお、本実施例で増幅したβ−グロビン（ヒト型）遺伝
子の増幅用プライマ（ＫＭ２９およびＫＭ３８）のゲノ
ム上の位置と塩基配列を図５に示す。

【００３０】引き続き、温度調整器２４０からの指示に
より表２のような温度サイクルを細胞９００に施してＰ
ＣＲ法により遺伝子増幅する。

【００３１】 表２ 温度サイクル 94℃, 3 分 (1 サイクル) 45℃, 2 分 / 72 ℃, 3 分 / 94 ℃, 1 分 (30サイク
ル) 45℃, 5 分 / 72 ℃, 7 分 (1 サイクル) なお、温度サイクルは使用するプライマや増幅する遺伝
子の長さ等によって異なる。

【００３２】この後、開閉指示器２２０からの指示によ
り、洗浄液だめ５１０からリン酸緩衝液および超純水
（ＭｉｌｉＱ）をチャンバスペース４１２内に供給して
洗浄する。

【００３３】以上で、透過光観察および蛍光観察の対象
の試料が準備される。そして、以下の手順で細胞９００
内の特定の塩基配列を有する遺伝子の観察が実施され
る。

【００３４】まず、制御部２９０の指示により、光源２
１０から透過光観察用プローブ光が出力される。透過光
観察用プローブ光は光学系３００を介して観察ステージ
４００の試料に照射される。試料に照射され、透過した
光は光学系６００を介して高感度テレビカメラに入力
し、透過光が形成する細胞９００の像が撮像される。撮
像データは画像処理器８００に通知され、観察位置情報
とともに格納される。

【００３５】次に、制御部２９０の指示により、光源２
５０から蛍光用プローブ光が出力される。蛍光観察用プ
ローブ光は光学系６００を介して観察ステージ４００の
試料に照射される。試料に照射されて発生した蛍光した
光は光学系６００を介して高感度テレビカメラに入力
し、蛍光像が撮像される。撮像データは画像処理器８０
０に通知され、観察位置情報とともに格納される。

【００３６】次いで、制御部２９０の指示により、移動
制御器２３０から観察ステージ４００へ移動指示が通知
され、観察ステージ４００が移動する。引き続き、上記
と同様に細胞９００の透過光像および蛍光像が撮像さ
れ、画像処理器８００に観察位置情報とともに格納され
る。

【００３７】更に、制御部２９０の指示により観察ステ
ージ４００を移動させながら、観測したい領域に関する
細胞９００の透過光像データおよび蛍光像データを画像
処理器８００に観察位置情報とともに格納する。

【００３８】撮像データの収集が終了すると、画像処理
器８００は制御部２９０の指示に従って、指示された観
察位置の透過光像、蛍光像、または透過光像と蛍光像と
の合成像を表示器１００に表示する。

【００３９】図６および図７は、検出結果の表示器１０
０の表示を示す写真である。図６（ａ）および図７
（ａ）は蛍光像を、図６（ｂ）および図７（ｂ）は透過
光像を示す。図６（ａ）および図７（ａ）から蛍光像で
輝点が観察される。蛍光像と透過光像と重ねると、輝点
の位置は細胞の中の核の位置に相当する。これは、細胞
核内に多量の蛍光核酸物質の存在を意味する。つまり、
細胞核内でＰＣＲが起こり、蛍光核酸物質でラベルされ
たＰＣＲ産物が多量に産出されたことが確認できる。

【００４０】図８は、コントロール系の検出結果であ
り、上記の検出工程においてＰＣＲが起こらないように
プライマを添加しないＰＣＲ反応液をした場合の検出結
果である。図８（ａ）は蛍光像を、図８（ｂ）は透過光
像を示す。図８（ａ）に示されるように、蛍光像に輝点
は無く、ＰＣＲ反応は起きなかったことが確認できる。

【００４１】（第２実施例）本実施例は、測定対象の細
胞で、あらかじめ本方法により自動もしくは手動で遺伝
子増幅ラベル化されたものを懸濁液の状態で観察して、
細胞内の特定の塩基配列を有する遺伝子を検出する。

【００４２】図９は、本実施例で所用する検出装置の構
成図である。図９に示すように、この装置は第１実施例
と比べて、検出制御部には、開閉制御器２２０と温度調
整器２４０がなく、これらの制御を行わない分だけ制御
部の構成が異なるとともに、観察ステージが基材４２３
のみから構成されることが異なる。そして、測定対象の
細胞９１０が実装されたスライドガラスサンプル４９０
を基材４２３に乗せて、検出を実行する。本実施例の検
出は、測定対象の試料の作成までが第１実施例と異な
る。

【００４３】本実施例では、採取した細胞を培養し、細
胞培養液を遠心（5000rpm, 5min ）して細胞を集める。
集めた細胞を細胞固定液であるＳＴＦ原液中に約１５分
間浸した後、再度遠心して細胞を集める。再度集められ
た細胞を水またはＰＢＳで細胞を洗浄した後、プロテナ
ーゼＫ溶液（濃度＝１μg/ml）に３７℃で１５分間の条
件で浸す。この後、更に遠心して細胞を集め、水または
ＰＢＳで洗浄する。

【００４４】引き続き、第１実施例と同様のＰＣＲ反応
液を加え、第１実施例と同様の温度サイクルを施す。こ
の後、もう一度遠心して細胞を集め、水またはＰＢＳで
洗浄する。

【００４５】次に、ＰＢＳで再懸濁して細胞懸濁液とし
て、スライドグラス上にのせ、カバーガラスを被せて測
定試料４９０とする。

【００４６】以後、第１実施例と同様にして、透過光像
と蛍光像とを収集し、表示する。本実施例においても第
１実施例と同様の結果を得る。

【００４７】本発明は、上記の実施例に限定されるもの
ではなく変形が可能である。例えば、上記の実施例では
ラベル化核酸塩基として蛍光性核酸塩基としたが、放射
性同位元素を含む核酸塩基や発光性もしくは吸光性核酸
塩基を使用することも可能である。なお、こうした場合
には、ラベル化特性を検出することになるので、ラベル
化特性に応じた検出器を使用する必要がある。また、本
実施例ではヒトのβ−グロビン遺伝子増幅用プライマを
用いてヒト特異的遺伝子を検出したが、本方法は疾患原
因となる突然変異遺伝子、病因ウィルス特異的遺伝子，
ガンにより変異を起こした遺伝子等のプライマを用いる
ことによりそれらの存在の検出をすることが可能であ
る。

【００４８】

【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、本発明の特
定の塩基配列を有する遺伝子の検出方法によれば、特定
の塩基配列を有する遺伝子を増幅するとともに、増幅遺
伝子にラベル化した核酸塩基を取り込ませることとした
ので、自動化可能であり、かつ、精度良く迅速に細胞内
の特定の塩基配列を有する遺伝子を検出することができ
る。

【００４９】

【配列表】

配列番号 ：１ （ＫＭ２９） 配列の長さ：２２ 配列の型 ：ヌクレオチド 鎖の数 ：一重鎖 トポロジー：線状 配列 ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡ ＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡ ＧＧ 配列番号 ：２ （ＫＭ３８） 配列の長さ：２２ 配列の型 ：ヌクレオチド 鎖の数 ：一重鎖 トポロジー：線状 配列 ＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴ ＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴ ＴＧ

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の特定の塩基配列を有する遺伝子の検出
方法の概要説明図である。

【図２】本発明の特定の塩基配列を有する遺伝子の検出
方法の概要説明図である。

【図３】本発明の第１実施例で使用する検出装置の構成
図である。

【図４】図３の検出装置の観察ステージの詳細構成図で
ある。

【図５】β−グロビン（ヒト型）プライマの位置と配列
との説明図である。

【図６】実施例での細胞（生物の形態）の検出結果を示
す顕微鏡写真である。

【図７】実施例での細胞（生物の形態）の検出結果を示
す顕微鏡写真である。

【図８】コントロール系での細胞（生物の形態）に関す
る検出結果を示す顕微鏡写真である。

【図９】本発明の第２実施例で使用する検出装置の構成
図である。

【符号の説明】

１００…表示器、２００，２６０…検出制御部、３０
０，６００…光学系、４００…観察ステージ、５１０…
洗浄液ため、５２０…廃液ため、５３０…注入器、７０
０…高感度テレビカメラ、８００…画像処理器、９０
０，９１０…測定対象細胞。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定対象の遺伝子を有する可能性のある
   細胞もしくはその細胞を含む組織切片を固定化するとと
   もに、前記細胞内の前記測定対象の遺伝子の存在する可
   能性のある領域と前記細胞の外部領域とを連通する第１
   の工程と、 前記測定対象の遺伝子の存在する可能性のある領域と前
   記細胞の外部領域とが連通された前記細胞内に、ラベル
   化核酸塩基を含むポリメラーゼ連鎖反応による特定の塩
   基配列を有する遺伝子の増幅に必要な反応液一式を導入
   する第２の工程と、 前記反応液が導入された前記細胞もしくはその細胞を含
   む組織切片の周囲温度を調節して、前記特定の塩基配列
   を有する遺伝子を選択的に前記細胞内で増幅する第３の
   工程と、 選択的に増幅された前記特定の塩基配列を有する遺伝子
   を有する前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片から
   遺伝子増幅に使用されなかったラベル化核酸塩基を洗浄
   して排出する第４の工程と、 洗浄された前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片で
   発生するラベル化特性を観察し、前記細胞もしくはその
   細胞を含む組織切片内の前記特定の塩基配列を有する遺
   伝子を検出する第５の工程と、 を備えることを特徴とする特定の塩基配列を有する遺伝
   子の検出方法。
2. 【請求項２】 前記第１の工程は、 前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片をガラスの表
   面に固着し、 前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片が固着した前
   記ガラスを第１の時間にわたって細胞固定液に浸した後
   にリンスし、 固定された前記細胞をタンパク質分解酵素の溶液で第２
   の時間にわたって処理する、 ことを特徴とする請求項１記載の特定の塩基配列を有す
   る遺伝子の検出方法。
3. 【請求項３】 前記第１の工程は、 前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片の懸濁液を遠
   心して前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片を集
   め、 集められた前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片を
   第３の時間にわたって細胞固定液に浸した後にリンス
   し、 固定された前記細胞もしくはその細胞を含む組織切片を
   再度遠心して集め、 再度遠心して集められた前記細胞もしくはその細胞を含
   む組織切片をタンパク質分解酵素の溶液で第４の時間に
   わたって処理する、 ことを特徴とすることを特徴とする請求項１記載の特定
   の塩基配列を有する遺伝子の検出方法。
4. 【請求項４】 前記ラベル化特性は蛍光性であり、前記
   第５の工程での蛍光観察は蛍光顕微鏡および高感度テレ
   ビカメラで行う、ことを特徴とする請求項１記載の特定
   の塩基配列を有する遺伝子の検出方法。